高升降溫速率是實現細胞無冰凍融的關鍵技術途徑。本研究研制了一套基于藍寶石的超快速固體表面冷凍-激光復溫凍融可視化系統，開展了不同冷凍保護劑組分和體積以及不同激光能量下的液滴凍融實驗研究。結果表明：冷凍操作時該系統可實現1 μL體積混合低溫保護劑［1.5 mol/L丙二醇（PG）+ 1.5 mol/L乙二醇（EG）+ 0.5 mol/L海藻糖（TRE）］的降溫速率高達9.2×103 ℃/min，且1～8 μL容積范圍的液滴均可實現玻璃化冷凍；經過比對多種冷凍保護劑配比濃度，等比例混合滲透性保護劑和海藻糖的組合具有最好的玻璃化冷凍效果和更均勻的結晶特性。在復溫操作時，首次測得400～1 200 W激光功率作用下含有金納米顆粒的玻璃態液滴的升溫曲線，速率高達106 ℃/min量級。依據不同功率復溫過程的液滴圖像，明確了實現微米級分辨率無冰復溫的激光功率范圍為1 400～1 600 W。本文工作同步實現了液滴的超高速升降溫、瞬態可視化觀察和溫度測量，為判斷液滴無冰凍融提供了技術手段，有利于促進生物細胞和組織超快速凍融技術的發展。
0 引言
生物材料的低溫凍融技術主要涉及冷凍、保存和復溫三個過程。冷凍過程通過降溫方式抑制處于冷凍保護劑（cryoprotectant agent, CPA）溶液中的細胞代謝活動，如在–196 ℃液氮溫度下生物材料內部化學反應幾乎停滯，進而讓生物材料在保存過程中實現延時的保存。目前冷凍過程主要采用玻璃化快速冷凍的方式[1]，通過高濃度CPA以及快速的非平衡冷卻將生物樣品從液態直接轉化為玻璃態。然而高濃度的CPA意味著較高的生物毒性[2-3]。與采用階梯式降溫的傳統慢速冷凍相比，玻璃化冷凍避免了冷凍過程中冰晶的產生，可最小化乃至消除低溫損傷[4-5]。復溫是指在需要的時候對已經冷凍好的生物樣本進行復溫解凍，使之恢復到正常生理狀態的技術。目前研究人員通過降低樣品體積以及應用多物理場方式，進一步降低了復溫過程中重結晶帶來的細胞損傷。凍融技術的出現，消除了獲取和使用生物材料之間的時間、空間差距[6-7]，緩解了生物樣本在輔助生殖、干細胞治療、再生醫學等生物醫學應用中的供需矛盾[8]。
細胞低溫凍融的核心目標之一在于先最小化生物樣本再玻璃化冷凍和復溫，降低低溫損傷，確保其活性和生理功能正常。而以往的研究表明，升降溫速率是影響冰晶生長的主要因素，因此廣大研究者致力于通過不同的冷凍和復溫策略來提高升降溫速率，并希望結合可視化和測溫手段探究凍融過程中的結晶規律。目前，采用最小體積法強化冷凍速率的方式仍無法滿足臨床醫學大體積樣本的冷凍需求，而采用冷凍載體法則使可視化和測溫變得尤為困難[9-10]；此外，傳統恒溫水浴復溫方式無法達到無冰凍融所需的臨界升溫速率。
本文基于藍寶石固體表面接觸式冷凍和激光復溫組合方式，搭建了具有高變溫速率、微尺度觀察及測溫能力的低溫凍融可視化系統，以不同組分的冷凍保護劑液滴為對象，在確保升降溫速率能夠滿足無冰凍融要求的同時，實現凍融全過程的可視化觀測和溫度測量，并探究了實現無冰凍融的外部影響因素，提高了液滴無冰凍融的綜合判斷方法的可靠性，為深入研究采用表面冷凍法和激光復溫法的液滴提供了新的技術手段。
1 凍融可視化系統及方案
1.1 固體表面冷凍-激光復溫可視化系統設計
根據上述研究目標，設計并搭建的系統包含以藍寶石載物臺為核心的多個子系統，其構成如圖1所示。
圖1
基于固體表面冷凍和激光復溫凍融可視化系統
a. 整體可視化凍融系統；b. 熱電偶布置示意；c. 藍寶石片及液滴
Figure1. Schematic design drawing of visualization system based on solid surface vitrification and laser rewarminga. integrated visual freeze-thaw system; b. schematic arrangement of thermocouple; c. sapphire film and droplets
如圖1a所示，整套凍融平臺置于光學平臺上以減小輕微震動對可視化觀察的影響，高頻數據采集儀（單通道采樣頻率為50 kHz）實現對液滴在微秒分辨率下的溫度記錄，高速相機結合氙燈冷光源實現對液滴在微米空間分辨率和毫秒級時間分辨率下的狀態記錄。滑動絲桿可通過轉動和升降二個自由度，將藍寶石載物臺在加熱工位（激光加熱）和冷凍工位（液氮杜瓦冷卻）之間互相切換。冷凍工位下，如圖1b～c所示，載物臺由10 mm直徑、0.2 mm厚的藍寶石片制成，藍寶石片裝載在聚四氟乙烯碗具中間，與液氮杜瓦中的液氮直接接觸，從而預冷藍寶石片至77 K，再利用藍寶石片在低溫下的高熱導率特性實現對樣品液滴的玻璃化冷凍。同時，線徑50 μm的熱電偶置于待滴液處的中部區，將測溫探頭布置于液滴縱向中部位置，液滴中部的溫度近似為液滴的平均溫度[11]。熱電偶的測溫頭直徑50 μm，將測溫頭近似為半徑25 μm的球體，其體積為 
