細胞膜片技術是一種將細胞制備成片狀的技術，該技術保留了大量的細胞外基質、細胞-細胞連接等，在骨軟骨組織的修復與再生中具有廣泛的應用前景。該文論述了干細胞膜片的種類、特性及構建方法，并對干細胞膜片血管化、與各種細胞因子和支架材料等復合應用于骨與軟骨修復的研究現狀進行了綜述，旨在探索干細胞膜片在骨與軟骨修復領域的進一步發展方向。
引用本文： 馬宏, 邢飛, 項舟, 段鑫. 干細胞膜片在骨與軟骨修復中的應用. 華西醫學, 2023, 38(10): 1553-1558. doi: 10.7507/1002-0179.202204071 復制
感染、創傷、腫瘤等原因造成的骨與軟骨損傷一直是骨科臨床工作的一項難題。組織工程的發展為組織修復提供了新的方法。傳統的組織工程方法主要通過酶消化獲得足夠量的種子細胞，將這些細胞的單細胞懸液直接注射到局部區域或者接種在可生物降解的支架上來支持組織形成[1]。但在構建過程中，酶的應用將導致細胞外基質被破壞，單一干細胞注射存在大量細胞丟失和低存活率的問題[2]。為了克服這些缺點，細胞膜片技術因不需要酶或侵襲過程能完整保存細胞外基質、細胞間連接等，而提高局部細胞接種率[3]。間充質干細胞是目前廣泛應用的種子細胞之一，其具有廣泛的來源，可以分化為骨、軟骨等組織，同時還具有潛在的抗炎、抗免疫的作用[4]。因此，越來越多的學者將間充質干細胞同細胞膜片技術聯合起來應用于骨與軟骨損傷中[5-6]。本文綜述了干細胞膜片的種類、特性及構建方法，以及干細胞膜片血管化、各種細胞因子和支架材料干細胞膜片用于骨與軟骨損傷修復的研究進展，旨在探索干細胞膜片在骨與軟骨修復的進一步發展方向。
1 干細胞膜片
1.1 干細胞膜片的種類
干細胞膜片根據細胞來源，可分為骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cell, BMSC）膜片、脂肪間充質干細胞（adipose-derived stem cell, ADSC）膜片、臍帶間充質干細胞膜片等。根據細胞層數，可分為單層細胞膜片、雙層細胞膜片和多層細胞膜片。
1.2 干細胞膜片的構建
干細胞膜片的構建主要以特殊材料組成的培養基底為基礎。通過改變溫度、光、pH 等刺激因素，改變材料對細胞的黏附行為，使細胞自然脫離，從而產生細胞膜片。
1.2.1 溫度控制法
聚 N-異丙基丙烯酰胺通常以共價結合的方式被固定在培養容器的表面。隨著環境溫度的變化，聚 N-異丙基丙烯酰胺發生疏水性/親水性的快速轉變，從而使細胞的黏附和分離能夠隨著溫度的變化而控制。采用這種方法時，無需任何酶處理即可獲得培養在溫度敏感型細胞培養皿上的貼壁細胞作為連續完整的活細胞膜片[7]。溫度控制法是目前收獲細胞膜片最常用的制備方法，其操作簡便，但需要特殊培養皿，價格昂貴，收獲時間對溫度反應性培養皿表面的優化可以提高細胞培養和細胞膜片分離的效率。Choi 等[8]使用聚 N-異丙基丙烯酰胺納米拓撲術將干細胞膜片的總收獲期縮短至 2 d，極大地縮短了膜片的總收獲期。
1.2.2 機械搔刮法
機械搔刮法是指干細胞在培養皿中形成膜片后，用細胞刮刀及鑷子將膜片從培養皿表面剝離。Weng 等[9]在成骨培養基內添加抗壞血酸促進間充質干細胞細胞外基質分泌，通過細胞刮刀從培養皿邊緣向中心刮取而獲得干細胞膜片。機械搔刮法是目前制備干細胞膜片最簡單的一種方法，不需要特殊的培養皿或技術，但是其制備膜片的時間較長，通常需要 2 周。
1.2.3 磁反應法
