引用本文： 吳辰, 唐朝暉, 羅鵬飛. 血液外泌體攜帶 miR-140-3p 負調控泛素結合酶 E2C 抑制小細胞肺癌的增殖和上皮-間質轉化. 華西醫學, 2023, 38(10): 1522-1529. doi: 10.7507/1002-0179.202305047 復制
肺癌是全球最常見的癌癥之一，也是死亡率最高的癌癥[1]。小細胞肺癌（small cell lung carcinoma, SCLC）是肺癌的次要亞型；SCLC 易廣泛的早期轉移，是具有強侵襲性的惡性腫瘤，治療方法有限，預后效果不良[2]。因此，迫切需要探索 SCLC 發生發展新穎的分子機制以進行準確診斷及尋找更有效的診療策略。癌細胞的持續生長、侵襲和轉移取決于復雜組織微環境的細胞間通訊[3]。細胞外囊泡（extracellular vesicle, EV）是一種傳遞信息的“信使”。供體細胞分泌 EV，并攜帶大量長鏈非編碼 RNA、微小 RNA（microRNA, miRNA）、脂質、蛋白質等，受體細胞接受供體細胞的來信并做出響應，調節細胞增殖、遷移和侵襲等生物學功能[3]。惡性細胞比正常細胞能分泌更多 EV，且這些 EV 可從體液中分離[4]。miRNA 是一類短的非編碼 RNA，可通過 mRNA 3’-UTR 端互補配對結合實現對靶基因的轉錄后調控[5]。miR-140-3p 是一類 miRNA，在不同腫瘤中發揮重要作用，如在結直腸癌[6]和乳腺癌[7]中抑制癌細胞的惡性增殖，但目前關于外泌體攜帶小分子物質影響 SCLC 的增殖、遷移及上皮-間質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）的研究較少。因此，本研究探討了血液外泌體攜帶 miR-140-3p 對 SCLC 細胞生物學功能的影響及機制，為其靶向治療提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 數據集和生物信息學分析
1.1.1 數據集獲取
從 GEO 數據庫下載SCLC相關的 miRNA 數據集 GSE19945（正常：8、腫瘤：35）、mRNA 數據集 GSE40275（正常：43、腫瘤：21）和 GSE60052（正常：7、腫瘤：79）。SCLC 相關數據集納入標準：① 確認數據集與 SCLC 相關；② 確認數據集包含 miRNA 或 mRNA 的表達數據；③ 數據集包含足夠的 SCLC 樣本。排除標準：① 數據集缺乏相關的注釋信息；② 數據集質量不佳，如樣本處理出現問題、數據缺失等。
1.1.2 生物信息學分析
采用 T-test 檢測 miR-140-3p 在正常組織和SCLC組織中的表達差異，并通過 EVmiRNA數據庫分析 miR-140-3p 在不同組織和細胞外泌體中的表達情況。利用數據庫 miRTarBase、miRDB、mirDIP和 miRSearch預測 miR-140-3p 的下游 mRNA，并用 T-test 檢測其表達量在患者不同臨床分期的差異。
1.2 臨床研究和分析
1.2.1 臨床研究對象
收集 2021 年 12 月—2022 年 12 月在永州市中心醫院切除的 SCLC 組織和配對癌旁組織（距癌組織 3～5 cm），切除后立即儲存在液氮中直至使用。專門收集 SCLC 患者術前血清標本進行活檢。將樣品在 4℃下 1 000 g 離心 10 min，離心半徑 10 cm，上層清液在 4 °C 下 10 000 g 進一步離心 10 min，離心半徑 10 cm，以完全消除細胞成分。在分析之前，將血清儲存在?80℃。并于實驗開始前 7 d 選擇健康志愿者（對照組）獲得血清樣品。患者納入標準：① 明確的SCLC病理學確診；② 已簽署過術前知情書。患者排除標準：① 存在其他腫瘤類型或混合類型；② 臨床資料不完整。對照組納入標準：① 確保無任何腫瘤或其他嚴重疾病；② 年齡在患者年齡區間；對照組排除標準：① 正在使用可能影響血清外泌體的藥物；② 孕婦。本研究已通過永州市中心醫院醫學倫理審查批準（2023053101）。本研究根據“每個組至少 30 個樣本”的經驗規則來確定樣本量。
1.2.2 觀察指標
通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantificational real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測 SCLC 組織樣本中 miR-140-3p 和泛素結合酶 E2C（ubiquitin-conjugating enzyme E2C, UBE2C）的表達水平分布情況，根據表達量的中位數確定高低分組，表達量低于中位數為低表達組，其余為高表達組。根據以往經驗，觀察兩組樣本的來源患者年齡、性別、SCLC 腫瘤直徑、TNM 分期、T 分期和 N 分期，分析 miR-140-3p 和 UBE2C 的表達水平與上述病理參數的相關性。
1.2.3 血清外泌體分離與鑒定
使用血清外泌體分離試劑（美國賽默飛），按照制造商的步驟分離健康志愿者和 SCLC 患者血清中的外泌體。將 0.2 mL 總外泌體分離試劑添加到 1 mL 血清樣品中，并在 4℃下孵育 30 min，后在室溫下以 10 000 g 離心 10 min，離心半徑 10 cm。將細胞培養基以 2 000 g 離心 30 min 去除細胞和碎片。使用透射電子電鏡（transmission electron microscope, TEM）檢測提取的外泌體，收集外泌體沉淀物用于 miRNA 提取。
1.3 細胞分析
1.3.1 細胞培養
采用正常人胚肺細胞系 MRC-5（BNCC353614）及SCLC細胞系 NCI-H69（BNCC359344）、NCI-H446（BNCC100065）、NCI-H1688（BNCC342559），以上細胞系均購自北納生物，均在含有 10%胎牛血清（美國海克隆）的 RPMI-1640 培養液（美國西格瑪）中培養，適當添加 100 U/mL 鏈霉素和 100 U/mL 青霉素（美國賽默飛）。所有細胞均培養在 37℃、5%二氧化碳（carbon dioxide, CO2）的恒溫培養箱中備用。
1.3.2 細胞轉染
miR-140-3p 模擬物（mimic）和 mimic NC（miR-140-3p 模擬物的陰性對照）、miR-140-3p 抑制劑（inhibitor）和 inhibitor NC（miR-140-3p 抑制劑的陰性對照）、過表達（overexpression, oe）‐NC（陰性對照）和 oe‐UBE2C 均購自吉瑪基因（中國上海）。均使用 Lipofectamine 2000（美國賽默飛）根據制造商的說明書對相應的 SCLC 細胞進行轉染。轉染 48 h 后，利用轉染細胞進行下一步實驗。
1.3.3 RNA 提取與 qRT-PCR
使用 TRIzol 試劑（美國賽默飛）從正常人胚肺細胞系和 SCLC 細胞系中提取總 RNA。用 NanoDrop 2000 系統（美國賽默飛）測定 RNA 濃度。使用 miScriptⅡRT kit（德國凱杰）將 miR-140-3p 反轉錄為 cDNA，miScript SYBR Green PCR Kit（德國凱杰）進行檢測，U6 作為內參；UBE2C mRNA 使用 PrimeScript RT Master Mix（日本寶日醫）合成 cDNA，SYBR? Premix Ex Taq TMⅡ（日本寶日醫）試劑盒進行檢測，糖酵解酶磷酸化脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）為內源性對照。在 7500 Fast 實時熒光定量合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）系統上行 qRT-PCR。結果用 2?ΔΔCt 值比較對照組和實驗組的目的基因相對表達量的差異，實驗重復 3 次。冷凍組織和外泌體的 qRT-PCR 檢測方法同上。qRT-PCR 引物序列見表1。
