通過回顧近年來國內外采用的組織工程雙相支架修復軟骨及軟骨下骨缺損的文獻，比較不同雙相支架修復軟骨及軟骨下骨效果差別，分析其優勢及存在的主要問題，并初步探討軟骨修復的合理方式和發展趨勢。研究結果表明，以雙相支架作為載體材料一體化修復軟骨及軟骨下骨缺損，較之傳統方式以及其他組織工程修復途徑有著不可比擬的優越性，而復合理想的種子細胞及合適生長因子后，更能促進修復效果。由此可見，雙相支架有利于修復骨軟骨缺損，而構建仿生化多相支架是未來研究的趨勢。
引用本文： 劉明, 余曦, 黃富國, 岑石強, 項舟. 組織工程雙相支架修復關節軟骨及軟骨下骨缺損研究進展. 華西醫學, 2014, 29(4): 783-787. doi: 10.7507/1002-0179.20140238 復制
外傷、炎癥、退變等常見疾患均可造成關節軟骨缺損，一旦缺損可產生疼痛、關節畸形等明顯癥狀，晚期并發關節功能障礙，已日益成為影響國民健康狀況和生活質量的專科問題。單純軟骨組織再生能力非常有限，有研究指出，通常＜2 cm2的缺損面積機體能自身修復[1]，且軟骨缺損的同時往往伴有軟骨下骨缺損。近來的研究表明其修復和重建對軟骨修復的整體效果尤其是遠期療效有重要影響[2]。傳統修復方法諸如軟骨下骨鉆孔術、軟骨移植和軟骨細胞移植等，存在新生軟骨缺乏透明軟骨特性、遠期臨床療效欠佳等問題[3]，而關節置換則存在假體磨損、腐蝕及松動等問題，且適用人群有限[4]。因此，自從組織工程理念產生伊始，關節軟骨的修復重建便成為這一領域研究的焦點與難點。
經過20余年的發展，軟骨組織工程在基礎研究、臨床應用方面都取得了顯著進展，其關注的焦點圍繞在以下3個方面：① 理想種子細胞的選取；② 三維生物支架的構建；③ 細胞培養及與材料復合的合適環境和條件[5]。隨著生物材料、細胞分子生物學的深入研究及再生醫學技術的發展，組織工程軟骨支架不僅需要為種子細胞提供仿生的三維細胞外基質結構，并具備細胞/分子調控能力，為細胞的黏附、生長、分化提供最近似于體內的微環境[6]。兼具骨相和軟骨相修復作用的“雙相支架”以及探索一體化修復軟骨與軟骨下骨缺損的新方法，對于明確骨軟骨缺損修復的機制、進一步發現更為有效的修復途徑非常有必要。
1 國內外研究現狀
1.1 單純雙相支架
理想的組織工程支架應具有良好的生物相容性、表面活性、可塑性及適宜的生物降解性[7]，同時兼具力學強度，尤其在新生組織長入初期能為其提供一定的機械支撐作用十分必要[8]。
雙相支架由軟骨相和骨相構成。上層軟骨相支架主要起臨時細胞外基質的作用，為軟骨細胞提供附著、增殖、分化和代謝的場所，故應具有良好的生物相容性、可降解吸收性和利于軟骨細胞貼壁生長的表面特性；下層骨相材料應在結構及生物力學特性上近似于體內骨組織，并在功能上有利于成骨細胞的黏附、增殖或者種子細胞向成骨方向分化。Holland等[9]使用聚乙二醇富馬酸水凝膠制備雙層支架修復兔關節軟骨缺損，術后4周和14周觀察均未發現炎性細胞或關節腫脹，表明水凝膠材料及其降解產物具有良好的生物相容性；術后4周超過60%的支架降解，14周時軟骨區由透明軟骨填充，軟骨細胞排列有序，并伴有大量糖胺多糖，骨區則由小梁骨填充，且未發現骨組織向上長入軟骨區域的現象。表明該種水凝膠支架具有生物可降解性，其降解速率可與骨軟骨缺損修復速率相匹配，并誘導生理狀態下自體修復作用，是一種較適宜雙相支架制備的原材料。Getgood等[10]采用膠原-糖胺聚糖（GAG）-磷酸鈣制作新型雙相支架并建立山羊膝關節骨軟骨缺損模型，與傳統聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）雙相支架進行對比，評估該種新型雙相支架誘導的新生組織的形態學、組織學和力學性質。力學測試顯示，雖然浸潤的新型膠原-GAG-磷酸鈣支架硬度較低，且擺放時已出現不可逆的壓縮，但12周和26周觀察結果都顯示兩種支架組缺損處硬度均超過80%，說明細胞外基質在新型雙相支架內沉積，加強了新型支架的力學性質。