磁誘導干細胞膜片主要通過細胞內吞作用，將磁性納米顆粒內吞到細胞內，在外加磁場的控制下逐層堆疊，形成多層或含不同共培養細胞類型的干細胞膜片。Silva 等[10]在磁力的幫助下，通過細胞內化的四氧化三鐵納米顆粒來構建多層預血運磁性細胞膜片用于骨再生。與傳統的溫度響應型細胞片制備方法相比，磁控策略具有操縱多種細胞類型形成復雜細胞膜片的獨特能力。
1.2.4 光反應法
光誘導細胞膜片技術作為一種新的方法出現，最早是由 Hong 等[11]將細胞培養在二氧化鈦納米涂層的培養皿上，在 365 nm 紫外光照射下介導二氧化鈦親水性及疏水性的變化，從而形成細胞膜片。Jiang 等[12]發現光反應系統可以產生較少損傷的 BMSC 膜片，并能夠改善膜片的活力和成骨能力。與溫度、磁、pH、電等其他因素相比，光照射法具有非侵入性、控制準確的優點[13]。在適當的波長、功率密度和曝光時間下，光照對細胞的存活和后續的細胞行為是安全的[12]。
1.3 干細胞膜片的特性
干細胞膜片因其不需要酶或侵襲過程，保留了細胞外基質、細胞-細胞連接和細胞-細胞外基質連接，提高了局部細胞接種率[14]。研究顯示，以細胞膜片形式收獲的干細胞存活率和旁分泌因子分泌能力更高[15]。干細胞膜片中細胞外基質蛋白起到了組織黏合劑的作用，允許干細胞膜片在不需要支撐材料的情況下自發黏附在生物表面，并且可以通過層疊多個細胞膜片來制造三維細胞密度組織[16]。此外，干細胞膜片具有一定的機械強度，可單獨應用于組織修復，也可以與各種細胞因子、支架材料等復合。
2 干細胞膜片在骨修復中的應用
干細胞膜片具有一定的機械強度和可操作性，可以通過疊加構建理想厚度的細胞膜片，以夯實和注射的方式將其植入生物體內[17]。目前，其在骨缺損修復的應用取得了不錯的成果。Fujii 等[18]表明牙髓間充質干細胞膜片能夠在小鼠顱骨缺損模型中成功地愈合骨。Yoshida 等[19]在使用 ADSC 膜片填塞大鼠股骨遠端干骺端的鉆孔骨缺損實驗中發現，對照組在術后 4 周仍有部分孔洞，而 ADSC 膜片則幾乎完全修復了孔洞。Liu 等[20]比較了不同來源的間充質干細胞膜片在兔顱骨缺損模型中的修復效果，發現牙槽骨源性間充質干細胞膜片比髂骨源性間充質干細胞膜片具備更好的成骨能力。
轉染技術的應用及細胞因子、金屬顆粒與干細胞膜片的復合可促進成骨。Kim 等[21]將骨形態發生蛋白-7 基因轉染到 ADSC 膜片上，可顯著提高其成骨能力。Wang 等[22]將負載微 RNA-21 的殼聚糖/透明質酸納米顆粒反向轉染 BMSC 膜片，成功地誘導 BMSC 膜片成骨，發現微 RNA-21 能上調鈣化相關基因的表達，促進堿性磷酸酶的產生、膠原的分泌和礦化結節的形成。Zhang 等[23]通過腺病毒載體建立了高表達 Parkin（泛素連接酶）的 BMSC 膜片，發現表達高含量 Parkin 的膜片可增加成骨相關基因蛋白的表達，并通過自噬信號的上調，加速大鼠脛骨骨折愈合。Dang 等[24]將 BMSC 膜片與納米微粒相結合構建無支架干細胞構建體，并將其植入大鼠臨界大小的顱骨缺損模型中。該微粒以明膠與羥基磷灰石為載體，能夠早期釋放轉化生長因子β1 以誘導軟骨形成，并以更持續的方式釋放骨形態發生蛋白-2 以促進軟骨內成骨。為了避免局部骨組織自體干細胞的干擾，Zhang 等[25]在免疫缺陷小鼠異位移植的模型中植入了由含金納米顆粒的成骨誘導培養液收獲的牙周膜干細胞膜片，結果表明與對照組相比，金納米顆粒能夠明顯提高牙周膜干細胞膜片的成骨能力，促進成骨分化和基質礦化。此外，調節細胞膜信號通路也被廣泛地應用于成骨研究。He 等[26]證實磁性氧化石墨烯在低濃度下具有生物相容性，且可能通過 Wnt/β聯蛋白和骨形態發生蛋白信號通路顯著促進 BMSC 膜片的成骨分化。在另一項研究中，Tian 等[27]發現 Jagged 1 蛋白介導的 Notch 激活可以克服高密度細胞膜片培養引起的干細胞老化，并增強體內細胞片的成骨能力。