表1
qRT-PCR 引物序列
1.3.4 細胞外泌體的分離與鑒定
使用細胞培養基總外泌體分離試劑（美國賽默飛），按制造商步驟分離 SCLC 細胞系中的外泌體。細胞培養基以 2 000 g 離心 30 min 以去除細胞和碎片。將 1 mL 無細胞培養基轉移至新試管中，并添加 0.5 mL 總外泌體分離試劑。樣品 4℃下孵育過夜，隨后在 4℃下以 10 000 g 離心 1 h，離心半徑 10 cm。使用 TEM 來檢測所提取外泌體，收集外泌體沉淀物用于 miRNA 提取。
1.3.5 共焦顯微成像
24 μg 外泌體中加入適量親脂示蹤劑細胞膜綠色熒光探針（DiO）溶液（美國賽默飛），37 °C 條件下孵育 20 min。用 MW 3000 外泌體離心柱（美國賽默飛）去除過量的 DiO。用 Infinite? 200 PRO 熒光計（瑞士帝肯）分析外泌體標記效率。將 NCI-H1688 細胞接種在 8 孔腔室玻片上（1×104 或 4×104 細胞/孔），24 h 后將 DiO 標記的外泌體（8 μg）添加到受體細胞 NCI-H1688 的培養基中，并在 37 °C 下培養 3 h。用 4%多聚甲醛在室溫下固定 NCI-H1688 細胞 10 min，并在室溫下用 0.1% Triton X-100 孵育 5 min，隨后用 Alexa Fluor 555 鬼筆環肽（美國賽默飛）染色 30 min，再加入帶有 4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚（4’, 6-diamidino-2- phenylindole, DAPI）的 Prolong? Diamond Antifade 試劑（美國賽默飛），用熒光顯微鏡（美國賽默飛）觀察細胞。
1.3.6 雙熒光素酶實驗
分別構建插入野生型（WT）和突變型（MUT）UBE2C 的 pmirGLO 熒光素酶報告載體（美國普洛麥格）。293T 細胞（中國北納生物）在 24 孔板中培養，并將 miR mimic/mimic NC 和 UBE2C-WT/UBE2C-MUT 質粒共轉染到細胞中。48 h 后通過雙熒光素酶報告系統（美國普洛麥格）測定熒光素酶活性。實驗重復 3 次。
1.3.7 蛋白質免疫印跡法分析
用放射免疫沉淀法裂解緩沖液（中國上海碧云天）提取 NCI-H1688 細胞裂解產物，采用比色分析法蛋白質測定試劑盒（中國上海碧云天）測定蛋白濃度。高溫變性后，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠膠體電泳將蛋白質從樣品緩沖液中分離，轉移到聚偏二氟乙烯膜（美國密理博）中并用 5%牛血清白蛋白封閉 2 h，然后在 4℃下與一抗孵育過夜。隨后與二抗山羊抗兔免疫球蛋白 G 重鏈和輕鏈（H&L）（貨號 ab150077，稀釋比例 1∶2 000，英國艾博抗）在室溫下孵育 2 h。使用化學發光試劑盒（美國通用醫療）檢測蛋白質信號。實驗重復 3 次。一抗信息：UBE2C（貨號 ab252940，稀釋比例 1∶1 000）、GAPDH（貨號 ab181602，稀釋比例 1∶10 000）、E 型鈣黏附蛋白（貨號 ab40772，稀釋比例 1∶10 000）、N 型鈣黏附蛋白（貨號 ab76011，稀釋比例 1∶10 000）、波形蛋白（Vimentin）（貨號 ab92547，稀釋比例 1∶5 000）、溶酶體相關膜蛋白 3（CD63）（貨號 ab134045，稀釋比例 1∶1 000）、人腫瘤易感基因 101（TSG101）（貨號 ab125011，稀釋比例 1∶1 000）、β-肌動蛋白（β-actin）（貨號 ab213262，稀釋比例 1∶5 000）。所有一抗均為兔抗（英國艾博抗）。
1.3.8 細胞計數檢測試劑盒-8（cell counting kit-8, CCK-8）和克隆形成實驗
① CCK-8：將 NCI-H1688 和 NCI-H69 細胞以每孔 2×104 的密度接種在 96 孔板上，細胞培養在 37℃含 5%CO2 的條件下。培養 0、24、48、72 h 后，每孔加入 10 μL CCK-8 溶液（日本同仁），之后在 37℃含 5%CO2 的條件下培養 2 h。利用酶標儀（美國賽默飛）測量 450 nm 處的吸光值。實驗重復 3 次。
② 克隆形成：將細胞以每孔 1×103 個細胞接種在 6 孔板上，每個處理組設 3 個復孔。在完全培養基上培養 14 d 直到明顯的克隆形成。在室溫下將細胞克隆用 4%的多聚甲醛固定 15 min，0.5%結晶紫（美國賽默飛）染色 20 min。用無菌水清洗去除殘留的結晶紫。將細胞數超過 50 個的克隆定義為克隆，使用光學顯微鏡（加拿大 Quantitative Imaging）捕獲圖像，計算每孔的克隆數。實驗重復 3 次。
1.3.9 膜聯蛋白 V/碘化丙啶（annexin V / propidium iodide, AnnexinV/PI）雙染色檢測細胞凋亡
將 NCI-H1688 細胞和 NCI-H69 細胞培養至對數生長期后，用不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶處理，離心棄上層清液，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline, PBS）清洗 2 次，用 500 μL 預冷的 1×結合緩沖液重懸細胞，調整細胞濃度為 1×106 cells/mL。取 100 μL 細胞懸液，加入 5 μL 異硫氰酸熒光素標記的膜聯蛋白（中國江蘇凱基生物），室溫避光孵育 15 min，上機前 5min 加入 2.5 μL 碘化丙啶染色，流式細胞儀（美國賽默飛）檢測細胞凋亡情況。實驗重復 3 次。
1.3.10 劃痕愈合實驗
將 NCI-H1688 細胞或 NCI-H69 細胞接種在 6 孔板中，當細胞覆蓋達到 80%時使用 200 μL 移液管尖端輕輕刮擦穿過孔中心的單層。將孔用培養基短暫洗滌 2 次除去分離細胞。加入新鮮培養基，細胞再生長 24 h，顯微鏡上放大 40 倍觀察和拍照 0、24 h 的細胞遷移情況。實驗重復 3 次。
1.3.11 Transwell 侵襲實驗
將大約 1×104 個/孔 NCI-H1688 細胞或 NCI-H69 細胞加入 24 孔 Transwell 小室（美國碧迪醫療）上室中，頂部室用基質膠包被。將含有 10%胎牛血清（美國 Gibco）的 DMEM-H 條件培養液（美國西格瑪）填充到下室中。細胞侵襲實驗細胞在 37℃溫育 36 h 后，用 4%多聚甲醛固定并對膜下表面的細胞用 0.5%結晶紫染色，最后用濕潤棉簽涂敷器除去未通過膜的細胞。染色后用倒置顯微鏡放大 100 倍進行觀察、拍照。實驗重復 3 次。
1.4 動物實驗方法
1.4.1 裸鼠腫瘤異種移植
選擇 20 只雄性裸鼠。裸鼠購自北京重河實驗科技有限公司，鼠齡 4 周，在無菌條件下飼養（12 h 黑白光照周期，25℃，60%～70%濕度）。將裸鼠隨機分為 4 組，每組 5 只，選擇其中 2 組分別將由 NC mimic 或 miR-140-3p mimic 穩定轉染的 NCI-H1688 細胞注入裸鼠皮下，建立小鼠異種移植模型，剩下 2 組備用。腫瘤生長在 1 周后開始檢測。腫瘤體積測量方法：體積（mm3）=（長×寬 2）/2。6 周后裸鼠安樂死并測量腫瘤重量和對腫瘤進行拍照。研究已通過永州市中心醫院倫理委員會審查（批件號 2023071402）。
1.4.2 免疫組織化學（免疫組化）分析
