引用本文： 高兵, 張洪波, 張弛, 彭政. 171 株臨床分離的肺炎鏈球菌毒力基因攜帶狀況的研究. 華西醫學, 2019, 34(9): 1042-1046. doi: 10.7507/1002-0179.201906078 復制
肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，SP）發現于 1881 年，是各種感染如社區獲得性肺炎、中耳炎、腦膜炎、膿腫、敗血癥等的主要致病菌之一，尤其對于嬰幼兒和老年人，其中肺炎、敗血癥和腦膜炎致死率較高[1]。在發展中國家，5 歲以下兒童中每年有超過 110 萬人因患肺炎而死亡，而 SP 是其中最主要的病原菌，約占 20%[2]。SP 的耐藥性加劇了這一形勢[3]。此外，SP 有超過 90 種血清型，而目前的疫苗策略不能完全覆蓋[4-5]。目前，SP 具有多種毒力基因，而且其導致各種感染疾病的具體機制有待明確，但毒力基因在此過程中可能具有重要作用，這種作用可能體現在毒力基因的有無和表達水平兩個方面[6-8]。本研究從 DNA 水平上調查了 3 種主要的 SP 毒力基因：肺炎鏈球菌溶細胞素基因（pneumolysin gene，ply）、肺炎鏈球菌自溶素基因（autolysin gene，lytA）和神經氨酸酶 A 基因（neuraminidase A gene，nanA），并初步分析了痰液分離與血源分離的 SP 之間的毒力基因攜帶差異。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株來源
SP 標準菌株 ATCC49619 由中國醫學菌種保藏中心提供。171 株臨床 SP 菌株，于 2015 年—2016 年分離自武漢同濟醫院住院患兒標本，均為非重復菌株；其中，147 株分離自痰液標本，24 株分離自血液標本。171 例住院患兒年齡為 5 d～15 歲，男 90 例，女 81 例。痰液分離出 SP 患兒經影像學和臨床相關檢查進一步證實為 SP 肺炎。所有菌株均經全自動微生物鑒定儀 VITEK Compact-2 鑒定卡 GP 鑒定到種，并經已有文獻報道的 SP 種特異 PCR 檢測進行確認（靶基因為 pbp2B）[9]。
1.1.2 主要試劑
聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成，血平板購自法國生物梅里埃公司。
1.1.3 主要儀器
3111 型二氧化碳培養箱購自美國 Thermo Electron 公司，VITEK Compact-2 型全自動細菌分析儀購自法國生物梅里埃公司，Mastercycler 普通 PCR 儀購自德國 eppendorf 公司，WD-9413A 凝膠成像分析儀購自北京六一儀器廠，PAC3000 型電泳儀購自美國 BIO-RAD 公司。
1.2 方法
1.2.1 染色體 DNA 提取
取 –70 ℃ 環境下 20% 甘油肉湯保存的 SP 轉于哥倫比亞血瓊脂平板上，置 37 ℃，5% 二氧化碳培養 18～24 h，傳代后收集整個血平板菌落，用煮沸-冷凍法[10]提取基因組 DNA：取 10 個菌落置于含有 200μL 雙蒸水（ddH2O）的 1.5 mL Eppendorf 管中，100 ℃ 水浴 30 min，取出后置于?20 ℃ 冷凍 30 min，室溫解凍后 15 000×g 離心 1 min，取上清液。
1.2.2 pbp2B、ply、lytA 和 nanA 基因的檢測