在骨缺損修復中，血管生成不足是組織工程中修復大塊骨缺損的難題之一。細胞膜片技術為血管形成提供了良好的微環境，因為該技術可以保留對血管生成至關重要的完整的細胞外基質。近年來，研究者主要通過不同細胞共培養來促進細胞膜片血管化。研究表明，內皮祖細胞（endothelial progenitor cell, EPC）可以為 BMSC 的成骨分化提供局部微環境，而 EPC 與 BMSC 的結合不僅在體外可以促進成骨細胞的分化，并在體內通過支持骨再生促進骨愈合[28]。此外，ADSC 因較 BMSC 來源更廣泛、更方便獲取。Zhang 等[29]通過疊加兔成骨誘導的 ADSC 膜片和血管內皮細胞膜片，構建了雙層細胞膜片，發現該復合細胞膜片能夠促進兔大段骨缺損的修復。Wang 等[30]誘導 ADSC 定向分化為 EPC，并將其接種于成骨誘導的 ADSC 膜片上，通過“三明治”方式疊加至 3 層，構建成骨 ADSC-EPC 膜片復合體，影像學和組織學顯示，該復合體在兔顱骨缺損模型中形成致密、血管化良好的新骨組織，且修復程度明顯大于對照組。此外，Wu 等[31]在 2 型糖尿病大鼠雙側顱骨缺損模型中，探究在高糖條件下 EPC 是否能促進 BMSC 的成骨，并探討其可能的機制。結果表明，BMSC/EPC 復合膜片組的骨再生能力最強，F-肌動蛋白/YAP（Yes associated protein）通路在 BMSC 的成骨分化中起重要作用。
細胞膜片因其物理特性較軟而無法起到支撐作用，且不能用于較大的骨缺損，因此研究者利用細胞膜片包被支架材料來進行骨缺損修復，充分發揮骨組織工程支架和細胞膜片各自的優勢。Lin 等[32]設計了一種具有廣泛孔隙率和適當孔徑的β-磷酸三鈣/Ⅰ型膠原復合支架，將其與成骨誘導的 BMSC 膜片結合在一起，并移植到裸鼠皮下，與對照組相比，該組在第 4 周可觀察到明顯的新骨形成。Shan 等[33]將包被了 PLGA（聚丙交酯-乙交酯）支架的 BMSC 膜片植入犬下頜骨缺損模型中，組織學和影像學顯示實驗組較對照組有較多的中央管和紅骨髓，并含有較多的板層骨。Xue 等[34]使用負載高遷移率族蛋白的明膠海綿支架結合 BMSC 膜片，發現其可以促進大鼠脛骨骨折手術后的骨愈合。Zhang 等[35]制備了干細胞來源的預血運 BMSC 膜片和成骨細胞膜片，然后將這 2 個細胞片堆疊在一起模擬天然骨膜，通過包裹多孔支架，形成仿生骨膜/支架復合體，并將其植入大鼠顱骨缺損區。研究結果表明，與自體骨膜相比，具有多孔支架的仿生骨膜具有相似的體內成骨和血管生成的能力。Wang 等[36]發現復合納米羥基磷灰石和自體富血小板纖維蛋白顆粒的 BMSC 膜片可促進兔顱骨臨界大小缺損的骨再生。Zhang 等[29]誘導兔 ADSC 分化為成骨細胞和血管內皮細胞，利用細胞膜片技術，獲得成骨和血管內皮細胞雙層細胞膜片，再復合聚賴氨酸修飾的珊瑚羥基磷灰石支架，構建血管化組織工程骨，并植入兔橈骨大段骨缺損中。結果顯示，聚賴氨酸能有效促進 ADSC 的黏附、增殖和分化，構建的血管化組織工程骨的成骨過程、血管化程度都遠快于珊瑚羥基磷灰石支架。
3 干細胞膜片在軟骨修復中的應用
