引用本文： 李謀, 鄭興菊, 黃子星, 宋彬. 體素內不相干運動成像評價大鼠肝細胞癌的微血管生成. 華西醫學, 2018, 33(4): 411-416. doi: 10.7507/1002-0179.201701065 復制
肝癌是全球第五大常見的惡性腫瘤，其中肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發性肝癌中最主要的類型[1-2]。微血管密度（microvessel density，MVD）是運用特異性抗體標記腫瘤組織血管內皮細胞，在顯微鏡下計數單位面積中的微血管數目，是目前被認為最能反映腫瘤新生血管增生情況的直觀方法[3]。HCC 的腫瘤血管生成在實體腫瘤的發生、發展以及轉移各階段均有重要作用，腫瘤內微血管越多，MVD 越高，其生物學行為越惡性。同時，微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）也能夠反映 HCC 的惡性潛能，發生 MVI 的 HCC 轉移可能性更大，是影響腫瘤轉移的獨立危險因素[4]。抗血管治療已成為 HCC 治療的重要策略之一[5-7]。因此術前評估 HCC 的 MVD 及 MVI 對其治療方案的選取、預后評價等具有重要意義[8-10]。由于病理學檢查為有創檢查，一定程度上應用受限[11-12]，因此術前應用影像學方法無創評估腫瘤微血管生成具有重要意義。
彌散加權成像（diffusion weighted imaging，DWI）通過反映組織內水分子的布朗運動，間接反映組織的微觀結構特點[13-15]。但由于 DWI 計算得出的表觀彌散系數（apparent diffusion coefficient，ADC）值受到微循環毛細血管灌注的影響，因此 Le Bihan 等[16]提出體素內不相干運動成像（intravoxel incoherent motion diffusion weighted imaging，IVIM）理論，以消除病灶內血流灌注對彌散測量的影響。目前關于 IVIM 涉及 HCC MVD 及 MVI 的研究較少且結論不一[17]。本研究旨在通過判斷 IVIM 參數預測 HCC MVD、MVI 的能力，評估目前已有的研究結果，并提供一種無創評估 HCC 微血管生成的方法。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、材料與設備
100 只 6 周齡、體質量 100～150 g 的健康雄性清潔級 Wistar 大鼠，購自四川達碩動物中心。二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN），購自美國 Sigma 公司。MRI 掃描采用德國西門子公司生產的 Skyra 3.0 T 磁共振掃描儀。
1.2 建立大鼠 HCC 模型
采用隨機數字表法將 100 只大鼠隨機分為實驗組（90 只）和空白組（10 只）。實驗組大鼠自由飲用濃度為 0.1 mg/mL 的 DEN 溶液，而空白組大鼠僅給予蒸餾水，兩組大鼠均自由食用飼料，喂養 12 周。所有操作遵守四川大學動物保護方針。
1.3 掃描及圖像分析
用 2% 異氟烷對大鼠進行呼吸麻醉后，從膈頂掃描至肝下緣，掃描序列包括 T1 加權像（T1 weighted image，T1WI）、IVIM，以及軸位、冠狀位和矢狀位 T2 加權像（T2 weighted image，T2WI）。經預實驗測試后，序列掃描參數如下：① T1WI：重復時間（repetition time，TR） 201 ms，回波時間（echo time，TE） 4.59 ms，視野 90 mm×100 mm，矩陣 225×250，層厚 1.5 mm，間隔 0.1 mm，帶寬 300 Hz，掃描時間 253 s。