引用本文： 姚楊, 蘇杰, 徐銳, 朱星枚, 成碧萍. 腎上腺髓質素在肝癌患者中的表達及意義. 華西醫學, 2016, 31(2): 266-269. doi: 10.7507/1002-0179.20160072 復制
肝癌是世界范圍內一種常見的惡性腫瘤，在我國每年有11萬人死于肝癌，肝癌死亡率僅次于胃癌，為我國居第2位的癌癥“殺手”。盡管隨著醫學科學的不斷進步出現了許多治療手段，根治性切除仍然是治療肝癌的首選方法，但術后高復發率及高轉移率高影響了肝癌的療效。因此，研究其發病與轉機制，尋找新的治療方法是目前肝癌治療中的一個重要課題。
腎上腺髓質素（ADM）是由日本學者于1993年發現的一種血管源性活性肽[1]，主要由血管內皮細胞核血管平滑肌細胞合成分泌，其結構域與降鈣素基因相關肽（CGRP）相似，屬于CGRP超家族成員，通過CGRP1及特異性ADM受體產生作用。近年研究來發現ADM可能通過促進血管生成、刺激有絲分裂、抑制凋亡及有助于腫瘤細胞免疫逃逸等作用影響腫瘤的發生發展[2-6]。目前關于ADM在肝癌組織中表達及其分子機制的研究較少。本實驗通過免疫組織化學方法和酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測ADM在肝癌患者組織及血液中的表達情況，分析ADM與肝癌組織分化程度、腫塊大小、是否轉移等生物學特性的關系，探討ADM在肝癌發生、發展過程中的作用機制，旨在提高肝癌的早期診斷率，探討其作為一種新的評估預后指標的可能性，并為肝癌的治療提供新的理論依據及實驗基礎。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
1.1.1 肝癌及正常肝組織標本
肝癌組織標本自西安醫學院第一附屬醫院2012年1月－2013年11月期間54例外科住院手術患者，術前患者未接受抗腫瘤治療，無其他免疫、內分泌、代謝性疾病，均經術后病理證實，術后隨訪至今。其中男33例，女21例；年齡42～78歲，平均（61.0±5.8）歲；高分化21例，中分化11例，低分化22例；腫瘤直徑≤5 cm者22例，＞5 cm者32例；肝癌參照美國癌癥聯合會（AJCC）第7版分期[7]，Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期35例；伴有淋巴結轉移者28例，無淋巴結轉移26例。此外選取10例肝癌癌旁組織及8例肝外傷患者（術后病理證實為正常肝組織）肝臟標本為良性組織對照，其中男7例，女11例，平均年齡（46.0±3.1）歲。
1.1.2 血液標本
隨機選擇2013年1月－6月我院60例住院肝癌患者，均符合肝癌診斷標準，根據臨床癥狀、體征及腫瘤標志物等生物化學指標確認，作為肝癌組，其中男28例，女32例；年齡28～67歲，平均年齡（43.2±5.3）歲；根據AJCC第7版分期[7]，Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期35例。另選擇同期40例我院門診健康體檢者為健康對照組，要求無其他免疫、內分泌、代謝性疾病，實驗室檢查均屬于正常范圍，其中男21例，女19例；年齡32～68歲，平均（48.0±6.2）歲。
1.2 肝癌及正常肝組織ADM檢測
1.2.1 標本采集
肝癌組織：手術切除肝癌后，避開壞死和出血區域，無菌狀態立刻切取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小癌組織。癌旁組織：自肝癌組織邊沿取1.5 cm以內的肝組織，大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，無癌細胞浸潤。肝外傷：沿外傷組織邊沿取1.5 cm以內的肝組織，大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm。標本取下后投入液氮保存。
1.2.2 免疫組織化學
