引用本文： 唐新, 鄭果, 陳卓, 黃強, 李棋, 付維力, 李箭, 陳剛, 周宗科, 裴福興. 干擾小RNA下調瘦素受體抑制人骨關節炎軟骨細胞白細胞介素-1β和一氧化氮的信使RNA表達. 華西醫學, 2016, 31(5): 854-858. doi: 10.7507/1002-0179.201600233 復制
骨關節炎（OA）是一種隨年齡增長而發生率明顯增加的退行性關節疾病，其發病是一個多因素參與的復雜過程[1]，至今其病因和發病機制仍不十分清楚。研究表明，關節軟骨的退變是引起OA和OA發展過程中的主要病理特點[2-3]；軟骨細胞的功能下降、凋亡增多、炎性因子和降解蛋白酶分泌增多等改變則是OA 病理進程中最重要的因素[4-5]。
肥胖被認為是眾多OA致病因素中促進其發生發展的主要原因之一。在研究肥胖與OA的關系中，脂肪組織也被認為是具有分泌功能的內分泌器官，分泌一系列脂肪相關因子，其中最熱門的就是瘦素（leptin）。瘦素現在已經被認為是聯系肥胖和骨關節炎的潛在系統性因子，并可作為關節炎的診斷指標、藥物治療的靶點并為預后提供重要的參考信息[6-7]。瘦素的生物學功能是通過與瘦素受體（Ob-Rb）結合激活下游炎性信號通路來介導的[8]。越來越多的證據表明瘦素通過與瘦素受體Ob-Rb結合誘導如腫瘤壞死因子（TNF）、干擾素γ（INFγ）、白細胞介素（IL）、環氧化酶2（COX-2）、一氧化氮（NO）等炎性因子的產生，并在如OA、類風濕關節炎等炎性疾病中發揮作用[8-11]。
本研究針對人OA的軟骨細胞的瘦素受體的Ob-Rb基因進行干擾小RNA（siRNA）的脂質體轉染下調，然后通過熒光定量聚合酶鏈反應（Q-PCR）檢測軟骨細胞中前炎性因子IL-1β和NO的mRNA表達，旨在為臨床OA的基因治療提供新思路和實驗支持。
1 資料與方法
1.1 研究對象及樣本來源
所有標本均取自于2013年1月－6月四川大學華西醫院骨科收治的10例晚期OA行全膝關節置換患者，取材位置位于股骨髁內、外髁負重過渡區的關節軟骨組織。其中男3例，女7例；年齡45～71歲，平均（61.7±6.69）歲；體質量指數（BMI）25.00～29.38 kg/m2，平均（27.50±1.28）kg/m2。參照美國風濕病學會對OA的診斷標準[12]，嚴格排除免疫性及其他可能影響膝關節病情的合并癥。所有患者術前經全科討論意見一致。該研究獲得醫院倫理委員會的批準，所有患者術前均經其本人知情同意。
1.2 實驗試劑與儀器
1.2.1 實驗試劑
細胞培養基（DMEM）低糖培養基、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）、0.25%胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、胎牛血清（美國GIBCO公司）、BLOCK-iTTM Fluorescent Oligo（美國Invitrogen公司）、脂質體LipofectamineTM 2000（美國Invitrogen公司）、Opti-MEM?I減血清培養基（美國Invitrogen公司）、siRNA（廣州銳博公司）、重組人IL-1β（美國Sigma公司）。
1.2.2 實驗設備
超凈工作臺（德國Heraeus公司），水浴搖床（德國Memmert公司）、倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）、37℃ 55% 二氧化碳（CO2）孵育箱（日本Sanyo公司），CFX96熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD公司）、多功能酶標儀、離心機、電泳儀、微量天平等。
