鐵作為大多數生物體必須的微量元素，是執行關鍵反應的各種酶的重要輔因子，鐵載體已被認為是重要的毒力因子。cAMP 受體蛋白是一個整體調控子，直接或間接參與了某些原核生物以及真核生物鐵載體相關基因的調控。該文簡單介紹了 cAMP 受體蛋白，并就 cAMP 受體蛋白對肺炎克雷伯菌、鼠疫耶爾森菌、創傷弧菌及新型隱球菌等菌種鐵載體相關毒力基因的調控進行綜述，以期為明確 cAMP 受體蛋白對鐵載體的調控機制打下理論基礎，并為致病菌毒力控制及臨床防治提供參考。
引用本文： 畢建蝶, 杜艷. cAMP受體蛋白對鐵載體相關毒力基因的調控. 華西醫學, 2020, 35(8): 995-998. doi: 10.7507/1002-0179.202006351 復制
鐵是大多數生物體必需的微量元素，是執行電子傳遞、抵抗活性氧中間體和 RNA 的合成等[1]關鍵反應的各種酶的重要輔因子。自然環境中鐵主要以較難溶解的三價鐵（Fe3+）的化合物形式存在，生物利用率普遍較低，幾乎所有已知的菌種都會分泌鐵載體以應對生長和代謝過程中鐵的短缺[2]。在很多病原菌中鐵載體被看作是重要的毒力因子之一，它能夠讓病原菌在缺鐵的環境中也可以生存繁殖并引起嚴重感染[3]。cAMP 受體蛋白（cAMP receptor protein，CRP）是一個整體調控子，參與調控包括原核生物和真核生物等許多微生物基因的表達。關于 CRP 的調控作用，最早發現其對真核生物有代謝和免疫調節作用，而在后期的研究中 CRP 被發現能夠直接調控致病菌莢膜多糖、菌毛和生物膜等多種毒力基因的表達[4-6]。目前關于 CRP 對細菌鐵載體相關毒力基因調控的具體機制尚未完全明了。該文簡單介紹了 CRP，并就 CRP 對鐵載體相關毒力基因的調控進行綜述，以期為明確 CRP 對鐵載體的調控機制打下理論基礎，并為致病菌毒力控制及臨床防治提供參考。
1 CRP
CRP 也稱為分解代謝激活蛋白，是一個具有 DNA 結合區及 cAMP 結合位點的同二聚體[7]。CRP 同 cAMP 結合后再與保守的 DNA 序列結合，從中能夠以一種簡單的機制激活或抑制來自各種啟動子的轉錄啟動，從而控制細菌新陳代謝、蛋白質分泌和毒力。cAMP 與大腸桿菌 CRP 有很高的結合親和力，在 1∶1 的 cAMP/CRP 相互作用中使 DNA 結合增加約 1 000 倍[8]。在細菌中，所有基因都由一種 RNA 聚合酶全酶轉錄，該全酶由一種五亞單位核心酶（α2ββ′ω）和一種 sigma 因子組成。聚合酶識別某些啟動子序列以啟動轉錄，這一過程恰好就需要 CRP 作為激活劑來激活[9]。在 CRP 依賴的啟動子中，CRP 通過與 RNA 聚合酶的直接蛋白-蛋白相互作用激活轉錄，激活機制一般根據其不同的交互模式分為兩類：一類是通過lac啟動子處的大腸桿菌 CRP 與核心啟動子上游的特定 DNA 位點結合，并促進 RNA 聚合酶全酶結合形成 RNA 聚合酶啟動子封閉復合物來刺激轉錄；另一類則是通過gal啟動子處的大腸桿菌 CRP 與核心啟動子重疊的特定 DNA 位點結合來刺激轉錄，并促進 RNA 聚合酶啟動子封閉復合物轉化為具有催化活性的 RNA 聚合酶啟動子開放復合物[10]。CRP 本身不具有活性，只有同 cAMP 結合形成 CRP-cAMP 復合物后才能結合特定 DNA 序列，以調控靶基因進行起始轉錄。
2 不同菌種中 CRP 調控鐵載體相關基因
2.1 肺炎克雷伯菌