PCR 反應體系由 0.125 μL rTaq 酶（5 U/μL）、2.5 μL 緩沖液（10×）、2.0 μL 脫氧核糖核苷三磷酸（12 mmol/L）、1.5 μL 氯化鎂（25 mmol/L）、0.5 μL 正反引物（20 μmol/L）、14.875 μL ddH2O、3.0 μL DNA 模板組成。反應條件：94 ℃ 預變性 5 min，按 94 ℃，30 s→退火溫度（表1），1 min→72 ℃，1 min，共 30 個循環，最后 72 ℃，10 min。電泳：取 5.0 μL PCR 產物加 1.0 μL 上樣緩沖液（6×），在 2.0% 瓊脂糖上電泳：150 V，75 mA 電泳 25 min。電泳后用凝膠照像系統拍照成像。本研究所有菌株均經過全自動微生物儀器鑒定，并再經普通 PCR 再次驗證。
表1
PCR 用引物序列
1.3 統計學方法
采用 SPSS 25.0 軟件進行統計學分析。3 種毒力基因的檢測結果用陽性百分率（陽性株數/組內株數）比較，組間和組內比較采用 Fisher 確切概率法檢驗。SP 所致病死率采用百分率表示，組間和組內比較采用 Fisher 確切概率法檢驗。住院天數采用均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 pbp2B、ply、lytA 和 nanA 基因檢測的電泳圖
pbp2B、ply、lytA 和 nanA 基因檢測的電泳圖，目的條帶長度依次為 682、329、308 和 500 bp。pbp2B 用于鑒定待測菌是否為 SP，ply、lytA 和 nanA 用于檢測待測菌是否含有此毒力基因。見圖 1。
圖1
pbp2B、ply、lytA 和 nanA 基因檢測的電泳圖
a.
2.2 SP 的 3 種毒力基因的陽性率
171 株 SP 中，24 株 SP 分離自血液，147 株分離自痰液；痰源組和血源組 SP 攜帶毒力基因 ply、lytA 和 nanA 的比例趨于一致。在痰源組和血源組組內，3 種毒力基因陽性率比較，差異均有統計學意義（P=0.010、0.009），毒力基因 nanA 的攜帶率均比 ply 和 lytA 低（P<0.05）。見表2。
表2
SP 的 3 種毒力基因的陽性率［n=171，株（%）］
2.3 SP 所致敗血癥和肺炎的病死率和住院天數比較
血源 SP 所致敗血癥和痰源 SP 所致肺炎的病死率［8.3%（2/24）vs. 0.7%（1/147）］比較，差異無統計學意義（P=0.052）；其住院天數［（14.2±2.4）vs.（6.4±1.5）d］比較，差異有統計學意義（t=21.303，P<0.001）。
3 討論
SP 是臨床最常見的病原菌之一，主要導致各種類型的社區獲得性感染，如社區獲得性肺炎、中耳炎、腦膜炎、膿腫、敗血癥等。其中，敗血癥和腦膜炎尤其兇險。SP 的致病機制主要涉及機體的免疫系統和 SP 的毒力兩個方面。SP 擁有 10 種以上的毒力基因[13-14]，如莢膜多糖合成素 A 基因（capsular polysaccharide synthesisA gene，cpsA）、ply、lytA 和 nanA 等。通常認為莢膜是 SP 具有致病性的前提，因此，cpsA 基因在臨床分離的 SP 中應該存在普遍性，本研究未作調查。
Ply 是一種相對分子質量為 53×103的毒素，是臨床 SP 菌株產生的一種關鍵性的毒力因子，又被稱為膽固醇結合溶細胞素，幾乎可以溶解所有真核細胞胞膜[15]。Ply 可發揮一系列的生物學活性，有利于 SP 的攜帶和致病[16-17]。Ply 可激活補體的經典途徑[18-19]，可抑制咳嗽、白細胞的殺菌活性和游走[20]，也可刺激白細胞介素-8 的合成[21]。lytA 編碼自溶酶，當營養物質缺乏或 β-內酰胺類抗菌藥物使細胞壁合成停滯，則自溶酶作用于細胞壁的肽聚糖，介導細菌自溶，促進毒素及相關毒力因子的釋放。Nan 通過分解細胞或體液中的多糖、糖蛋白、聚合糖上的唾液酸殘基等暴露宿主細胞表面的黏附受體。有研究發現，SP 毒力因子 NanA 有助于 SP 形成生物膜，從而抵抗機體的免疫反應；并通過小鼠模型發現 NanA 有助于 SP 通過血腦屏障，從而入侵腦脊液[22]。
