引用本文： 王登朝, 宋佳佳, 白浩, 劉堂喻亨, 焦琳, 吳濤, 巫麗娟, 張靜薇, 應斌武. HKDC-1 基因多態性與中國西部結核病患者一線抗結核藥物性肝損傷的相關性研究. 華西醫學, 2019, 34(8): 878-884. doi: 10.7507/1002-0179.201907076 復制
結核病是重大傳染性疾病之一。2017 年，結核病導致約 130 萬例非艾滋病毒感染患者死亡，位列單一感染源所致患者死亡的感染性疾病首位[1]。目前，包括異煙肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇等藥物在內的 6～9 個月聯合治療是結核病的標準療法。在治療過程中，抗結核藥物性肝損傷（anti-tuberculosis drug-induced liver injury，ATDILI）是主要的藥物不良反應，由于定義和治療方案的差異，其發生率在不同研究中有所不同，以往研究報告顯示 ATDILI 發病率從 1% 到 28% 不等[2-3]。ATDILI 常導致抗結核藥物的使用受限甚至治療失敗，因此，更多了解 ATDILI 可以幫助臨床醫生更好地選擇用藥方案。已有研究表明，大多數 ATDILI 發生與使用異煙肼有關。異煙肼生物活化及失活相關代謝關鍵酶是影響 ATDILI 發生的重要因素之一，異煙肼活性代謝產物的生成可導致肝細胞損傷[4-5]。多項研究發現異煙肼代謝酶相關基因多態性與 ATDILI 的發生發展相關，如 NAT2、CYP2E1 等[6-7]。隨著研究進展，異煙肼介導的線粒體功能障礙也被證實是 ATDILI 發生的重要機制之一[8-9]。研究發現己糖激酶結構域-1（hexokinase domain-containing protein 1，HKDC-1）具有低葡萄糖磷酸化能力，肝細胞是其主要表達場所之一，與肝細胞的線粒體功能高度有關。小鼠肝細胞模型顯示，HKDC-1 在肝細胞中過表達可導致其糖酵解能力和最大線粒體呼吸功能下降，從而導致線粒體功能障礙[10-11]。急性體內過表達致線粒體分裂標志物動力相關蛋白-1 增加，也提示 HKDC-1 過度誘導線粒體功能障礙[12-13]。但目前仍沒有研究探討 HKDC-1 基因多態性是否可導致 ATDILI 的發生。本研究旨在探討在中國西部結核病患者人群中 ATDILI 的發生與 HKDC-1 基因多態性之間的關系。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
連續收集 2016 年 11 月—2018 年 4 月四川大學華西醫院收治的 1 060 例高度疑似結核病例，排除艾滋病、乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎和用藥前肝腎功能異常的患者后，由經驗豐富的呼吸內科醫生根據典型結核病癥狀、結核微生物學和/或影像學證據以及有效的抗結核藥物治療判斷后，773 例患者確診為結核病。所有患者最初 2 個月均采用抗結核標準方案進行治療，包括異煙肼（300 mg/d）、利福平（600 mg/d）、吡嗪酰胺（1 500 mg/d）、乙胺丁醇（750 mg/d），隨后 4 個月使用包括異煙肼、利福平和乙胺丁醇在內的標準方案繼續進行治療。排除依從性差、缺乏隨訪、使用其他肝毒性藥物或轉用二線抗結核藥物的患者，最終納入 746 例符合條件的患者。根據患者用藥期間是否發生 ATDILI 將患者分為 ATDILI 組和非 ATDILI 組。本研究經四川大學華西醫院倫理委員會批準［審批號：2014 年審（198）號］，所有患者均提供知情同意書。
ATDILI 判斷標準：① 使用抗結核藥物治療之前，血清丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素正常；② 治療過程中，根據通用標準，患者 ALT 水平升高超過正常范圍高限 5 倍以上，或者 ALT 水平升高超高限 3 倍，同時伴有總膽紅素水平超正常高限 2 倍，或者具有典型的惡心、嘔吐、疼痛癥狀，或堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）≥2 倍正常高限，伴或不伴有谷氨酸轉移酶（glutamyl transpeptadase，GGT）升高；③ 在發生 ATDILI 前 2 周內，患者未接受具有潛在肝毒性藥物治療[14]。
1.2 研究方法
1.2.1 臨床資料收集
收集患者所有臨床數據，包括人口統計學資料、實驗室指標和常見臨床癥狀（發熱、盜汗、乏力、體重減輕），均通過電子病歷獲取。開始抗結核治療后，前 2 個月每 2 周檢測 1 次肝功能、全血計數等血液檢測指標，后 4 個月每 4 周檢測 1 次。記錄與結核病治療和預后相關的實驗室指標的峰值及谷值，以評估 ATDILI。