作者觀察了12周和26周修復情況，發現組織學和形態學結果均顯示新型膠原-GAG-磷酸鈣雙相支架產生的新生組織優于傳統PLGA支架。植入26周觀察發現，75%的新型膠原-GAG-磷酸鈣雙相支架出現透明軟骨樣新生組織，而僅50%的PLGA支架和17%的空白對照組出現透明軟骨樣組織，說明該種新型支架為軟骨的修復提供了優渥的環境。另外，研究還提到膠原-GAG能被蛋白酶、軟骨素酶等降解，其降解產物為低聚肽和糖類的片段，是骨軟骨中自然存在的物質且對缺損部位無任何影響。因此膠原-GAG可作為骨軟骨缺損的修復中軟骨修復支架材料。
1.2 細胞-雙相支架復合物
利用單純雙相支架修復骨軟骨缺損組織的來源為自體成熟細胞或內源性干細胞；修復通過自體組織爬行至支架進行，此種途徑面臨的主要問題可能是細胞爬行距離不足或爬行受限導致修復時間延長甚至遠期效果欠佳[1, 11]。隨后有研究嘗試將特定種子細胞與雙相支架構建復合物修復骨軟骨缺損，利用組織工程支架體內或者體外的誘導特性，為種子細胞的生長、分化提供更為優化的微環境[5, 12]。多項研究比較了細胞-支架復合物與單純支架修復骨軟骨缺損的能力，絕大部分發現前者具有更好的效果[11-17]，也有研究發現二者間差異無統計意義[18]。目前運用較多的是自體軟骨細胞、間充質干細胞（MSC）以及脂肪源性干細胞（ADSC）。其他來源的干細胞，如骨髓來源祖細胞（BMPC）及滑膜來源干細胞（SDSC），臍帶血干細胞（UCSC）和羊水源性干細胞（AFSC）也有相應的報道[16-23]。
自體軟骨細胞具有分化程度高、分泌功能旺盛、不引起免疫排斥反應等優點，植入體內后可快速分泌細胞外基質替代軟骨缺損[5, 19]。Jiang等[11]使用聚乳酸及PLGA/β-磷酸三鈣構制備雙相支架，實驗組將自體軟骨細胞種植在軟骨相，植入豬股骨遠端負重關節面骨軟骨缺損，6個月后軟骨相材料完全降解，新生軟骨以透明軟骨為主，并檢測到同質性Ⅱ型膠原和硫酸糖胺多糖表達；而采用單純支架修復的對照組則以纖維軟骨或纖維組織為主要修復組織。表明經過添加成分和有效的構建，PLGA可成為骨軟骨雙相支架，并具備合適的軟骨誘導特性，二組間比較結果也在一定程度上證明了自體內源性軟骨細胞難以在生物支架長距離爬行的假說。
MSC具有來源廣泛、易獲取、增殖能力強、多向分化潛能等優勢，是組織工程領域應用最為廣泛的一類種子細胞[5, 22, 23]。張華亮等[17]將體外培養擴增的兔MSC種植于殼聚糖/羥基磷灰石雙相支架修復其股骨遠端關節面缺損，術后12周發現細胞-支架組軟骨相被透明軟骨修復，軟骨細胞規律排列，周圍有均一基質填充，骨相則被小梁骨填充，兩相的修復組織與周圍自體組織整合良好；而單純支架組缺損處則被少量纖維樣組織修復，且有大量炎性細胞。Shao等[18]將聚己內酯（PCL）作為骨相材料、纖維蛋白膠作為軟骨相材料構建雙相支架，并種植MSC修復兔膝關節骨軟骨缺損，取得了類似效果。Ho等[15]較為創新地將MSC-PCL/PCL+磷酸三鈣雙相支架的表面進一步添加電紡絲PCL-膠原膜作為骨膜替代物，同時植入豬股骨髁間骨軟骨缺損模型內，利用電紡絲膜選擇性滲透功能及特定的孔徑，促進來自滑膜間隙的營養物質的交換，防止種子細胞漏至關節腔，從而預防繼發性軟骨肥大。植入后6個月，新生軟骨中含有少量纖維軟骨和大量糖胺多糖，軟骨下骨缺損處有新生骨組織長入，且礦化程度較高。上述研究以及其他同類比較研究揭示：在高分子材料基礎上加入合適的天然材料或人工材料，可以發揮各種成分的優勢，改善支架整體的生物相容性，是制備骨軟骨雙相支架的一種合理途徑，而MSC在不同的誘導環境下既能促進透明軟骨再生，也能形成類骨組織，也是一種理想的種子細胞[12, 24]。單純植入支架更多依賴內源性MSC的自我修復，最終主要形成纖維軟骨，而細胞-雙相支架復合物的修復模式無疑更接近體內真實的修復過程，為種子細胞的爬行、生長和分化提供了合適的微環境。