本研究所有菌株均經過全自動微生物儀器鑒定，并再經普通 PCR 再次驗證。從本研究結果來看，3 種毒力基因 ply、lytA 和 nanA 在痰源 SP 中的陽性率分別為 95.9%、96.6% 和 88.4%，而在血源 SP 中分別為 100.0%、100.0% 和 79.2%，與已有文獻[13, 23]報道相近，但又顯著高于已有文獻[24]。此外，地區不同也可能是造成結果差異的一個原因。痰源組和血源組 SP 攜帶毒力基因 ply、lytA 和 nanA 的比例趨于一致，毒力基因 nanA 的攜帶率比 ply 和 lytA 都低。這也說明 SP 毒力基因 DNA 水平上的差異不是造成其致病性差異的原因。有研究表明，SP 毒力基因的表達水平對于其致病性也可能起了關鍵性的作用[8, 25]。有文獻發現 ply 的相對高表達（相差 102～103量級）有助于 SP 入侵血液[8]。由于 nanA 在 SP 入侵腦脊液的過程中起著重要作用，因此，nanA 的相對低攜帶率也部分印證了臨床上腦脊液感染 SP 占比相對更低的事實[26-27]。在本研究中，痰源和血源導致的病死率差異并無統計學意義，而住院天數差異則有統計學意義，這可能源于醫療技術的進步和抗菌藥物的合理應用，但住院天數的延長則意味著疾病更重和醫療費用的增加。
總的來看，本研究發現痰源組和血源組 SP 攜帶毒力基因 ply、lytA 和 nanA 的陽性率趨于一致，其導致的病死率也無統計學差異，但會導致住院天數的增加。本研究存在以下不足：① 研究例數偏少，相應地會帶來較大的誤差。② SP 有多種毒力基因，而本研究只涉及到其中常見的 3 種，調查不夠全面。③ 如前所述，毒力基因的有無及其表達水平均可能與 SP 的致病類型相關，而本研究只涉及了 3 個毒力基因 DNA 序列的有無。由于 SP 可以導致多種類型的感染，為探討其相應的致病機制需展開進一步的研究。
肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，SP）發現于 1881 年，是各種感染如社區獲得性肺炎、中耳炎、腦膜炎、膿腫、敗血癥等的主要致病菌之一，尤其對于嬰幼兒和老年人，其中肺炎、敗血癥和腦膜炎致死率較高[1]。在發展中國家，5 歲以下兒童中每年有超過 110 萬人因患肺炎而死亡，而 SP 是其中最主要的病原菌，約占 20%[2]。SP 的耐藥性加劇了這一形勢[3]。此外，SP 有超過 90 種血清型，而目前的疫苗策略不能完全覆蓋[4-5]。目前，SP 具有多種毒力基因，而且其導致各種感染疾病的具體機制有待明確，但毒力基因在此過程中可能具有重要作用，這種作用可能體現在毒力基因的有無和表達水平兩個方面[6-8]。本研究從 DNA 水平上調查了 3 種主要的 SP 毒力基因：肺炎鏈球菌溶細胞素基因（pneumolysin gene，ply）、肺炎鏈球菌自溶素基因（autolysin gene，lytA）和神經氨酸酶 A 基因（neuraminidase A gene，nanA），并初步分析了痰液分離與血源分離的 SP 之間的毒力基因攜帶差異。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株來源