1.2.2 基因多態性的選擇
從 dbSNP 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/）中系統地選擇 HKDC-1 基因的候選單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）。納入標準：① 最小等位基因頻率大于 5%；② 候選 SNP 的選擇首先考慮潛在的功能區域，然后依次為外顯子區、啟動子區、內含子區和基因間區。篩選后，納入 7 個候選 SNP，包括 rs12248244、rs7085830、rs3740598、rs7899214、rs2102339、rs77607834 和 rs906219。
1.2.3 SNP 的分型
治療前收集所有參與者的 5 mL 乙二胺四乙酸抗凝血全血備用。根據標準操作程序，采用 QIAamp? DNA Blood Mini Kit（德國 Qiagen 公司）提取 DNA。所選 SNP 均采用 2×48-Plex SNPscanTM Kit（上海天昊生物技術公司）試劑盒進行分型。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 19.0 軟件進行統計分析。正態分布的連續變量采用均數±標準差表示，組間比較采用 t 檢驗；非正態分布的連續變量采用中位數（下四分位數，上四分位數）表示，組間比較采用 Wilcoxon 秩和檢驗；分類變量用絕對數和百分數表示，組間比較采用 χ2檢驗。此外，利用 PLINK（version 1.9）軟件（www.cog.genomics.org/plink/1.9/）進行等位基因分布和遺傳模型分析。比值比（odds ratio，OR）和 95% 置信區間（confidence interval，CI）被用作關聯的度量。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 研究人群基本特征與實驗室指標
本研究排除實驗中隨訪差、使用其他肝毒性藥物患者、更改應用二線抗結核藥物患者 27 例后共納入符合標準的患者 746 例，其中出現 ATDILI 的患者 118 例，未出現 ATDILI 的患者 628 例。兩組患者年齡、性別、飲酒史、吸煙史差異無統計學意義（P>0.05）。臨床癥狀中，夜間盜汗、乏力的發生率兩組間差異無統計學意義（P>0.05），而發熱、體重減輕的發生率在兩組間差異有統計學意義（P=0.004、0.024）。實驗室相關指標中，白細胞計數、紅細胞計數、血紅蛋白、血小板計數、C 反應蛋白、直接膽紅素在兩組間差異無統計學意義（P>0.05），盡管總膽紅素、ALP 和 GGT 在兩組間基線水平差異有統計學意義（P<0.05），但兩組治療前均處于正常范圍。見表 1。
表1
兩組人口學、臨床資料特征及實驗室指標
2.2 HKDC-1 基因多態性與 ATDILI 的關系
在 7 個 SNP 位點中，rs906219 的等位基因頻率分布和基因型頻率分布在兩組的差異均有統計學意義（P<0.05）。rs906219 的 C 等位基因攜帶者與 A 等位基因攜帶者相比，其發生 ATDILI 的風險降低［OR=0.737，95%CI（0.556，0.957），P=0.033］；rs906219 位點與 ATDILI 發生風險的關聯在加性模型和顯性模型中進一步得以驗證，相較于 AA 基因型，CC/AC 基因型的發病風險降低［CC vs. AA：OR=0.563，95%CI（0.325，0.976），P=0.039；CC+CA vs. AA：OR=0.533，95%CI（0.348，0.817），P=0.004］。雖然 rs77607834 位點的等位基因頻率分布和顯性模型頻率分布在 ATDILI 組和非 ATDILI組的差異有統計學意義（P<0.05），但 ATDILI 組均未檢測出 GG 基因型，非 ATDILI 組僅檢出 5 例 GG 基因型，結果可能不具有代表性。其余的 5 個 SNP 位點無論是等位基因頻率還是基因型頻率在 ATDILI 組和非 ATDILI 組之間的分布差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 2～8。
表2
rs12248244 位點等位基因、基因型及遺傳模型在兩組分布情況（例）
表8
rs906219 位點等位基因、基因型及遺傳模型在兩組分布情況（例）
表3
rs7085830 位點等位基因、基因型及遺傳模型在兩組分布情況（例）