② T2WI：TR 3 000 ms，TE 62 ms，視野 90 mm×100 mm，矩陣 225×250，層厚 1.5 mm，間隔 0.1 mm，帶寬 300 Hz，掃描時間 203 s。③ IVIM：TR 3 300 ms，TE 68 ms，視野 110 mm×100 mm，矩陣 157×143，層厚 1.5 mm，b 值 0、25、50、80、150、300、500、800，掃描時間 4 min 42 s。IVIM 測值：在圖像上采用圓形感興趣區對病灶測值。測量時盡量避免邊緣噪聲和部分容積效應的影響，同時避開病灶內出血、液化壞死區域。每個參數取 3 次測量的平均值。結合 T1、T2 平掃，在 ADC 圖像上選擇病灶的最大徑平面，將感興趣區置于病灶的實質部分，記為 ADCLes。將上述 HCC 病灶 ADC 圖像的感興趣區復制到相同層面的 IVIM 參數圖（D、D*、f）上，分別記為 DLes、D*Les、fLes。由 2 名腹部影像診斷醫師利用工作站（Version VB 35 A）獨立分析、測量圖像，意見不同則協商達成一致。
1.4 病理學檢測
采用頸椎脫臼法處死大鼠，結合軸位、矢狀位和冠狀位 T2WI 選取目標病灶后用石蠟包埋，行蘇木精-伊紅（ematoxylin-eosin，HE）染色，并采用 Envision 法行 CD31 染色。由 2 名年資 5 年以上的病理醫生分別對病灶的 HE 切片結果進行分析，若病灶為 HCC，進一步計數 MVD 及判斷有無 MVI，意見不同則協商達成一致。
1.5 統計學方法
所有統計分析采用 SPSS 20.0 軟件。計量資料采用均數±標準差表示，采用獨立樣本 t 檢驗比較 MVI（+）和 MVI（–）組 HCC 的 ADC 值、IVIM 相關參數值有無差異。采用 Spearman 相關性分析評估 IVIM 相關參數值與 MVD 有無相關性，r 為正值代表正相關，負值代表負相關；0≤|r|<0.25，無相關性或相關性弱；0.25≤|r|<0.5，相關性一般；0.5≤|r|<0.75，相關性良好；|r|≥0.75，相關性非常好[18]。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠肝癌模型
喂養 12 周期間，實驗組死亡 26 只，解剖后發現死因可能為肺炎、肝硬化導致的并發癥、腫瘤破裂出血等。空白組 10 只均存活。對剩余 64 只實驗組大鼠進行 MRI 掃描，因過度麻醉死亡 3 只，因 IVIM 圖像病灶區域出現信號缺失排除 4 只，最終對 57 只實驗組大鼠進行病理取材。
2.2 病理結果及統計結果
共納入 50 個 HCC 病灶，包含 MVI（+）組 27 個，MVI（–）組 23 個。50 個 HCC 病灶 MVD 為（18.2±11.4）個/視野，ADC、D 及 D*分別為（0.85±0.14）、（0.75±0.14）、（28.5±7.39）× 10–3 mm2/s，f 值為（16.0±7.54）%，各 IVIM 參數與 MVD 的相關系數見表 1，散點圖見圖 1。HCC 的 ADC 值、D 值與 MVD 呈負相關（r=–0.406，P=0.003；r=–0.468，P=0.001）；D*值、f 值與 MVD 無統計學相關性（P=0.172、0.074）；MVI（+）組和 MVI（–）組的 IVIM 相關參數、ADC 差異均無統計學意義（P=0.393、0.395、0.221、0.550），見表 2 及圖 2、3。
表1
MVD 與 ADC、IVIM 相關參數的相關性分析
圖1
ADC、D、D*及 f 與 MVD 相關性分析的散點圖
表2
MVI（+）與 MVI（–）組 IVIM 相關參數值、ADC 值
圖2
一例病灶內無 MVI 的大鼠 HCC 病灶 MRI 及病理圖像
a. T1 圖像，病灶呈稍長 T1 信號；b. T2 圖像，病灶呈長 T2 信號；c. DWI 呈高信號；d. ADC 圖像呈稍低信號；c、d 示病灶彌散稍受限；e～g. 分別為其 D、D*、