SP 標準菌株 ATCC49619 由中國醫學菌種保藏中心提供。171 株臨床 SP 菌株，于 2015 年—2016 年分離自武漢同濟醫院住院患兒標本，均為非重復菌株；其中，147 株分離自痰液標本，24 株分離自血液標本。171 例住院患兒年齡為 5 d～15 歲，男 90 例，女 81 例。痰液分離出 SP 患兒經影像學和臨床相關檢查進一步證實為 SP 肺炎。所有菌株均經全自動微生物鑒定儀 VITEK Compact-2 鑒定卡 GP 鑒定到種，并經已有文獻報道的 SP 種特異 PCR 檢測進行確認（靶基因為 pbp2B）[9]。
1.1.2 主要試劑
聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成，血平板購自法國生物梅里埃公司。
1.1.3 主要儀器
3111 型二氧化碳培養箱購自美國 Thermo Electron 公司，VITEK Compact-2 型全自動細菌分析儀購自法國生物梅里埃公司，Mastercycler 普通 PCR 儀購自德國 eppendorf 公司，WD-9413A 凝膠成像分析儀購自北京六一儀器廠，PAC3000 型電泳儀購自美國 BIO-RAD 公司。
1.2 方法
1.2.1 染色體 DNA 提取
取 –70 ℃ 環境下 20% 甘油肉湯保存的 SP 轉于哥倫比亞血瓊脂平板上，置 37 ℃，5% 二氧化碳培養 18～24 h，傳代后收集整個血平板菌落，用煮沸-冷凍法[10]提取基因組 DNA：取 10 個菌落置于含有 200μL 雙蒸水（ddH2O）的 1.5 mL Eppendorf 管中，100 ℃ 水浴 30 min，取出后置于?20 ℃ 冷凍 30 min，室溫解凍后 15 000×g 離心 1 min，取上清液。
1.2.2 pbp2B、ply、lytA 和 nanA 基因的檢測
PCR 反應體系由 0.125 μL rTaq 酶（5 U/μL）、2.5 μL 緩沖液（10×）、2.0 μL 脫氧核糖核苷三磷酸（12 mmol/L）、1.5 μL 氯化鎂（25 mmol/L）、0.5 μL 正反引物（20 μmol/L）、14.875 μL ddH2O、3.0 μL DNA 模板組成。反應條件：94 ℃ 預變性 5 min，按 94 ℃，30 s→退火溫度（表1），1 min→72 ℃，1 min，共 30 個循環，最后 72 ℃，10 min。電泳：取 5.0 μL PCR 產物加 1.0 μL 上樣緩沖液（6×），在 2.0% 瓊脂糖上電泳：150 V，75 mA 電泳 25 min。電泳后用凝膠照像系統拍照成像。本研究所有菌株均經過全自動微生物儀器鑒定，并再經普通 PCR 再次驗證。
表1
PCR 用引物序列
1.3 統計學方法
采用 SPSS 25.0 軟件進行統計學分析。3 種毒力基因的檢測結果用陽性百分率（陽性株數/組內株數）比較，組間和組內比較采用 Fisher 確切概率法檢驗。SP 所致病死率采用百分率表示，組間和組內比較采用 Fisher 確切概率法檢驗。住院天數采用均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 pbp2B、ply、lytA 和 nanA 基因檢測的電泳圖
pbp2B、ply、lytA 和 nanA 基因檢測的電泳圖，目的條帶長度依次為 682、329、308 和 500 bp。pbp2B 用于鑒定待測菌是否為 SP，ply、lytA 和 nanA 用于檢測待測菌是否含有此毒力基因。見圖 1。
圖1
pbp2B、ply、lytA 和 nanA 基因檢測的電泳圖
a.