關節軟骨是一種無血管和神經的組織，且處于嚴酷的生物力學環境，受到損傷后的愈合能力很差。軟骨缺損是導致關節疼痛和殘疾的重要原因。目前，微骨折等骨髓刺激技術是臨床實踐中最常用的方法[37]。然而，由此產生的混合透明的纖維軟骨組織不如天然透明軟骨，特別是其承受壓力的能力[38]。軟骨缺損的新療法采用細胞膜片技術，該技術允許收獲具有豐富細胞外基質和細胞的完整細胞膜片。與其他細胞膜片相比，軟骨細胞膜片在軟骨缺損修復中的應用研究更多[39]。遺憾的是，軟骨細胞在體外培養過程中容易去分化變成纖維樣細胞，失去軟骨細胞本身的生理特性，當去分化的軟骨細胞被移植到軟骨缺損處時，再生組織最終會變成纖維軟骨，與正常軟骨相比功能較差[40]。
近年來，許多研究表明干細胞來源的細胞膜片在軟骨修復方面具有極大的潛力，并展現出較好的軟骨形成能力，例如 Thorp 等[41]采用 BMSC 構建干細胞膜片，并利用自發的分離后膜片收縮和成軟骨誘導，制造無支架、透明樣軟骨結構，結果表明透明樣軟骨分化的干細胞膜片可以自發地黏附在軟骨組織上，且獲得的膜片在分化后成功地達到了健康的關節軟骨的透明樣表型。Le 等[42]將臍帶間充質干細胞膜片植入大鼠股骨頭骨軟骨缺損中，發現這種移植對 4 級（根據國際軟骨修復協會評分分級）骨軟骨股骨頭缺損的軟骨再生有積極作用，表明臍帶間充質干細胞膜片移植可促進晚期軟骨損傷的再生。You 等[43]在兔骨軟骨缺損模型中植入包裹軟骨顆粒的人羊膜間充質干細胞膜片，組織學染色表明人羊膜間充質干細胞膜片/軟骨顆粒組在缺損區形成大量透明樣軟骨，且與周圍正常軟骨結合良好。Thorp 等[44]研究了干細胞膜片多層化對體外構建透明質軟骨三維分層結構的影響，發現構建厚度從 14 μm（1 層構建）到 25 μm（2 層構建）增加了細胞鈣黏蛋白、連接蛋白和整合素的相互作用和隨后的體外軟骨形成。然而，初始厚度 33 μm（3 層結構）的膜片則明顯降低了體外軟骨形成的速度和程度，阻礙 3 層結構透明樣分化的主要限制因素可能是氧氣和營養物質的擴散不足。此外，也有研究人員認識到軟骨和軟骨下骨之間的界面在較短時間內重建骨軟骨損傷的重要性[45]。如果沒有過渡層形成鈣化的軟骨帶，形成的軟骨和軟骨下骨的結合強度可能不夠[46]。Jin 等[47]發現 1∶1 比例的成軟骨和成骨誘導培養基可以有效地誘導 BMSC 膜片向鈣化軟骨方向分化，模擬軟骨到骨的梯度變化，從而構建骨軟骨復合體，并移植到兔膝關節骨軟骨缺損處，結果表明與無梯度的多層結構相比，其能促進組織再生，形成完整的軟骨層。
細胞外基質支架是一種理想的生物材料，它含有能夠滋養和支持駐留細胞的生物活性分子[48]，保留了原始組織的結構和大部分功能特性。將干細胞來源細胞膜片與細胞外基質支架相結合的組織工程學在軟骨修復方面具有巨大的臨床潛力。Wang 等[49]用不同濃度的十二烷基硫酸鈉對同種異體 BMSC 膜片進行脫細胞處理，從而衍生出一種細胞外基質支架，并用于兔骨軟骨重建。Zhang 等[50]用 ADSC 膜片包裹微孔脫細胞骨軟骨細胞外基質支架，并將其植入兔髕骨骨軟骨缺損模型中，探索該復合物促進軟骨修復及再生軟骨組織和周圍天然軟骨之間界面整合的效果。結果表明，與對照組相比，包被了微孔骨軟骨脫細胞基質支架的干細胞膜片幾乎復制了正常的關節軟骨結構，具備更好的軟骨形成及界面整合能力。
4 小結與展望
本文詳細闡述了細胞膜片的制備方法及干細胞來源細胞膜片在骨與軟骨修復領域的研究進展。干細胞與細胞膜片技術的結合在骨與軟骨修復中的應用越來越廣泛，但其也面臨著一些問題。如何挑選合適的干細胞、如何將干細胞膜片更好地整合至支架上、如何改善膜片復合物的血運等有待解決。在未來，還需加強對細胞膜片分子機制的深入研究，才能充分發揮干細胞來源細胞膜片的優勢，以便讓其更好地滿足臨床需要。