圖3
一例病灶內有 MVI 的大鼠 HCC 病灶 MRI 及病理圖像
a. T1 圖像，病灶呈稍長 T1 信號；b. T2 圖像，病灶呈稍長 T2 信號；c. DWI 呈高信號；d. ADC 圖像呈低信號；c、d 示病灶彌散明顯受限；e～g. 分別為其 D、D*、
3 討論
本研究發現 ADC 及 IVIM 參數 D 與 HCC MVD 具有相關性，但 MVI（+）組和 MVI（–）組的 IVIM 相關參數、ADC 差異無統計學意義（P>0.05），表明 ADC、D 一定程度上可用于無創評估 HCC 的 MVD，但評估 MVI 的能力受限。
DWI 通過梯度回波技術來反映組織內水分子的布朗運動，進而間接反映感興趣區組織內微觀結構的特點，但在活體組織內，不僅有水分子的擴散，還有微循環毛細血管灌注的影響。因此 Le Bihan 等[16]在 20 世紀 80 年代提出 IVIM 理論，即 Sb/S0=（1–f）×exp（–bD）+f×exp［（–b（D+D*）］，其中，S 代表感興趣區內信號強度；D 代表感興趣區內純水分子擴散，為真性擴散系數；D*代表感興趣區內微循環灌注，為假性擴散系數；f為灌注分數，代表感興趣區內微循環灌注效應占總體擴散效應的容積率。IVIM 能夠將灌注導致的彌散與真實彌散分離，更準確地評估彌散及灌注。
HCC 在血管生成因子的刺激下，已存在的微血管內皮細胞重新進入細胞增殖周期，形成新生毛細血管，與 HCC 的生成、生長及預后有密切關系[19]。研究表明，MVD 是一個獨立而重要的預后因素，高 MVD 提示腫瘤易發生轉移，預后不良[20]。本研究發現，HCC 的 ADC 值、D 值與 MVD 有一定的負相關關系。腫瘤的病理分級越高，腫瘤組織內水分子擴散受限越嚴重[18]，同時腫瘤病理分級越高，腫瘤內微血管越多，亦會加大對腫瘤組織內水分子擴散運動的抑制作用，二者共同作用的結果最終導致反映純水分子擴散的 D 值與 MVD 具有一定的負相關性，而包含腫瘤組織內純水分子擴散和微循環血流灌注兩方面信息的 ADC 值，亦與 MVD 呈現出一定的負相關關系。
Lee 等[21]將人結直腸癌細胞種植于裸鼠腹側皮下，建立腫瘤模型后進行 IVIM 成像，結果示：D*值和 f 值分別與 MVD 具有良好的正相關關系（r=0.782，P<0.001；r=0.749，P<0.001），能夠反映腫瘤的灌注信息。本研究中，D*值、f 值與 MVD 無相關性，與上述報道不一致，推測原因為 D*值和f 值的可重復性差，D 值和 ADC 值的可重復性較好[22-23]，與掃描時的呼吸方式、病灶位置等因素有關。
僅有少數研究應用 DWI 的 ADC 值來預測 HCC 的 MVI[24-25]。這些研究認為 ADC 可預測 HCC 的 MVI：當 ADC 值<1.227×10–3 mm2/s（b=0、500 s/mm2）時，可作為小 HCC（腫瘤直徑≤2 cm）MVI 的預測因子。ADC 值<1.11×10–3 mm2/s 有利于術前預測 HCC 的 MVI。對于本研究，應用單變量分析 MVI（+）組和 MVI（–）組的 ADC 值、IVIM 相關參數值，差異均無統計學意義（P>0.05），目前尚需更多、更大樣本含量的研究進一步驗證。
本研究存在一些不足。第一，不能完全確保病理取材標本與 MRI 圖像參數測量層面相一致。研究中我們采用了以下方法使二者盡量保持一致：結合 T1、T2 軸位、冠狀位、矢狀位圖像，對參數測量層面準確定位；掃描體位和取材體位保持一致，均取仰臥位，取材時，找到 MRI 參數測量平面。但所取標本厚度與 MRI 掃描層厚有一定差距，難免導致病理標本與參數測量層面之間存在一定的誤差。第二，本研究的樣本量相對較小，主要是受到建模周期較長的限制。第三，IVIM-DWI 的掃描參數，目前并無統一標準，因此本研究在進行預實驗后，選取了相比之下能獲得最佳圖像質量的參數進行掃描，與別的研究所選掃描參數有差異，是造成與之結果不一致的原因之一。