ADSC實為間充質干細胞的一種，已經成為骨軟骨組織工程學中種子細胞研究的熱點。Jurgens等[13]通過建立山羊右膝關節骨軟骨缺損模型，針對脂肪源性基質血管成分和脂肪源性干細胞種植的兩種支架，分析研究和評估了其安全性、適用性和修復效果。研究以無細胞膠原Ⅰ/Ⅲ支架作為對照組，植入支架1和4個月后分別進行大體標本觀察，免疫組織化學等結果測定和分析。支架植入1個月后3組均無不良反應，顯微鏡下觀察3組無明顯差異。4個月后發現，細胞種植支架組新生修復組織明顯增多，Ⅱ型膠原、透明軟骨樣物質生成明顯增多，且軟骨層糖胺聚糖含量更接近宿主組織，缺損部位可見良好成熟的軟骨下骨生成。脂肪源性干細胞具有自我更新和多向分化的潛能，且ADSC來源廣泛，獲取容易，供體創傷小，易于臨床操作等優勢，為骨軟骨缺損修復重建種子細胞的研究提供了另一種選擇。
BMPC可由滑膜中獲得，研究發現其具有形成軟骨或骨的潛能[14]。Gao等[14]在透明質酸/磷酸三鈣雙相支架的軟骨相接種BMPC，術后14周發現與空白支架組相比，細胞-支架組的新生軟骨組織同質性更好，軟骨細胞形態也更為典型，與周圍軟骨整合也更好。另外該研究使用的骨相材料——注射用磷酸三鈣無需預先塑形即可填充缺損的任意維度和形狀，無疑是可供選擇的良好支架材料。
SDSC自我更新能力高，且具有誘導成脂肪、骨及軟骨的能力[16]。Pei等[16]利用聚羥基乙酸較好的力學支撐性能、纖維蛋白膠促進細胞的同質分布及促進體外成軟骨作用，構建纖維膠+聚羥基乙酸雙相支架，將SDSC種植于軟骨相中，體外培養1個月后，檢測到新生組織中硫酸糖胺多糖及Ⅱ型膠原的表達隨時間遞增，然后將細胞-支架復合物植入兔膝關節骨軟骨缺損處，6個月后缺損被透明樣軟骨覆蓋，顯示出SDSC在軟骨修復領域有一定的應用前景。
綜上所述，骨軟骨組織工程種子細胞有多種選擇，考慮到自體軟骨細胞來源有限，其實際應用受到一定限制，采用自體MSC既避免了免疫排斥反應、簡化手術過程，又可以依托雙相支架充分發掘其多向分化潛能，較之其他細胞更具應用前景。
1.3 生長因子與雙相支架
骨軟骨缺損的修復過程當中，除了有能夠成骨和成軟骨的細胞存在之外，還需要通過特定的細胞素或者生長因子進行調控，因此為進一步模擬人骨缺損修復所需的細胞外基質，創造適合的修復三維環境，研究者提出在雙相支架內添加生長因子以調控種子細胞的分化和生長，促進和誘導目標組織的生成。血管內皮生長因子（VEGF）對軟骨細胞存活有著重要的意義。Sakata等[25]通過可降解支架研究了骨軟骨修復再生過程中VEGF的聚集分布，發現在骨軟骨缺損修復過程中，支架植入后成骨部位的VEGF呈持續性表達，而成軟骨部位的VEGF表達減弱，空白缺損部位VEGF則均勻分布，但軟骨形成明顯延遲。
轉化生長因子（TGF-β）可調節骨代謝，目前發現有5個亞型[25]。Holland等[9]使用未種植細胞的水凝膠雙相支架修復兔骨軟骨缺損，術后4周和14周，添加TGF-β1組的標本O’Driscoll法組織學評分明顯優于未添加組，提示TGF-β1可促進自體細胞修復骨缺損。Pei等[14]在SDSC-雙相支架復合物中添加生長因子“雞尾酒”[含不同濃度的TGF-β1、成纖維細胞生長因子（FGF）、類胰島素一號增長因子（IGF-Ⅰ）]，體外三維培養1個月發現，這種生長因子混合液能為SDSC最大程度增殖和成軟骨分化提供有效的化學信號，表明了將單一生長因子制成混合物后可發揮互補優勢，更好地起到調控與促進作用。
目前針對體內骨軟骨缺損修復過程中，各種生長因子的濃度和分布的研究已經成為研究骨軟骨缺損修復中的重要組成部分。通過觀察、監測和模擬生長因子的濃度和分布，能夠提高骨軟骨缺損修復的仿生學性質，有效促進成骨化和成軟骨化的進程，達到良好的修復效果。