1.3 軟骨細胞獲取及培養方法
1.3.1 軟骨細胞的分離培養
膝關節置換術中在無菌條件下顯露膝關節軟骨組織,以銳利刀片取OA患者軟骨組織（股骨髁和脛骨平臺），用生理鹽水沖洗3次，尖刀片刮除軟骨膜后生理鹽水再次沖洗2～3次。將關節軟骨細胞的體外兩步酶消化法（胰蛋白酶+Ⅱ型膠原酶）對軟骨細胞進行分離培養。當原代培養細胞覆蓋瓶底80%以上時，吸盡培養基，PBS液清洗2～3次后加入0.25%胰蛋白酶，37℃，5%CO2孵育箱消化2～3 min，然后將培養瓶放置于倒置相差顯微鏡下觀察，顯示大部分細胞變圓漂浮時，加入20%含胎牛血清培養基終止消化，并適度拍打培養瓶底以幫助貼壁細胞順利脫壁，以離心半徑7 cm、1 000 r/min離心3 min后加入適量20%胎牛血清DMEM培養基重懸，血球計數板計數，1×104/mL傳代接種進入傳代培養。取第3代培養細胞進行實驗。
1.3.2 軟骨鑒定
取二代軟骨細胞進行細胞爬片、Ⅱ型膠原免疫組織化學及甲苯胺藍染色進行細胞形態學的進一步鑒定。①甲苯胺藍染色：采用爬片技術，待軟骨細胞基本長滿后，取出細胞爬片，PBS液沖洗3次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，自來水漂洗15 min，雙蒸水沖洗 3次，放于染色架上，1%甲苯胺藍染色30 min，雙蒸水洗去多余的染液，100%無水乙醇脫水，中性樹膠封片倒置相差顯微鏡下觀察并拍照記錄。②Ⅱ型膠原免疫組織化學染色：采用爬片技術，待軟骨細胞基本長滿后，取出細胞爬片，放于染色架上，滴加正常非免疫動物血清室溫下孵育10 min。除去血清，滴加1︰1 000 兔抗人Ⅱ型膠原一抗，4℃過夜。PBS液沖洗3次，5 min/次。滴加生物素標記的二抗，室溫下孵育10 min，PBS液沖洗3次，5 min/次。二氨基聯苯胺顯色，蘇木精復色，無水乙醇脫水，中性樹膠封片倒置相差顯微鏡下觀察并拍照記錄。
1.3.3 Ob-Rb基因轉染
構建最佳siRNA的 Ob-Rb脂質體（實驗組），用空白Ob-Rb脂質體作為對照脂質體（對照組），將最佳的96孔板的轉染濃度換算成6孔板所對應的濃度，BLOCK-iT? Fluorescent Oligo換成設計合成好的siRNA（實驗組）以及陰性對照組。用Lipofectamine2000（美國Invitrogen公司）對接種到6孔板的OA軟骨細胞進行轉染，按照試劑盒說明書進行操作。轉染后24 h Ob-Rb的沉默率經 RT-PCR檢測Ob-Rb信使RNA（mRNA）的含量較空白組降低78.5%。
1.3.4 Q-PCR檢測
各組分別在轉然后24、48、72 h應用Q-PCR檢測炎性因子基因IL-1β的基因mRNA表達量。采用Trizol一步法提取各組軟骨細胞總RNA，RNA定量后逆轉錄合成第1鏈互補NDA（cDNA），用Roter-Gene 3000熒光定量PCR系統進行PCR反應。引物序列為IL-1β-FP：5’-TTCGACACATGGGATAACGAGG-3’；IL-1β-RP：5’-TTTTTGCTGTGAGTCCCGGAG-3’。PCR 配置反應體系：Taq DNA聚合酶0.125 μL，10倍PCR緩沖液2.5 μL，25 mmol/L氯化鎂1.5 μL，10 mmoL/L脫氧核糖核苷三磷酸0.5 μL，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物（25 mmol/L）各1 μL，cDNA模板2 μL，加水至25 μL。