ADM的檢測采用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法，取石蠟標本切片，60℃烤2 h，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，3 min/次；0.3 % TritonX-100室溫孵育20 min，3%過氧化氫室溫孵育15 min，以滅火內源性過氧化物酶；10%山羊血清封閉，室溫30 min；甩去多余液體，不洗；加入1︰50稀釋的鼠抗人ADM單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），37℃ 1～2 h，0.01 mol/L PBS洗5 min，共3次，加第二抗體，37℃ 45 min。0.01 mol/L PBS洗5 min，共4次，二氨基聯苯胺顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復染，脫水、透明、封片。同時以PBS代替第一抗體作為陰性對照。ADM以細胞核或細胞質中出現棕黃色顆粒為陽性細胞。隨機選取10個高倍視野，計算每個視野內100個腫瘤細胞中陽性染色的細胞數，即陽性細胞的百分數，并取平均值。以腫瘤細胞不著色或陽性細胞數＜10%為陰性，≥10%為陽性，其中10%～50%為低表達，＞50%為高表達。
1.3 血液標本中ADM檢測
兩組均于清晨空腹抽取肘靜脈血4 mL，所有血液標本均在30 min內3 000 r/min離心5 min，離心分離血漿，取上層血清標本于-80℃冰箱保存，待成批測定，避免反復凍溶。采用ELISA法檢測ADM。取出酶標板，每孔依次加入50 μL的標準品，分別將將標本標記，加入50 μL樣品，經過孵育反應，洗版，加入底物，再孵育，加入終止液，酶標儀上讀吸光度值，查出其相應的濃度值。酶標儀由美國伯樂公司提供，測定方法嚴格按照說明書操作。
1.4 統計學方法
本研究統計分析采用SPSS 12.0統計軟件。計數資料采用百分比表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差表示，組間比較行t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 ADM于肝癌組織和正常肝組織內表達
在高倍（×400）鏡下，肝癌組織中可見大量癌細胞呈ADM陽性表達，呈棕黃色，數量多而濃。肝癌組織的ADM陽性表達率為74.1%，在18例良性組織中ADM陽性表達率為38.9%，肝癌組織中ADM陽性表達率高于良性組織，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖 1。
圖1
ADM 在肝癌組織及正常肝組織中的表達（SP ×400）
a. 肝癌組織 b. 正常肝組織
2.2 肝癌組織中ADM表達與臨床病理特征的關系
ADM在低、中、高分化肝癌的陽性率分別為95.2%、54.5%和40.9%。不同分化程度之間的表達具統計學意義（P＜0.01）；有淋巴結轉移者ADM陽性率高于無淋巴結轉移者（P＜0.05）。不同年齡、性別、腫瘤大小及臨床分期的陽性表達率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
ADM 與臨床病理參數關系
2.3 肝癌組和健康對照組血漿中ADM的表達
肝癌組血漿ADM含量[（60.18 ±18.25）ng/L]高于健康對照組[（35.48 ±10.32）ng/L]，表達差異有統計學意義（t=7.764，P＜0.001）。25例Ⅰ～Ⅱ期肝癌患者血漿ADM為（46.35±25.24） ng/L，35例Ⅲ～Ⅳ期肝癌患者血漿ADM含量為（65.84±19.38）ng/L，差異有統計學意義（t=-3.384，P=0.001）。
3 討論
肝癌作為當前最常見的惡性腫瘤之一[8]，其短期內病死率高、發展迅速、預后差等特點嚴重威脅著人們的健康，每年我國高達10萬患者死于肝癌，近來雖然療效明顯提高，但肝癌患者切除術后的遠期預后仍然不樂觀，目前復發率高達60%以上，5年生存率為40%～50%，術后復發率高，是晚期死亡的主要原因，因此，肝癌術后復發的預防及處理成為當前提升肝癌切除后成活率的重要因素[9-11]。
