椎間盤退變是一個多因素參與的病理過程，是全球導致殘疾的主要原因之一。椎間盤退變相關病理改變的主要特征是細胞外基質降解、細胞凋亡、自噬和衰老以及炎癥等。微 RNA 的失調與各種病理有關，包括椎間盤退變等各種退行性疾病。該文綜述了微 RNA 在退變椎間盤病理中的研究現狀，重點介紹了微 RNA 在細胞外基質降解、細胞凋亡和炎癥以及軟骨終板中的生物學機制和其潛在的治療前景。
引用本文： 王玨翰, 朱策, 黃勇, 丁鴻, 吳銳邦, 黃雷震, 陳騫, 豐干鈞, 劉立岷, 宋躍明. 微 RNA 在椎間盤退變中的研究進展. 華西醫學, 2022, 37(10): 1554-1564. doi: 10.7507/1002-0179.202207140 復制
椎間盤是位于脊柱椎體間的異質性纖維軟骨組織，其中心區域是髓核，側面被周圍纖維環包圍，上下兩面均是軟骨終板，此結構賦予了脊柱運動和彎曲能力[1]。但椎間盤屬于體內最大的無血管結構，神經末梢也只達纖維環外圍[2]。這些結構特征使得椎間盤很容易發生退變[3]。椎間盤退行性疾病，簡稱椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IDD），是一種導致椎間盤的形態和生理功能發生重大變化，最終導致其承壓和扭轉負荷的能力下降的疾病[4]。IDD 使椎間盤的減震緩沖能力減弱，增加了纖維環壁破裂的機會，使髓核外滲和神經結構受壓，是大多數脊柱肌肉骨骼疾病（包括椎管狹窄、結構不穩定、椎間盤突出、神經根病和脊髓病）的病理基礎[5]。IDD 發病機制復雜，目前學界認為是環境和遺傳因素的相互作用。其中環境因素，如機械負荷、體力活動和吸煙，所起作用相對較小[6-9]。而基因遺傳被認為是 IDD 的主要危險因素，導致了 70% 以上的 IDD 的發生[10]。在 IDD 發生發展過程中，椎間盤細胞的凋亡異常增加，異常聚集，細胞外基質蛋白（異常合成和/或降解）失調，炎癥因子過度表達，加速炎癥微環境的形成，進一步影響周圍椎間盤細胞[7, 11-13]。加強對這種相互作用背后的分子機制的理解，有助于確定 IDD 的新治療靶點。微 RNA（microRNA，miRNA）是一種單鏈非編碼 RNA，長度約為 22 個核苷酸，研究表明其可調節體內許多基因的表達[14]。據報道，miRNA 只占人類基因組的 1%～3%，但其可調控約 33.3% 的蛋白質編碼基因[15-16]。一個確定的 miRNA 可調節許多不同的下游靶基因，而一個確定的靶基因也可受多個 miRNA 控制[17]。失調的 miRNA 在許多疾病的發生發展中起關鍵作用，包括各種癌癥、多種退行性疾病、心腦血管疾病和其他慢性病[18-19]。近來，越來越多的研究揭示了 miRNA 在防治 IDD 中的作用，其中包括髓核細胞增殖、髓核細胞凋亡、細胞外基質降解和炎癥等方面[20]。本文將基于以上幾個方面對近期 miRNA 與 IDD 的研究進展進行綜述。
1 miRNA 在 IDD 中的表達譜
2011 年，研究者對 IDD 中 miRNA 表達譜進行了首次分析，結果提示相較于脊柱側凸患者的正常髓核組織，IDD 患者有 29 個差異表達的 miRNA，其中 6 個上調，23 個下調[21]。此后 10 年，多項研究如雨后春筍涌現，繼續證實 IDD 患者的 miRNA 表達譜異于對照組。Zhao 等[22]在 2014 年比較了 IDD 和脊髓損傷患者的 miRNA 表達譜，發現在 IDD 組有 26 個 miRNA 下調，另有 25 個上調。進一步研究表明，這些異常表達的 miRNA 參與調控包括 Wnt、磷酸肌醇 3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）在內的多種信號通路[22-26]。這些信號通路被證實在 IDD 的發病機制中起著關鍵作用。另外，互補堿基序列賦予了 miRNA 結合靶基因 3’ 端非翻譯區的能力，使 miRNA 可通過結合 mRNA 導致一些與退變高度相關的關鍵靶蛋白表達減少，從而間接控制 IDD 的病理過程[27-29]。隨著對非編碼 RNA 研究的進一步深化以及生物信息學分析手段和生物信息學數據庫的日趨完善，近年來研究者們針對椎間盤組織構建了更加成熟的非編碼 RNA 與下游分子的互作網絡，以期完整地展示椎間盤中 miRNA 的表達譜。有研究通過 Gene Expression Omnibus 數據集獲得椎間盤中 miRNA 的相關數據，通過預測數據庫（ENCORI、TargetScan、miRecords、miRmap 和 circBank），構建了一個與 IDD 相關的潛在環狀 RNA-miRNA-mRNA 網絡，通過維恩分析，研究者鑒定預測出 miR-423-5p 和 miR-185-5p 為基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2 的上游分子[30]。另有研究通過選擇新的高通量測序手段，從 IDD 的樣本和脊髓損傷樣本（對照組）中隨機抽取 3 個樣本進行非編碼 RNA 測序，結果在 IDD 中發現了 463 個差異表達的長非編碼 RNA（long noncoding RNA，lncRNA）、47 個差異表達的 miRNA 和 1334 個差異表達的 mRNA；研究者同樣構建了一個競爭性內源性 RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）網絡，并鑒定了 lncRNA XIST-hsa-miR-4775-PLA2G7 和 lncRNA XIST-hsa-miR-424-5p-AMOT/TGFBR3 ceRNA 軸；利用實時熒光定量聚合酶鏈反應對 15 個 IDD 樣本和 15 個對照組樣本進行上述分子信號軸中差異表達基因的驗證，結果發現樣本中相關的 hsa-miR-4775 與 hsa-miR-424-5p 確實發生了差異性表達；另外該研究通過基因本體富集分析表明，miRNA 與椎間盤中多個生物學過程相關，包括細胞外基質組織、細胞外結構組織、白細胞遷移和間充質發育[31]。這些 miRNA 表達譜都闡釋了某些特定的 miRNA 及其上下游分子信號通路可能在 IDD 的發展過程中至關重要，并可能作為 IDD 的替代診斷生物標志物和新的治療策略。
2 miRNA 在椎間盤細胞凋亡中的作用
凋亡，又稱Ⅰ型程序性細胞死亡，其特征是染色體濃縮、細胞收縮、DNA 降解和凋亡小體形成。凋亡不僅存在于各種生理過程中，而且涉及許多病理性退行性疾病，如骨關節炎、神經退行性疾病和 IDD。髓核細胞通過合成細胞外基質成分以維持機械負荷下的椎間盤結構穩定性。有證據表明，IDD 的一個典型特征是髓核細胞減少和細胞外基質過度降解[32]。研究表明，miRNA 對髓核細胞的凋亡和細胞外基質降解，既有積極作用，也有消極作用，如在 IDD 中 miR-21、miR-499a-5p、miR-486-5p、miR-125a、miR-145 和 miR-573 表達降低，發揮凋亡抑制劑作用[33-38]，而與之相反，miR-27a、miR-494、miR-30d、miR-222-3p、miR-15a、miR-143、miR-532、miR-138-5p 在 IDD 中高表達，促進凋亡發生[39-47]。miR-129-5p 是一種傳統理解上的腫瘤抑制因子，IDD 患者中 miR-129-5p 下調，而人為上調 miR-129-5p 可以通過抑制髓核細胞凋亡和促進細胞外基質合成來保護椎間盤免于發生退變[48-49]。miRNA 譜發現 miR-573 在 IDD 組織中顯著下調，增加 miR-573 的表達可通過靶向抑制 Bax 來阻止髓核細胞凋亡，延緩 IDD 進程[38]。另外，與健康人髓核細胞相比，miR-499a-5p 在 IDD 患者的髓核細胞中顯著下調，過表達 miR-499a-5p 可通過靶向 SOX4 來抑制髓核細胞凋亡并防止細胞外基質降解[34]。相反，一些 miRNA 可促進髓核細胞凋亡及細胞外基質降解，加速 IDD 進展。研究顯示，miR-24-3p 水平與 IDD 程度呈正相關，過表達 miR-24-3p 通過靶向胰島素樣生長因子結合蛋白 5（insulin-like growth factor binding protein 5，IGFBP5）/細胞外信號調節激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信號通路顯著誘導髓核細胞凋亡[50]。miR-222 亦可通過靶向 TIMP3 基因在變性中起促進炎癥和凋亡的作用，而敲除 miR-222、沉默 TIMP3 則可有效逆轉其在退變變性進程中的作用[51]。最近的研究發現，miR-143-5p 在 IDD 中過表達，miR-143-5p 可通過信號通路靶向 eEF2 基因，促進細胞凋亡，抑制髓核細胞增殖[52]。另有研究表明，miR-30d 與調節細胞凋亡、維持椎間盤穩態有關[53]。更加深入的研究表明，miR-30d 通過靶向 SOX9 促進髓核細胞凋亡和細胞外基質降解，SOX9 的沉默可明顯逆轉 miR-30d 的作用[42]。還有許多其他 miRNA 在調節髓核細胞凋亡和細胞外基質降解中起著至關重要的作用。這些研究為髓核細胞凋亡和細胞外基質降解提供了分子機制層面的解釋。除了在髓核細胞中，另有研究發現 miR-106a-5p 在纖維環細胞中，miR-34a 和 miR-221 在軟骨終板中也發揮了凋亡調控作用[12, 54-55]。