石蠟包埋裸鼠腫瘤組織切片在二甲苯中脫蠟，用梯度乙醇處理。1%雙氧水在 PBS 中使內源性過氧化物酶失活 10 min 后，用 PBS 沖洗 3 次切片，5%脫脂乳/PBS 孵育 30 min，以減少非特異性結合。切片用抗 UBE2C 和 Ki-67 抗體孵育，5%脫脂牛奶/PBS 稀釋，4℃孵育 16 h。PBS 沖洗 2 次后，采用免疫組化檢測系統對組織切片進行檢測，倒置顯微鏡放大 400 倍觀察 UBE2C 和 Ki67 的陽性細胞率并拍照。所有切片均用蘇木精復染。用相同濃度的非免疫非免疫球蛋白G（貨號 ab150077，稀釋比例 1∶1000）代替一抗處理對照組（陰性對照），作陰性對照。抗體信息：UBE2C（貨號 ab252940，稀釋比例 1∶1000）、Ki67（貨號 ab15580，稀釋比例 1∶500），均為兔抗（英國艾博抗）。實驗重復 3 次。
1.5 統計學方法
采用 GraphPad Prism 8 軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差的形式表示，組間比較采用 t 檢驗。計數資料采用頻數表示，組間比較采用χ2 檢驗。采用 R 語言計算 miR-140-3p 和 UBE2C 的 Pearson 相關系數分析相關性。雙側檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 患者一般資料
共納入患者 45 例，其中 SCLC 組織和配對癌旁組織 45 對，術前血清標本 40 份；健康志愿者 30 人。患者的臨床病理資料見表2。可見miR-140-3p 表達水平與腫瘤直徑（χ2=5.140，P=0.021）、TNM 分期（χ2=5.021，P=0.038）、T 分期（χ2=6.412，P=0.009）、N 分期（χ2=6.537，P=0.007）有關；UBE2C 表達水平與 TNM 分期（χ2=13.926，P＜0.001）、T 分期（χ2=16.200，P=0.009）、N 分期（χ2=5.021，P=0.007）有關。
表2
SCLC 組織 miR-140-3p、UBE2C 表達水平與病理參數相關性分析（例）
2.2 miR-140-3p 在 SCLC 中的表達及主要來源
T-test 分析 GSE19945 數據集結果顯示，miR-140-3p 在SCLC組織中表達低于正常組織（1.17±0.78 vs. 3.55±0.63，P<0.001）。qRT-PCR 結果顯示，miR-140-3p 在 SCLC 組織中表達低于正常組織（0.71±0.36 vs. 1.17±0.53，P<0.001）。在 SCLC 細胞（NCI-H69、NCI-H446 和 NCI-H1688）中相對表達量也低于正常人胚肺細胞系 MRC-5（0.67±0.08 vs. 0.50±0.07 vs. 0.38±0.04 vs. 1.00±0.07）。通過 EVmiRNA 數據庫檢索發現 miR-140-3p 主要存在于血液外泌體中。蛋白質免疫印跡法檢測出外泌體表面標志物為 CD63、TSG101 及β-actin（圖1a），且通過 TEM 檢測外泌體大小和形態結果（圖1b）顯示其呈杯碟狀，且直徑小于 100 nm，可確保所分離到的是外泌體。qRT-PCR 結果顯示，SCLC 患者血液來源的外泌體中的 miR-140-3p 相對表達量較健康志愿者偏低（0.46±0.06 vs. 1.00±0.10，P<0.05）。
圖1
miR-140-3p 在 SCLC 中的表達及主要來源分析
a. 蛋白免疫印跡法檢測從健康志愿者和 SCLC 患者血液純化外泌體的表面標志物 CD63、TSG101 的表達條帶圖；b. TEM 檢測從健康志愿者和 SCLC 患者血液純化外泌體的形態。標尺=200 nm；exo：外泌體；TEM：透射電子電鏡；SCLC ：小細胞肺癌；TSG101：人腫瘤易感基因101；β-actin：β-肌動蛋白
2.3 血液外泌體能否遞送 miR-140-3p 至 SCLC 細胞分析
熒光共聚焦顯微鏡觀察外泌體（DiO 標記）孵育的 NCI-H1688 細胞，能清楚地觀察到綠色熒光（圖2），顯示 SCLC 細胞能有效吸收血液外泌體。qRT-PCR 結果顯示，從健康志愿者血液分離的 Normal 外泌體孵育的 SCLC 細胞中 miR-140-3p 的表達水平高于從 SCLC 患者血液分離的 SCLC 外泌體組及與未經處理的 NCI-H1688 組（3.13±0.26 vs.1.14±0.12 vs.1.00±0.09）。
圖2
熒光共聚焦顯微鏡觀察 NCI-H1688 細胞彩色像
綠色為外泌體，紅色為 NCI-H1688 細胞骨架，藍色為細胞核；白色長、短箭均指向DiO標記的外泌體所在位置；第4列圖為第3列圖中的白框處放大；標尺=50 μm；exo ：外泌體；Phalloidin：鬼筆環肽；DiO：細胞膜綠色熒光探針；DAPI：4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚；PBS：磷酸緩沖鹽溶液
2.4 miR-140-3p 對 SCLC 細胞的生物學功能影響
NCI-H1688 細胞分為 mimic NC 組（轉染 mimic NC）和 miR mimic 組（轉染 miR-140-3p mimic），NCI-H69 細胞分為 inhibitor NC 組（轉染 inhibitor NC）和 miR inhibitor 組（轉染 miR-140-3p inhibitor）。CCK-8 檢測得 miR mimic 組與 mimic NC 組相比，72 h 時細胞活力顯著降低（0.73±0.08 vs. 1.22±0.13，P<0.05），miR inhibitor 組與 inhibitor NC 組相比，72 h 時細胞活力顯著增高（1.74±0.12 vs. 1.13±0.09，P<0.05）。miR mimic 組細胞克隆數低于 mimic NC 組（47.33±2.52 vs. 107.67±10.69，P<0.05），miR inhibitor 組細胞克隆數高于 inhibitor NC 組（197.33±18.15 vs. 114.00±9.54，P<0.05）。miR mimic 組細胞劃痕愈合率低于 mimic NC 組［（11.63±2.62）% vs.（31.77±4.30）%，P<0.05］，miR inhibitor 組細胞劃痕愈合率高于 inhibitor NC 組［（49.23±5.75）% vs. （33.30±4.13）%，P<0.05］。miR mimic 組細胞侵襲數低于 mimic NC 組（44.33±3.06 vs. 102.67±8.50，P<0.05），miR inhibitor 組細胞侵襲數高于 inhibitor NC 組（159±12.17 vs. 97±7.94，P<0.05）。miR mimic 組細胞凋亡率高于 mimic NC 組［（14.48±1.20）% vs.（10.14±1.21）%，P<0.05］，miR inhibitor 組細胞凋亡率低于 inhibitor NC 組［（3.86±1.26）% vs.（11.40±1.09）%，P<0.05］。
2.5 miR-140-3p 的靶基因及對 EMT 過程的影響
miRTarBase、miRDB、mirDIP 和 miRSearch 數據庫預測 miR-140-3p 下游調控靶基因，取交集得到 5 個靶基因（ACVR2B、ATP6AP2、NFYA、SLC1A4、UBE2C）。在 GSE40275、GSE60052 數據集中驗證發現，相對于正常組織，UBE2C 在SCLC組織中高表達（圖3a、3b）。對臨床樣本進行 qRT-PCR 檢測，驗證 UBE2C 在 SCLC 組織中表達高于正常組織（P<0.05），且與 miR-140-3p 呈負相關（r2=0.1987，P=0.0022）。在 SCLC 細胞（NCI-H69、NCI-H446 和 NCI-H1688）中相對表達量也高于正常人胚肺細胞系 MRC-5（2.53±0.22 vs. 2.98±0.17 vs. 3.95±0.58 vs.1.00±0.12）。生物信息學預測分析 miR-140-3p 與 UBE2C 存在靶向結合位點，miR-140-3p 的一部分序列與 UBE2C 的 3’ UTR 中的特定區域互補配對，形成 miRNA-mRNA 雙鏈結構。