ADM是在嗜鉻細胞瘤中發現的一種活性多肽，屬于CGRP超家族成員，廣泛分布于各個組織和器官中，以自分泌或者旁分泌的方式發揮其生物學作用，隨著研究的深入，當前，不少研究證實ADM和惡性腫瘤間有著密切關系。有研究報道ADM為人體腫瘤細胞內的自分泌生長因子，其中95%的腫瘤細胞能產生ADM，同時和組織學的分級與不良的預后相關[12]。卵巢癌的ADM表達和腫瘤分期和預后相關[13]。有研究發現，通過提升增殖率及降低凋亡率，ADM能顯著地推動腎上皮質癌SW-13細胞的成長[14]；在惡性程度更高的前列腺組織或前列腺癌細胞株內ADM高表達[15]；而在膠質瘤細胞內通過RNA印跡法與放射免疫法研究發現，ADM表達和腫瘤病理類別與分化程度相關[16]。
在其他腫瘤方面，有研究發現肺癌患者中ADM表達明顯增強，其表達水平與肺癌分化程度顯著相關，ADM基因在肺癌的發生、發展中可能起重要作用[17]；結腸癌患者的血液中有較高濃度的ADM，手術后血液ADM水平下降；此外，在外科切除垂體瘤后可以使庫欣綜合征患者的血液ADM水平降至正常，均表明腫瘤是ADM的主要來源。
本研究發現ADM在肝癌組織的表達明顯高于正常肝組織，肝癌組血漿ADM含量高于正常對照組，其差異有統計學意義（P＜0.01）。肝癌組織內的ADM可能是由肝癌腫瘤細胞產生及分泌的。ADM可能以自分泌或旁分泌的形式影響腫瘤細胞的增殖，其極有可能作為腫瘤產物抑制了宿主的免疫反應，進而幫助腫瘤細胞免疫逃逸。本研究還發現肝癌組織內的ADM蛋白的表達與年齡、病理類別或臨床分期等臨床生物學指標均無關，但與病理分化程度有關，ADM在低、中、高分化肝癌的陽性率分別為95.2%、54.5%和40.9%，不同分化程度之間的表達具統計學意義（P＜0.01），病理分化的程度越低，轉移范圍越廣，其ADM陽性的表達率就越高，臨床預后就越差，顯示ADM可能為全新的腫瘤轉移相關因子，其有希望成為肝癌等惡性腫瘤分子標志物，ADM基因的表達水平可能是肝癌惡性程度和侵襲性的重要指標。
綜上所述，ADM于肝癌發生和發展的環節均起著重要作用，但上述機制并未完全闡明，ADM表達水平的增加，能否作為判斷肝癌和預后的獨立指標，及以ADM中心的靶向基因治療于肝癌的可行性和有效性均有待展開深入的研究。
肝癌是世界范圍內一種常見的惡性腫瘤，在我國每年有11萬人死于肝癌，肝癌死亡率僅次于胃癌，為我國居第2位的癌癥“殺手”。盡管隨著醫學科學的不斷進步出現了許多治療手段，根治性切除仍然是治療肝癌的首選方法，但術后高復發率及高轉移率高影響了肝癌的療效。因此，研究其發病與轉機制，尋找新的治療方法是目前肝癌治療中的一個重要課題。
腎上腺髓質素（ADM）是由日本學者于1993年發現的一種血管源性活性肽[1]，主要由血管內皮細胞核血管平滑肌細胞合成分泌，其結構域與降鈣素基因相關肽（CGRP）相似，屬于CGRP超家族成員，通過CGRP1及特異性ADM受體產生作用。近年研究來發現ADM可能通過促進血管生成、刺激有絲分裂、抑制凋亡及有助于腫瘤細胞免疫逃逸等作用影響腫瘤的發生發展[2-6]。目前關于ADM在肝癌組織中表達及其分子機制的研究較少。本實驗通過免疫組織化學方法和酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測ADM在肝癌患者組織及血液中的表達情況，分析ADM與肝癌組織分化程度、腫塊大小、是否轉移等生物學特性的關系，探討ADM在肝癌發生、發展過程中的作用機制，旨在提高肝癌的早期診斷率，探討其作為一種新的評估預后指標的可能性，并為肝癌的治療提供新的理論依據及實驗基礎。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
1.1.1 肝癌及正常肝組織標本
肝癌組織標本自西安醫學院第一附屬醫院2012年1月－2013年11月期間54例外科住院手術患者，術前患者未接受抗腫瘤治療，無其他免疫、內分泌、代謝性疾病，均經術后病理證實，術后隨訪至今。其中男33例，女21例；年齡42～78歲，平均（61.0±5.8）歲；高分化21例，中分化11例，低分化22例；腫瘤直徑≤5 cm者22例，＞5 cm者32例；肝癌參照美國癌癥聯合會（AJCC）第7版分期[7]，Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期35例；伴有淋巴結轉移者28例，無淋巴結轉移26例。此外選取10例肝癌癌旁組織及8例肝外傷患者（術后病理證實為正常肝組織）肝臟標本為良性組織對照，其中男7例，女11例，平均年齡（46.0±3.1）歲。