上述既往研究都提示了 miRNA 在椎間盤中與細胞凋亡的聯系，一些學者便利用這些 miRNA 信號通路設計了一些能夠抑制椎間盤細胞凋亡的生物材料，以期在一定程度上緩解 IDD。研究者建立了 IDD 小鼠模型和細胞模型，并證明在體外和體內 IDD 過程中發生了 NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白 3 介導的細胞壞死、凋亡和炎癥反應；然后，分離純化富血小板血漿來源的外泌體（platelet-rich plasma-derived exosome，PRP-exo），發現 PRP-exo 可以抑制髓核細胞的凋亡；進一步的結果表明，PRP-exo 通過調節 kelch 樣 ECH 關聯蛋白 1（kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）-核因子 E2 相關因子 2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）通路對過氧化氫處理的髓核細胞發揮保護作用，研究者從機制上探討了 PRP-exo 通過下調 Keap1，從而導致 Keap1-Nrf2 復合物釋放 Nrf2，Nrf2 進一步從細胞質轉到細胞核，實現其抗氧化凋亡的生物功能，此外，miR-141-3p 在 PRP-exo 中富集，靶向 Keap1 mRNA 的 3’ 非翻譯區進行降解，導致 Nrf2 易位，此外，過表達 miR-141-3p 可以改善過氧化氫對髓核細胞的細胞毒作用，上調 Keap1、沉默 Nrf2 可以消除過氧化氫對髓核細胞的細胞毒作用，研究證實了 PRP-exo miR-141-3p 激活 Keap1-Nrf2 通路，減緩過氧化介導的細胞凋亡，減緩 IDD[56]。以間充質干細胞為基礎的治療方法在 IDD 的治療中同樣顯示出了一定的效果。有研究者通過差速離心分離出間充質干細胞來源的外泌體并鑒定其特征，發現了間充質干細胞來源的外泌體中 miR-410 是凋亡的關鍵調控因子的證據[57]。表1 對上述參與椎間盤細胞凋亡的 miRNA 進行了總結。
表1
參與椎間盤細胞凋亡的 miRNA
3 miRNA 在椎間盤細胞自噬中的作用
自噬是一種廣泛存在于真核細胞中的生理活動，對維持細胞穩態以應對缺氧、毒性、饑餓和其他應激刺激至關重要[58]。越來越多證據表明，自噬參與了多種生理和病理生理過程，包括 IDD。Gruber 等[59]研究表明，自噬相關基因在退變椎間盤中的表達高于正常椎間盤。細胞中自噬反應的適當激活可增強髓核細胞抵抗壓力負荷能力，而自噬功能障礙會促進髓核細胞死亡。椎間盤中髓核組織通過軟骨終板的滲透來完成營養的吸收，然而終板的營養物質擴散能力可因老化或吸煙等其他原因引起的軟骨下骨骨化而顯著降低。在營養缺乏條件下，人髓核細胞的數量減少并表現出自噬增加[60]。
近 10 年來，miRNA 介導的自噬在 IDD 中的作用引起了廣泛關注。這類 miRNA 可通過直接靶向自噬相關蛋白 7（autophagy related protein 7，ATG7）和信號通路來調節髓核細胞自噬的不同過程[61]。miR-210 的表達與 IDD 程度呈正相關，過表達 miR-210 通過 ATG7，抑制退變髓核細胞中的自噬[62]。Wang 等[63]發現，miR-21 在人類退變性髓核細胞中可減少自噬體形成、自噬標志物微管相關蛋白 1A/1B-輕鏈 3-Ⅱ/Ⅰ比率，通過升高參與自噬調控的如磷酸酶和張力蛋白同源蛋白（phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten，PTEN）/AKT/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路活性從而抑制自噬及細胞外基質降解。此外，Lin 等[64]進一步驗證了過表達 miR-21 增加了白細胞介素（interleukin，IL）-6 的炎癥反應并降低了細胞自噬的能力。另有研究顯示，miR-129-5p 通過靶向 Beclin-1 抑制髓核細胞自噬，而 miR-129-5p 的表達受甲基化過程調節，這表明靶向 miR-129-5p 甲基化的治療可能是潛在的 IDD 有效治療方案[65]。半乳糖凝集素-3 是 Wnt/β-catenin 信號通路的關鍵調節因子。據報道，miR-185 的表達增加可通過促使 Wnt/β-catenin 信號通路失活從而促進大鼠 IDD 中髓核細胞的存活并抑制自噬[66]。近期另有研究發現，miR-155-3p 在缺氧誘導因子 1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF1α）/組蛋白賴氨酸去甲基化酶 3A（lysine specific demethylase 3A，KDM3A）軸的參與下對 IDD 髓核細胞自噬有積極影響[67]。該研究收集腰椎間盤突出癥患者的 IDD 髓核組織和外傷性腰椎骨折患者的外傷性椎間盤髓核組織，檢測髓核組織自噬標志物蛋白，將 miR-155-3p mimic 或 KDM3A-小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）轉染入 IDD 髓核細胞，探討其在細胞自噬中的作用，結果發現：IDD 髓核組織和細胞中 miR-155-3p 降低，HIF1α 和 KDM3A 升高，miR-155-3p 升高或 KDM3A 沉默可促進 IDD 髓核細胞的增殖和自噬；此外，在 IDD 髓核細胞中，升高的 miR-155-3p 降低了 KDM3A 和 HIF1α 的表達，而沉默的 KDM3A 降低了 HIF1α 的表達，研究認為上調 miR-155-3p 或沉默 KDM3A 可通過抑制 HIF1α 促進 IDD 髓核細胞自噬、抑制凋亡，可能亦是治療 IDD 的一個新的分子靶點[67]。另一項研究從 IDD 患者的椎間盤中分離出髓核細胞，通過單丹黃顯尸胺染色顯示細胞自噬，蛋白質印跡法檢測髓核細胞中細胞外基質相關蛋白的表達并采用熒光素酶報告酶和 RNA 免疫沉淀法鑒定 RNA 之間的結合，研究結果表明：miR-654-5p 在 IDD 患者的退變髓核組織中顯著上調，miR-654-5p 的高表達與 IDD 程度呈正相關；下游的功能分析表明，miR-654-5p 通過提高 MMP-3、MMP-9 和 MMP-13 的表達水平，以及通過抑制自噬降低膠原Ⅰ、膠原Ⅱ、SOX9 和聚集蛋白的表達，促進了細胞外基質降解[68]。該研究還顯示，ATG7 為 miR-654-5p 的直接下游靶基因，miR-654-5p 可與 ATG7 的 3’ 非編碼區結合，抑制下游 mRNA 表達，進一步降低其翻譯，敲除 ATG7 可消除 miR-654-5p 抑制劑對細胞外基質降解和自噬調節的影響；此外，miR-654-5p 以 ATG7 依賴的方式增加磷酸化 PI3K、磷酸化 Akt 和磷酸化 mTOR 的蛋白表達水平，從而抑制髓核細胞自噬，該結果揭示了 miR-654-5p 可能通過靶向 ATG7 激活 PI3K/AKT/mTOR 信號通路抑制自噬，從而增強細胞外基質降解[68]。這些發現可能從細胞自噬的層面為 IDD 的治療提供新的見解。表2 對上述參與椎間盤細胞自噬的 miRNA 進行了總結。