圖3
miR-140-3p 的靶基因及其對 EMT 過程影響分析
a. 預測靶基因分別在 GSE40275 數據集中的表達量；b. 預測靶基因分別在 GSE60052 數據集中的表達量；c. 蛋白質印跡法檢測各處理組 EMT 相關蛋白的表達條帶圖。EMT：上皮-間質轉化；UBE2C：泛素結合酶E2C；N-Cadherin：神經鈣黏素；Vimentin：波形蛋白；GAPGH：糖酵解酶磷酸化脫氫酶；mimic：模擬物；oe：過表達；NC：陰性對照；ns：無顯著差異；*
雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示相比于 mimic NC 組，過表達 miR-140-3p 抑制野生型 UBE2C 的表達（P<0.05），而對突變型 UBE2C 的表達沒有影響（P>0.05），說明 miR-140-3p 和 UBE2C 具有靶向結合的關系。miR-140-3p 過表達的細胞 UBE2C mRNA（0.49±0.05）和蛋白水平均低于陰性對照組（1.00±0.12）（P<0.05），且能逆轉過表達 UBE2C 對 UBE2C mRNA 和蛋白表達水平的促進作用（P<0.05）。miR-140-3p 過表達提高了上皮表型相關蛋白 E-Cadherin 的表達并下降了間質表型相關蛋白神經鈣黏素（N-Cadherin）和 Vimentin 的表達（P<0.05）；而同時過表達 miR-140-3p 和 UBE2C 逆轉了上述 EMT 相關蛋白的表達（P<0.05）。見圖3c。
2.6 miR-140-3p 靶向 UBE2C 對 SCLC 細胞生物學功能的影響
采用 CCK-8 法檢測各處理組的 NCI-H1688 細胞的增殖能力。單獨過表達 miR-140-3p 的 SCLC 細胞的活力（72 h 時：0.86±0.11 vs. 1.35±0.13，P<0.05）、細胞克隆數（41.33±4.19 vs. 101.33±9.10，P<0.05）、劃痕愈合率［（14.01±2.01）% vs.（38.51±4.19）%，P<0.05］、細胞侵襲數（48.33±4.16 vs. 99.33±9.07，P<0.05）均低于對照組，凋亡率［（13.89±0.15）% vs.（10.12±1.13）%，P<0.05］高于對照組。而單獨過表達 UBE2C 得到了相反的結果，單獨過表達 UBE2C 后 SCLC 細胞的活力（72 h 時：2.16±0.22vs. 1.35±0.13，P<0.05）、克隆數（198.33±11.67 vs. 101.33±9.10，P<0.05）、劃痕愈合率［（60.68±5.80）%vs.（38.51±4.19）%，P<0.05］、細胞侵襲數（160.67±13.61 vs. 99.33±9.07，P<0.05）均高于對照組，凋亡率低于對照組［（6.22±0.30）% vs.（10.12±1.13）%，P<0.05］；同時過表達 miR-140-3p 和 UBE2C 時，SCLC 細胞的生物學功能變化均得到明顯恢復（P<0.05）。
2.7 體內驗證 miR-140-3p 對 SCLC 腫瘤生長的影響
通過建立小鼠異種模型，進行體內實驗顯示，與 NC mimic 組相比，miR-140-3p mimic 抑制了腫瘤的生長，miR-140-3p mimic 組腫瘤重量低于 NC mimic 組［（0.58±0.36）vs.（1.58±0.27）g，P<0.05］。前 4 周兩組小鼠的腫瘤體積無顯著差異，在第 5 周［（456.51±88.11）vs.（142.77±60.71）mm3，P<0.05］和第 6 周［（604.57±141.03）vs.（231.34±103.06）mm3，P<0.05］時，miR-140-3p mimic 組腫瘤體積顯著小于 NC mimic 組。在腫瘤組織中，miR-140-3p 過表達組的 miR-140-3p 表達水平高于 NC mimic 組（12.33±2.68 vs. 1.00±0.08，P<0.05），miR-140-3p 過表達組 UBE2C 較 NC mimic 組下調（0.38±0.06 vs. 1.00±0.20，P<0.05）。與 NC mimic 組相比，過表達 miR-140-3p 抑制了 UBE2C 蛋白以及 N-Cadherin、Vimentin 表達，上調了 E-Cadherin 的表達（P<0.05）。免疫組化實驗結果顯示過表達 miR-140-3p 組裸鼠腫瘤組織中 UBE2C［（23.65±3.49）% vs.（63.76±4.81）%，P<0.05］和 Ki67 陽性細胞率［（21.47±2.37）% vs.（54.28%±4.19）%，P<0.05］均低于 NC mimic 組。
3 討論
研究表明外泌體能攜帶信息分子作為細胞間的通訊橋梁[8]。其中外泌體攜帶的 miRNA 可調節受體細胞的各種生物學功能，如缺氧性腫瘤外泌體來源的 miR-301a 通過 PTEN/PI3Kγ介導 M2 巨噬細胞極化，促進胰腺癌轉移[9]。但外泌體 miRNA 在 SCLC 發生發展中的分子作用機制還未被充分了解。
本研究通過對 SCLC 臨床樣本進行分析，得出 SCLC 惡性進展與 miR-140-3p 和 UBE2C 的表達量相關。生物信息學分析得 miR-140-3p 主要來源于人血液外泌體中。qRT-PCR 實驗表明，與正常外泌體相比，SCLC 外泌體中 miR-140-3p 表達水平較低。miR-140-3p 作為一個分子標志物，在一系列惡性腫瘤疾病中被視為抑癌 miRNA。如 miR-140-3p 在結直腸癌中通過靶向 PD-L1 使 PI3K/AKT 通路失活，從而抑制癌細胞的生長并誘導其凋亡[6]；在子宮肌瘤細胞中，通過下調 ANK2 的表達來抑制癌細胞生長和侵襲[10]。這表明 miR-140-3p 可能是一種極具潛力的診斷和治療的新靶點，但還沒有研究明確 miR-140-3p 在 SCLC 的表達情況及作用。共聚焦顯微成像表明受體 SCLC 細胞能攝取血液外泌體。隨后在 SCLC 細胞中對 miR-140-3p 進行了過表達和抑制處理，結果和預期一致，miR-140-3p 能抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。
本研究發現，miR-140-3p 與 UBE2C 存在結合位點，隨后通過雙熒光素酶報告實驗驗證其靶向結合關系。UBE2C 屬于 E2 基因家族，編碼與泛素依賴性蛋白水解相關的一個 19 kDa 蛋白，UBE2C 過表達會導致染色體錯誤分離及細胞周期圖譜的改變，從而促進細胞惡性增殖并抑制細胞凋亡[11]。UBE2C 在包括轉移性前列腺癌、直腸癌、食管鱗癌等各類型的癌癥中異常高表達[12-14]，在腫瘤的發生和發展中發揮重要作用；另有研究報道 UBE2C 可誘導 EMT 過程[15]。本研究結果與以上研究結論相似。UBE2C 表達水平與 SCLC 進展呈正相關，其在 SCLC 患者中的異常高表達促進了 EMT 過程，降低了 SCLC 細胞凋亡率，對于 SCLC 細胞的增殖、遷移和侵襲非常重要。且對 SCLC 細胞進行過表達 UBE2C 處理后，可抑制 miR-140-3p 過表達對 SCLC 細胞的影響，證實 miR-140-3p 通過直接靶向 UBE2C 抑制 SCLC 細胞增殖、遷移、侵襲和 EMT 過程并促進其凋亡。最后，本研究采用裸鼠進行體內實驗進一步驗證了 miR-140-3p 對 SCLC 的抑癌作用。
綜上，血液外泌體攜帶的 miR-140-3p 通過靶向 UBE2C 抑制 SCLC 細胞增殖、遷移、侵襲和 EMT 過程并促進其凋亡，可為 SCLC 早期診斷及治療方法提供新思路，并為其預后監測提供新方向。然而，目前 SCLC 外泌體中 miR-140-3p 下調的機制、UBE2C 促進癌細胞生長的細胞通路及血液外泌體供體細胞仍不清楚，還有待對其上下游信號進一步研究。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