PCR擴增：95℃，3 min；95℃，30 s，56℃，30 s，72℃，40 s，30個循環；72℃，10 min。對照設立：以GAPDH為內對照，無cDNA模板的反應體系為空白對照。2%瓊脂糖凝膠電泳，Goldview染色，凝膠掃描儀成像，采用紫外激發，Quantity One 4.6.1軟件分析數據。Q-PCR檢測相對拷貝數反應體系：重蒸水11.3 μL，SYBR Premix Ex TaqTM（2×） 10 μL，primer 1（200 μmol/L）0.1 μL，primer 2（200 μμmol/L）0.1 μL，cDNA 1.0 μL，加水至 20 μL。PCR擴增：95℃，30 s；95℃，5 s，56℃，5 s，72 ℃，20 s（收集熒光），40個循環。以0.1℃/0.2 s，從65℃持續升溫到95℃作熔點曲線。數據分析：記錄Ct（cycle threshold）值及熔點溫度，數據分析采用熒光定量分析軟件：CFX manager 2.1（BIO-RAD）。用2-ΔΔCt計算目的基因的相對拷貝數。ΔΔCt= ΔCtexp?ΔCtcon=（Ctexp?target?Ctexp?GAPDH）? （Ctcon-target?Ctcon?GAPDH）。
1.4 統計學方法
采用SPSS 16.0統計軟件。計量資料采用均數 ± 標準差表示，統計前先進行正態分布檢驗，若符合正態分布且方差齊，則兩組間比較采用t檢驗；若不符合正態分析或方差不齊，則兩組間樣本組間比較采用Mann-Whitney秩和檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞鑒定結果
甲苯胺藍染色均可見細胞外基質中染色呈陽性，軟骨細胞正染以藍色為主，呈異染性；Ⅱ型膠原免疫組織化學染色細胞核染色呈陽性，表現為棕黃色（圖 1）。表明培養細胞為軟骨細胞。
圖1
軟骨細胞鑒定倒置相差顯微鏡像
a. 細胞外基質中染色呈陽性，軟骨細胞正染以藍色為主，呈異染性（甲苯胺藍染色×100）b. 細胞核染色呈陽性，表現為棕黃色（Ⅱ型膠原免疫組織化學染色 ×100）
2.2 Q-PCR檢測結果
實驗組和對照組干預后24、48和72 h內，IL-1β的表達2-ΔΔCt值均隨時間的變化逐漸升高，但實驗組均明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 2。
圖2
干預24、48和72 h內，NO的表達水平
對照組組干預后24、48和72 h內，NO的表達2-ΔΔCt值均隨時間的變化逐漸升高，實驗組的表達2-ΔΔCt值均隨時間的變化逐漸升高，但實驗組均明顯低于對照組，有統計學意義（P＜0.05）。見圖 3。
圖3
干預后24、48和72 h內，IL-1β的表達水平
3 討論
近年來，瘦素在OA中的作用越來越受到重視。膝關節OA患者膝關節液中的瘦素含量遠遠高于血漿瘦素水平[13]，而且嚴重OA患者的關節液中瘦素水平顯著高于較輕的患者。Simopoulou等[14]取OA患者關節軟骨嚴重病變部位和輕微病變部位做體外培養，用正常人關節軟骨作為對照，結果發現，關節軟骨細胞可獨立表達瘦素和其功能性受體Ob-Rb，且瘦素的表達量與關節軟骨的病變程度呈正相關。