作者貢獻：馬宏、邢飛負責綜述構思、資料搜集、觀點形成、文章撰寫及修改，段鑫負責綜述立題、構思建議、文章初稿修改，項舟負責對綜述構思提出建議。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
感染、創傷、腫瘤等原因造成的骨與軟骨損傷一直是骨科臨床工作的一項難題。組織工程的發展為組織修復提供了新的方法。傳統的組織工程方法主要通過酶消化獲得足夠量的種子細胞，將這些細胞的單細胞懸液直接注射到局部區域或者接種在可生物降解的支架上來支持組織形成[1]。但在構建過程中，酶的應用將導致細胞外基質被破壞，單一干細胞注射存在大量細胞丟失和低存活率的問題[2]。為了克服這些缺點，細胞膜片技術因不需要酶或侵襲過程能完整保存細胞外基質、細胞間連接等，而提高局部細胞接種率[3]。間充質干細胞是目前廣泛應用的種子細胞之一，其具有廣泛的來源，可以分化為骨、軟骨等組織，同時還具有潛在的抗炎、抗免疫的作用[4]。因此，越來越多的學者將間充質干細胞同細胞膜片技術聯合起來應用于骨與軟骨損傷中[5-6]。本文綜述了干細胞膜片的種類、特性及構建方法，以及干細胞膜片血管化、各種細胞因子和支架材料干細胞膜片用于骨與軟骨損傷修復的研究進展，旨在探索干細胞膜片在骨與軟骨修復的進一步發展方向。
1 干細胞膜片
1.1 干細胞膜片的種類
干細胞膜片根據細胞來源，可分為骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cell, BMSC）膜片、脂肪間充質干細胞（adipose-derived stem cell, ADSC）膜片、臍帶間充質干細胞膜片等。根據細胞層數，可分為單層細胞膜片、雙層細胞膜片和多層細胞膜片。
1.2 干細胞膜片的構建
干細胞膜片的構建主要以特殊材料組成的培養基底為基礎。通過改變溫度、光、pH 等刺激因素，改變材料對細胞的黏附行為，使細胞自然脫離，從而產生細胞膜片。
1.2.1 溫度控制法
聚 N-異丙基丙烯酰胺通常以共價結合的方式被固定在培養容器的表面。隨著環境溫度的變化，聚 N-異丙基丙烯酰胺發生疏水性/親水性的快速轉變，從而使細胞的黏附和分離能夠隨著溫度的變化而控制。采用這種方法時，無需任何酶處理即可獲得培養在溫度敏感型細胞培養皿上的貼壁細胞作為連續完整的活細胞膜片[7]。溫度控制法是目前收獲細胞膜片最常用的制備方法，其操作簡便，但需要特殊培養皿，價格昂貴，收獲時間對溫度反應性培養皿表面的優化可以提高細胞培養和細胞膜片分離的效率。Choi 等[8]使用聚 N-異丙基丙烯酰胺納米拓撲術將干細胞膜片的總收獲期縮短至 2 d，極大地縮短了膜片的總收獲期。
1.2.2 機械搔刮法
機械搔刮法是指干細胞在培養皿中形成膜片后，用細胞刮刀及鑷子將膜片從培養皿表面剝離。Weng 等[9]在成骨培養基內添加抗壞血酸促進間充質干細胞細胞外基質分泌，通過細胞刮刀從培養皿邊緣向中心刮取而獲得干細胞膜片。機械搔刮法是目前制備干細胞膜片最簡單的一種方法，不需要特殊的培養皿或技術，但是其制備膜片的時間較長，通常需要 2 周。
1.2.3 磁反應法
磁誘導干細胞膜片主要通過細胞內吞作用，將磁性納米顆粒內吞到細胞內，在外加磁場的控制下逐層堆疊，形成多層或含不同共培養細胞類型的干細胞膜片。Silva 等[10]在磁力的幫助下，通過細胞內化的四氧化三鐵納米顆粒來構建多層預血運磁性細胞膜片用于骨再生。與傳統的溫度響應型細胞片制備方法相比，磁控策略具有操縱多種細胞類型形成復雜細胞膜片的獨特能力。
1.2.4 光反應法