肺炎克雷伯菌通過鐵載體系統攝取足夠的鐵才能使其在感染期間生存和繁殖[11]。已報道的與肺炎克雷伯菌毒力密切相關的鐵載體主要是氣桿菌素腸桿菌素、沙門菌素和耶爾森菌素 4 種，分別由iuc基因、ent基因、iro基因和irp基因進行編碼[12]。肺炎克雷伯菌作為公認的多藥耐藥醫療相關感染的病原體，由于移動輔助基因的存在，個別菌株的毒力潛力有所不同，特別是編碼鐵載體氣桿菌素和沙門菌素生物合成的基因簇與侵襲性疾病有關，并且在引起嚴重社區相關感染（如肝膿腫和肺炎）的超強毒力肺炎克雷伯菌中很常見[13]。Russo 等[14]已經證明了在缺鐵的環境中超強毒力肺炎克雷伯菌比普通肺炎克雷伯菌產生的鐵載體多。Arabaghian 等[15]對 34 株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌進行毒力基因檢測，結果顯示 55.9% 的菌株存在耶爾森菌素鐵載體，35% 的菌株存在 kfu 鐵攝取系統。Fe3+的攝取是由kfuA、kfuB和kfuC（三價鐵 ABC 轉運體）基因編碼的[16]，楊世亞[17]對kfuABC啟動子區的結構進行分析，發現﹣204 到﹣171 間的堿基序列有 CRP 的結合位點，首次證實 CRP 負調控kfuABC基因的轉錄。同時 CRP 也能夠聯合鐵離子攝取調節子對肺炎克雷伯菌菌株鐵攝取基因進行調控[17]。高倩倩等[18]發現entB、ybtS基因攜帶率較高，entB、ybtS基因都是屬于鐵載體系統，既能抑制 T 淋巴細胞增殖又能幫助細菌攝取鐵，并且和肺炎克雷伯菌的毒力密切相關。然而 CRP 是否通過調控entB和ybtS的表達而影響菌株毒力還有待研究。
2.2 鼠疫耶爾森菌
鼠疫耶爾森菌是肺鼠疫、腺鼠疫和敗血癥鼠疫的病原體。在多種感染途徑中，鼠疫耶爾森菌主要靠分泌耶爾菌素鐵載體來獲取鐵，對其致病性至關重要[19]，而 CRP 則是鼠疫菌重要的轉錄調控因子[20]。當 CRP 與 cAMP 結合時，可激活或抑制耶爾森菌中數百個基因的表達。CRP 能夠間接抑制耶爾菌素的生物合成和攝取相關基因（耶爾菌素受體基因fyuA和控制耶爾菌素位點表達的轉錄調控基因ybtA）的表達，導致生產耶爾菌素和運輸血紅素所需的irp基因的表達水平也降低[21]。在crp突變株中fyuA和ybtA基因表達水平上升，經驗證 CRP 并不與對應于ybtA或fyuA啟動子的序列結合，說明CRP 對耶爾菌素的控制可能是間接的[21]。ybt和irp基因在肺鼠疫期間對鐵的獲取、毒性和炎癥至關重要[22]。在肺炎早期耶爾菌素是必需的，并且在葡萄糖充足和crp表達較低時表達，隨著肺炎進展到促炎期，宿主細胞死于熱休克，鐵通過其他途徑獲得更加有效，CRP 間接關閉耶爾菌素基因的表達[23-24]。可見鼠疫耶爾森菌 CRP 與鐵攝取相關基因之間的調節是復雜多樣的。
2.3 創傷弧菌
創傷弧菌是一種革蘭陰性嗜鹽細菌，可引起迅速發展的致命性敗血癥和壞死性傷口感染。一些已確定的毒力因子莢膜多糖、鐵攝取系統、菌毛、細胞毒素和外毒素等，已被報道在創傷弧菌感染的發病機制中發揮重要作用[25]。這些毒力因子的協同表達是創傷弧菌致病所必需的，并受整體調控因子 CRP 的直接或間接調控[26]。鐵是包括創傷弧菌在內的大多數細菌生存和增殖所必需的元素，獲取鐵的能力是創傷弧菌感染致病機制中最確定的毒力因素之一。創傷肌動蛋白受體 VuuA 介導的鐵載體系統是創傷弧菌獲得鐵的重要方式，該系統受 CRP 的正調控[27]。創傷弧菌具有的血紅素受體 HupA 可以直接從各種血紅素蛋白中獲取鐵，此外它還可以利用大腸桿菌鐵載體氣桿菌素的特異性受體 iutA 獲得鐵。hupA和iutA基因的表達受 CRP 的正調控[28-29]。在鐵限制條件下，溫度變化能夠通過促進的新陳代謝促進VuuA和crp基因的表達，并且 CRP 和 VuuA 介導的鐵載體系統協同作用，達到創傷弧菌的最佳新陳代謝[27]。在鐵限制條件下，溫度變化介導的VuuA基因或crp基因表達變化的潛在機制還需要進一步的實驗來確定。