1.1.2 血液標本
隨機選擇2013年1月－6月我院60例住院肝癌患者，均符合肝癌診斷標準，根據臨床癥狀、體征及腫瘤標志物等生物化學指標確認，作為肝癌組，其中男28例，女32例；年齡28～67歲，平均年齡（43.2±5.3）歲；根據AJCC第7版分期[7]，Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期35例。另選擇同期40例我院門診健康體檢者為健康對照組，要求無其他免疫、內分泌、代謝性疾病，實驗室檢查均屬于正常范圍，其中男21例，女19例；年齡32～68歲，平均（48.0±6.2）歲。
1.2 肝癌及正常肝組織ADM檢測
1.2.1 標本采集
肝癌組織：手術切除肝癌后，避開壞死和出血區域，無菌狀態立刻切取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小癌組織。癌旁組織：自肝癌組織邊沿取1.5 cm以內的肝組織，大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，無癌細胞浸潤。肝外傷：沿外傷組織邊沿取1.5 cm以內的肝組織，大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm。標本取下后投入液氮保存。
1.2.2 免疫組織化學
ADM的檢測采用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法，取石蠟標本切片，60℃烤2 h，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，3 min/次；0.3 % TritonX-100室溫孵育20 min，3%過氧化氫室溫孵育15 min，以滅火內源性過氧化物酶；10%山羊血清封閉，室溫30 min；甩去多余液體，不洗；加入1︰50稀釋的鼠抗人ADM單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），37℃ 1～2 h，0.01 mol/L PBS洗5 min，共3次，加第二抗體，37℃ 45 min。0.01 mol/L PBS洗5 min，共4次，二氨基聯苯胺顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復染，脫水、透明、封片。同時以PBS代替第一抗體作為陰性對照。ADM以細胞核或細胞質中出現棕黃色顆粒為陽性細胞。隨機選取10個高倍視野，計算每個視野內100個腫瘤細胞中陽性染色的細胞數，即陽性細胞的百分數，并取平均值。以腫瘤細胞不著色或陽性細胞數＜10%為陰性，≥10%為陽性，其中10%～50%為低表達，＞50%為高表達。
1.3 血液標本中ADM檢測
兩組均于清晨空腹抽取肘靜脈血4 mL，所有血液標本均在30 min內3 000 r/min離心5 min，離心分離血漿，取上層血清標本于-80℃冰箱保存，待成批測定，避免反復凍溶。采用ELISA法檢測ADM。取出酶標板，每孔依次加入50 μL的標準品，分別將將標本標記，加入50 μL樣品，經過孵育反應，洗版，加入底物，再孵育，加入終止液，酶標儀上讀吸光度值，查出其相應的濃度值。酶標儀由美國伯樂公司提供，測定方法嚴格按照說明書操作。
1.4 統計學方法
本研究統計分析采用SPSS 12.0統計軟件。計數資料采用百分比表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差表示，組間比較行t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 ADM于肝癌組織和正常肝組織內表達