光誘導細胞膜片技術作為一種新的方法出現，最早是由 Hong 等[11]將細胞培養在二氧化鈦納米涂層的培養皿上，在 365 nm 紫外光照射下介導二氧化鈦親水性及疏水性的變化，從而形成細胞膜片。Jiang 等[12]發現光反應系統可以產生較少損傷的 BMSC 膜片，并能夠改善膜片的活力和成骨能力。與溫度、磁、pH、電等其他因素相比，光照射法具有非侵入性、控制準確的優點[13]。在適當的波長、功率密度和曝光時間下，光照對細胞的存活和后續的細胞行為是安全的[12]。
1.3 干細胞膜片的特性
干細胞膜片因其不需要酶或侵襲過程，保留了細胞外基質、細胞-細胞連接和細胞-細胞外基質連接，提高了局部細胞接種率[14]。研究顯示，以細胞膜片形式收獲的干細胞存活率和旁分泌因子分泌能力更高[15]。干細胞膜片中細胞外基質蛋白起到了組織黏合劑的作用，允許干細胞膜片在不需要支撐材料的情況下自發黏附在生物表面，并且可以通過層疊多個細胞膜片來制造三維細胞密度組織[16]。此外，干細胞膜片具有一定的機械強度，可單獨應用于組織修復，也可以與各種細胞因子、支架材料等復合。
2 干細胞膜片在骨修復中的應用
干細胞膜片具有一定的機械強度和可操作性，可以通過疊加構建理想厚度的細胞膜片，以夯實和注射的方式將其植入生物體內[17]。目前，其在骨缺損修復的應用取得了不錯的成果。Fujii 等[18]表明牙髓間充質干細胞膜片能夠在小鼠顱骨缺損模型中成功地愈合骨。Yoshida 等[19]在使用 ADSC 膜片填塞大鼠股骨遠端干骺端的鉆孔骨缺損實驗中發現，對照組在術后 4 周仍有部分孔洞，而 ADSC 膜片則幾乎完全修復了孔洞。Liu 等[20]比較了不同來源的間充質干細胞膜片在兔顱骨缺損模型中的修復效果，發現牙槽骨源性間充質干細胞膜片比髂骨源性間充質干細胞膜片具備更好的成骨能力。
轉染技術的應用及細胞因子、金屬顆粒與干細胞膜片的復合可促進成骨。Kim 等[21]將骨形態發生蛋白-7 基因轉染到 ADSC 膜片上，可顯著提高其成骨能力。Wang 等[22]將負載微 RNA-21 的殼聚糖/透明質酸納米顆粒反向轉染 BMSC 膜片，成功地誘導 BMSC 膜片成骨，發現微 RNA-21 能上調鈣化相關基因的表達，促進堿性磷酸酶的產生、膠原的分泌和礦化結節的形成。Zhang 等[23]通過腺病毒載體建立了高表達 Parkin（泛素連接酶）的 BMSC 膜片，發現表達高含量 Parkin 的膜片可增加成骨相關基因蛋白的表達，并通過自噬信號的上調，加速大鼠脛骨骨折愈合。Dang 等[24]將 BMSC 膜片與納米微粒相結合構建無支架干細胞構建體，并將其植入大鼠臨界大小的顱骨缺損模型中。該微粒以明膠與羥基磷灰石為載體，能夠早期釋放轉化生長因子β1 以誘導軟骨形成，并以更持續的方式釋放骨形態發生蛋白-2 以促進軟骨內成骨。為了避免局部骨組織自體干細胞的干擾，Zhang 等[25]在免疫缺陷小鼠異位移植的模型中植入了由含金納米顆粒的成骨誘導培養液收獲的牙周膜干細胞膜片，結果表明與對照組相比，金納米顆粒能夠明顯提高牙周膜干細胞膜片的成骨能力，促進成骨分化和基質礦化。此外，調節細胞膜信號通路也被廣泛地應用于成骨研究。He 等[26]證實磁性氧化石墨烯在低濃度下具有生物相容性，且可能通過 Wnt/β聯蛋白和骨形態發生蛋白信號通路顯著促進 BMSC 膜片的成骨分化。在另一項研究中，Tian 等[27]發現 Jagged 1 蛋白介導的 Notch 激活可以克服高密度細胞膜片培養引起的干細胞老化，并增強體內細胞片的成骨能力。