表2
參與椎間盤細胞自噬的 miRNA
4 miRNA 在椎間盤細胞增殖中的作用
健康人椎間盤中的細胞數量稀少并且分布稀疏。然而，當椎間盤發生退變時，細胞異常增殖成簇[69]。在這一復雜的病理生理過程中，多種 miRNA 可作為椎間盤細胞增殖的重要間接調節因子，異常表達的 miRNA 譜可視為 IDD 生物標志物。例如，在髓核細胞中，miR-21 的異常過表達通過下調程序性細胞死亡因子 4（programmed cell death 4，PDCD4）和 PTEN 增加了退變髓核細胞的增殖水平[70]。相反，Liu 等[71]發現敲除 miR-21 可逆轉細胞增殖，而 Akt 抑制劑 Ly294002 可逆轉 miR-21 誘導的效應。這些結果表明 miR-21 是 IDD 的潛在生物標志物和治療靶點。此外，miR-10b、miR-96、miR-184、miR-2355-5p 和 miR-665 的過表達還可通過靶向 HOXD10、ARID2、GAS1、ERFFI1 和 GDF5 促進退變的髓核細胞增殖[72-76]，上調 miR-222-3p、miR-15a 和 miR-125b-1-3p 也可調節髓核細胞增殖[43-44, 77]。除了髓核細胞，纖維環細胞中的 miR-106a-5p 和軟骨終板細胞中的 miR-365 也可影響 IDD 進程中的細胞增殖，分別通過 ATG7 抑制增殖水平，通過 HDAC4 促進增殖[54, 78]。另有研究發現，miR-25-3p 在大鼠退行性髓核細胞中表達下調，與細胞死亡相關的 Bcl-2 相互作用介質（BCL-2 interacting mediator of cell death，Bim）是 miR-25-3p 的直接靶標，該研究將 miR?25?3p 抑制劑、miR?25?3p 抑制劑陰性對照、miR?25?3p 抑制劑+對照 siRNA 和 miR?25?3p 抑制劑+Bim?siRNA 轉染髓核細胞 48 h 后，分析細胞增殖和凋亡情況，結果表明 miR-25-3p 抑制劑可降低髓核細胞增殖，誘導細胞凋亡，Bim-siRNA 可逆轉上述作用；此外，研究進一步將 10 ng/mL IL-1β 加入髓核細胞培養 24 h，建立 IDD 體外細胞模型，實驗結果表明，IL-1β 降低了髓核細胞增殖，增加了細胞凋亡，而 miR-25-3p 模擬物阻止了這一現象，miR-25-3p 可通過上調 Bim 從而促進細胞增殖減輕 IL-1β 處理對髓核細胞的影響[79]。此外，有研究通過 miRNA 微陣列測序分析了 IDD 與正常組織中差異化表達的 miRNA，發現 miR-31-5p 在兩組中顯著性差異化表達；然后，通過實時熒光定量聚合酶鏈反應評估了各組中 miR-31-5p 的水平，通過熒光素酶實驗評估了 miR-31-5p 與基質細胞衍生因子 1（stromal cell derived factor 1，SDF-1）/CXC 趨化因子受體 7 軸之間的關聯，發現 miR-31-5p 過表達可以促進髓核細胞增殖，抑制凋亡，促進細胞外基質形成，抑制髓核細胞基質降解酶水平[80]。表3 對上述參與椎間盤細胞增殖的 miRNA 進行了總結。
表3
參與椎間盤細胞增殖的 miRNA
5 miRNA 在細胞外基質合成/降解中的作用
細胞外基質是椎間盤細胞生存的微環境，對于細胞外基質而言，2 個主要成分對其完整性至關重要，其一為提供抗張強度的Ⅰ型和Ⅱ型膠原網絡，其二為可與水結合的蛋白多糖，如蛋白聚糖[81]。然而，髓核細胞代謝失調將導致它們合成這些細胞外基質成分的能力降低，而分泌細胞外基質降解分子［例如 MMP 和血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS）］的能力增加[82-84]。因此，髓核細胞調節失調和蛋白多糖分解會導致組織的水結合能力減弱，椎間盤內機械力學性能下降，致使纖維環撕裂、終板鈣化和骨贅形成。最終級聯放大的病理反應導致其結構崩潰，造成 IDD。雖然退變過程最早出現在髓核，但隨著退變的進一步加重，退變區域會逐漸擴大到纖維環，2 個組織之間的邊界會變得模糊[85]。髓核細胞丟失進一步促進了細胞外基質降解，從而造成一種級聯放大的病理反應過程。
miRNA 對膠原網絡和蛋白聚糖等結構蛋白表達的影響主要通過 2 條途徑發生：一條是通過靶向直接參與細胞外基質降解的酶（如 MMP[86-89]），目前已有研究在患者退變椎間盤組織中分離的退行性髓核細胞中觀察到 miR-93 下調以及 MMP-3 水平升高，并證實 miR-93 可靶向調節 MMP-3，導致Ⅱ型膠原降解[86]；另一條是通過靶向細胞外基質代謝信號轉導酶（PTEN）/信號轉導與轉錄激活因子 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號通路或生長分化因子 5（growth differentiation factor 5，GDF5）途徑[71, 90-92]。miR-98 可能通過影響 IL-6/STAT3 信號通路從而影響 IDD，研究發現，在 IDD 組織中 miR-98 表達水平的下調導致了髓核組織中 IL-6 水平升高，此外，抑制 miR-98 表達可增加 STAT3、磷酸化 STAT3 和 MMP-2 蛋白的表達水平從而激活 STAT3 信號通路，促進 IDD[90]。目前，GDF5 已經被證實參與了細胞外基質合成代謝[93]。GDF5 基因多態性與退行性疾病（如骨關節炎）的易感性有顯著關聯[94]。在 IDD 中，GDF5 的表達主要受 2 個 miRNA（miR-7 和 miR-132）的負向調控[91-92]。miR-132 通過直接靶向 GDF5 從而促進細胞外基質降解，并通 MAPK/ERK 途徑增加 MMP-13 和 ADAMTS4 的表達。體內實驗表明，抑制 miR-132 的表達可以減弱細胞外基質的降解[91]。在大鼠 IDD 模型和 IL-1β 刺激下的髓核細胞中，研究者們發現了 miR-7 靶向 GDF5 的作用，該結果表明，miR-7 的過表達促進了細胞外基質的降解，而抑制 miR-7 則降低了這一作用[92]。另有實驗表明，miR-494 在退變椎間盤組織中的表達水平顯著上調且可直接靶向 SOX9 基因，過表達 miR-494 可導致細胞外基質降解酶如 MMP-3、MMP-13 和 ADAMTS5 的基因表達和蛋白水平增加；同時，抑制 miR-494 可以使Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的表達增加[40-41]。近期研究闡明了 miR-140-3p 在穿刺誘導的 IDD 模型中的再生作用，作者通過生物信息學分析，確定 IDD 中與 miR-140-3p 相關的調控因子［Kruppel 樣因子 5（Kruppel-like factor 5，KLF5）/N-鈣黏著蛋白（N-cadherin）/鼠雙微基因 2（murine double minute 2，MDM2）/Slug 鋅指蛋白（Slug zinc finger protein，Slug）］，從 IDD 標本的髓核中提取間充質干細胞，分析 miR-140-3p 對其凋亡和分化的影響，結果顯示，miR-140-3p 在退化髓核組織中低表達，而將其過表達能一定程度緩解 IDD；對下游分子機制的研究提示，miR-140-3p 靶向 KLF5 表達，而 KLF5 高表達會阻礙間充質干細胞的遷移和分化；在退變椎間盤來源的間充質干細胞中，miR-140-3p 介導 KLF5 下調同時升高 N-cadherin 的表達，并轉錄抑制 MDM2，從而上調 Slug 的表達[95]。在祖國傳統醫學領域，也有關于 miRNA 對椎間盤細胞外基質影響的研究。補腎活血方是一種由 6 種中草藥組成的中藥方劑，被廣泛用于治療 IDD。有研究者通過 DIANA 在線工具和熒光素酶報告基因檢測證實，miR-483-3p 和 miR-23c 分別通過直接靶向調控 CTNNB1 和 GSK3B，從而通過 Wnt 信號通路影響補腎活血方對髓核細胞增殖和細胞外基質合成的作用[96]。表4 對上述參與椎間盤細胞外基質合成/降解的 miRNA 進行了總結。
表4