表4
rs3740598 位點等位基因、基因型及遺傳模型在兩組分布情況（例）
表5
rs7899214 位點等位基因、基因型及遺傳模型在兩組分布情況（例）
表6
rs2102339 位點等位基因、基因型及遺傳模型在兩組分布情況（例）
表7
rs77607834 位點等位基因、基因型及遺傳模型在兩組分布情況（例）
3 討論
抗結核藥物引起的肝損傷是世界性問題，尤其是在結核高負擔國家。以往研究主要集中于患者的遺傳多態性及編碼異煙肼生物活化及失活的代謝酶的基因改變后導致異煙肼活性代謝產物不同積累，造成肝損傷。現在隨著新機制的發現，異煙肼介導的線粒體功能障礙與 ATDILI 的相關性逐漸被認識，但其具體發生機制仍不清楚。在本研究中，我們探討了 HKDC-1 基因多態性與中國西部結核病患者 ATDILI 的相關性。
HKDC-1 在肝臟中高度表達[15]。由于 HKDC-1 序列與其他己糖激酶異構體序列明顯相同，研究認為 HKDC-1 在調控葡萄糖磷酸化和線粒體結合方面可能與己糖激酶的功能類似[16-18]。HKDC-1 與線粒體電壓離子通道結合后直接與線粒體內腺苷三磷酸結合[19]。HKDC-1 在肝細胞中過表達可導致其糖酵解能力和最大線粒體呼吸功能下降。Chen 等[20]報道 HKDC-1 異常表達可增加活性氧的形成，導致線粒體膜電位下降，隨后觸發細胞損傷。大量不同的藥物可通過不同機制引起肝損傷，其中線粒體功能障礙是一種主要的毒性模式[21]。針對異煙肼，線粒體功能紊亂也參與了肝細胞損傷，有報道稱經異煙肼活性代謝產物肼作用后的小鼠肝細胞形成巨線粒體，引起功能障礙[22]。在本研究中，我們發現經抗結核藥物治療患者中 rs906219（CC/AC 基因型）具有低水平發生 ATDILI 風險，起到一定保護作用。由此我們推測，具有 AA 基因型患者線粒體功能障礙發生率更高。但是此推測需要功能學實驗證實。在本研究中，我們還評估了非基因相關因素年齡、性別、體重、吸煙史、飲酒史等，發現其與 ATDILI 無相關性。
本研究的局限性：首先本文研究的主要是異煙肼起主導作用的聯合用藥導致 ATDILI 的發生機制，其單個藥物影響應進一步闡釋。第二，本研究沒有區分 ATDILI 發病時間在不同患者中的差異。第三，仍需進一步探究 HKDC-1 的表達水平與 ATDILI 的發生關聯。
綜上，本研究發現 HKDC-1 中 rs906219 SNP 在中國西部結核病患者中與 ATDILI 的發生具有相關性，為個性化的抗結核治療提供了線索。
結核病是重大傳染性疾病之一。2017 年，結核病導致約 130 萬例非艾滋病毒感染患者死亡，位列單一感染源所致患者死亡的感染性疾病首位[1]。目前，包括異煙肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇等藥物在內的 6～9 個月聯合治療是結核病的標準療法。在治療過程中，抗結核藥物性肝損傷（anti-tuberculosis drug-induced liver injury，ATDILI）是主要的藥物不良反應，由于定義和治療方案的差異，其發生率在不同研究中有所不同，以往研究報告顯示 ATDILI 發病率從 1% 到 28% 不等[2-3]。ATDILI 常導致抗結核藥物的使用受限甚至治療失敗，因此，更多了解 ATDILI 可以幫助臨床醫生更好地選擇用藥方案。已有研究表明，大多數 ATDILI 發生與使用異煙肼有關。異煙肼生物活化及失活相關代謝關鍵酶是影響 ATDILI 發生的重要因素之一，異煙肼活性代謝產物的生成可導致肝細胞損傷[4-5]。多項研究發現異煙肼代謝酶相關基因多態性與 ATDILI 的發生發展相關，如 NAT2、CYP2E1 等[6-7]。隨著研究進展，異煙肼介導的線粒體功能障礙也被證實是 ATDILI 發生的重要機制之一[8-9]。研究發現己糖激酶結構域-1（hexokinase domain-containing protein 1，HKDC-1）具有低葡萄糖磷酸化能力，肝細胞是其主要表達場所之一，與肝細胞的線粒體功能高度有關。小鼠肝細胞模型顯示，HKDC-1 在肝細胞中過表達可導致其糖酵解能力和最大線粒體呼吸功能下降，從而導致線粒體功能障礙[10-11]。急性體內過表達致線粒體分裂標志物動力相關蛋白-1 增加，也提示 HKDC-1 過度誘導線粒體功能障礙[12-13]。但目前仍沒有研究探討 HKDC-1 基因多態性是否可導致 ATDILI 的發生。本研究旨在探討在中國西部結核病患者人群中 ATDILI 的發生與 HKDC-1 基因多態性之間的關系。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