瘦素與關節軟骨細胞膜上的Ob-Rb結合后，可增加IL-1β、基質金屬蛋白酶（MMP）-9和MMP-19的產生，從而介導炎性反應導致關節軟骨的破壞[14]。另外也有研究顯示瘦素可誘導IL-1β的表達和刺激MMP-9、MMP-13蛋白的生成，表明瘦素在關節軟骨的代謝中起到了親炎癥反應的作用[15]。Koskinen等[16]發現瘦素可通過增加OA關節軟骨中NO、前列腺素E2、IL-6和IL-8的生成來調節軟骨代謝，促使軟骨分解。將瘦素添加到人原代軟骨細胞和ATDC5軟骨細胞體外培養中發現瘦素通過與IL-1協同作用誘導NO的生成和增加Ⅱ型一氧化氮氧化酶（NOS）的表達從而介導炎癥反應[8]。這些研究都通過體外細胞培養表明了瘦素對于關節軟骨的不利作用。
瘦素在OA關節軟骨破壞中的這種關鍵作用已被認為可能是治療OA的一個基因靶點，Iliopoulos等[17]通過體外脂質體瞬時轉染軟骨細胞干擾瘦素基因，成功下調了軟骨細胞的瘦素表達，并減少了MMP-13的產生。但是在體內環境中，關節滑膜、關節軟骨、髕骨下脂肪墊以及骨贅都可表達瘦素[18-19]，并且關節滑膜和髕骨下脂肪墊是關節內產生瘦素的主要組織[20]。因此僅阻斷關節軟骨細胞瘦素的表達不足以阻止瘦素對關節軟骨的不良影響。通過抑制關節軟骨細胞上Ob-Rb的表達也許能更徹底的起到抑制OA患者關節腔內高濃度瘦素對關節軟骨的有害作用。
基于上述已有的瘦素研究成果，結合關節軟骨脂質體轉染系統，我們設想應用靶向瘦素受體Ob-Rb基因的siRNA轉染軟骨細胞，阻斷瘦素在關節軟骨細胞中的信號傳導，抑制前炎性因子的生成，進而抑制關節軟骨破壞，從而為臨床OA的基因治療提供新思路和實驗支持。本研究成功對瘦素受體的基因進行了下調，下調瘦素受體后24、48及72 h后實驗組IL-1β和NO的mRNA表達均明顯低于對照組，且隨時間的推移，兩組之間的差距愈來愈大。因此，我們認為siRNA技術下調瘦素受體可明顯抑制人骨關節炎軟骨細胞炎癥因子的表達，進而對關節的軟骨起到保護作用。這可能為我們臨床OA的基因治療提供新思路和實驗支持。
骨關節炎（OA）是一種隨年齡增長而發生率明顯增加的退行性關節疾病，其發病是一個多因素參與的復雜過程[1]，至今其病因和發病機制仍不十分清楚。研究表明，關節軟骨的退變是引起OA和OA發展過程中的主要病理特點[2-3]；軟骨細胞的功能下降、凋亡增多、炎性因子和降解蛋白酶分泌增多等改變則是OA 病理進程中最重要的因素[4-5]。
肥胖被認為是眾多OA致病因素中促進其發生發展的主要原因之一。在研究肥胖與OA的關系中，脂肪組織也被認為是具有分泌功能的內分泌器官，分泌一系列脂肪相關因子，其中最熱門的就是瘦素（leptin）。瘦素現在已經被認為是聯系肥胖和骨關節炎的潛在系統性因子，并可作為關節炎的診斷指標、藥物治療的靶點并為預后提供重要的參考信息[6-7]。瘦素的生物學功能是通過與瘦素受體（Ob-Rb）結合激活下游炎性信號通路來介導的[8]。越來越多的證據表明瘦素通過與瘦素受體Ob-Rb結合誘導如腫瘤壞死因子（TNF）、干擾素γ（INFγ）、白細胞介素（IL）、環氧化酶2（COX-2）、一氧化氮（NO）等炎性因子的產生，并在如OA、類風濕關節炎等炎性疾病中發揮作用[8-11]。
本研究針對人OA的軟骨細胞的瘦素受體的Ob-Rb基因進行干擾小RNA（siRNA）的脂質體轉染下調，然后通過熒光定量聚合酶鏈反應（Q-PCR）檢測軟骨細胞中前炎性因子IL-1β和NO的mRNA表達，旨在為臨床OA的基因治療提供新思路和實驗支持。
1 資料與方法
1.1 研究對象及樣本來源