參與椎間盤細胞外基質合成/降解的 miRNA
6 miRNA 在 IDD 炎癥反應中的作用
一直以來，炎癥都被認為與椎間盤的老化有關。然而最近的研究表明，炎癥與 IDD 緊密相關[97]。一方面，炎性細胞因子通過激活細胞外基質降解蛋白和抑制細胞外基質結構分子來促進退變過程；另一方面，隨著炎癥反應的進展，來自背根神經節的免疫細胞和痛覺神經纖維滲入受損的椎間盤組織，釋放神經營養素，痛覺神經纖維產生痛覺。此外，這些細胞因子還對椎間盤細胞衰老和凋亡產生一定的影響[97-100]。miRNA 與炎癥之間聯系密切，其既是細胞炎癥微環境的一部分，又可導致細胞因子失調而促成炎癥[101]。
研究發現 miR-640 在退變椎間盤組織和細胞中表達水平上調，研究者通過添加腫瘤壞死因子-α 和 IL-1β 刺激細胞后，發現 miR-640 表達量隨核因子 κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路顯著增加[102]。Shen 等[103]的研究揭示了髓核細胞在接受脂多糖刺激后，NF-κB 信號通路通過 Toll 樣受體 4 誘導 miR-625-5p 表達，同時通過雙熒光素酶報告試驗揭示了 miR-625-5p 下游靶點為細胞外基質結構蛋白Ⅰ型膠原。另有 2 項研究發現 miR-194 在椎間盤炎癥環境中的表達水平有所下調，并提供了 miR-194 參與炎癥反應的證據：這種下調與清選蛋白 4A（cullin 4A，CUL4A）和清選蛋白 4B（cullin 4B，CUL4B）兩種蛋白的過表達有關；相反，在退變的椎間盤組織中 CUL4A 和 CUL4B 的含量增加程度，與退變的程度呈正相關[104-105]。此外，研究表明 miR-194 下游靶向腫瘤壞死因子受體相關因子 6，將 miR-194 轉染至受脂多糖處理后的大鼠髓核細胞中可以有效減少炎性細胞因子的表達[104]。另有研究發現抑制 miR-203-3p 的表達可通過上調雌激素受體 α 防止脂多糖誘導的炎癥和 IDD 的退變，而沉默雌激素受體 α 逆轉了這種保護作用[106]。近期研究檢測了 miR-200c-3p 在 IDD 患者椎間盤組織中的表達水平，采用脂多糖處理髓核細胞構建 IDD 細胞模型，利用熒光素酶活性、聚合酶鏈反應和蛋白質印跡法分別測定相關下游 RNA 和蛋白表達水平，結果顯示 IDD 患者椎間盤組織中 miR-200c-3p 的表達水平低于正常受試者，脂多糖處理降低了 miR-200c-3p 在髓核細胞中的表達水平；研究還發現，miR-200c-3p 可通過靶向 RAP2C/ERK 從而抑制 IDD 中細胞炎癥因子水平，從而減緩 IDD 的進程[107]。表5 對上述參與椎間盤細胞炎癥反應的 miRNA 進行了總結。
表5
參與椎間盤細胞炎癥反應的 miRNA
7 miRNA 在調節軟骨終板退化中的作用
椎間盤是體內最大的無血管器官，營養供給主要依靠軟骨終板的擴散功能。鈣化是 IDD 的典型標志，它降低了營養物質的輸送，破壞了椎間盤代謝物交換的平衡，最終導致 IDD 加速[108]。目前，越來越多的研究表明 miRNA 與 IDD 密切相關。有研究表明，軟骨終板的鈣化與 IDD 的程度呈正相關，與健康組織相比，鈣化終板中 miR-20a 的表達顯著升高，該實驗表明，miR-20a 的過表達通過靶向強直蛋白同源物（ankylosis progressive homolog，ANKH）增強了軟骨終板軟骨細胞的鈣化，并促進了椎間盤的退變，表明 miR-20a 和 ANKH 是抑制 IDD 進展的潛在靶點[109]。miR-34a 除了在骨關節炎中與軟骨細胞凋亡密切相關以外，其也可通過增強 Fas 介導的終板軟骨細胞凋亡從而影響 IDD[12]。此外，miRNA 還可以作為軟骨終板發病機制的中間調節因子。例如，間歇性周期性機械張力下調轉化生長因子-β 和 miR-455-5p 的表達，而 miR-455-5p 的下調導致矮小相關轉錄因子 2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）表達上調，最終導致終板軟骨細胞變性；相反，wnt/β-catenin 通路的激活導致 miR-455-5p 的上調，進而抑制 RUNX2 的表達，減輕終板變性[110]。此外，有研究發現 miR-142-3p/高遷移率族蛋白 B1（high mobility group box 1，HMGB1）分子信號通路對軟骨終板細胞增殖、凋亡、遷移和自噬的調控或潛在的分子機制，研究者采用雙熒光素酶法檢測 miR-142-3p 的靶基因，結果顯示軟骨終板細胞中 miR-142-3p 的靶基因為 HMGB1，敲低 miR-142-3p 抑制了 HMGB1 的表達水平，抑制了軟骨終板細胞的增殖和遷移，但促進了軟骨終板細胞凋亡；此外，凋亡或自噬相關蛋白檢測結果顯示，敲低 miR-142-3p 可以促進細胞凋亡和自噬[111]。而軟骨終板干細胞（cartilage endplate stem cell，CESC）在軟骨終板的軟骨形成和成骨過程中同樣起著重要的作用。近期研究探討了 miR-637 通過調控 WNT5A 抑制人 CESC 成骨分化的機制，研究獲取了退行性軟骨終板和非退行性軟骨終板標本提取 CESC，檢測其表面干細胞標志物、堿性磷酸酶水平、成骨分化、成骨基因（Runx2、COL1）和軟骨形成基因（COL2），同時檢測 CESC 中的 miR-637 的表達，其結果證實了 miR-637 與 WNT5A 的靶向關系，發現退變 CESC 中 miR-637 表達下調，過表達 miR-637 抑制退變 CESC 的成骨分化，抑制 miR-637 促進退變 CESC 的成骨分化能力[112]。表6 對上述參與軟骨終板退化的 miRNA 進行了總結。
表6
參與調節軟骨終板退化的 miRNA
8 展望與小結
近年來，隨著生物信息學技術的迅速發展和廣泛應用，大量研究表明，miRNA 在 IDD 的發病機制中起著微妙的調節作用，具有廣闊的發展前景。許多異常表達的 miRNA 被認為是早期診斷的生物標志物或者潛在的治療靶點。此外，新的材料和技術，如可注射的水凝膠或可裝載 miRNA 的納米顆粒，遺傳技術和基于干細胞的治療，正在迅速發展，使得干擾椎間盤細胞內 miRNA 的表達成為可能。圖1 為涉及椎間盤多個病理過程的 miRNA 總結示意圖。
圖1
涉及椎間盤多個病理過程的 miRNA 總結示意圖
miRNA 通過多種病理過程促進/緩解 IDD 的進展，包括髓核細胞增殖和凋亡、炎癥、細胞外基質重塑/降解和軟骨終板改變
筆者所在課題組通過總結以上研究，進一步探索了 miRNA 在 IDD 中的新的分子通路，我們通過收集退變和正常大鼠椎間盤標本進行 miRNA 高通量測序，篩選出差異性表達最顯著的目標 miRNA，結果顯示 miR-101-3p 及 miR-25-3p 在退變椎間盤中明顯降低，進一步研究證實 miR-101-3p 可以通過靶向斯鈣素 1/血管內皮生長因子/促分裂素原活化蛋白激酶信號通路抑制細胞外基質降解酶的表達并促進相關細胞外基質成分的合成，miR-25-3p 通過沉默金屬調控轉錄因子 1（metal regulatory transcription factor 1，MTF1）蛋白表達，抑制 MTF1 轉核，從而抑制 IL-1β/ZIP8/MTF1 信號通路，進而抑制 IL-1β 引起的細胞外基質降解酶表達并促進細胞外基質蛋白表達，最終抑制 IDD，闡明了其治療 IDD 的潛在可能性[113-114]。并且課題組成功設計合成了具備良好穩定性及轉染效率的 miRNA 載體超支化聚酯 PEG-H40-PEI，通過負載包裹 miR-29a 從體外及體內實驗均驗證了遞送 miR-29a 能夠明顯抑制椎間盤纖維化，對 miRNA 轉化臨床治療 IDD 作出了探索和貢獻[115]。
目前，高通量生物技術工具的快速發展極大地促進了 miRNA 在 IDD 中的研究，然而我們仍然面臨許多挑戰。例如，缺乏對非編碼 RNA 網絡整體視圖的了解使得識別要干擾的關鍵節點存在一定困難；干細胞，如間充質干細胞，已被用于椎間盤變性治療以幫助組織再生和修復，其中包含 miRNA，用以改善微環境，然而骨髓間充質干細胞在退變的椎間盤組織中很難存活，因此干細胞植入還迫切需要組織工程技術的進一步改進。未來的研究應繼續關注 miRNA 網絡乃至非編碼 RNA 網絡，并在納米材料或工程組織中尋找可行的方法來干擾調控網絡中的中樞節點。隨著這些問題的解決，miRNA 調控機制的研究進展將為 IDD 治療提供更加廣闊而光明的前景。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