在骨缺損修復中，血管生成不足是組織工程中修復大塊骨缺損的難題之一。細胞膜片技術為血管形成提供了良好的微環境，因為該技術可以保留對血管生成至關重要的完整的細胞外基質。近年來，研究者主要通過不同細胞共培養來促進細胞膜片血管化。研究表明，內皮祖細胞（endothelial progenitor cell, EPC）可以為 BMSC 的成骨分化提供局部微環境，而 EPC 與 BMSC 的結合不僅在體外可以促進成骨細胞的分化，并在體內通過支持骨再生促進骨愈合[28]。此外，ADSC 因較 BMSC 來源更廣泛、更方便獲取。Zhang 等[29]通過疊加兔成骨誘導的 ADSC 膜片和血管內皮細胞膜片，構建了雙層細胞膜片，發現該復合細胞膜片能夠促進兔大段骨缺損的修復。Wang 等[30]誘導 ADSC 定向分化為 EPC，并將其接種于成骨誘導的 ADSC 膜片上，通過“三明治”方式疊加至 3 層，構建成骨 ADSC-EPC 膜片復合體，影像學和組織學顯示，該復合體在兔顱骨缺損模型中形成致密、血管化良好的新骨組織，且修復程度明顯大于對照組。此外，Wu 等[31]在 2 型糖尿病大鼠雙側顱骨缺損模型中，探究在高糖條件下 EPC 是否能促進 BMSC 的成骨，并探討其可能的機制。結果表明，BMSC/EPC 復合膜片組的骨再生能力最強，F-肌動蛋白/YAP（Yes associated protein）通路在 BMSC 的成骨分化中起重要作用。
細胞膜片因其物理特性較軟而無法起到支撐作用，且不能用于較大的骨缺損，因此研究者利用細胞膜片包被支架材料來進行骨缺損修復，充分發揮骨組織工程支架和細胞膜片各自的優勢。Lin 等[32]設計了一種具有廣泛孔隙率和適當孔徑的β-磷酸三鈣/Ⅰ型膠原復合支架，將其與成骨誘導的 BMSC 膜片結合在一起，并移植到裸鼠皮下，與對照組相比，該組在第 4 周可觀察到明顯的新骨形成。Shan 等[33]將包被了 PLGA（聚丙交酯-乙交酯）支架的 BMSC 膜片植入犬下頜骨缺損模型中，組織學和影像學顯示實驗組較對照組有較多的中央管和紅骨髓，并含有較多的板層骨。Xue 等[34]使用負載高遷移率族蛋白的明膠海綿支架結合 BMSC 膜片，發現其可以促進大鼠脛骨骨折手術后的骨愈合。Zhang 等[35]制備了干細胞來源的預血運 BMSC 膜片和成骨細胞膜片，然后將這 2 個細胞片堆疊在一起模擬天然骨膜，通過包裹多孔支架，形成仿生骨膜/支架復合體，并將其植入大鼠顱骨缺損區。研究結果表明，與自體骨膜相比，具有多孔支架的仿生骨膜具有相似的體內成骨和血管生成的能力。Wang 等[36]發現復合納米羥基磷灰石和自體富血小板纖維蛋白顆粒的 BMSC 膜片可促進兔顱骨臨界大小缺損的骨再生。Zhang 等[29]誘導兔 ADSC 分化為成骨細胞和血管內皮細胞，利用細胞膜片技術，獲得成骨和血管內皮細胞雙層細胞膜片，再復合聚賴氨酸修飾的珊瑚羥基磷灰石支架，構建血管化組織工程骨，并植入兔橈骨大段骨缺損中。結果顯示，聚賴氨酸能有效促進 ADSC 的黏附、增殖和分化，構建的血管化組織工程骨的成骨過程、血管化程度都遠快于珊瑚羥基磷灰石支架。
3 干細胞膜片在軟骨修復中的應用
關節軟骨是一種無血管和神經的組織，且處于嚴酷的生物力學環境，受到損傷后的愈合能力很差。軟骨缺損是導致關節疼痛和殘疾的重要原因。目前，微骨折等骨髓刺激技術是臨床實踐中最常用的方法[37]。然而，由此產生的混合透明的纖維軟骨組織不如天然透明軟骨，特別是其承受壓力的能力[38]。軟骨缺損的新療法采用細胞膜片技術，該技術允許收獲具有豐富細胞外基質和細胞的完整細胞膜片。與其他細胞膜片相比，軟骨細胞膜片在軟骨缺損修復中的應用研究更多[39]。遺憾的是，軟骨細胞在體外培養過程中容易去分化變成纖維樣細胞，失去軟骨細胞本身的生理特性，當去分化的軟骨細胞被移植到軟骨缺損處時，再生組織最終會變成纖維軟骨，與正常軟骨相比功能較差[40]。