2.4 其他菌種
在大腸桿菌中鐵-碳代謝相互聯系的情況下，許多鐵代謝基因受到 CRP 和鐵離子攝取調節子的雙重調控，腸桿菌素鐵載體基因entABCEF和檸檬酸鐵（一種異源鐵載體）基因fecABE被鐵離子攝取調節子抑制但被 CRP 激活[30]。此外，在一種與心內膜炎、菌血癥、囊性纖維化、呼吸道和泌尿道、中樞神經系統、眼睛、皮膚和軟組織感染有關的人類病原體嗜麥芽窄食單胞菌中，同樣存在一個由fecA介導的檸檬酸鐵轉運系統，該系統受 CRP 的控制。CRP 是rpfF的轉錄激活劑，通過結合rpfF啟動子的上游區域進而影響fecA的表達[31]。
在細菌這類原核生物中，CRP 的調控作用相對簡單，只需結合成 CRP-cAMP 復合物形式直接與 RNA 聚合酶相互作用，就可以激活靶基因的起始轉錄。而在真核生物中，CRP 對靶基因的激活起始必須依賴蛋白激酶 A 途徑，CRP-cAMP 復合物需先與蛋白激酶 A 結合，激活蛋白激酶 A 活性后才能激活靶基因的轉錄[17]。新型隱球菌中鐵的的攝取主要就是通過 cAMP/蛋白激酶 A 途徑調節鐵載體轉運體的SIT1（signaling threshold regulating transmembrane adaptor 1）基因，蛋白激酶 A 催化亞單位基因的缺失導致SIT1的轉錄水平升高[32]。綜上，CRP 對各種微生物鐵載體相關毒力基因的調控機制是存在顯著差異的，尤其是在真核生物與原核生物中。
3 總結和展望
CRP 是病原菌中普遍存在的一個整體調控子，直接或間接參與了肺炎克雷伯菌、鼠疫耶爾森菌及創傷弧菌等菌種鐵載體相關基因的調控，對病原菌在缺鐵環境中的生長繁殖具有重要作用。CRP 既可單獨也可協同其他調控子共同調控細菌各種毒力基因及相應表型，構建了一個復雜的轉錄調控網絡。然而對于 CRP 在某些細菌中如何調控某些毒力基因的表達機制還不是很明確，深入研究 CRP 對鐵載體相關毒力基因的調控機制將有助于完善 CRP 調控網絡，為致病菌毒力控制及臨床防治提供更加可靠的依據。
鐵是大多數生物體必需的微量元素，是執行電子傳遞、抵抗活性氧中間體和 RNA 的合成等[1]關鍵反應的各種酶的重要輔因子。自然環境中鐵主要以較難溶解的三價鐵（Fe3+）的化合物形式存在，生物利用率普遍較低，幾乎所有已知的菌種都會分泌鐵載體以應對生長和代謝過程中鐵的短缺[2]。在很多病原菌中鐵載體被看作是重要的毒力因子之一，它能夠讓病原菌在缺鐵的環境中也可以生存繁殖并引起嚴重感染[3]。cAMP 受體蛋白（cAMP receptor protein，CRP）是一個整體調控子，參與調控包括原核生物和真核生物等許多微生物基因的表達。關于 CRP 的調控作用，最早發現其對真核生物有代謝和免疫調節作用，而在后期的研究中 CRP 被發現能夠直接調控致病菌莢膜多糖、菌毛和生物膜等多種毒力基因的表達[4-6]。目前關于 CRP 對細菌鐵載體相關毒力基因調控的具體機制尚未完全明了。該文簡單介紹了 CRP，并就 CRP 對鐵載體相關毒力基因的調控進行綜述，以期為明確 CRP 對鐵載體的調控機制打下理論基礎，并為致病菌毒力控制及臨床防治提供參考。
1 CRP