所有標本均取自于2013年1月－6月四川大學華西醫院骨科收治的10例晚期OA行全膝關節置換患者，取材位置位于股骨髁內、外髁負重過渡區的關節軟骨組織。其中男3例，女7例；年齡45～71歲，平均（61.7±6.69）歲；體質量指數（BMI）25.00～29.38 kg/m2，平均（27.50±1.28）kg/m2。參照美國風濕病學會對OA的診斷標準[12]，嚴格排除免疫性及其他可能影響膝關節病情的合并癥。所有患者術前經全科討論意見一致。該研究獲得醫院倫理委員會的批準，所有患者術前均經其本人知情同意。
1.2 實驗試劑與儀器
1.2.1 實驗試劑
細胞培養基（DMEM）低糖培養基、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）、0.25%胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、胎牛血清（美國GIBCO公司）、BLOCK-iTTM Fluorescent Oligo（美國Invitrogen公司）、脂質體LipofectamineTM 2000（美國Invitrogen公司）、Opti-MEM?I減血清培養基（美國Invitrogen公司）、siRNA（廣州銳博公司）、重組人IL-1β（美國Sigma公司）。
1.2.2 實驗設備
超凈工作臺（德國Heraeus公司），水浴搖床（德國Memmert公司）、倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）、37℃ 55% 二氧化碳（CO2）孵育箱（日本Sanyo公司），CFX96熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD公司）、多功能酶標儀、離心機、電泳儀、微量天平等。
1.3 軟骨細胞獲取及培養方法
1.3.1 軟骨細胞的分離培養
膝關節置換術中在無菌條件下顯露膝關節軟骨組織,以銳利刀片取OA患者軟骨組織（股骨髁和脛骨平臺），用生理鹽水沖洗3次，尖刀片刮除軟骨膜后生理鹽水再次沖洗2～3次。將關節軟骨細胞的體外兩步酶消化法（胰蛋白酶+Ⅱ型膠原酶）對軟骨細胞進行分離培養。當原代培養細胞覆蓋瓶底80%以上時，吸盡培養基，PBS液清洗2～3次后加入0.25%胰蛋白酶，37℃，5%CO2孵育箱消化2～3 min，然后將培養瓶放置于倒置相差顯微鏡下觀察，顯示大部分細胞變圓漂浮時，加入20%含胎牛血清培養基終止消化，并適度拍打培養瓶底以幫助貼壁細胞順利脫壁，以離心半徑7 cm、1 000 r/min離心3 min后加入適量20%胎牛血清DMEM培養基重懸，血球計數板計數，1×104/mL傳代接種進入傳代培養。取第3代培養細胞進行實驗。
1.3.2 軟骨鑒定
取二代軟骨細胞進行細胞爬片、Ⅱ型膠原免疫組織化學及甲苯胺藍染色進行細胞形態學的進一步鑒定。①甲苯胺藍染色：采用爬片技術，待軟骨細胞基本長滿后，取出細胞爬片，PBS液沖洗3次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，自來水漂洗15 min，雙蒸水沖洗 3次，放于染色架上，1%甲苯胺藍染色30 min，雙蒸水洗去多余的染液，100%無水乙醇脫水，中性樹膠封片倒置相差顯微鏡下觀察并拍照記錄。②Ⅱ型膠原免疫組織化學染色：采用爬片技術，待軟骨細胞基本長滿后，取出細胞爬片，放于染色架上，滴加正常非免疫動物血清室溫下孵育10 min。除去血清，滴加1︰1 000 兔抗人Ⅱ型膠原一抗，4℃過夜。PBS液沖洗3次，5 min/次。滴加生物素標記的二抗，室溫下孵育10 min，PBS液沖洗3次，5 min/次。二氨基聯苯胺顯色，蘇木精復色，無水乙醇脫水，中性樹膠封片倒置相差顯微鏡下觀察并拍照記錄。