2.2 SP 的 3 種毒力基因的陽性率
171 株 SP 中，24 株 SP 分離自血液，147 株分離自痰液；痰源組和血源組 SP 攜帶毒力基因 ply、lytA 和 nanA 的比例趨于一致。在痰源組和血源組組內，3 種毒力基因陽性率比較，差異均有統計學意義（P=0.010、0.009），毒力基因 nanA 的攜帶率均比 ply 和 lytA 低（P<0.05）。見表2。
表2
SP 的 3 種毒力基因的陽性率［n=171，株（%）］
2.3 SP 所致敗血癥和肺炎的病死率和住院天數比較
血源 SP 所致敗血癥和痰源 SP 所致肺炎的病死率［8.3%（2/24）vs. 0.7%（1/147）］比較，差異無統計學意義（P=0.052）；其住院天數［（14.2±2.4）vs.（6.4±1.5）d］比較，差異有統計學意義（t=21.303，P<0.001）。
3 討論
SP 是臨床最常見的病原菌之一，主要導致各種類型的社區獲得性感染，如社區獲得性肺炎、中耳炎、腦膜炎、膿腫、敗血癥等。其中，敗血癥和腦膜炎尤其兇險。SP 的致病機制主要涉及機體的免疫系統和 SP 的毒力兩個方面。SP 擁有 10 種以上的毒力基因[13-14]，如莢膜多糖合成素 A 基因（capsular polysaccharide synthesisA gene，cpsA）、ply、lytA 和 nanA 等。通常認為莢膜是 SP 具有致病性的前提，因此，cpsA 基因在臨床分離的 SP 中應該存在普遍性，本研究未作調查。
Ply 是一種相對分子質量為 53×103的毒素，是臨床 SP 菌株產生的一種關鍵性的毒力因子，又被稱為膽固醇結合溶細胞素，幾乎可以溶解所有真核細胞胞膜[15]。Ply 可發揮一系列的生物學活性，有利于 SP 的攜帶和致病[16-17]。Ply 可激活補體的經典途徑[18-19]，可抑制咳嗽、白細胞的殺菌活性和游走[20]，也可刺激白細胞介素-8 的合成[21]。lytA 編碼自溶酶，當營養物質缺乏或 β-內酰胺類抗菌藥物使細胞壁合成停滯，則自溶酶作用于細胞壁的肽聚糖，介導細菌自溶，促進毒素及相關毒力因子的釋放。Nan 通過分解細胞或體液中的多糖、糖蛋白、聚合糖上的唾液酸殘基等暴露宿主細胞表面的黏附受體。有研究發現，SP 毒力因子 NanA 有助于 SP 形成生物膜，從而抵抗機體的免疫反應；并通過小鼠模型發現 NanA 有助于 SP 通過血腦屏障，從而入侵腦脊液[22]。
本研究所有菌株均經過全自動微生物儀器鑒定，并再經普通 PCR 再次驗證。從本研究結果來看，3 種毒力基因 ply、lytA 和 nanA 在痰源 SP 中的陽性率分別為 95.9%、96.6% 和 88.4%，而在血源 SP 中分別為 100.0%、100.0% 和 79.2%，與已有文獻[13, 23]報道相近，但又顯著高于已有文獻[24]。此外，地區不同也可能是造成結果差異的一個原因。痰源組和血源組 SP 攜帶毒力基因 ply、lytA 和 nanA 的比例趨于一致，毒力基因 nanA 的攜帶率比 ply 和 lytA 都低。這也說明 SP 毒力基因 DNA 水平上的差異不是造成其致病性差異的原因。有研究表明，SP 毒力基因的表達水平對于其致病性也可能起了關鍵性的作用[8, 25]。有文獻發現 ply 的相對高表達（相差 102～103量級）有助于 SP 入侵血液[8]。由于 nanA 在 SP 入侵腦脊液的過程中起著重要作用，因此，nanA 的相對低攜帶率也部分印證了臨床上腦脊液感染 SP 占比相對更低的事實[26-27]。在本研究中，痰源和血源導致的病死率差異并無統計學意義，而住院天數差異則有統計學意義，這可能源于醫療技術的進步和抗菌藥物的合理應用，但住院天數的延長則意味著疾病更重和醫療費用的增加。
總的來看，本研究發現痰源組和血源組 SP 攜帶毒力基因 ply、lytA 和 nanA 的陽性率趨于一致，其導致的病死率也無統計學差異，但會導致住院天數的增加。本研究存在以下不足：① 研究例數偏少，相應地會帶來較大的誤差。② SP 有多種毒力基因，而本研究只涉及到其中常見的 3 種，調查不夠全面。③ 如前所述，毒力基因的有無及其表達水平均可能與 SP 的致病類型相關，而本研究只涉及了 3 個毒力基因 DNA 序列的有無。由于 SP 可以導致多種類型的感染，為探討其相應的致病機制需展開進一步的研究。