椎間盤是位于脊柱椎體間的異質性纖維軟骨組織，其中心區域是髓核，側面被周圍纖維環包圍，上下兩面均是軟骨終板，此結構賦予了脊柱運動和彎曲能力[1]。但椎間盤屬于體內最大的無血管結構，神經末梢也只達纖維環外圍[2]。這些結構特征使得椎間盤很容易發生退變[3]。椎間盤退行性疾病，簡稱椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IDD），是一種導致椎間盤的形態和生理功能發生重大變化，最終導致其承壓和扭轉負荷的能力下降的疾病[4]。IDD 使椎間盤的減震緩沖能力減弱，增加了纖維環壁破裂的機會，使髓核外滲和神經結構受壓，是大多數脊柱肌肉骨骼疾病（包括椎管狹窄、結構不穩定、椎間盤突出、神經根病和脊髓病）的病理基礎[5]。IDD 發病機制復雜，目前學界認為是環境和遺傳因素的相互作用。其中環境因素，如機械負荷、體力活動和吸煙，所起作用相對較小[6-9]。而基因遺傳被認為是 IDD 的主要危險因素，導致了 70% 以上的 IDD 的發生[10]。在 IDD 發生發展過程中，椎間盤細胞的凋亡異常增加，異常聚集，細胞外基質蛋白（異常合成和/或降解）失調，炎癥因子過度表達，加速炎癥微環境的形成，進一步影響周圍椎間盤細胞[7, 11-13]。加強對這種相互作用背后的分子機制的理解，有助于確定 IDD 的新治療靶點。微 RNA（microRNA，miRNA）是一種單鏈非編碼 RNA，長度約為 22 個核苷酸，研究表明其可調節體內許多基因的表達[14]。據報道，miRNA 只占人類基因組的 1%～3%，但其可調控約 33.3% 的蛋白質編碼基因[15-16]。一個確定的 miRNA 可調節許多不同的下游靶基因，而一個確定的靶基因也可受多個 miRNA 控制[17]。失調的 miRNA 在許多疾病的發生發展中起關鍵作用，包括各種癌癥、多種退行性疾病、心腦血管疾病和其他慢性病[18-19]。近來，越來越多的研究揭示了 miRNA 在防治 IDD 中的作用，其中包括髓核細胞增殖、髓核細胞凋亡、細胞外基質降解和炎癥等方面[20]。本文將基于以上幾個方面對近期 miRNA 與 IDD 的研究進展進行綜述。
1 miRNA 在 IDD 中的表達譜
2011 年，研究者對 IDD 中 miRNA 表達譜進行了首次分析，結果提示相較于脊柱側凸患者的正常髓核組織，IDD 患者有 29 個差異表達的 miRNA，其中 6 個上調，23 個下調[21]。此后 10 年，多項研究如雨后春筍涌現，繼續證實 IDD 患者的 miRNA 表達譜異于對照組。Zhao 等[22]在 2014 年比較了 IDD 和脊髓損傷患者的 miRNA 表達譜，發現在 IDD 組有 26 個 miRNA 下調，另有 25 個上調。進一步研究表明，這些異常表達的 miRNA 參與調控包括 Wnt、磷酸肌醇 3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）在內的多種信號通路[22-26]。這些信號通路被證實在 IDD 的發病機制中起著關鍵作用。另外，互補堿基序列賦予了 miRNA 結合靶基因 3’ 端非翻譯區的能力，使 miRNA 可通過結合 mRNA 導致一些與退變高度相關的關鍵靶蛋白表達減少，從而間接控制 IDD 的病理過程[27-29]。隨著對非編碼 RNA 研究的進一步深化以及生物信息學分析手段和生物信息學數據庫的日趨完善，近年來研究者們針對椎間盤組織構建了更加成熟的非編碼 RNA 與下游分子的互作網絡，以期完整地展示椎間盤中 miRNA 的表達譜。有研究通過 Gene Expression Omnibus 數據集獲得椎間盤中 miRNA 的相關數據，通過預測數據庫（ENCORI、TargetScan、miRecords、miRmap 和 circBank），構建了一個與 IDD 相關的潛在環狀 RNA-miRNA-mRNA 網絡，通過維恩分析，研究者鑒定預測出 miR-423-5p 和 miR-185-5p 為基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2 的上游分子[30]。另有研究通過選擇新的高通量測序手段，從 IDD 的樣本和脊髓損傷樣本（對照組）中隨機抽取 3 個樣本進行非編碼 RNA 測序，結果在 IDD 中發現了 463 個差異表達的長非編碼 RNA（long noncoding RNA，lncRNA）、47 個差異表達的 miRNA 和 1334 個差異表達的 mRNA；研究者同樣構建了一個競爭性內源性 RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）網絡，并鑒定了 lncRNA XIST-hsa-miR-4775-PLA2G7 和 lncRNA XIST-hsa-miR-424-5p-AMOT/TGFBR3 ceRNA 軸；利用實時熒光定量聚合酶鏈反應對 15 個 IDD 樣本和 15 個對照組樣本進行上述分子信號軸中差異表達基因的驗證，結果發現樣本中相關的 hsa-miR-4775 與 hsa-miR-424-5p 確實發生了差異性表達；另外該研究通過基因本體富集分析表明，miRNA 與椎間盤中多個生物學過程相關，包括細胞外基質組織、細胞外結構組織、白細胞遷移和間充質發育[31]。這些 miRNA 表達譜都闡釋了某些特定的 miRNA 及其上下游分子信號通路可能在 IDD 的發展過程中至關重要，并可能作為 IDD 的替代診斷生物標志物和新的治療策略。
2 miRNA 在椎間盤細胞凋亡中的作用
凋亡，又稱Ⅰ型程序性細胞死亡，其特征是染色體濃縮、細胞收縮、DNA 降解和凋亡小體形成。凋亡不僅存在于各種生理過程中，而且涉及許多病理性退行性疾病，如骨關節炎、神經退行性疾病和 IDD。髓核細胞通過合成細胞外基質成分以維持機械負荷下的椎間盤結構穩定性。有證據表明，IDD 的一個典型特征是髓核細胞減少和細胞外基質過度降解[32]。研究表明，miRNA 對髓核細胞的凋亡和細胞外基質降解，既有積極作用，也有消極作用，如在 IDD 中 miR-21、miR-499a-5p、miR-486-5p、miR-125a、miR-145 和 miR-573 表達降低，發揮凋亡抑制劑作用[33-38]，而與之相反，miR-27a、miR-494、miR-30d、miR-222-3p、miR-15a、miR-143、miR-532、miR-138-5p 在 IDD 中高表達，促進凋亡發生[39-47]。miR-129-5p 是一種傳統理解上的腫瘤抑制因子，IDD 患者中 miR-129-5p 下調，而人為上調 miR-129-5p 可以通過抑制髓核細胞凋亡和促進細胞外基質合成來保護椎間盤免于發生退變[48-49]。miRNA 譜發現 miR-573 在 IDD 組織中顯著下調，增加 miR-573 的表達可通過靶向抑制 Bax 來阻止髓核細胞凋亡，延緩 IDD 進程[38]。另外，與健康人髓核細胞相比，miR-499a-5p 在 IDD 患者的髓核細胞中顯著下調，過表達 miR-499a-5p 可通過靶向 SOX4 來抑制髓核細胞凋亡并防止細胞外基質降解[34]。相反，一些 miRNA 可促進髓核細胞凋亡及細胞外基質降解，加速 IDD 進展。研究顯示，miR-24-3p 水平與 IDD 程度呈正相關，過表達 miR-24-3p 通過靶向胰島素樣生長因子結合蛋白 5（insulin-like growth factor binding protein 5，IGFBP5）/細胞外信號調節激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信號通路顯著誘導髓核細胞凋亡[50]。miR-222 亦可通過靶向 TIMP3 基因在變性中起促進炎癥和凋亡的作用，而敲除 miR-222、沉默 TIMP3 則可有效逆轉其在退變變性進程中的作用[51]。最近的研究發現，miR-143-5p 在 IDD 中過表達，miR-143-5p 可通過信號通路靶向 eEF2 基因，促進細胞凋亡，抑制髓核細胞增殖[52]。另有研究表明，miR-30d 與調節細胞凋亡、維持椎間盤穩態有關[53]。更加深入的研究表明，miR-30d 通過靶向 SOX9 促進髓核細胞凋亡和細胞外基質降解，SOX9 的沉默可明顯逆轉 miR-30d 的作用[42]。還有許多其他 miRNA 在調節髓核細胞凋亡和細胞外基質降解中起著至關重要的作用。這些研究為髓核細胞凋亡和細胞外基質降解提供了分子機制層面的解釋。除了在髓核細胞中，另有研究發現 miR-106a-5p 在纖維環細胞中，miR-34a 和 miR-221 在軟骨終板中也發揮了凋亡調控作用[12, 54-55]。