2 優勢分析
關節軟骨是功能復雜、細胞外基質高度有序排列的無血管組織，加之其有限的內在修復能力，發生病變可致關節退變及骨關節炎[26-28]。已經用于治療關節軟骨損傷的常見外科方法是軟骨下骨鉆孔術及軟骨移植術，旨在刺激損傷部位的愈合反應或使用組織移植物填充損傷[27, 28]。隨后的研究表明，手術制造的磨損或鉆孔導致的修復組織主要是纖維軟骨或纖維樣組織[29]，而軟骨移植后常會出現軟骨內膜骨化，且其來源十分有限，此外，兩種手術的長期療效也非常有限[25, 30]。
組織工程途徑修復骨軟骨缺損如今已廣泛開展。最初的支架以具有單一力學性質的單一材料為主，遠期結果顯示新生組織常常缺乏正常軟骨由淺層向深層的漸進式結構，這便使處于表面的關節軟骨缺乏正常的代謝及生物力學支持，后期出現缺損中心區域細胞的退變，致使軟骨碎裂、塌陷[31-33]。隨著對軟骨自身結構特性及其修復機制認識的不斷深入，研究者發現單純依賴軟骨-軟骨界面微弱的連接，往往難以達到滿意的修復效果，于是構建出組織工程雙相支架，修復軟骨的同時修復重建軟骨下骨，以期較好地克服由于生物力學強度不足導致的術后遠期關節面出現碎裂、塌陷的問題[8]。支架上層軟骨相模擬具有潤滑和減震功能的關節軟骨，多孔的結構利于細胞的接種和成軟骨分化，下層骨相類似于體內松質骨結構，支撐附于其上的軟骨并與宿主骨形成良好整合。較之單層支架，雙相支架不僅能集合不同類型生物材料的自身優勢，并能通過調整兩相結構中不同成分的生物降解速率，使得不同修復組織的修復時間相匹配，既不影響新生組織的長入，又可在每個時間段從整體上保證支架和新生組織的力學性能，這一效果也在前述一系列研究中得到了證實。
通過多個使用單純雙相支架修復骨軟骨缺損的實驗，研究者發現機體自身修復細胞爬行能力和增殖能力有限，以致關節面和缺損區中心往往難以有效修復[12]，為了克服這一難題，開始構建細胞-雙相支架復合物，其中以MSC采用最多。事實表明，通過對雙相支架合理的構建以及表面改性，便可利用各相不同的生物學特性誘導分化細胞，使得MSC向骨或軟骨分化，結果是縮短了修復組織長入和缺損愈合的時間，加強了愈合效果[17, 19, 20]。生長因子的合理使用有利于細胞與支架的復合，并確保種子細胞在適應的微環境下定向分化，且不論是在添加種子細胞或未添加種子細胞的支架中，它們被證明可以促進修復[9, 16]。
3 存在問題及展望
盡管組織工程雙相支架修復骨軟骨缺損的研究取得了一定進展，但仍存在不少問題有待深入探索：比如許多動物實驗選用的模型以年幼及年輕動物或者小型哺乳動物為主，其各項生理參數與人體實際情況差別較大[5, 8]；另外，盡管新生軟骨已經出現透明軟骨，但與宿主軟骨的整合仍不夠理想，其機制尚不十分明確[12, 22]；雙相支架修復骨軟骨缺損的更長期的療效如何以及生長因子在支架中的作用機制，也需進一步的實驗研究闡明[5, 27]。因此，要將組織工程雙相支架修復骨軟骨損傷的優越性應用于臨床實踐，造福關節軟骨疾病患者，仍有諸多工作尚待完善。
而且，隨著仿生學理念不斷應用于再生醫學領域，中間層組織工程學的概念也逐步成為重要的研究部分。隨著雙相支架研究的增多和深入，顯示出了骨軟骨修復中固有的缺陷，主要是軟骨與軟骨下骨區域結合部形成了一個截然分開的界線，這樣容易導致兩相間缺乏牢固的生物學錨定，干細胞在兩相結合區定向分化不均一，及修復后產生一個較明顯的“條帶”區等[34-36]。已有諸多研究開始在雙相支架的基礎上設計多層支架，將軟骨與軟骨下骨間的結合帶設計為一個“中間層”，使其過度更為仿生化[37-39]，未來的研究將進一步設計梯度式支架，更好地模擬體內的真實情況。