肺癌是全球最常見的癌癥之一，也是死亡率最高的癌癥[1]。小細胞肺癌（small cell lung carcinoma, SCLC）是肺癌的次要亞型；SCLC 易廣泛的早期轉移，是具有強侵襲性的惡性腫瘤，治療方法有限，預后效果不良[2]。因此，迫切需要探索 SCLC 發生發展新穎的分子機制以進行準確診斷及尋找更有效的診療策略。癌細胞的持續生長、侵襲和轉移取決于復雜組織微環境的細胞間通訊[3]。細胞外囊泡（extracellular vesicle, EV）是一種傳遞信息的“信使”。供體細胞分泌 EV，并攜帶大量長鏈非編碼 RNA、微小 RNA（microRNA, miRNA）、脂質、蛋白質等，受體細胞接受供體細胞的來信并做出響應，調節細胞增殖、遷移和侵襲等生物學功能[3]。惡性細胞比正常細胞能分泌更多 EV，且這些 EV 可從體液中分離[4]。miRNA 是一類短的非編碼 RNA，可通過 mRNA 3’-UTR 端互補配對結合實現對靶基因的轉錄后調控[5]。miR-140-3p 是一類 miRNA，在不同腫瘤中發揮重要作用，如在結直腸癌[6]和乳腺癌[7]中抑制癌細胞的惡性增殖，但目前關于外泌體攜帶小分子物質影響 SCLC 的增殖、遷移及上皮-間質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）的研究較少。因此，本研究探討了血液外泌體攜帶 miR-140-3p 對 SCLC 細胞生物學功能的影響及機制，為其靶向治療提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 數據集和生物信息學分析
1.1.1 數據集獲取
從 GEO 數據庫下載SCLC相關的 miRNA 數據集 GSE19945（正常：8、腫瘤：35）、mRNA 數據集 GSE40275（正常：43、腫瘤：21）和 GSE60052（正常：7、腫瘤：79）。SCLC 相關數據集納入標準：① 確認數據集與 SCLC 相關；② 確認數據集包含 miRNA 或 mRNA 的表達數據；③ 數據集包含足夠的 SCLC 樣本。排除標準：① 數據集缺乏相關的注釋信息；② 數據集質量不佳，如樣本處理出現問題、數據缺失等。
1.1.2 生物信息學分析
采用 T-test 檢測 miR-140-3p 在正常組織和SCLC組織中的表達差異，并通過 EVmiRNA數據庫分析 miR-140-3p 在不同組織和細胞外泌體中的表達情況。利用數據庫 miRTarBase、miRDB、mirDIP和 miRSearch預測 miR-140-3p 的下游 mRNA，并用 T-test 檢測其表達量在患者不同臨床分期的差異。
1.2 臨床研究和分析
1.2.1 臨床研究對象
收集 2021 年 12 月—2022 年 12 月在永州市中心醫院切除的 SCLC 組織和配對癌旁組織（距癌組織 3～5 cm），切除后立即儲存在液氮中直至使用。專門收集 SCLC 患者術前血清標本進行活檢。將樣品在 4℃下 1 000 g 離心 10 min，離心半徑 10 cm，上層清液在 4 °C 下 10 000 g 進一步離心 10 min，離心半徑 10 cm，以完全消除細胞成分。在分析之前，將血清儲存在?80℃。并于實驗開始前 7 d 選擇健康志愿者（對照組）獲得血清樣品。患者納入標準：① 明確的SCLC病理學確診；② 已簽署過術前知情書。患者排除標準：① 存在其他腫瘤類型或混合類型；② 臨床資料不完整。對照組納入標準：① 確保無任何腫瘤或其他嚴重疾病；② 年齡在患者年齡區間；對照組排除標準：① 正在使用可能影響血清外泌體的藥物；② 孕婦。本研究已通過永州市中心醫院醫學倫理審查批準（2023053101）。本研究根據“每個組至少 30 個樣本”的經驗規則來確定樣本量。
1.2.2 觀察指標
通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantificational real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測 SCLC 組織樣本中 miR-140-3p 和泛素結合酶 E2C（ubiquitin-conjugating enzyme E2C, UBE2C）的表達水平分布情況，根據表達量的中位數確定高低分組，表達量低于中位數為低表達組，其余為高表達組。根據以往經驗，觀察兩組樣本的來源患者年齡、性別、SCLC 腫瘤直徑、TNM 分期、T 分期和 N 分期，分析 miR-140-3p 和 UBE2C 的表達水平與上述病理參數的相關性。
1.2.3 血清外泌體分離與鑒定
使用血清外泌體分離試劑（美國賽默飛），按照制造商的步驟分離健康志愿者和 SCLC 患者血清中的外泌體。將 0.2 mL 總外泌體分離試劑添加到 1 mL 血清樣品中，并在 4℃下孵育 30 min，后在室溫下以 10 000 g 離心 10 min，離心半徑 10 cm。將細胞培養基以 2 000 g 離心 30 min 去除細胞和碎片。使用透射電子電鏡（transmission electron microscope, TEM）檢測提取的外泌體，收集外泌體沉淀物用于 miRNA 提取。
1.3 細胞分析
1.3.1 細胞培養
采用正常人胚肺細胞系 MRC-5（BNCC353614）及SCLC細胞系 NCI-H69（BNCC359344）、NCI-H446（BNCC100065）、NCI-H1688（BNCC342559），以上細胞系均購自北納生物，均在含有 10%胎牛血清（美國海克隆）的 RPMI-1640 培養液（美國西格瑪）中培養，適當添加 100 U/mL 鏈霉素和 100 U/mL 青霉素（美國賽默飛）。所有細胞均培養在 37℃、5%二氧化碳（carbon dioxide, CO2）的恒溫培養箱中備用。
1.3.2 細胞轉染
miR-140-3p 模擬物（mimic）和 mimic NC（miR-140-3p 模擬物的陰性對照）、miR-140-3p 抑制劑（inhibitor）和 inhibitor NC（miR-140-3p 抑制劑的陰性對照）、過表達（overexpression, oe）‐NC（陰性對照）和 oe‐UBE2C 均購自吉瑪基因（中國上海）。均使用 Lipofectamine 2000（美國賽默飛）根據制造商的說明書對相應的 SCLC 細胞進行轉染。轉染 48 h 后，利用轉染細胞進行下一步實驗。
1.3.3 RNA 提取與 qRT-PCR
使用 TRIzol 試劑（美國賽默飛）從正常人胚肺細胞系和 SCLC 細胞系中提取總 RNA。用 NanoDrop 2000 系統（美國賽默飛）測定 RNA 濃度。使用 miScriptⅡRT kit（德國凱杰）將 miR-140-3p 反轉錄為 cDNA，miScript SYBR Green PCR Kit（德國凱杰）進行檢測，U6 作為內參；UBE2C mRNA 使用 PrimeScript RT Master Mix（日本寶日醫）合成 cDNA，SYBR? Premix Ex Taq TMⅡ（日本寶日醫）試劑盒進行檢測，糖酵解酶磷酸化脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）為內源性對照。在 7500 Fast 實時熒光定量合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）系統上行 qRT-PCR。結果用 2?ΔΔCt 值比較對照組和實驗組的目的基因相對表達量的差異，實驗重復 3 次。冷凍組織和外泌體的 qRT-PCR 檢測方法同上。qRT-PCR 引物序列見表1。
表1
qRT-PCR 引物序列
1.3.4 細胞外泌體的分離與鑒定