連續收集 2016 年 11 月—2018 年 4 月四川大學華西醫院收治的 1 060 例高度疑似結核病例，排除艾滋病、乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎和用藥前肝腎功能異常的患者后，由經驗豐富的呼吸內科醫生根據典型結核病癥狀、結核微生物學和/或影像學證據以及有效的抗結核藥物治療判斷后，773 例患者確診為結核病。所有患者最初 2 個月均采用抗結核標準方案進行治療，包括異煙肼（300 mg/d）、利福平（600 mg/d）、吡嗪酰胺（1 500 mg/d）、乙胺丁醇（750 mg/d），隨后 4 個月使用包括異煙肼、利福平和乙胺丁醇在內的標準方案繼續進行治療。排除依從性差、缺乏隨訪、使用其他肝毒性藥物或轉用二線抗結核藥物的患者，最終納入 746 例符合條件的患者。根據患者用藥期間是否發生 ATDILI 將患者分為 ATDILI 組和非 ATDILI 組。本研究經四川大學華西醫院倫理委員會批準［審批號：2014 年審（198）號］，所有患者均提供知情同意書。
ATDILI 判斷標準：① 使用抗結核藥物治療之前，血清丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素正常；② 治療過程中，根據通用標準，患者 ALT 水平升高超過正常范圍高限 5 倍以上，或者 ALT 水平升高超高限 3 倍，同時伴有總膽紅素水平超正常高限 2 倍，或者具有典型的惡心、嘔吐、疼痛癥狀，或堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）≥2 倍正常高限，伴或不伴有谷氨酸轉移酶（glutamyl transpeptadase，GGT）升高；③ 在發生 ATDILI 前 2 周內，患者未接受具有潛在肝毒性藥物治療[14]。
1.2 研究方法
1.2.1 臨床資料收集
收集患者所有臨床數據，包括人口統計學資料、實驗室指標和常見臨床癥狀（發熱、盜汗、乏力、體重減輕），均通過電子病歷獲取。開始抗結核治療后，前 2 個月每 2 周檢測 1 次肝功能、全血計數等血液檢測指標，后 4 個月每 4 周檢測 1 次。記錄與結核病治療和預后相關的實驗室指標的峰值及谷值，以評估 ATDILI。
1.2.2 基因多態性的選擇
從 dbSNP 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/）中系統地選擇 HKDC-1 基因的候選單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）。納入標準：① 最小等位基因頻率大于 5%；② 候選 SNP 的選擇首先考慮潛在的功能區域，然后依次為外顯子區、啟動子區、內含子區和基因間區。篩選后，納入 7 個候選 SNP，包括 rs12248244、rs7085830、rs3740598、rs7899214、rs2102339、rs77607834 和 rs906219。
1.2.3 SNP 的分型
治療前收集所有參與者的 5 mL 乙二胺四乙酸抗凝血全血備用。根據標準操作程序，采用 QIAamp? DNA Blood Mini Kit（德國 Qiagen 公司）提取 DNA。所選 SNP 均采用 2×48-Plex SNPscanTM Kit（上海天昊生物技術公司）試劑盒進行分型。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 19.0 軟件進行統計分析。正態分布的連續變量采用均數±標準差表示，組間比較采用 t 檢驗；非正態分布的連續變量采用中位數（下四分位數，上四分位數）表示，組間比較采用 Wilcoxon 秩和檢驗；分類變量用絕對數和百分數表示，組間比較采用 χ2檢驗。此外，利用 PLINK（version 1.9）軟件（www.cog.genomics.org/plink/1.9/）進行等位基因分布和遺傳模型分析。比值比（odds ratio，OR）和 95% 置信區間（confidence interval，CI）被用作關聯的度量。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 研究人群基本特征與實驗室指標