關節軟骨是一個復雜有序的組織，現有的工程化軟骨培養體系中，還不能有效地區分這些精細結構。但可以預見的是，未來軟骨修復的發展會愈發重視組織工程學原則，并基于生理學、仿生學及其他生命科學的理念，來設計、構建和恢復關節軟骨的功能。因此，通過骨軟骨組織工程方法，采用更適宜的生物材料、更理想的種子細胞乃至生長因子，進一步構建仿生化的細胞-雙相支架復合物，為細胞的生長、分化提供最近似于體內的微環境，采取合理的手術方式植入關節缺損處，一體化修復軟骨及軟骨下骨以確保遠期效果，將成為今后骨軟骨缺損修復研究的發展趨勢。
外傷、炎癥、退變等常見疾患均可造成關節軟骨缺損，一旦缺損可產生疼痛、關節畸形等明顯癥狀，晚期并發關節功能障礙，已日益成為影響國民健康狀況和生活質量的專科問題。單純軟骨組織再生能力非常有限，有研究指出，通常＜2 cm2的缺損面積機體能自身修復[1]，且軟骨缺損的同時往往伴有軟骨下骨缺損。近來的研究表明其修復和重建對軟骨修復的整體效果尤其是遠期療效有重要影響[2]。傳統修復方法諸如軟骨下骨鉆孔術、軟骨移植和軟骨細胞移植等，存在新生軟骨缺乏透明軟骨特性、遠期臨床療效欠佳等問題[3]，而關節置換則存在假體磨損、腐蝕及松動等問題，且適用人群有限[4]。因此，自從組織工程理念產生伊始，關節軟骨的修復重建便成為這一領域研究的焦點與難點。
經過20余年的發展，軟骨組織工程在基礎研究、臨床應用方面都取得了顯著進展，其關注的焦點圍繞在以下3個方面：① 理想種子細胞的選取；② 三維生物支架的構建；③ 細胞培養及與材料復合的合適環境和條件[5]。隨著生物材料、細胞分子生物學的深入研究及再生醫學技術的發展，組織工程軟骨支架不僅需要為種子細胞提供仿生的三維細胞外基質結構，并具備細胞/分子調控能力，為細胞的黏附、生長、分化提供最近似于體內的微環境[6]。兼具骨相和軟骨相修復作用的“雙相支架”以及探索一體化修復軟骨與軟骨下骨缺損的新方法，對于明確骨軟骨缺損修復的機制、進一步發現更為有效的修復途徑非常有必要。
1 國內外研究現狀
1.1 單純雙相支架
理想的組織工程支架應具有良好的生物相容性、表面活性、可塑性及適宜的生物降解性[7]，同時兼具力學強度，尤其在新生組織長入初期能為其提供一定的機械支撐作用十分必要[8]。
雙相支架由軟骨相和骨相構成。上層軟骨相支架主要起臨時細胞外基質的作用，為軟骨細胞提供附著、增殖、分化和代謝的場所，故應具有良好的生物相容性、可降解吸收性和利于軟骨細胞貼壁生長的表面特性；下層骨相材料應在結構及生物力學特性上近似于體內骨組織，并在功能上有利于成骨細胞的黏附、增殖或者種子細胞向成骨方向分化。Holland等[9]使用聚乙二醇富馬酸水凝膠制備雙層支架修復兔關節軟骨缺損，術后4周和14周觀察均未發現炎性細胞或關節腫脹，表明水凝膠材料及其降解產物具有良好的生物相容性；術后4周超過60%的支架降解，14周時軟骨區由透明軟骨填充，軟骨細胞排列有序，并伴有大量糖胺多糖，骨區則由小梁骨填充，且未發現骨組織向上長入軟骨區域的現象。表明該種水凝膠支架具有生物可降解性，其降解速率可與骨軟骨缺損修復速率相匹配，并誘導生理狀態下自體修復作用，是一種較適宜雙相支架制備的原材料。Getgood等[10]采用膠原-糖胺聚糖（GAG）-磷酸鈣制作新型雙相支架并建立山羊膝關節骨軟骨缺損模型，與傳統聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）雙相支架進行對比，評估該種新型雙相支架誘導的新生組織的形態學、組織學和力學性質。力學測試顯示，雖然浸潤的新型膠原-GAG-磷酸鈣支架硬度較低，且擺放時已出現不可逆的壓縮，但12周和26周觀察結果都顯示兩種支架組缺損處硬度均超過80%，說明細胞外基質在新型雙相支架內沉積，加強了新型支架的力學性質。作者觀察了12周和26周修復情況，發現組織學和形態學結果均顯示新型膠原-GAG-磷酸鈣雙相支架產生的新生組織優于傳統PLGA支架。植入26周觀察發現，75%的新型膠原-GAG-磷酸鈣雙相支架出現透明軟骨樣新生組織，而僅50%的PLGA支架和17%的空白對照組出現透明軟骨樣組織，說明該種新型支架為軟骨的修復提供了優渥的環境。另外，研究還提到膠原-GAG能被蛋白酶、軟骨素酶等降解，其降解產物為低聚肽和糖類的片段，是骨軟骨中自然存在的物質且對缺損部位無任何影響。因此膠原-GAG可作為骨軟骨缺損的修復中軟骨修復支架材料。