上述既往研究都提示了 miRNA 在椎間盤中與細胞凋亡的聯系，一些學者便利用這些 miRNA 信號通路設計了一些能夠抑制椎間盤細胞凋亡的生物材料，以期在一定程度上緩解 IDD。研究者建立了 IDD 小鼠模型和細胞模型，并證明在體外和體內 IDD 過程中發生了 NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白 3 介導的細胞壞死、凋亡和炎癥反應；然后，分離純化富血小板血漿來源的外泌體（platelet-rich plasma-derived exosome，PRP-exo），發現 PRP-exo 可以抑制髓核細胞的凋亡；進一步的結果表明，PRP-exo 通過調節 kelch 樣 ECH 關聯蛋白 1（kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）-核因子 E2 相關因子 2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）通路對過氧化氫處理的髓核細胞發揮保護作用，研究者從機制上探討了 PRP-exo 通過下調 Keap1，從而導致 Keap1-Nrf2 復合物釋放 Nrf2，Nrf2 進一步從細胞質轉到細胞核，實現其抗氧化凋亡的生物功能，此外，miR-141-3p 在 PRP-exo 中富集，靶向 Keap1 mRNA 的 3’ 非翻譯區進行降解，導致 Nrf2 易位，此外，過表達 miR-141-3p 可以改善過氧化氫對髓核細胞的細胞毒作用，上調 Keap1、沉默 Nrf2 可以消除過氧化氫對髓核細胞的細胞毒作用，研究證實了 PRP-exo miR-141-3p 激活 Keap1-Nrf2 通路，減緩過氧化介導的細胞凋亡，減緩 IDD[56]。以間充質干細胞為基礎的治療方法在 IDD 的治療中同樣顯示出了一定的效果。有研究者通過差速離心分離出間充質干細胞來源的外泌體并鑒定其特征，發現了間充質干細胞來源的外泌體中 miR-410 是凋亡的關鍵調控因子的證據[57]。表1 對上述參與椎間盤細胞凋亡的 miRNA 進行了總結。
表1
參與椎間盤細胞凋亡的 miRNA
3 miRNA 在椎間盤細胞自噬中的作用
自噬是一種廣泛存在于真核細胞中的生理活動，對維持細胞穩態以應對缺氧、毒性、饑餓和其他應激刺激至關重要[58]。越來越多證據表明，自噬參與了多種生理和病理生理過程，包括 IDD。Gruber 等[59]研究表明，自噬相關基因在退變椎間盤中的表達高于正常椎間盤。細胞中自噬反應的適當激活可增強髓核細胞抵抗壓力負荷能力，而自噬功能障礙會促進髓核細胞死亡。椎間盤中髓核組織通過軟骨終板的滲透來完成營養的吸收，然而終板的營養物質擴散能力可因老化或吸煙等其他原因引起的軟骨下骨骨化而顯著降低。在營養缺乏條件下，人髓核細胞的數量減少并表現出自噬增加[60]。
近 10 年來，miRNA 介導的自噬在 IDD 中的作用引起了廣泛關注。這類 miRNA 可通過直接靶向自噬相關蛋白 7（autophagy related protein 7，ATG7）和信號通路來調節髓核細胞自噬的不同過程[61]。miR-210 的表達與 IDD 程度呈正相關，過表達 miR-210 通過 ATG7，抑制退變髓核細胞中的自噬[62]。Wang 等[63]發現，miR-21 在人類退變性髓核細胞中可減少自噬體形成、自噬標志物微管相關蛋白 1A/1B-輕鏈 3-Ⅱ/Ⅰ比率，通過升高參與自噬調控的如磷酸酶和張力蛋白同源蛋白（phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten，PTEN）/AKT/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路活性從而抑制自噬及細胞外基質降解。此外，Lin 等[64]進一步驗證了過表達 miR-21 增加了白細胞介素（interleukin，IL）-6 的炎癥反應并降低了細胞自噬的能力。另有研究顯示，miR-129-5p 通過靶向 Beclin-1 抑制髓核細胞自噬，而 miR-129-5p 的表達受甲基化過程調節，這表明靶向 miR-129-5p 甲基化的治療可能是潛在的 IDD 有效治療方案[65]。半乳糖凝集素-3 是 Wnt/β-catenin 信號通路的關鍵調節因子。據報道，miR-185 的表達增加可通過促使 Wnt/β-catenin 信號通路失活從而促進大鼠 IDD 中髓核細胞的存活并抑制自噬[66]。近期另有研究發現，miR-155-3p 在缺氧誘導因子 1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF1α）/組蛋白賴氨酸去甲基化酶 3A（lysine specific demethylase 3A，KDM3A）軸的參與下對 IDD 髓核細胞自噬有積極影響[67]。該研究收集腰椎間盤突出癥患者的 IDD 髓核組織和外傷性腰椎骨折患者的外傷性椎間盤髓核組織，檢測髓核組織自噬標志物蛋白，將 miR-155-3p mimic 或 KDM3A-小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）轉染入 IDD 髓核細胞，探討其在細胞自噬中的作用，結果發現：IDD 髓核組織和細胞中 miR-155-3p 降低，HIF1α 和 KDM3A 升高，miR-155-3p 升高或 KDM3A 沉默可促進 IDD 髓核細胞的增殖和自噬；此外，在 IDD 髓核細胞中，升高的 miR-155-3p 降低了 KDM3A 和 HIF1α 的表達，而沉默的 KDM3A 降低了 HIF1α 的表達，研究認為上調 miR-155-3p 或沉默 KDM3A 可通過抑制 HIF1α 促進 IDD 髓核細胞自噬、抑制凋亡，可能亦是治療 IDD 的一個新的分子靶點[67]。另一項研究從 IDD 患者的椎間盤中分離出髓核細胞，通過單丹黃顯尸胺染色顯示細胞自噬，蛋白質印跡法檢測髓核細胞中細胞外基質相關蛋白的表達并采用熒光素酶報告酶和 RNA 免疫沉淀法鑒定 RNA 之間的結合，研究結果表明：miR-654-5p 在 IDD 患者的退變髓核組織中顯著上調，miR-654-5p 的高表達與 IDD 程度呈正相關；下游的功能分析表明，miR-654-5p 通過提高 MMP-3、MMP-9 和 MMP-13 的表達水平，以及通過抑制自噬降低膠原Ⅰ、膠原Ⅱ、SOX9 和聚集蛋白的表達，促進了細胞外基質降解[68]。該研究還顯示，ATG7 為 miR-654-5p 的直接下游靶基因，miR-654-5p 可與 ATG7 的 3’ 非編碼區結合，抑制下游 mRNA 表達，進一步降低其翻譯，敲除 ATG7 可消除 miR-654-5p 抑制劑對細胞外基質降解和自噬調節的影響；此外，miR-654-5p 以 ATG7 依賴的方式增加磷酸化 PI3K、磷酸化 Akt 和磷酸化 mTOR 的蛋白表達水平，從而抑制髓核細胞自噬，該結果揭示了 miR-654-5p 可能通過靶向 ATG7 激活 PI3K/AKT/mTOR 信號通路抑制自噬，從而增強細胞外基質降解[68]。這些發現可能從細胞自噬的層面為 IDD 的治療提供新的見解。表2 對上述參與椎間盤細胞自噬的 miRNA 進行了總結。
表2
參與椎間盤細胞自噬的 miRNA
4 miRNA 在椎間盤細胞增殖中的作用