1.3.3 Ob-Rb基因轉染
構建最佳siRNA的 Ob-Rb脂質體（實驗組），用空白Ob-Rb脂質體作為對照脂質體（對照組），將最佳的96孔板的轉染濃度換算成6孔板所對應的濃度，BLOCK-iT? Fluorescent Oligo換成設計合成好的siRNA（實驗組）以及陰性對照組。用Lipofectamine2000（美國Invitrogen公司）對接種到6孔板的OA軟骨細胞進行轉染，按照試劑盒說明書進行操作。轉染后24 h Ob-Rb的沉默率經 RT-PCR檢測Ob-Rb信使RNA（mRNA）的含量較空白組降低78.5%。
1.3.4 Q-PCR檢測
各組分別在轉然后24、48、72 h應用Q-PCR檢測炎性因子基因IL-1β的基因mRNA表達量。采用Trizol一步法提取各組軟骨細胞總RNA，RNA定量后逆轉錄合成第1鏈互補NDA（cDNA），用Roter-Gene 3000熒光定量PCR系統進行PCR反應。引物序列為IL-1β-FP：5’-TTCGACACATGGGATAACGAGG-3’；IL-1β-RP：5’-TTTTTGCTGTGAGTCCCGGAG-3’。PCR 配置反應體系：Taq DNA聚合酶0.125 μL，10倍PCR緩沖液2.5 μL，25 mmol/L氯化鎂1.5 μL，10 mmoL/L脫氧核糖核苷三磷酸0.5 μL，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物（25 mmol/L）各1 μL，cDNA模板2 μL，加水至25 μL。PCR擴增：95℃，3 min；95℃，30 s，56℃，30 s，72℃，40 s，30個循環；72℃，10 min。對照設立：以GAPDH為內對照，無cDNA模板的反應體系為空白對照。2%瓊脂糖凝膠電泳，Goldview染色，凝膠掃描儀成像，采用紫外激發，Quantity One 4.6.1軟件分析數據。Q-PCR檢測相對拷貝數反應體系：重蒸水11.3 μL，SYBR Premix Ex TaqTM（2×） 10 μL，primer 1（200 μmol/L）0.1 μL，primer 2（200 μμmol/L）0.1 μL，cDNA 1.0 μL，加水至 20 μL。PCR擴增：95℃，30 s；95℃，5 s，56℃，5 s，72 ℃，20 s（收集熒光），40個循環。以0.1℃/0.2 s，從65℃持續升溫到95℃作熔點曲線。數據分析：記錄Ct（cycle threshold）值及熔點溫度，數據分析采用熒光定量分析軟件：CFX manager 2.1（BIO-RAD）。用2-ΔΔCt計算目的基因的相對拷貝數。ΔΔCt= ΔCtexp?ΔCtcon=（Ctexp?target?Ctexp?GAPDH）? （Ctcon-target?Ctcon?GAPDH）。
1.4 統計學方法
采用SPSS 16.0統計軟件。計量資料采用均數 ± 標準差表示，統計前先進行正態分布檢驗，若符合正態分布且方差齊，則兩組間比較采用t檢驗；若不符合正態分析或方差不齊，則兩組間樣本組間比較采用Mann-Whitney秩和檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞鑒定結果