本研究排除實驗中隨訪差、使用其他肝毒性藥物患者、更改應用二線抗結核藥物患者 27 例后共納入符合標準的患者 746 例，其中出現 ATDILI 的患者 118 例，未出現 ATDILI 的患者 628 例。兩組患者年齡、性別、飲酒史、吸煙史差異無統計學意義（P>0.05）。臨床癥狀中，夜間盜汗、乏力的發生率兩組間差異無統計學意義（P>0.05），而發熱、體重減輕的發生率在兩組間差異有統計學意義（P=0.004、0.024）。實驗室相關指標中，白細胞計數、紅細胞計數、血紅蛋白、血小板計數、C 反應蛋白、直接膽紅素在兩組間差異無統計學意義（P>0.05），盡管總膽紅素、ALP 和 GGT 在兩組間基線水平差異有統計學意義（P<0.05），但兩組治療前均處于正常范圍。見表 1。
表1
兩組人口學、臨床資料特征及實驗室指標
2.2 HKDC-1 基因多態性與 ATDILI 的關系
在 7 個 SNP 位點中，rs906219 的等位基因頻率分布和基因型頻率分布在兩組的差異均有統計學意義（P<0.05）。rs906219 的 C 等位基因攜帶者與 A 等位基因攜帶者相比，其發生 ATDILI 的風險降低［OR=0.737，95%CI（0.556，0.957），P=0.033］；rs906219 位點與 ATDILI 發生風險的關聯在加性模型和顯性模型中進一步得以驗證，相較于 AA 基因型，CC/AC 基因型的發病風險降低［CC vs. AA：OR=0.563，95%CI（0.325，0.976），P=0.039；CC+CA vs. AA：OR=0.533，95%CI（0.348，0.817），P=0.004］。雖然 rs77607834 位點的等位基因頻率分布和顯性模型頻率分布在 ATDILI 組和非 ATDILI組的差異有統計學意義（P<0.05），但 ATDILI 組均未檢測出 GG 基因型，非 ATDILI 組僅檢出 5 例 GG 基因型，結果可能不具有代表性。其余的 5 個 SNP 位點無論是等位基因頻率還是基因型頻率在 ATDILI 組和非 ATDILI 組之間的分布差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 2～8。
表2
rs12248244 位點等位基因、基因型及遺傳模型在兩組分布情況（例）
表8
rs906219 位點等位基因、基因型及遺傳模型在兩組分布情況（例）
表3
rs7085830 位點等位基因、基因型及遺傳模型在兩組分布情況（例）
表4
rs3740598 位點等位基因、基因型及遺傳模型在兩組分布情況（例）
表5
rs7899214 位點等位基因、基因型及遺傳模型在兩組分布情況（例）
表6
rs2102339 位點等位基因、基因型及遺傳模型在兩組分布情況（例）
表7
rs77607834 位點等位基因、基因型及遺傳模型在兩組分布情況（例）
3 討論
抗結核藥物引起的肝損傷是世界性問題，尤其是在結核高負擔國家。以往研究主要集中于患者的遺傳多態性及編碼異煙肼生物活化及失活的代謝酶的基因改變后導致異煙肼活性代謝產物不同積累，造成肝損傷。現在隨著新機制的發現，異煙肼介導的線粒體功能障礙與 ATDILI 的相關性逐漸被認識，但其具體發生機制仍不清楚。在本研究中，我們探討了 HKDC-1 基因多態性與中國西部結核病患者 ATDILI 的相關性。
HKDC-1 在肝臟中高度表達[15]。由于 HKDC-1 序列與其他己糖激酶異構體序列明顯相同，研究認為 HKDC-1 在調控葡萄糖磷酸化和線粒體結合方面可能與己糖激酶的功能類似[16-18]。HKDC-1 與線粒體電壓離子通道結合后直接與線粒體內腺苷三磷酸結合[19]。HKDC-1 在肝細胞中過表達可導致其糖酵解能力和最大線粒體呼吸功能下降。Chen 等[20]報道 HKDC-1 異常表達可增加活性氧的形成，導致線粒體膜電位下降，隨后觸發細胞損傷。大量不同的藥物可通過不同機制引起肝損傷，其中線粒體功能障礙是一種主要的毒性模式[21]。針對異煙肼，線粒體功能紊亂也參與了肝細胞損傷，有報道稱經異煙肼活性代謝產物肼作用后的小鼠肝細胞形成巨線粒體，引起功能障礙[22]。在本研究中，我們發現經抗結核藥物治療患者中 rs906219（CC/AC 基因型）具有低水平發生 ATDILI 風險，起到一定保護作用。由此我們推測，具有 AA 基因型患者線粒體功能障礙發生率更高。但是此推測需要功能學實驗證實。在本研究中，我們還評估了非基因相關因素年齡、性別、體重、吸煙史、飲酒史等，發現其與 ATDILI 無相關性。
本研究的局限性：首先本文研究的主要是異煙肼起主導作用的聯合用藥導致 ATDILI 的發生機制，其單個藥物影響應進一步闡釋。第二，本研究沒有區分 ATDILI 發病時間在不同患者中的差異。第三，仍需進一步探究 HKDC-1 的表達水平與 ATDILI 的發生關聯。
綜上，本研究發現 HKDC-1 中 rs906219 SNP 在中國西部結核病患者中與 ATDILI 的發生具有相關性，為個性化的抗結核治療提供了線索。