1.2 細胞-雙相支架復合物
利用單純雙相支架修復骨軟骨缺損組織的來源為自體成熟細胞或內源性干細胞；修復通過自體組織爬行至支架進行，此種途徑面臨的主要問題可能是細胞爬行距離不足或爬行受限導致修復時間延長甚至遠期效果欠佳[1, 11]。隨后有研究嘗試將特定種子細胞與雙相支架構建復合物修復骨軟骨缺損，利用組織工程支架體內或者體外的誘導特性，為種子細胞的生長、分化提供更為優化的微環境[5, 12]。多項研究比較了細胞-支架復合物與單純支架修復骨軟骨缺損的能力，絕大部分發現前者具有更好的效果[11-17]，也有研究發現二者間差異無統計意義[18]。目前運用較多的是自體軟骨細胞、間充質干細胞（MSC）以及脂肪源性干細胞（ADSC）。其他來源的干細胞，如骨髓來源祖細胞（BMPC）及滑膜來源干細胞（SDSC），臍帶血干細胞（UCSC）和羊水源性干細胞（AFSC）也有相應的報道[16-23]。
自體軟骨細胞具有分化程度高、分泌功能旺盛、不引起免疫排斥反應等優點，植入體內后可快速分泌細胞外基質替代軟骨缺損[5, 19]。Jiang等[11]使用聚乳酸及PLGA/β-磷酸三鈣構制備雙相支架，實驗組將自體軟骨細胞種植在軟骨相，植入豬股骨遠端負重關節面骨軟骨缺損，6個月后軟骨相材料完全降解，新生軟骨以透明軟骨為主，并檢測到同質性Ⅱ型膠原和硫酸糖胺多糖表達；而采用單純支架修復的對照組則以纖維軟骨或纖維組織為主要修復組織。表明經過添加成分和有效的構建，PLGA可成為骨軟骨雙相支架，并具備合適的軟骨誘導特性，二組間比較結果也在一定程度上證明了自體內源性軟骨細胞難以在生物支架長距離爬行的假說。
MSC具有來源廣泛、易獲取、增殖能力強、多向分化潛能等優勢，是組織工程領域應用最為廣泛的一類種子細胞[5, 22, 23]。張華亮等[17]將體外培養擴增的兔MSC種植于殼聚糖/羥基磷灰石雙相支架修復其股骨遠端關節面缺損，術后12周發現細胞-支架組軟骨相被透明軟骨修復，軟骨細胞規律排列，周圍有均一基質填充，骨相則被小梁骨填充，兩相的修復組織與周圍自體組織整合良好；而單純支架組缺損處則被少量纖維樣組織修復，且有大量炎性細胞。Shao等[18]將聚己內酯（PCL）作為骨相材料、纖維蛋白膠作為軟骨相材料構建雙相支架，并種植MSC修復兔膝關節骨軟骨缺損，取得了類似效果。Ho等[15]較為創新地將MSC-PCL/PCL+磷酸三鈣雙相支架的表面進一步添加電紡絲PCL-膠原膜作為骨膜替代物，同時植入豬股骨髁間骨軟骨缺損模型內，利用電紡絲膜選擇性滲透功能及特定的孔徑，促進來自滑膜間隙的營養物質的交換，防止種子細胞漏至關節腔，從而預防繼發性軟骨肥大。植入后6個月，新生軟骨中含有少量纖維軟骨和大量糖胺多糖，軟骨下骨缺損處有新生骨組織長入，且礦化程度較高。上述研究以及其他同類比較研究揭示：在高分子材料基礎上加入合適的天然材料或人工材料，可以發揮各種成分的優勢，改善支架整體的生物相容性，是制備骨軟骨雙相支架的一種合理途徑，而MSC在不同的誘導環境下既能促進透明軟骨再生，也能形成類骨組織，也是一種理想的種子細胞[12, 24]。單純植入支架更多依賴內源性MSC的自我修復，最終主要形成纖維軟骨，而細胞-雙相支架復合物的修復模式無疑更接近體內真實的修復過程，為種子細胞的爬行、生長和分化提供了合適的微環境。