肝癌是全球第五大常見的惡性腫瘤，其中肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發性肝癌中最主要的類型[1-2]。微血管密度（microvessel density，MVD）是運用特異性抗體標記腫瘤組織血管內皮細胞，在顯微鏡下計數單位面積中的微血管數目，是目前被認為最能反映腫瘤新生血管增生情況的直觀方法[3]。HCC 的腫瘤血管生成在實體腫瘤的發生、發展以及轉移各階段均有重要作用，腫瘤內微血管越多，MVD 越高，其生物學行為越惡性。同時，微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）也能夠反映 HCC 的惡性潛能，發生 MVI 的 HCC 轉移可能性更大，是影響腫瘤轉移的獨立危險因素[4]。抗血管治療已成為 HCC 治療的重要策略之一[5-7]。因此術前評估 HCC 的 MVD 及 MVI 對其治療方案的選取、預后評價等具有重要意義[8-10]。由于病理學檢查為有創檢查，一定程度上應用受限[11-12]，因此術前應用影像學方法無創評估腫瘤微血管生成具有重要意義。
彌散加權成像（diffusion weighted imaging，DWI）通過反映組織內水分子的布朗運動，間接反映組織的微觀結構特點[13-15]。但由于 DWI 計算得出的表觀彌散系數（apparent diffusion coefficient，ADC）值受到微循環毛細血管灌注的影響，因此 Le Bihan 等[16]提出體素內不相干運動成像（intravoxel incoherent motion diffusion weighted imaging，IVIM）理論，以消除病灶內血流灌注對彌散測量的影響。目前關于 IVIM 涉及 HCC MVD 及 MVI 的研究較少且結論不一[17]。本研究旨在通過判斷 IVIM 參數預測 HCC MVD、MVI 的能力，評估目前已有的研究結果，并提供一種無創評估 HCC 微血管生成的方法。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、材料與設備
100 只 6 周齡、體質量 100～150 g 的健康雄性清潔級 Wistar 大鼠，購自四川達碩動物中心。二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN），購自美國 Sigma 公司。MRI 掃描采用德國西門子公司生產的 Skyra 3.0 T 磁共振掃描儀。
1.2 建立大鼠 HCC 模型
采用隨機數字表法將 100 只大鼠隨機分為實驗組（90 只）和空白組（10 只）。實驗組大鼠自由飲用濃度為 0.1 mg/mL 的 DEN 溶液，而空白組大鼠僅給予蒸餾水，兩組大鼠均自由食用飼料，喂養 12 周。所有操作遵守四川大學動物保護方針。
1.3 掃描及圖像分析
用 2% 異氟烷對大鼠進行呼吸麻醉后，從膈頂掃描至肝下緣，掃描序列包括 T1 加權像（T1 weighted image，T1WI）、IVIM，以及軸位、冠狀位和矢狀位 T2 加權像（T2 weighted image，T2WI）。經預實驗測試后，序列掃描參數如下：① T1WI：重復時間（repetition time，TR） 201 ms，回波時間（echo time，TE） 4.59 ms，視野 90 mm×100 mm，矩陣 225×250，層厚 1.5 mm，間隔 0.1 mm，帶寬 300 Hz，掃描時間 253 s。② T2WI：TR 3 000 ms，TE 62 ms，視野 90 mm×100 mm，矩陣 225×250，層厚 1.5 mm，間隔 0.1 mm，帶寬 300 Hz，掃描時間 203 s。