使用細胞培養基總外泌體分離試劑（美國賽默飛），按制造商步驟分離 SCLC 細胞系中的外泌體。細胞培養基以 2 000 g 離心 30 min 以去除細胞和碎片。將 1 mL 無細胞培養基轉移至新試管中，并添加 0.5 mL 總外泌體分離試劑。樣品 4℃下孵育過夜，隨后在 4℃下以 10 000 g 離心 1 h，離心半徑 10 cm。使用 TEM 來檢測所提取外泌體，收集外泌體沉淀物用于 miRNA 提取。
1.3.5 共焦顯微成像
24 μg 外泌體中加入適量親脂示蹤劑細胞膜綠色熒光探針（DiO）溶液（美國賽默飛），37 °C 條件下孵育 20 min。用 MW 3000 外泌體離心柱（美國賽默飛）去除過量的 DiO。用 Infinite? 200 PRO 熒光計（瑞士帝肯）分析外泌體標記效率。將 NCI-H1688 細胞接種在 8 孔腔室玻片上（1×104 或 4×104 細胞/孔），24 h 后將 DiO 標記的外泌體（8 μg）添加到受體細胞 NCI-H1688 的培養基中，并在 37 °C 下培養 3 h。用 4%多聚甲醛在室溫下固定 NCI-H1688 細胞 10 min，并在室溫下用 0.1% Triton X-100 孵育 5 min，隨后用 Alexa Fluor 555 鬼筆環肽（美國賽默飛）染色 30 min，再加入帶有 4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚（4’, 6-diamidino-2- phenylindole, DAPI）的 Prolong? Diamond Antifade 試劑（美國賽默飛），用熒光顯微鏡（美國賽默飛）觀察細胞。
1.3.6 雙熒光素酶實驗
分別構建插入野生型（WT）和突變型（MUT）UBE2C 的 pmirGLO 熒光素酶報告載體（美國普洛麥格）。293T 細胞（中國北納生物）在 24 孔板中培養，并將 miR mimic/mimic NC 和 UBE2C-WT/UBE2C-MUT 質粒共轉染到細胞中。48 h 后通過雙熒光素酶報告系統（美國普洛麥格）測定熒光素酶活性。實驗重復 3 次。
1.3.7 蛋白質免疫印跡法分析
用放射免疫沉淀法裂解緩沖液（中國上海碧云天）提取 NCI-H1688 細胞裂解產物，采用比色分析法蛋白質測定試劑盒（中國上海碧云天）測定蛋白濃度。高溫變性后，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠膠體電泳將蛋白質從樣品緩沖液中分離，轉移到聚偏二氟乙烯膜（美國密理博）中并用 5%牛血清白蛋白封閉 2 h，然后在 4℃下與一抗孵育過夜。隨后與二抗山羊抗兔免疫球蛋白 G 重鏈和輕鏈（H&L）（貨號 ab150077，稀釋比例 1∶2 000，英國艾博抗）在室溫下孵育 2 h。使用化學發光試劑盒（美國通用醫療）檢測蛋白質信號。實驗重復 3 次。一抗信息：UBE2C（貨號 ab252940，稀釋比例 1∶1 000）、GAPDH（貨號 ab181602，稀釋比例 1∶10 000）、E 型鈣黏附蛋白（貨號 ab40772，稀釋比例 1∶10 000）、N 型鈣黏附蛋白（貨號 ab76011，稀釋比例 1∶10 000）、波形蛋白（Vimentin）（貨號 ab92547，稀釋比例 1∶5 000）、溶酶體相關膜蛋白 3（CD63）（貨號 ab134045，稀釋比例 1∶1 000）、人腫瘤易感基因 101（TSG101）（貨號 ab125011，稀釋比例 1∶1 000）、β-肌動蛋白（β-actin）（貨號 ab213262，稀釋比例 1∶5 000）。所有一抗均為兔抗（英國艾博抗）。
1.3.8 細胞計數檢測試劑盒-8（cell counting kit-8, CCK-8）和克隆形成實驗
① CCK-8：將 NCI-H1688 和 NCI-H69 細胞以每孔 2×104 的密度接種在 96 孔板上，細胞培養在 37℃含 5%CO2 的條件下。培養 0、24、48、72 h 后，每孔加入 10 μL CCK-8 溶液（日本同仁），之后在 37℃含 5%CO2 的條件下培養 2 h。利用酶標儀（美國賽默飛）測量 450 nm 處的吸光值。實驗重復 3 次。
② 克隆形成：將細胞以每孔 1×103 個細胞接種在 6 孔板上，每個處理組設 3 個復孔。在完全培養基上培養 14 d 直到明顯的克隆形成。在室溫下將細胞克隆用 4%的多聚甲醛固定 15 min，0.5%結晶紫（美國賽默飛）染色 20 min。用無菌水清洗去除殘留的結晶紫。將細胞數超過 50 個的克隆定義為克隆，使用光學顯微鏡（加拿大 Quantitative Imaging）捕獲圖像，計算每孔的克隆數。實驗重復 3 次。
1.3.9 膜聯蛋白 V/碘化丙啶（annexin V / propidium iodide, AnnexinV/PI）雙染色檢測細胞凋亡
將 NCI-H1688 細胞和 NCI-H69 細胞培養至對數生長期后，用不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶處理，離心棄上層清液，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline, PBS）清洗 2 次，用 500 μL 預冷的 1×結合緩沖液重懸細胞，調整細胞濃度為 1×106 cells/mL。取 100 μL 細胞懸液，加入 5 μL 異硫氰酸熒光素標記的膜聯蛋白（中國江蘇凱基生物），室溫避光孵育 15 min，上機前 5min 加入 2.5 μL 碘化丙啶染色，流式細胞儀（美國賽默飛）檢測細胞凋亡情況。實驗重復 3 次。
1.3.10 劃痕愈合實驗
將 NCI-H1688 細胞或 NCI-H69 細胞接種在 6 孔板中，當細胞覆蓋達到 80%時使用 200 μL 移液管尖端輕輕刮擦穿過孔中心的單層。將孔用培養基短暫洗滌 2 次除去分離細胞。加入新鮮培養基，細胞再生長 24 h，顯微鏡上放大 40 倍觀察和拍照 0、24 h 的細胞遷移情況。實驗重復 3 次。
1.3.11 Transwell 侵襲實驗
將大約 1×104 個/孔 NCI-H1688 細胞或 NCI-H69 細胞加入 24 孔 Transwell 小室（美國碧迪醫療）上室中，頂部室用基質膠包被。將含有 10%胎牛血清（美國 Gibco）的 DMEM-H 條件培養液（美國西格瑪）填充到下室中。細胞侵襲實驗細胞在 37℃溫育 36 h 后，用 4%多聚甲醛固定并對膜下表面的細胞用 0.5%結晶紫染色，最后用濕潤棉簽涂敷器除去未通過膜的細胞。染色后用倒置顯微鏡放大 100 倍進行觀察、拍照。實驗重復 3 次。
1.4 動物實驗方法
1.4.1 裸鼠腫瘤異種移植
選擇 20 只雄性裸鼠。裸鼠購自北京重河實驗科技有限公司，鼠齡 4 周，在無菌條件下飼養（12 h 黑白光照周期，25℃，60%～70%濕度）。將裸鼠隨機分為 4 組，每組 5 只，選擇其中 2 組分別將由 NC mimic 或 miR-140-3p mimic 穩定轉染的 NCI-H1688 細胞注入裸鼠皮下，建立小鼠異種移植模型，剩下 2 組備用。腫瘤生長在 1 周后開始檢測。腫瘤體積測量方法：體積（mm3）=（長×寬 2）/2。6 周后裸鼠安樂死并測量腫瘤重量和對腫瘤進行拍照。研究已通過永州市中心醫院倫理委員會審查（批件號 2023071402）。
1.4.2 免疫組織化學（免疫組化）分析
石蠟包埋裸鼠腫瘤組織切片在二甲苯中脫蠟，用梯度乙醇處理。1%雙氧水在 PBS 中使內源性過氧化物酶失活 10 min 后，用 PBS 沖洗 3 次切片，5%脫脂乳/PBS 孵育 30 min，以減少非特異性結合。切片用抗 UBE2C 和 Ki-67 抗體孵育，5%脫脂牛奶/PBS 稀釋，4℃孵育 16 h。PBS 沖洗 2 次后，采用免疫組化檢測系統對組織切片進行檢測，倒置顯微鏡放大 400 倍觀察 UBE2C 和 Ki67 的陽性細胞率并拍照。所有切片均用蘇木精復染。用相同濃度的非免疫非免疫球蛋白G（貨號 ab150077，稀釋比例 1∶1000）代替一抗處理對照組（陰性對照），作陰性對照。抗體信息：UBE2C（貨號 ab252940，稀釋比例 1∶1000）、Ki67（貨號 ab15580，稀釋比例 1∶500），均為兔抗（英國艾博抗）。實驗重復 3 次。