CRP 也稱為分解代謝激活蛋白，是一個具有 DNA 結合區及 cAMP 結合位點的同二聚體[7]。CRP 同 cAMP 結合后再與保守的 DNA 序列結合，從中能夠以一種簡單的機制激活或抑制來自各種啟動子的轉錄啟動，從而控制細菌新陳代謝、蛋白質分泌和毒力。cAMP 與大腸桿菌 CRP 有很高的結合親和力，在 1∶1 的 cAMP/CRP 相互作用中使 DNA 結合增加約 1 000 倍[8]。在細菌中，所有基因都由一種 RNA 聚合酶全酶轉錄，該全酶由一種五亞單位核心酶（α2ββ′ω）和一種 sigma 因子組成。聚合酶識別某些啟動子序列以啟動轉錄，這一過程恰好就需要 CRP 作為激活劑來激活[9]。在 CRP 依賴的啟動子中，CRP 通過與 RNA 聚合酶的直接蛋白-蛋白相互作用激活轉錄，激活機制一般根據其不同的交互模式分為兩類：一類是通過lac啟動子處的大腸桿菌 CRP 與核心啟動子上游的特定 DNA 位點結合，并促進 RNA 聚合酶全酶結合形成 RNA 聚合酶啟動子封閉復合物來刺激轉錄；另一類則是通過gal啟動子處的大腸桿菌 CRP 與核心啟動子重疊的特定 DNA 位點結合來刺激轉錄，并促進 RNA 聚合酶啟動子封閉復合物轉化為具有催化活性的 RNA 聚合酶啟動子開放復合物[10]。CRP 本身不具有活性，只有同 cAMP 結合形成 CRP-cAMP 復合物后才能結合特定 DNA 序列，以調控靶基因進行起始轉錄。
2 不同菌種中 CRP 調控鐵載體相關基因
2.1 肺炎克雷伯菌
肺炎克雷伯菌通過鐵載體系統攝取足夠的鐵才能使其在感染期間生存和繁殖[11]。已報道的與肺炎克雷伯菌毒力密切相關的鐵載體主要是氣桿菌素腸桿菌素、沙門菌素和耶爾森菌素 4 種，分別由iuc基因、ent基因、iro基因和irp基因進行編碼[12]。肺炎克雷伯菌作為公認的多藥耐藥醫療相關感染的病原體，由于移動輔助基因的存在，個別菌株的毒力潛力有所不同，特別是編碼鐵載體氣桿菌素和沙門菌素生物合成的基因簇與侵襲性疾病有關，并且在引起嚴重社區相關感染（如肝膿腫和肺炎）的超強毒力肺炎克雷伯菌中很常見[13]。Russo 等[14]已經證明了在缺鐵的環境中超強毒力肺炎克雷伯菌比普通肺炎克雷伯菌產生的鐵載體多。Arabaghian 等[15]對 34 株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌進行毒力基因檢測，結果顯示 55.9% 的菌株存在耶爾森菌素鐵載體，35% 的菌株存在 kfu 鐵攝取系統。Fe3+的攝取是由kfuA、kfuB和kfuC（三價鐵 ABC 轉運體）基因編碼的[16]，楊世亞[17]對kfuABC啟動子區的結構進行分析，發現﹣204 到﹣171 間的堿基序列有 CRP 的結合位點，首次證實 CRP 負調控kfuABC基因的轉錄。同時 CRP 也能夠聯合鐵離子攝取調節子對肺炎克雷伯菌菌株鐵攝取基因進行調控[17]。高倩倩等[18]發現entB、ybtS基因攜帶率較高，entB、ybtS基因都是屬于鐵載體系統，既能抑制 T 淋巴細胞增殖又能幫助細菌攝取鐵，并且和肺炎克雷伯菌的毒力密切相關。然而 CRP 是否通過調控entB和ybtS的表達而影響菌株毒力還有待研究。
2.2 鼠疫耶爾森菌
鼠疫耶爾森菌是肺鼠疫、腺鼠疫和敗血癥鼠疫的病原體。在多種感染途徑中，鼠疫耶爾森菌主要靠分泌耶爾菌素鐵載體來獲取鐵，對其致病性至關重要[19]，而 CRP 則是鼠疫菌重要的轉錄調控因子[20]。當 CRP 與 cAMP 結合時，可激活或抑制耶爾森菌中數百個基因的表達。CRP 能夠間接抑制耶爾菌素的生物合成和攝取相關基因（耶爾菌素受體基因fyuA和控制耶爾菌素位點表達的轉錄調控基因ybtA）的表達，導致生產耶爾菌素和運輸血紅素所需的irp基因的表達水平也降低[21]。在crp突變株中fyuA和ybtA基因表達水平上升，經驗證 CRP 并不與對應于ybtA或fyuA啟動子的序列結合，說明CRP 對耶爾菌素的控制可能是間接的[21]。ybt和irp基因在肺鼠疫期間對鐵的獲取、毒性和炎癥至關重要[22]。在肺炎早期耶爾菌素是必需的，并且在葡萄糖充足和crp表達較低時表達，隨著肺炎進展到促炎期，宿主細胞死于熱休克，鐵通過其他途徑獲得更加有效，CRP 間接關閉耶爾菌素基因的表達[23-24]。可見鼠疫耶爾森菌 CRP 與鐵攝取相關基因之間的調節是復雜多樣的。