甲苯胺藍染色均可見細胞外基質中染色呈陽性，軟骨細胞正染以藍色為主，呈異染性；Ⅱ型膠原免疫組織化學染色細胞核染色呈陽性，表現為棕黃色（圖 1）。表明培養細胞為軟骨細胞。
圖1
軟骨細胞鑒定倒置相差顯微鏡像
a. 細胞外基質中染色呈陽性，軟骨細胞正染以藍色為主，呈異染性（甲苯胺藍染色×100）b. 細胞核染色呈陽性，表現為棕黃色（Ⅱ型膠原免疫組織化學染色 ×100）
2.2 Q-PCR檢測結果
實驗組和對照組干預后24、48和72 h內，IL-1β的表達2-ΔΔCt值均隨時間的變化逐漸升高，但實驗組均明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 2。
圖2
干預24、48和72 h內，NO的表達水平
對照組組干預后24、48和72 h內，NO的表達2-ΔΔCt值均隨時間的變化逐漸升高，實驗組的表達2-ΔΔCt值均隨時間的變化逐漸升高，但實驗組均明顯低于對照組，有統計學意義（P＜0.05）。見圖 3。
圖3
干預后24、48和72 h內，IL-1β的表達水平
3 討論
近年來，瘦素在OA中的作用越來越受到重視。膝關節OA患者膝關節液中的瘦素含量遠遠高于血漿瘦素水平[13]，而且嚴重OA患者的關節液中瘦素水平顯著高于較輕的患者。Simopoulou等[14]取OA患者關節軟骨嚴重病變部位和輕微病變部位做體外培養，用正常人關節軟骨作為對照，結果發現，關節軟骨細胞可獨立表達瘦素和其功能性受體Ob-Rb，且瘦素的表達量與關節軟骨的病變程度呈正相關。
瘦素與關節軟骨細胞膜上的Ob-Rb結合后，可增加IL-1β、基質金屬蛋白酶（MMP）-9和MMP-19的產生，從而介導炎性反應導致關節軟骨的破壞[14]。另外也有研究顯示瘦素可誘導IL-1β的表達和刺激MMP-9、MMP-13蛋白的生成，表明瘦素在關節軟骨的代謝中起到了親炎癥反應的作用[15]。Koskinen等[16]發現瘦素可通過增加OA關節軟骨中NO、前列腺素E2、IL-6和IL-8的生成來調節軟骨代謝，促使軟骨分解。將瘦素添加到人原代軟骨細胞和ATDC5軟骨細胞體外培養中發現瘦素通過與IL-1協同作用誘導NO的生成和增加Ⅱ型一氧化氮氧化酶（NOS）的表達從而介導炎癥反應[8]。這些研究都通過體外細胞培養表明了瘦素對于關節軟骨的不利作用。
瘦素在OA關節軟骨破壞中的這種關鍵作用已被認為可能是治療OA的一個基因靶點，Iliopoulos等[17]通過體外脂質體瞬時轉染軟骨細胞干擾瘦素基因，成功下調了軟骨細胞的瘦素表達，并減少了MMP-13的產生。但是在體內環境中，關節滑膜、關節軟骨、髕骨下脂肪墊以及骨贅都可表達瘦素[18-19]，并且關節滑膜和髕骨下脂肪墊是關節內產生瘦素的主要組織[20]。因此僅阻斷關節軟骨細胞瘦素的表達不足以阻止瘦素對關節軟骨的不良影響。通過抑制關節軟骨細胞上Ob-Rb的表達也許能更徹底的起到抑制OA患者關節腔內高濃度瘦素對關節軟骨的有害作用。
基于上述已有的瘦素研究成果，結合關節軟骨脂質體轉染系統，我們設想應用靶向瘦素受體Ob-Rb基因的siRNA轉染軟骨細胞，阻斷瘦素在關節軟骨細胞中的信號傳導，抑制前炎性因子的生成，進而抑制關節軟骨破壞，從而為臨床OA的基因治療提供新思路和實驗支持。本研究成功對瘦素受體的基因進行了下調，下調瘦素受體后24、48及72 h后實驗組IL-1β和NO的mRNA表達均明顯低于對照組，且隨時間的推移，兩組之間的差距愈來愈大。因此，我們認為siRNA技術下調瘦素受體可明顯抑制人骨關節炎軟骨細胞炎癥因子的表達，進而對關節的軟骨起到保護作用。這可能為我們臨床OA的基因治療提供新思路和實驗支持。