ADSC實為間充質干細胞的一種，已經成為骨軟骨組織工程學中種子細胞研究的熱點。Jurgens等[13]通過建立山羊右膝關節骨軟骨缺損模型，針對脂肪源性基質血管成分和脂肪源性干細胞種植的兩種支架，分析研究和評估了其安全性、適用性和修復效果。研究以無細胞膠原Ⅰ/Ⅲ支架作為對照組，植入支架1和4個月后分別進行大體標本觀察，免疫組織化學等結果測定和分析。支架植入1個月后3組均無不良反應，顯微鏡下觀察3組無明顯差異。4個月后發現，細胞種植支架組新生修復組織明顯增多，Ⅱ型膠原、透明軟骨樣物質生成明顯增多，且軟骨層糖胺聚糖含量更接近宿主組織，缺損部位可見良好成熟的軟骨下骨生成。脂肪源性干細胞具有自我更新和多向分化的潛能，且ADSC來源廣泛，獲取容易，供體創傷小，易于臨床操作等優勢，為骨軟骨缺損修復重建種子細胞的研究提供了另一種選擇。
BMPC可由滑膜中獲得，研究發現其具有形成軟骨或骨的潛能[14]。Gao等[14]在透明質酸/磷酸三鈣雙相支架的軟骨相接種BMPC，術后14周發現與空白支架組相比，細胞-支架組的新生軟骨組織同質性更好，軟骨細胞形態也更為典型，與周圍軟骨整合也更好。另外該研究使用的骨相材料——注射用磷酸三鈣無需預先塑形即可填充缺損的任意維度和形狀，無疑是可供選擇的良好支架材料。
SDSC自我更新能力高，且具有誘導成脂肪、骨及軟骨的能力[16]。Pei等[16]利用聚羥基乙酸較好的力學支撐性能、纖維蛋白膠促進細胞的同質分布及促進體外成軟骨作用，構建纖維膠+聚羥基乙酸雙相支架，將SDSC種植于軟骨相中，體外培養1個月后，檢測到新生組織中硫酸糖胺多糖及Ⅱ型膠原的表達隨時間遞增，然后將細胞-支架復合物植入兔膝關節骨軟骨缺損處，6個月后缺損被透明樣軟骨覆蓋，顯示出SDSC在軟骨修復領域有一定的應用前景。
綜上所述，骨軟骨組織工程種子細胞有多種選擇，考慮到自體軟骨細胞來源有限，其實際應用受到一定限制，采用自體MSC既避免了免疫排斥反應、簡化手術過程，又可以依托雙相支架充分發掘其多向分化潛能，較之其他細胞更具應用前景。
1.3 生長因子與雙相支架
骨軟骨缺損的修復過程當中，除了有能夠成骨和成軟骨的細胞存在之外，還需要通過特定的細胞素或者生長因子進行調控，因此為進一步模擬人骨缺損修復所需的細胞外基質，創造適合的修復三維環境，研究者提出在雙相支架內添加生長因子以調控種子細胞的分化和生長，促進和誘導目標組織的生成。血管內皮生長因子（VEGF）對軟骨細胞存活有著重要的意義。Sakata等[25]通過可降解支架研究了骨軟骨修復再生過程中VEGF的聚集分布，發現在骨軟骨缺損修復過程中，支架植入后成骨部位的VEGF呈持續性表達，而成軟骨部位的VEGF表達減弱，空白缺損部位VEGF則均勻分布，但軟骨形成明顯延遲。
轉化生長因子（TGF-β）可調節骨代謝，目前發現有5個亞型[25]。Holland等[9]使用未種植細胞的水凝膠雙相支架修復兔骨軟骨缺損，術后4周和14周，添加TGF-β1組的標本O’Driscoll法組織學評分明顯優于未添加組，提示TGF-β1可促進自體細胞修復骨缺損。Pei等[14]在SDSC-雙相支架復合物中添加生長因子“雞尾酒”[含不同濃度的TGF-β1、成纖維細胞生長因子（FGF）、類胰島素一號增長因子（IGF-Ⅰ）]，體外三維培養1個月發現，這種生長因子混合液能為SDSC最大程度增殖和成軟骨分化提供有效的化學信號，表明了將單一生長因子制成混合物后可發揮互補優勢，更好地起到調控與促進作用。
目前針對體內骨軟骨缺損修復過程中，各種生長因子的濃度和分布的研究已經成為研究骨軟骨缺損修復中的重要組成部分。通過觀察、監測和模擬生長因子的濃度和分布，能夠提高骨軟骨缺損修復的仿生學性質，有效促進成骨化和成軟骨化的進程，達到良好的修復效果。
2 優勢分析
關節軟骨是功能復雜、細胞外基質高度有序排列的無血管組織，加之其有限的內在修復能力，發生病變可致關節退變及骨關節炎[26-28]。已經用于治療關節軟骨損傷的常見外科方法是軟骨下骨鉆孔術及軟骨移植術，旨在刺激損傷部位的愈合反應或使用組織移植物填充損傷[27, 28]。隨后的研究表明，手術制造的磨損或鉆孔導致的修復組織主要是纖維軟骨或纖維樣組織[29]，而軟骨移植后常會出現軟骨內膜骨化，且其來源十分有限，此外，兩種手術的長期療效也非常有限[25, 30]。