1.5 統計學方法
采用 GraphPad Prism 8 軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差的形式表示，組間比較采用 t 檢驗。計數資料采用頻數表示，組間比較采用χ2 檢驗。采用 R 語言計算 miR-140-3p 和 UBE2C 的 Pearson 相關系數分析相關性。雙側檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 患者一般資料
共納入患者 45 例，其中 SCLC 組織和配對癌旁組織 45 對，術前血清標本 40 份；健康志愿者 30 人。患者的臨床病理資料見表2。可見miR-140-3p 表達水平與腫瘤直徑（χ2=5.140，P=0.021）、TNM 分期（χ2=5.021，P=0.038）、T 分期（χ2=6.412，P=0.009）、N 分期（χ2=6.537，P=0.007）有關；UBE2C 表達水平與 TNM 分期（χ2=13.926，P＜0.001）、T 分期（χ2=16.200，P=0.009）、N 分期（χ2=5.021，P=0.007）有關。
表2
SCLC 組織 miR-140-3p、UBE2C 表達水平與病理參數相關性分析（例）
2.2 miR-140-3p 在 SCLC 中的表達及主要來源
T-test 分析 GSE19945 數據集結果顯示，miR-140-3p 在SCLC組織中表達低于正常組織（1.17±0.78 vs. 3.55±0.63，P<0.001）。qRT-PCR 結果顯示，miR-140-3p 在 SCLC 組織中表達低于正常組織（0.71±0.36 vs. 1.17±0.53，P<0.001）。在 SCLC 細胞（NCI-H69、NCI-H446 和 NCI-H1688）中相對表達量也低于正常人胚肺細胞系 MRC-5（0.67±0.08 vs. 0.50±0.07 vs. 0.38±0.04 vs. 1.00±0.07）。通過 EVmiRNA 數據庫檢索發現 miR-140-3p 主要存在于血液外泌體中。蛋白質免疫印跡法檢測出外泌體表面標志物為 CD63、TSG101 及β-actin（圖1a），且通過 TEM 檢測外泌體大小和形態結果（圖1b）顯示其呈杯碟狀，且直徑小于 100 nm，可確保所分離到的是外泌體。qRT-PCR 結果顯示，SCLC 患者血液來源的外泌體中的 miR-140-3p 相對表達量較健康志愿者偏低（0.46±0.06 vs. 1.00±0.10，P<0.05）。
圖1
miR-140-3p 在 SCLC 中的表達及主要來源分析
a. 蛋白免疫印跡法檢測從健康志愿者和 SCLC 患者血液純化外泌體的表面標志物 CD63、TSG101 的表達條帶圖；b. TEM 檢測從健康志愿者和 SCLC 患者血液純化外泌體的形態。標尺=200 nm；exo：外泌體；TEM：透射電子電鏡；SCLC ：小細胞肺癌；TSG101：人腫瘤易感基因101；β-actin：β-肌動蛋白
2.3 血液外泌體能否遞送 miR-140-3p 至 SCLC 細胞分析
熒光共聚焦顯微鏡觀察外泌體（DiO 標記）孵育的 NCI-H1688 細胞，能清楚地觀察到綠色熒光（圖2），顯示 SCLC 細胞能有效吸收血液外泌體。qRT-PCR 結果顯示，從健康志愿者血液分離的 Normal 外泌體孵育的 SCLC 細胞中 miR-140-3p 的表達水平高于從 SCLC 患者血液分離的 SCLC 外泌體組及與未經處理的 NCI-H1688 組（3.13±0.26 vs.1.14±0.12 vs.1.00±0.09）。
圖2
熒光共聚焦顯微鏡觀察 NCI-H1688 細胞彩色像
綠色為外泌體，紅色為 NCI-H1688 細胞骨架，藍色為細胞核；白色長、短箭均指向DiO標記的外泌體所在位置；第4列圖為第3列圖中的白框處放大；標尺=50 μm；exo ：外泌體；Phalloidin：鬼筆環肽；DiO：細胞膜綠色熒光探針；DAPI：4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚；PBS：磷酸緩沖鹽溶液
2.4 miR-140-3p 對 SCLC 細胞的生物學功能影響
NCI-H1688 細胞分為 mimic NC 組（轉染 mimic NC）和 miR mimic 組（轉染 miR-140-3p mimic），NCI-H69 細胞分為 inhibitor NC 組（轉染 inhibitor NC）和 miR inhibitor 組（轉染 miR-140-3p inhibitor）。CCK-8 檢測得 miR mimic 組與 mimic NC 組相比，72 h 時細胞活力顯著降低（0.73±0.08 vs. 1.22±0.13，P<0.05），miR inhibitor 組與 inhibitor NC 組相比，72 h 時細胞活力顯著增高（1.74±0.12 vs. 1.13±0.09，P<0.05）。miR mimic 組細胞克隆數低于 mimic NC 組（47.33±2.52 vs. 107.67±10.69，P<0.05），miR inhibitor 組細胞克隆數高于 inhibitor NC 組（197.33±18.15 vs. 114.00±9.54，P<0.05）。miR mimic 組細胞劃痕愈合率低于 mimic NC 組［（11.63±2.62）% vs.（31.77±4.30）%，P<0.05］，miR inhibitor 組細胞劃痕愈合率高于 inhibitor NC 組［（49.23±5.75）% vs. （33.30±4.13）%，P<0.05］。miR mimic 組細胞侵襲數低于 mimic NC 組（44.33±3.06 vs. 102.67±8.50，P<0.05），miR inhibitor 組細胞侵襲數高于 inhibitor NC 組（159±12.17 vs. 97±7.94，P<0.05）。miR mimic 組細胞凋亡率高于 mimic NC 組［（14.48±1.20）% vs.（10.14±1.21）%，P<0.05］，miR inhibitor 組細胞凋亡率低于 inhibitor NC 組［（3.86±1.26）% vs.（11.40±1.09）%，P<0.05］。
2.5 miR-140-3p 的靶基因及對 EMT 過程的影響
miRTarBase、miRDB、mirDIP 和 miRSearch 數據庫預測 miR-140-3p 下游調控靶基因，取交集得到 5 個靶基因（ACVR2B、ATP6AP2、NFYA、SLC1A4、UBE2C）。在 GSE40275、GSE60052 數據集中驗證發現，相對于正常組織，UBE2C 在SCLC組織中高表達（圖3a、3b）。對臨床樣本進行 qRT-PCR 檢測，驗證 UBE2C 在 SCLC 組織中表達高于正常組織（P<0.05），且與 miR-140-3p 呈負相關（r2=0.1987，P=0.0022）。在 SCLC 細胞（NCI-H69、NCI-H446 和 NCI-H1688）中相對表達量也高于正常人胚肺細胞系 MRC-5（2.53±0.22 vs. 2.98±0.17 vs. 3.95±0.58 vs.1.00±0.12）。生物信息學預測分析 miR-140-3p 與 UBE2C 存在靶向結合位點，miR-140-3p 的一部分序列與 UBE2C 的 3’ UTR 中的特定區域互補配對，形成 miRNA-mRNA 雙鏈結構。
圖3
miR-140-3p 的靶基因及其對 EMT 過程影響分析