健康人椎間盤中的細胞數量稀少并且分布稀疏。然而，當椎間盤發生退變時，細胞異常增殖成簇[69]。在這一復雜的病理生理過程中，多種 miRNA 可作為椎間盤細胞增殖的重要間接調節因子，異常表達的 miRNA 譜可視為 IDD 生物標志物。例如，在髓核細胞中，miR-21 的異常過表達通過下調程序性細胞死亡因子 4（programmed cell death 4，PDCD4）和 PTEN 增加了退變髓核細胞的增殖水平[70]。相反，Liu 等[71]發現敲除 miR-21 可逆轉細胞增殖，而 Akt 抑制劑 Ly294002 可逆轉 miR-21 誘導的效應。這些結果表明 miR-21 是 IDD 的潛在生物標志物和治療靶點。此外，miR-10b、miR-96、miR-184、miR-2355-5p 和 miR-665 的過表達還可通過靶向 HOXD10、ARID2、GAS1、ERFFI1 和 GDF5 促進退變的髓核細胞增殖[72-76]，上調 miR-222-3p、miR-15a 和 miR-125b-1-3p 也可調節髓核細胞增殖[43-44, 77]。除了髓核細胞，纖維環細胞中的 miR-106a-5p 和軟骨終板細胞中的 miR-365 也可影響 IDD 進程中的細胞增殖，分別通過 ATG7 抑制增殖水平，通過 HDAC4 促進增殖[54, 78]。另有研究發現，miR-25-3p 在大鼠退行性髓核細胞中表達下調，與細胞死亡相關的 Bcl-2 相互作用介質（BCL-2 interacting mediator of cell death，Bim）是 miR-25-3p 的直接靶標，該研究將 miR?25?3p 抑制劑、miR?25?3p 抑制劑陰性對照、miR?25?3p 抑制劑+對照 siRNA 和 miR?25?3p 抑制劑+Bim?siRNA 轉染髓核細胞 48 h 后，分析細胞增殖和凋亡情況，結果表明 miR-25-3p 抑制劑可降低髓核細胞增殖，誘導細胞凋亡，Bim-siRNA 可逆轉上述作用；此外，研究進一步將 10 ng/mL IL-1β 加入髓核細胞培養 24 h，建立 IDD 體外細胞模型，實驗結果表明，IL-1β 降低了髓核細胞增殖，增加了細胞凋亡，而 miR-25-3p 模擬物阻止了這一現象，miR-25-3p 可通過上調 Bim 從而促進細胞增殖減輕 IL-1β 處理對髓核細胞的影響[79]。此外，有研究通過 miRNA 微陣列測序分析了 IDD 與正常組織中差異化表達的 miRNA，發現 miR-31-5p 在兩組中顯著性差異化表達；然后，通過實時熒光定量聚合酶鏈反應評估了各組中 miR-31-5p 的水平，通過熒光素酶實驗評估了 miR-31-5p 與基質細胞衍生因子 1（stromal cell derived factor 1，SDF-1）/CXC 趨化因子受體 7 軸之間的關聯，發現 miR-31-5p 過表達可以促進髓核細胞增殖，抑制凋亡，促進細胞外基質形成，抑制髓核細胞基質降解酶水平[80]。表3 對上述參與椎間盤細胞增殖的 miRNA 進行了總結。
表3
參與椎間盤細胞增殖的 miRNA
5 miRNA 在細胞外基質合成/降解中的作用
細胞外基質是椎間盤細胞生存的微環境，對于細胞外基質而言，2 個主要成分對其完整性至關重要，其一為提供抗張強度的Ⅰ型和Ⅱ型膠原網絡，其二為可與水結合的蛋白多糖，如蛋白聚糖[81]。然而，髓核細胞代謝失調將導致它們合成這些細胞外基質成分的能力降低，而分泌細胞外基質降解分子［例如 MMP 和血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS）］的能力增加[82-84]。因此，髓核細胞調節失調和蛋白多糖分解會導致組織的水結合能力減弱，椎間盤內機械力學性能下降，致使纖維環撕裂、終板鈣化和骨贅形成。最終級聯放大的病理反應導致其結構崩潰，造成 IDD。雖然退變過程最早出現在髓核，但隨著退變的進一步加重，退變區域會逐漸擴大到纖維環，2 個組織之間的邊界會變得模糊[85]。髓核細胞丟失進一步促進了細胞外基質降解，從而造成一種級聯放大的病理反應過程。
miRNA 對膠原網絡和蛋白聚糖等結構蛋白表達的影響主要通過 2 條途徑發生：一條是通過靶向直接參與細胞外基質降解的酶（如 MMP[86-89]），目前已有研究在患者退變椎間盤組織中分離的退行性髓核細胞中觀察到 miR-93 下調以及 MMP-3 水平升高，并證實 miR-93 可靶向調節 MMP-3，導致Ⅱ型膠原降解[86]；另一條是通過靶向細胞外基質代謝信號轉導酶（PTEN）/信號轉導與轉錄激活因子 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號通路或生長分化因子 5（growth differentiation factor 5，GDF5）途徑[71, 90-92]。miR-98 可能通過影響 IL-6/STAT3 信號通路從而影響 IDD，研究發現，在 IDD 組織中 miR-98 表達水平的下調導致了髓核組織中 IL-6 水平升高，此外，抑制 miR-98 表達可增加 STAT3、磷酸化 STAT3 和 MMP-2 蛋白的表達水平從而激活 STAT3 信號通路，促進 IDD[90]。目前，GDF5 已經被證實參與了細胞外基質合成代謝[93]。GDF5 基因多態性與退行性疾病（如骨關節炎）的易感性有顯著關聯[94]。在 IDD 中，GDF5 的表達主要受 2 個 miRNA（miR-7 和 miR-132）的負向調控[91-92]。miR-132 通過直接靶向 GDF5 從而促進細胞外基質降解，并通 MAPK/ERK 途徑增加 MMP-13 和 ADAMTS4 的表達。體內實驗表明，抑制 miR-132 的表達可以減弱細胞外基質的降解[91]。在大鼠 IDD 模型和 IL-1β 刺激下的髓核細胞中，研究者們發現了 miR-7 靶向 GDF5 的作用，該結果表明，miR-7 的過表達促進了細胞外基質的降解，而抑制 miR-7 則降低了這一作用[92]。另有實驗表明，miR-494 在退變椎間盤組織中的表達水平顯著上調且可直接靶向 SOX9 基因，過表達 miR-494 可導致細胞外基質降解酶如 MMP-3、MMP-13 和 ADAMTS5 的基因表達和蛋白水平增加；同時，抑制 miR-494 可以使Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的表達增加[40-41]。近期研究闡明了 miR-140-3p 在穿刺誘導的 IDD 模型中的再生作用，作者通過生物信息學分析，確定 IDD 中與 miR-140-3p 相關的調控因子［Kruppel 樣因子 5（Kruppel-like factor 5，KLF5）/N-鈣黏著蛋白（N-cadherin）/鼠雙微基因 2（murine double minute 2，MDM2）/Slug 鋅指蛋白（Slug zinc finger protein，Slug）］，從 IDD 標本的髓核中提取間充質干細胞，分析 miR-140-3p 對其凋亡和分化的影響，結果顯示，miR-140-3p 在退化髓核組織中低表達，而將其過表達能一定程度緩解 IDD；對下游分子機制的研究提示，miR-140-3p 靶向 KLF5 表達，而 KLF5 高表達會阻礙間充質干細胞的遷移和分化；在退變椎間盤來源的間充質干細胞中，miR-140-3p 介導 KLF5 下調同時升高 N-cadherin 的表達，并轉錄抑制 MDM2，從而上調 Slug 的表達[95]。在祖國傳統醫學領域，也有關于 miRNA 對椎間盤細胞外基質影響的研究。補腎活血方是一種由 6 種中草藥組成的中藥方劑，被廣泛用于治療 IDD。有研究者通過 DIANA 在線工具和熒光素酶報告基因檢測證實，miR-483-3p 和 miR-23c 分別通過直接靶向調控 CTNNB1 和 GSK3B，從而通過 Wnt 信號通路影響補腎活血方對髓核細胞增殖和細胞外基質合成的作用[96]。表4 對上述參與椎間盤細胞外基質合成/降解的 miRNA 進行了總結。
表4
參與椎間盤細胞外基質合成/降解的 miRNA
6 miRNA 在 IDD 炎癥反應中的作用