近年來，許多研究表明干細胞來源的細胞膜片在軟骨修復方面具有極大的潛力，并展現出較好的軟骨形成能力，例如 Thorp 等[41]采用 BMSC 構建干細胞膜片，并利用自發的分離后膜片收縮和成軟骨誘導，制造無支架、透明樣軟骨結構，結果表明透明樣軟骨分化的干細胞膜片可以自發地黏附在軟骨組織上，且獲得的膜片在分化后成功地達到了健康的關節軟骨的透明樣表型。Le 等[42]將臍帶間充質干細胞膜片植入大鼠股骨頭骨軟骨缺損中，發現這種移植對 4 級（根據國際軟骨修復協會評分分級）骨軟骨股骨頭缺損的軟骨再生有積極作用，表明臍帶間充質干細胞膜片移植可促進晚期軟骨損傷的再生。You 等[43]在兔骨軟骨缺損模型中植入包裹軟骨顆粒的人羊膜間充質干細胞膜片，組織學染色表明人羊膜間充質干細胞膜片/軟骨顆粒組在缺損區形成大量透明樣軟骨，且與周圍正常軟骨結合良好。Thorp 等[44]研究了干細胞膜片多層化對體外構建透明質軟骨三維分層結構的影響，發現構建厚度從 14 μm（1 層構建）到 25 μm（2 層構建）增加了細胞鈣黏蛋白、連接蛋白和整合素的相互作用和隨后的體外軟骨形成。然而，初始厚度 33 μm（3 層結構）的膜片則明顯降低了體外軟骨形成的速度和程度，阻礙 3 層結構透明樣分化的主要限制因素可能是氧氣和營養物質的擴散不足。此外，也有研究人員認識到軟骨和軟骨下骨之間的界面在較短時間內重建骨軟骨損傷的重要性[45]。如果沒有過渡層形成鈣化的軟骨帶，形成的軟骨和軟骨下骨的結合強度可能不夠[46]。Jin 等[47]發現 1∶1 比例的成軟骨和成骨誘導培養基可以有效地誘導 BMSC 膜片向鈣化軟骨方向分化，模擬軟骨到骨的梯度變化，從而構建骨軟骨復合體，并移植到兔膝關節骨軟骨缺損處，結果表明與無梯度的多層結構相比，其能促進組織再生，形成完整的軟骨層。
細胞外基質支架是一種理想的生物材料，它含有能夠滋養和支持駐留細胞的生物活性分子[48]，保留了原始組織的結構和大部分功能特性。將干細胞來源細胞膜片與細胞外基質支架相結合的組織工程學在軟骨修復方面具有巨大的臨床潛力。Wang 等[49]用不同濃度的十二烷基硫酸鈉對同種異體 BMSC 膜片進行脫細胞處理，從而衍生出一種細胞外基質支架，并用于兔骨軟骨重建。Zhang 等[50]用 ADSC 膜片包裹微孔脫細胞骨軟骨細胞外基質支架，并將其植入兔髕骨骨軟骨缺損模型中，探索該復合物促進軟骨修復及再生軟骨組織和周圍天然軟骨之間界面整合的效果。結果表明，與對照組相比，包被了微孔骨軟骨脫細胞基質支架的干細胞膜片幾乎復制了正常的關節軟骨結構，具備更好的軟骨形成及界面整合能力。
4 小結與展望
本文詳細闡述了細胞膜片的制備方法及干細胞來源細胞膜片在骨與軟骨修復領域的研究進展。干細胞與細胞膜片技術的結合在骨與軟骨修復中的應用越來越廣泛，但其也面臨著一些問題。如何挑選合適的干細胞、如何將干細胞膜片更好地整合至支架上、如何改善膜片復合物的血運等有待解決。在未來，還需加強對細胞膜片分子機制的深入研究，才能充分發揮干細胞來源細胞膜片的優勢，以便讓其更好地滿足臨床需要。
作者貢獻：馬宏、邢飛負責綜述構思、資料搜集、觀點形成、文章撰寫及修改，段鑫負責綜述立題、構思建議、文章初稿修改，項舟負責對綜述構思提出建議。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。