③ IVIM：TR 3 300 ms，TE 68 ms，視野 110 mm×100 mm，矩陣 157×143，層厚 1.5 mm，b 值 0、25、50、80、150、300、500、800，掃描時間 4 min 42 s。IVIM 測值：在圖像上采用圓形感興趣區對病灶測值。測量時盡量避免邊緣噪聲和部分容積效應的影響，同時避開病灶內出血、液化壞死區域。每個參數取 3 次測量的平均值。結合 T1、T2 平掃，在 ADC 圖像上選擇病灶的最大徑平面，將感興趣區置于病灶的實質部分，記為 ADCLes。將上述 HCC 病灶 ADC 圖像的感興趣區復制到相同層面的 IVIM 參數圖（D、D*、f）上，分別記為 DLes、D*Les、fLes。由 2 名腹部影像診斷醫師利用工作站（Version VB 35 A）獨立分析、測量圖像，意見不同則協商達成一致。
1.4 病理學檢測
采用頸椎脫臼法處死大鼠，結合軸位、矢狀位和冠狀位 T2WI 選取目標病灶后用石蠟包埋，行蘇木精-伊紅（ematoxylin-eosin，HE）染色，并采用 Envision 法行 CD31 染色。由 2 名年資 5 年以上的病理醫生分別對病灶的 HE 切片結果進行分析，若病灶為 HCC，進一步計數 MVD 及判斷有無 MVI，意見不同則協商達成一致。
1.5 統計學方法
所有統計分析采用 SPSS 20.0 軟件。計量資料采用均數±標準差表示，采用獨立樣本 t 檢驗比較 MVI（+）和 MVI（–）組 HCC 的 ADC 值、IVIM 相關參數值有無差異。采用 Spearman 相關性分析評估 IVIM 相關參數值與 MVD 有無相關性，r 為正值代表正相關，負值代表負相關；0≤|r|<0.25，無相關性或相關性弱；0.25≤|r|<0.5，相關性一般；0.5≤|r|<0.75，相關性良好；|r|≥0.75，相關性非常好[18]。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠肝癌模型
喂養 12 周期間，實驗組死亡 26 只，解剖后發現死因可能為肺炎、肝硬化導致的并發癥、腫瘤破裂出血等。空白組 10 只均存活。對剩余 64 只實驗組大鼠進行 MRI 掃描，因過度麻醉死亡 3 只，因 IVIM 圖像病灶區域出現信號缺失排除 4 只，最終對 57 只實驗組大鼠進行病理取材。
2.2 病理結果及統計結果
共納入 50 個 HCC 病灶，包含 MVI（+）組 27 個，MVI（–）組 23 個。50 個 HCC 病灶 MVD 為（18.2±11.4）個/視野，ADC、D 及 D*分別為（0.85±0.14）、（0.75±0.14）、（28.5±7.39）× 10–3 mm2/s，f 值為（16.0±7.54）%，各 IVIM 參數與 MVD 的相關系數見表 1，散點圖見圖 1。HCC 的 ADC 值、D 值與 MVD 呈負相關（r=–0.406，P=0.003；r=–0.468，P=0.001）；D*值、f 值與 MVD 無統計學相關性（P=0.172、0.074）；MVI（+）組和 MVI（–）組的 IVIM 相關參數、ADC 差異均無統計學意義（P=0.393、0.395、0.221、0.550），見表 2 及圖 2、3。
表1
MVD 與 ADC、IVIM 相關參數的相關性分析
圖1
ADC、D、D*及 f 與 MVD 相關性分析的散點圖
表2
MVI（+）與 MVI（–）組 IVIM 相關參數值、ADC 值
圖2
一例病灶內無 MVI 的大鼠 HCC 病灶 MRI 及病理圖像
a. T1 圖像，病灶呈稍長 T1 信號；b. T2 圖像，病灶呈長 T2 信號；c. DWI 呈高信號；d. ADC 圖像呈稍低信號；c、d 示病灶彌散稍受限；e～g. 分別為其 D、D*、
圖3
一例病灶內有 MVI 的大鼠 HCC 病灶 MRI 及病理圖像