一直以來，炎癥都被認為與椎間盤的老化有關。然而最近的研究表明，炎癥與 IDD 緊密相關[97]。一方面，炎性細胞因子通過激活細胞外基質降解蛋白和抑制細胞外基質結構分子來促進退變過程；另一方面，隨著炎癥反應的進展，來自背根神經節的免疫細胞和痛覺神經纖維滲入受損的椎間盤組織，釋放神經營養素，痛覺神經纖維產生痛覺。此外，這些細胞因子還對椎間盤細胞衰老和凋亡產生一定的影響[97-100]。miRNA 與炎癥之間聯系密切，其既是細胞炎癥微環境的一部分，又可導致細胞因子失調而促成炎癥[101]。
研究發現 miR-640 在退變椎間盤組織和細胞中表達水平上調，研究者通過添加腫瘤壞死因子-α 和 IL-1β 刺激細胞后，發現 miR-640 表達量隨核因子 κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路顯著增加[102]。Shen 等[103]的研究揭示了髓核細胞在接受脂多糖刺激后，NF-κB 信號通路通過 Toll 樣受體 4 誘導 miR-625-5p 表達，同時通過雙熒光素酶報告試驗揭示了 miR-625-5p 下游靶點為細胞外基質結構蛋白Ⅰ型膠原。另有 2 項研究發現 miR-194 在椎間盤炎癥環境中的表達水平有所下調，并提供了 miR-194 參與炎癥反應的證據：這種下調與清選蛋白 4A（cullin 4A，CUL4A）和清選蛋白 4B（cullin 4B，CUL4B）兩種蛋白的過表達有關；相反，在退變的椎間盤組織中 CUL4A 和 CUL4B 的含量增加程度，與退變的程度呈正相關[104-105]。此外，研究表明 miR-194 下游靶向腫瘤壞死因子受體相關因子 6，將 miR-194 轉染至受脂多糖處理后的大鼠髓核細胞中可以有效減少炎性細胞因子的表達[104]。另有研究發現抑制 miR-203-3p 的表達可通過上調雌激素受體 α 防止脂多糖誘導的炎癥和 IDD 的退變，而沉默雌激素受體 α 逆轉了這種保護作用[106]。近期研究檢測了 miR-200c-3p 在 IDD 患者椎間盤組織中的表達水平，采用脂多糖處理髓核細胞構建 IDD 細胞模型，利用熒光素酶活性、聚合酶鏈反應和蛋白質印跡法分別測定相關下游 RNA 和蛋白表達水平，結果顯示 IDD 患者椎間盤組織中 miR-200c-3p 的表達水平低于正常受試者，脂多糖處理降低了 miR-200c-3p 在髓核細胞中的表達水平；研究還發現，miR-200c-3p 可通過靶向 RAP2C/ERK 從而抑制 IDD 中細胞炎癥因子水平，從而減緩 IDD 的進程[107]。表5 對上述參與椎間盤細胞炎癥反應的 miRNA 進行了總結。
表5
參與椎間盤細胞炎癥反應的 miRNA
7 miRNA 在調節軟骨終板退化中的作用
椎間盤是體內最大的無血管器官，營養供給主要依靠軟骨終板的擴散功能。鈣化是 IDD 的典型標志，它降低了營養物質的輸送，破壞了椎間盤代謝物交換的平衡，最終導致 IDD 加速[108]。目前，越來越多的研究表明 miRNA 與 IDD 密切相關。有研究表明，軟骨終板的鈣化與 IDD 的程度呈正相關，與健康組織相比，鈣化終板中 miR-20a 的表達顯著升高，該實驗表明，miR-20a 的過表達通過靶向強直蛋白同源物（ankylosis progressive homolog，ANKH）增強了軟骨終板軟骨細胞的鈣化，并促進了椎間盤的退變，表明 miR-20a 和 ANKH 是抑制 IDD 進展的潛在靶點[109]。miR-34a 除了在骨關節炎中與軟骨細胞凋亡密切相關以外，其也可通過增強 Fas 介導的終板軟骨細胞凋亡從而影響 IDD[12]。此外，miRNA 還可以作為軟骨終板發病機制的中間調節因子。例如，間歇性周期性機械張力下調轉化生長因子-β 和 miR-455-5p 的表達，而 miR-455-5p 的下調導致矮小相關轉錄因子 2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）表達上調，最終導致終板軟骨細胞變性；相反，wnt/β-catenin 通路的激活導致 miR-455-5p 的上調，進而抑制 RUNX2 的表達，減輕終板變性[110]。此外，有研究發現 miR-142-3p/高遷移率族蛋白 B1（high mobility group box 1，HMGB1）分子信號通路對軟骨終板細胞增殖、凋亡、遷移和自噬的調控或潛在的分子機制，研究者采用雙熒光素酶法檢測 miR-142-3p 的靶基因，結果顯示軟骨終板細胞中 miR-142-3p 的靶基因為 HMGB1，敲低 miR-142-3p 抑制了 HMGB1 的表達水平，抑制了軟骨終板細胞的增殖和遷移，但促進了軟骨終板細胞凋亡；此外，凋亡或自噬相關蛋白檢測結果顯示，敲低 miR-142-3p 可以促進細胞凋亡和自噬[111]。而軟骨終板干細胞（cartilage endplate stem cell，CESC）在軟骨終板的軟骨形成和成骨過程中同樣起著重要的作用。近期研究探討了 miR-637 通過調控 WNT5A 抑制人 CESC 成骨分化的機制，研究獲取了退行性軟骨終板和非退行性軟骨終板標本提取 CESC，檢測其表面干細胞標志物、堿性磷酸酶水平、成骨分化、成骨基因（Runx2、COL1）和軟骨形成基因（COL2），同時檢測 CESC 中的 miR-637 的表達，其結果證實了 miR-637 與 WNT5A 的靶向關系，發現退變 CESC 中 miR-637 表達下調，過表達 miR-637 抑制退變 CESC 的成骨分化，抑制 miR-637 促進退變 CESC 的成骨分化能力[112]。表6 對上述參與軟骨終板退化的 miRNA 進行了總結。
表6
參與調節軟骨終板退化的 miRNA
8 展望與小結
近年來，隨著生物信息學技術的迅速發展和廣泛應用，大量研究表明，miRNA 在 IDD 的發病機制中起著微妙的調節作用，具有廣闊的發展前景。許多異常表達的 miRNA 被認為是早期診斷的生物標志物或者潛在的治療靶點。此外，新的材料和技術，如可注射的水凝膠或可裝載 miRNA 的納米顆粒，遺傳技術和基于干細胞的治療，正在迅速發展，使得干擾椎間盤細胞內 miRNA 的表達成為可能。圖1 為涉及椎間盤多個病理過程的 miRNA 總結示意圖。
圖1
涉及椎間盤多個病理過程的 miRNA 總結示意圖
miRNA 通過多種病理過程促進/緩解 IDD 的進展，包括髓核細胞增殖和凋亡、炎癥、細胞外基質重塑/降解和軟骨終板改變
筆者所在課題組通過總結以上研究，進一步探索了 miRNA 在 IDD 中的新的分子通路，我們通過收集退變和正常大鼠椎間盤標本進行 miRNA 高通量測序，篩選出差異性表達最顯著的目標 miRNA，結果顯示 miR-101-3p 及 miR-25-3p 在退變椎間盤中明顯降低，進一步研究證實 miR-101-3p 可以通過靶向斯鈣素 1/血管內皮生長因子/促分裂素原活化蛋白激酶信號通路抑制細胞外基質降解酶的表達并促進相關細胞外基質成分的合成，miR-25-3p 通過沉默金屬調控轉錄因子 1（metal regulatory transcription factor 1，MTF1）蛋白表達，抑制 MTF1 轉核，從而抑制 IL-1β/ZIP8/MTF1 信號通路，進而抑制 IL-1β 引起的細胞外基質降解酶表達并促進細胞外基質蛋白表達，最終抑制 IDD，闡明了其治療 IDD 的潛在可能性[113-114]。并且課題組成功設計合成了具備良好穩定性及轉染效率的 miRNA 載體超支化聚酯 PEG-H40-PEI，通過負載包裹 miR-29a 從體外及體內實驗均驗證了遞送 miR-29a 能夠明顯抑制椎間盤纖維化，對 miRNA 轉化臨床治療 IDD 作出了探索和貢獻[115]。
目前，高通量生物技術工具的快速發展極大地促進了 miRNA 在 IDD 中的研究，然而我們仍然面臨許多挑戰。例如，缺乏對非編碼 RNA 網絡整體視圖的了解使得識別要干擾的關鍵節點存在一定困難；干細胞，如間充質干細胞，已被用于椎間盤變性治療以幫助組織再生和修復，其中包含 miRNA，用以改善微環境，然而骨髓間充質干細胞在退變的椎間盤組織中很難存活，因此干細胞植入還迫切需要組織工程技術的進一步改進。未來的研究應繼續關注 miRNA 網絡乃至非編碼 RNA 網絡，并在納米材料或工程組織中尋找可行的方法來干擾調控網絡中的中樞節點。隨著這些問題的解決，miRNA 調控機制的研究進展將為 IDD 治療提供更加廣闊而光明的前景。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