組織工程途徑修復骨軟骨缺損如今已廣泛開展。最初的支架以具有單一力學性質的單一材料為主，遠期結果顯示新生組織常常缺乏正常軟骨由淺層向深層的漸進式結構，這便使處于表面的關節軟骨缺乏正常的代謝及生物力學支持，后期出現缺損中心區域細胞的退變，致使軟骨碎裂、塌陷[31-33]。隨著對軟骨自身結構特性及其修復機制認識的不斷深入，研究者發現單純依賴軟骨-軟骨界面微弱的連接，往往難以達到滿意的修復效果，于是構建出組織工程雙相支架，修復軟骨的同時修復重建軟骨下骨，以期較好地克服由于生物力學強度不足導致的術后遠期關節面出現碎裂、塌陷的問題[8]。支架上層軟骨相模擬具有潤滑和減震功能的關節軟骨，多孔的結構利于細胞的接種和成軟骨分化，下層骨相類似于體內松質骨結構，支撐附于其上的軟骨并與宿主骨形成良好整合。較之單層支架，雙相支架不僅能集合不同類型生物材料的自身優勢，并能通過調整兩相結構中不同成分的生物降解速率，使得不同修復組織的修復時間相匹配，既不影響新生組織的長入，又可在每個時間段從整體上保證支架和新生組織的力學性能，這一效果也在前述一系列研究中得到了證實。
通過多個使用單純雙相支架修復骨軟骨缺損的實驗，研究者發現機體自身修復細胞爬行能力和增殖能力有限，以致關節面和缺損區中心往往難以有效修復[12]，為了克服這一難題，開始構建細胞-雙相支架復合物，其中以MSC采用最多。事實表明，通過對雙相支架合理的構建以及表面改性，便可利用各相不同的生物學特性誘導分化細胞，使得MSC向骨或軟骨分化，結果是縮短了修復組織長入和缺損愈合的時間，加強了愈合效果[17, 19, 20]。生長因子的合理使用有利于細胞與支架的復合，并確保種子細胞在適應的微環境下定向分化，且不論是在添加種子細胞或未添加種子細胞的支架中，它們被證明可以促進修復[9, 16]。
3 存在問題及展望
盡管組織工程雙相支架修復骨軟骨缺損的研究取得了一定進展，但仍存在不少問題有待深入探索：比如許多動物實驗選用的模型以年幼及年輕動物或者小型哺乳動物為主，其各項生理參數與人體實際情況差別較大[5, 8]；另外，盡管新生軟骨已經出現透明軟骨，但與宿主軟骨的整合仍不夠理想，其機制尚不十分明確[12, 22]；雙相支架修復骨軟骨缺損的更長期的療效如何以及生長因子在支架中的作用機制，也需進一步的實驗研究闡明[5, 27]。因此，要將組織工程雙相支架修復骨軟骨損傷的優越性應用于臨床實踐，造福關節軟骨疾病患者，仍有諸多工作尚待完善。
而且，隨著仿生學理念不斷應用于再生醫學領域，中間層組織工程學的概念也逐步成為重要的研究部分。隨著雙相支架研究的增多和深入，顯示出了骨軟骨修復中固有的缺陷，主要是軟骨與軟骨下骨區域結合部形成了一個截然分開的界線，這樣容易導致兩相間缺乏牢固的生物學錨定，干細胞在兩相結合區定向分化不均一，及修復后產生一個較明顯的“條帶”區等[34-36]。已有諸多研究開始在雙相支架的基礎上設計多層支架，將軟骨與軟骨下骨間的結合帶設計為一個“中間層”，使其過度更為仿生化[37-39]，未來的研究將進一步設計梯度式支架，更好地模擬體內的真實情況。
關節軟骨是一個復雜有序的組織，現有的工程化軟骨培養體系中，還不能有效地區分這些精細結構。但可以預見的是，未來軟骨修復的發展會愈發重視組織工程學原則，并基于生理學、仿生學及其他生命科學的理念，來設計、構建和恢復關節軟骨的功能。因此，通過骨軟骨組織工程方法，采用更適宜的生物材料、更理想的種子細胞乃至生長因子，進一步構建仿生化的細胞-雙相支架復合物，為細胞的生長、分化提供最近似于體內的微環境，采取合理的手術方式植入關節缺損處，一體化修復軟骨及軟骨下骨以確保遠期效果，將成為今后骨軟骨缺損修復研究的發展趨勢。