a. 預測靶基因分別在 GSE40275 數據集中的表達量；b. 預測靶基因分別在 GSE60052 數據集中的表達量；c. 蛋白質印跡法檢測各處理組 EMT 相關蛋白的表達條帶圖。EMT：上皮-間質轉化；UBE2C：泛素結合酶E2C；N-Cadherin：神經鈣黏素；Vimentin：波形蛋白；GAPGH：糖酵解酶磷酸化脫氫酶；mimic：模擬物；oe：過表達；NC：陰性對照；ns：無顯著差異；*
雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示相比于 mimic NC 組，過表達 miR-140-3p 抑制野生型 UBE2C 的表達（P<0.05），而對突變型 UBE2C 的表達沒有影響（P>0.05），說明 miR-140-3p 和 UBE2C 具有靶向結合的關系。miR-140-3p 過表達的細胞 UBE2C mRNA（0.49±0.05）和蛋白水平均低于陰性對照組（1.00±0.12）（P<0.05），且能逆轉過表達 UBE2C 對 UBE2C mRNA 和蛋白表達水平的促進作用（P<0.05）。miR-140-3p 過表達提高了上皮表型相關蛋白 E-Cadherin 的表達并下降了間質表型相關蛋白神經鈣黏素（N-Cadherin）和 Vimentin 的表達（P<0.05）；而同時過表達 miR-140-3p 和 UBE2C 逆轉了上述 EMT 相關蛋白的表達（P<0.05）。見圖3c。
2.6 miR-140-3p 靶向 UBE2C 對 SCLC 細胞生物學功能的影響
采用 CCK-8 法檢測各處理組的 NCI-H1688 細胞的增殖能力。單獨過表達 miR-140-3p 的 SCLC 細胞的活力（72 h 時：0.86±0.11 vs. 1.35±0.13，P<0.05）、細胞克隆數（41.33±4.19 vs. 101.33±9.10，P<0.05）、劃痕愈合率［（14.01±2.01）% vs.（38.51±4.19）%，P<0.05］、細胞侵襲數（48.33±4.16 vs. 99.33±9.07，P<0.05）均低于對照組，凋亡率［（13.89±0.15）% vs.（10.12±1.13）%，P<0.05］高于對照組。而單獨過表達 UBE2C 得到了相反的結果，單獨過表達 UBE2C 后 SCLC 細胞的活力（72 h 時：2.16±0.22vs. 1.35±0.13，P<0.05）、克隆數（198.33±11.67 vs. 101.33±9.10，P<0.05）、劃痕愈合率［（60.68±5.80）%vs.（38.51±4.19）%，P<0.05］、細胞侵襲數（160.67±13.61 vs. 99.33±9.07，P<0.05）均高于對照組，凋亡率低于對照組［（6.22±0.30）% vs.（10.12±1.13）%，P<0.05］；同時過表達 miR-140-3p 和 UBE2C 時，SCLC 細胞的生物學功能變化均得到明顯恢復（P<0.05）。
2.7 體內驗證 miR-140-3p 對 SCLC 腫瘤生長的影響
通過建立小鼠異種模型，進行體內實驗顯示，與 NC mimic 組相比，miR-140-3p mimic 抑制了腫瘤的生長，miR-140-3p mimic 組腫瘤重量低于 NC mimic 組［（0.58±0.36）vs.（1.58±0.27）g，P<0.05］。前 4 周兩組小鼠的腫瘤體積無顯著差異，在第 5 周［（456.51±88.11）vs.（142.77±60.71）mm3，P<0.05］和第 6 周［（604.57±141.03）vs.（231.34±103.06）mm3，P<0.05］時，miR-140-3p mimic 組腫瘤體積顯著小于 NC mimic 組。在腫瘤組織中，miR-140-3p 過表達組的 miR-140-3p 表達水平高于 NC mimic 組（12.33±2.68 vs. 1.00±0.08，P<0.05），miR-140-3p 過表達組 UBE2C 較 NC mimic 組下調（0.38±0.06 vs. 1.00±0.20，P<0.05）。與 NC mimic 組相比，過表達 miR-140-3p 抑制了 UBE2C 蛋白以及 N-Cadherin、Vimentin 表達，上調了 E-Cadherin 的表達（P<0.05）。免疫組化實驗結果顯示過表達 miR-140-3p 組裸鼠腫瘤組織中 UBE2C［（23.65±3.49）% vs.（63.76±4.81）%，P<0.05］和 Ki67 陽性細胞率［（21.47±2.37）% vs.（54.28%±4.19）%，P<0.05］均低于 NC mimic 組。
3 討論
研究表明外泌體能攜帶信息分子作為細胞間的通訊橋梁[8]。其中外泌體攜帶的 miRNA 可調節受體細胞的各種生物學功能，如缺氧性腫瘤外泌體來源的 miR-301a 通過 PTEN/PI3Kγ介導 M2 巨噬細胞極化，促進胰腺癌轉移[9]。但外泌體 miRNA 在 SCLC 發生發展中的分子作用機制還未被充分了解。
本研究通過對 SCLC 臨床樣本進行分析，得出 SCLC 惡性進展與 miR-140-3p 和 UBE2C 的表達量相關。生物信息學分析得 miR-140-3p 主要來源于人血液外泌體中。qRT-PCR 實驗表明，與正常外泌體相比，SCLC 外泌體中 miR-140-3p 表達水平較低。miR-140-3p 作為一個分子標志物，在一系列惡性腫瘤疾病中被視為抑癌 miRNA。如 miR-140-3p 在結直腸癌中通過靶向 PD-L1 使 PI3K/AKT 通路失活，從而抑制癌細胞的生長并誘導其凋亡[6]；在子宮肌瘤細胞中，通過下調 ANK2 的表達來抑制癌細胞生長和侵襲[10]。這表明 miR-140-3p 可能是一種極具潛力的診斷和治療的新靶點，但還沒有研究明確 miR-140-3p 在 SCLC 的表達情況及作用。共聚焦顯微成像表明受體 SCLC 細胞能攝取血液外泌體。隨后在 SCLC 細胞中對 miR-140-3p 進行了過表達和抑制處理，結果和預期一致，miR-140-3p 能抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。
本研究發現，miR-140-3p 與 UBE2C 存在結合位點，隨后通過雙熒光素酶報告實驗驗證其靶向結合關系。UBE2C 屬于 E2 基因家族，編碼與泛素依賴性蛋白水解相關的一個 19 kDa 蛋白，UBE2C 過表達會導致染色體錯誤分離及細胞周期圖譜的改變，從而促進細胞惡性增殖并抑制細胞凋亡[11]。UBE2C 在包括轉移性前列腺癌、直腸癌、食管鱗癌等各類型的癌癥中異常高表達[12-14]，在腫瘤的發生和發展中發揮重要作用；另有研究報道 UBE2C 可誘導 EMT 過程[15]。本研究結果與以上研究結論相似。UBE2C 表達水平與 SCLC 進展呈正相關，其在 SCLC 患者中的異常高表達促進了 EMT 過程，降低了 SCLC 細胞凋亡率，對于 SCLC 細胞的增殖、遷移和侵襲非常重要。且對 SCLC 細胞進行過表達 UBE2C 處理后，可抑制 miR-140-3p 過表達對 SCLC 細胞的影響，證實 miR-140-3p 通過直接靶向 UBE2C 抑制 SCLC 細胞增殖、遷移、侵襲和 EMT 過程并促進其凋亡。最后，本研究采用裸鼠進行體內實驗進一步驗證了 miR-140-3p 對 SCLC 的抑癌作用。
綜上，血液外泌體攜帶的 miR-140-3p 通過靶向 UBE2C 抑制 SCLC 細胞增殖、遷移、侵襲和 EMT 過程并促進其凋亡，可為 SCLC 早期診斷及治療方法提供新思路，并為其預后監測提供新方向。然而，目前 SCLC 外泌體中 miR-140-3p 下調的機制、UBE2C 促進癌細胞生長的細胞通路及血液外泌體供體細胞仍不清楚，還有待對其上下游信號進一步研究。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