a. T1 圖像，病灶呈稍長 T1 信號；b. T2 圖像，病灶呈稍長 T2 信號；c. DWI 呈高信號；d. ADC 圖像呈低信號；c、d 示病灶彌散明顯受限；e～g. 分別為其 D、D*、
3 討論
本研究發現 ADC 及 IVIM 參數 D 與 HCC MVD 具有相關性，但 MVI（+）組和 MVI（–）組的 IVIM 相關參數、ADC 差異無統計學意義（P>0.05），表明 ADC、D 一定程度上可用于無創評估 HCC 的 MVD，但評估 MVI 的能力受限。
DWI 通過梯度回波技術來反映組織內水分子的布朗運動，進而間接反映感興趣區組織內微觀結構的特點，但在活體組織內，不僅有水分子的擴散，還有微循環毛細血管灌注的影響。因此 Le Bihan 等[16]在 20 世紀 80 年代提出 IVIM 理論，即 Sb/S0=（1–f）×exp（–bD）+f×exp［（–b（D+D*）］，其中，S 代表感興趣區內信號強度；D 代表感興趣區內純水分子擴散，為真性擴散系數；D*代表感興趣區內微循環灌注，為假性擴散系數；f為灌注分數，代表感興趣區內微循環灌注效應占總體擴散效應的容積率。IVIM 能夠將灌注導致的彌散與真實彌散分離，更準確地評估彌散及灌注。
HCC 在血管生成因子的刺激下，已存在的微血管內皮細胞重新進入細胞增殖周期，形成新生毛細血管，與 HCC 的生成、生長及預后有密切關系[19]。研究表明，MVD 是一個獨立而重要的預后因素，高 MVD 提示腫瘤易發生轉移，預后不良[20]。本研究發現，HCC 的 ADC 值、D 值與 MVD 有一定的負相關關系。腫瘤的病理分級越高，腫瘤組織內水分子擴散受限越嚴重[18]，同時腫瘤病理分級越高，腫瘤內微血管越多，亦會加大對腫瘤組織內水分子擴散運動的抑制作用，二者共同作用的結果最終導致反映純水分子擴散的 D 值與 MVD 具有一定的負相關性，而包含腫瘤組織內純水分子擴散和微循環血流灌注兩方面信息的 ADC 值，亦與 MVD 呈現出一定的負相關關系。
Lee 等[21]將人結直腸癌細胞種植于裸鼠腹側皮下，建立腫瘤模型后進行 IVIM 成像，結果示：D*值和 f 值分別與 MVD 具有良好的正相關關系（r=0.782，P<0.001；r=0.749，P<0.001），能夠反映腫瘤的灌注信息。本研究中，D*值、f 值與 MVD 無相關性，與上述報道不一致，推測原因為 D*值和f 值的可重復性差，D 值和 ADC 值的可重復性較好[22-23]，與掃描時的呼吸方式、病灶位置等因素有關。
僅有少數研究應用 DWI 的 ADC 值來預測 HCC 的 MVI[24-25]。這些研究認為 ADC 可預測 HCC 的 MVI：當 ADC 值<1.227×10–3 mm2/s（b=0、500 s/mm2）時，可作為小 HCC（腫瘤直徑≤2 cm）MVI 的預測因子。ADC 值<1.11×10–3 mm2/s 有利于術前預測 HCC 的 MVI。對于本研究，應用單變量分析 MVI（+）組和 MVI（–）組的 ADC 值、IVIM 相關參數值，差異均無統計學意義（P>0.05），目前尚需更多、更大樣本含量的研究進一步驗證。
本研究存在一些不足。第一，不能完全確保病理取材標本與 MRI 圖像參數測量層面相一致。研究中我們采用了以下方法使二者盡量保持一致：結合 T1、T2 軸位、冠狀位、矢狀位圖像，對參數測量層面準確定位；掃描體位和取材體位保持一致，均取仰臥位，取材時，找到 MRI 參數測量平面。但所取標本厚度與 MRI 掃描層厚有一定差距，難免導致病理標本與參數測量層面之間存在一定的誤差。第二，本研究的樣本量相對較小，主要是受到建模周期較長的限制。第三，IVIM-DWI 的掃描參數，目前并無統一標準，因此本研究在進行預實驗后，選取了相比之下能獲得最佳圖像質量的參數進行掃描，與別的研究所選掃描參數有差異，是造成與之結果不一致的原因之一。