在高倍（×400）鏡下，肝癌組織中可見大量癌細胞呈ADM陽性表達，呈棕黃色，數量多而濃。肝癌組織的ADM陽性表達率為74.1%，在18例良性組織中ADM陽性表達率為38.9%，肝癌組織中ADM陽性表達率高于良性組織，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖 1。
圖1
ADM 在肝癌組織及正常肝組織中的表達（SP ×400）
a. 肝癌組織 b. 正常肝組織
2.2 肝癌組織中ADM表達與臨床病理特征的關系
ADM在低、中、高分化肝癌的陽性率分別為95.2%、54.5%和40.9%。不同分化程度之間的表達具統計學意義（P＜0.01）；有淋巴結轉移者ADM陽性率高于無淋巴結轉移者（P＜0.05）。不同年齡、性別、腫瘤大小及臨床分期的陽性表達率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
ADM 與臨床病理參數關系
2.3 肝癌組和健康對照組血漿中ADM的表達
肝癌組血漿ADM含量[（60.18 ±18.25）ng/L]高于健康對照組[（35.48 ±10.32）ng/L]，表達差異有統計學意義（t=7.764，P＜0.001）。25例Ⅰ～Ⅱ期肝癌患者血漿ADM為（46.35±25.24） ng/L，35例Ⅲ～Ⅳ期肝癌患者血漿ADM含量為（65.84±19.38）ng/L，差異有統計學意義（t=-3.384，P=0.001）。
3 討論
肝癌作為當前最常見的惡性腫瘤之一[8]，其短期內病死率高、發展迅速、預后差等特點嚴重威脅著人們的健康，每年我國高達10萬患者死于肝癌，近來雖然療效明顯提高，但肝癌患者切除術后的遠期預后仍然不樂觀，目前復發率高達60%以上，5年生存率為40%～50%，術后復發率高，是晚期死亡的主要原因，因此，肝癌術后復發的預防及處理成為當前提升肝癌切除后成活率的重要因素[9-11]。
ADM是在嗜鉻細胞瘤中發現的一種活性多肽，屬于CGRP超家族成員，廣泛分布于各個組織和器官中，以自分泌或者旁分泌的方式發揮其生物學作用，隨著研究的深入，當前，不少研究證實ADM和惡性腫瘤間有著密切關系。有研究報道ADM為人體腫瘤細胞內的自分泌生長因子，其中95%的腫瘤細胞能產生ADM，同時和組織學的分級與不良的預后相關[12]。卵巢癌的ADM表達和腫瘤分期和預后相關[13]。有研究發現，通過提升增殖率及降低凋亡率，ADM能顯著地推動腎上皮質癌SW-13細胞的成長[14]；在惡性程度更高的前列腺組織或前列腺癌細胞株內ADM高表達[15]；而在膠質瘤細胞內通過RNA印跡法與放射免疫法研究發現，ADM表達和腫瘤病理類別與分化程度相關[16]。
在其他腫瘤方面，有研究發現肺癌患者中ADM表達明顯增強，其表達水平與肺癌分化程度顯著相關，ADM基因在肺癌的發生、發展中可能起重要作用[17]；結腸癌患者的血液中有較高濃度的ADM，手術后血液ADM水平下降；此外，在外科切除垂體瘤后可以使庫欣綜合征患者的血液ADM水平降至正常，均表明腫瘤是ADM的主要來源。
本研究發現ADM在肝癌組織的表達明顯高于正常肝組織，肝癌組血漿ADM含量高于正常對照組，其差異有統計學意義（P＜0.01）。肝癌組織內的ADM可能是由肝癌腫瘤細胞產生及分泌的。ADM可能以自分泌或旁分泌的形式影響腫瘤細胞的增殖，其極有可能作為腫瘤產物抑制了宿主的免疫反應，進而幫助腫瘤細胞免疫逃逸。本研究還發現肝癌組織內的ADM蛋白的表達與年齡、病理類別或臨床分期等臨床生物學指標均無關，但與病理分化程度有關，ADM在低、中、高分化肝癌的陽性率分別為95.2%、54.5%和40.9%，不同分化程度之間的表達具統計學意義（P＜0.01），病理分化的程度越低，轉移范圍越廣，其ADM陽性的表達率就越高，臨床預后就越差，顯示ADM可能為全新的腫瘤轉移相關因子，其有希望成為肝癌等惡性腫瘤分子標志物，ADM基因的表達水平可能是肝癌惡性程度和侵襲性的重要指標。
綜上所述，ADM于肝癌發生和發展的環節均起著重要作用，但上述機制并未完全闡明，ADM表達水平的增加，能否作為判斷肝癌和預后的獨立指標，及以ADM中心的靶向基因治療于肝癌的可行性和有效性均有待展開深入的研究。