2.3 創傷弧菌
創傷弧菌是一種革蘭陰性嗜鹽細菌，可引起迅速發展的致命性敗血癥和壞死性傷口感染。一些已確定的毒力因子莢膜多糖、鐵攝取系統、菌毛、細胞毒素和外毒素等，已被報道在創傷弧菌感染的發病機制中發揮重要作用[25]。這些毒力因子的協同表達是創傷弧菌致病所必需的，并受整體調控因子 CRP 的直接或間接調控[26]。鐵是包括創傷弧菌在內的大多數細菌生存和增殖所必需的元素，獲取鐵的能力是創傷弧菌感染致病機制中最確定的毒力因素之一。創傷肌動蛋白受體 VuuA 介導的鐵載體系統是創傷弧菌獲得鐵的重要方式，該系統受 CRP 的正調控[27]。創傷弧菌具有的血紅素受體 HupA 可以直接從各種血紅素蛋白中獲取鐵，此外它還可以利用大腸桿菌鐵載體氣桿菌素的特異性受體 iutA 獲得鐵。hupA和iutA基因的表達受 CRP 的正調控[28-29]。在鐵限制條件下，溫度變化能夠通過促進的新陳代謝促進VuuA和crp基因的表達，并且 CRP 和 VuuA 介導的鐵載體系統協同作用，達到創傷弧菌的最佳新陳代謝[27]。在鐵限制條件下，溫度變化介導的VuuA基因或crp基因表達變化的潛在機制還需要進一步的實驗來確定。
2.4 其他菌種
在大腸桿菌中鐵-碳代謝相互聯系的情況下，許多鐵代謝基因受到 CRP 和鐵離子攝取調節子的雙重調控，腸桿菌素鐵載體基因entABCEF和檸檬酸鐵（一種異源鐵載體）基因fecABE被鐵離子攝取調節子抑制但被 CRP 激活[30]。此外，在一種與心內膜炎、菌血癥、囊性纖維化、呼吸道和泌尿道、中樞神經系統、眼睛、皮膚和軟組織感染有關的人類病原體嗜麥芽窄食單胞菌中，同樣存在一個由fecA介導的檸檬酸鐵轉運系統，該系統受 CRP 的控制。CRP 是rpfF的轉錄激活劑，通過結合rpfF啟動子的上游區域進而影響fecA的表達[31]。
在細菌這類原核生物中，CRP 的調控作用相對簡單，只需結合成 CRP-cAMP 復合物形式直接與 RNA 聚合酶相互作用，就可以激活靶基因的起始轉錄。而在真核生物中，CRP 對靶基因的激活起始必須依賴蛋白激酶 A 途徑，CRP-cAMP 復合物需先與蛋白激酶 A 結合，激活蛋白激酶 A 活性后才能激活靶基因的轉錄[17]。新型隱球菌中鐵的的攝取主要就是通過 cAMP/蛋白激酶 A 途徑調節鐵載體轉運體的SIT1（signaling threshold regulating transmembrane adaptor 1）基因，蛋白激酶 A 催化亞單位基因的缺失導致SIT1的轉錄水平升高[32]。綜上，CRP 對各種微生物鐵載體相關毒力基因的調控機制是存在顯著差異的，尤其是在真核生物與原核生物中。
3 總結和展望
CRP 是病原菌中普遍存在的一個整體調控子，直接或間接參與了肺炎克雷伯菌、鼠疫耶爾森菌及創傷弧菌等菌種鐵載體相關基因的調控，對病原菌在缺鐵環境中的生長繁殖具有重要作用。CRP 既可單獨也可協同其他調控子共同調控細菌各種毒力基因及相應表型，構建了一個復雜的轉錄調控網絡。然而對于 CRP 在某些細菌中如何調控某些毒力基因的表達機制還不是很明確，深入研究 CRP 對鐵載體相關毒力基因的調控機制將有助于完善 CRP 調控網絡，為致病菌毒力控制及臨床防治提供更加可靠的依據。