= 65 449.8 μm3，約占液滴體積的0.02%。為了減少熱電偶對液滴的影響，盡量僅使測溫探頭頭部和極少部分的熱電偶引線接觸液滴，保守估計測溫頭和熱電偶絲的總體積約占1 μL液滴體積的0.1%以內。加熱工位下，系統采用2 000 W單模連續光纖激光器，輸出的高斯激光波長為（1 064±10）nm。由于藍寶石玻璃本身的高透光性（約90%），樣品臺反射給液滴的激光能量可忽略不計，確保玻璃化液滴的受熱均勻性和升溫可控性，從而實現系統的冷凍復溫一體化操作。同時，冷凍保護溶液以及生物細胞的主要成分是水，對紅外激光的吸收率低，對1 064 nm激光吸收率僅為3.5%[12]。為了實現玻璃化液滴在激光復溫過程中均勻且快速的受熱，在溶液中均勻添加長67 nm、直徑10 nm的高生物相容性的金納米顆粒（gold nanorods，GNR），具有高穩定性的金納米顆粒在冷凍前均勻分散于液滴內部且無沉降，可作為空間內熱源在液滴內部均勻傳熱。由于本文旨在關注凍融瞬間液滴的溫度和樣態變化，時間尺度極短，均在10 s內，因此采用開放式凍融系統時，外界環境內的結霜對本文所要研究的液滴冷凍和復溫瞬間的影響較小，且便于高速相機更清晰無阻擋地捕捉到樣品的凍融過程。更多本系統涉及的設備信息如表1所示。
表1
主要系統設備及其不確定度
Table1.
Details and uncertainties of the main devices
1.2 凍融實驗條件及判定依據
基于藍寶石玻璃載物臺的固體表面冷凍及納米激光復溫策略，以玻璃化冷凍和無冰復溫為目標，通過改變液滴體積、保護劑組分和激光能量，探究不同因素對液滴凍融狀態的影響，并確定實現無冰凍融的外部條件。
1.2.1 冷凍保護劑
冷凍保護液由GNR溶液、滲透性CPA和海藻糖組成。GNR溶液采用安比奇生物BR-10-1064號產品，濃度為3.63 × 1011 NPs/mL。此外，考慮到細胞毒性問題[13]，冷凍保護液中滲透性CPA采用毒性較小的丙二醇（propylene glycol，PG）和乙二醇（ethylene glycol，EG）組合液，同時純度 ≥ 98.5%的α-海藻糖（trehalose，TRE）作為非滲透性CPA。配比標準采用物質的量濃度（mol/L），TRE濃度固定為0.5 mol/L，GNR溶液的體積占比固定為溶液總體積的25%。具體組分配比以5 mL的溶液總體積為例，如表2所示。
表2
不同濃度下的溶液組分配比
Table2.
Solution fraction at different concentrations
1.2.2 無冰凍融判定方法
通過可視化圖像與溫度曲線綜合給出無冰凍融的判定標準。在可視化圖像方面，冷凍效果主要由高時間和高空間分辨率的高速相機捕捉穩定后的狀態來實現。可視化冰晶的觀測原理是液滴內部產生的結晶現象將導致局部折射率發生較大變化。Zhan等[14]通過拉曼散射和X光衍射等手段證明了微米級空間分辨率的可視化設備觀測是判斷是否實現玻璃化冷凍的高效方法，即視野中未捕捉到明顯的白色結晶現象可認為玻璃化冷凍成功。通過此判別方式，本文在冷凍過程中獲得的冷凍狀態可分為如圖2所示的三類：完全結晶、部分結晶和玻璃化。完全結晶液滴的固液界面至液滴頂部全部被白色冰晶覆蓋，液滴與藍寶石玻璃表面發生粘連，無法完整分離冷凍液滴。冷凍全過程肉眼和圖像處理軟件都未捕捉到白色結晶，且液滴保持清澈透明，可以判定為成功實現玻璃化冷凍。在玻璃化和完全結晶狀態之間，存在一種局部玻璃化、局部結晶的過渡狀態，玻璃化區域一般處于液滴下方即傳熱路徑更小而降溫速率更高的部分，結晶位置則從液滴頂部區域開始生成，隨后擴散至外部。
圖2
液滴基于固體表面冷凍的三種冷凍狀態
Figure2.
Three cooling states of liquid droplets based on SSV method
溫度曲線通過極細熱電偶和高頻數據采集儀獲得。對2 μL的液滴在不同冷凍效果下的降溫曲線如圖3所示，三種不同冷凍狀態下的降溫在速率和平滑性上有較大的不同：液滴玻璃化的程度越高，相比于結晶態的降溫速率就越慢，在150～250 K左右的危險溫區內，完全結晶、局部玻璃化和玻璃化的降溫速率分別為7.8 × 103、5.3 × 103、3.3 × 10 3 ℃/min。對于發生結晶的冷凍過程而言，其曲線會由于溶液熱力學參數的劇變而出現明顯的降溫臺階，而玻璃化程度越高，其降溫曲線就越平滑。由此可以將可視化方法結合溫度曲線的平滑性綜合判定被測液滴的玻璃化程度。
圖3
2μL液滴在不同冷凍效果下的降溫曲線
Figure3.
Cooling curve of 2 μL droplet under different freezing effects
2 結果分析
基于上述實驗系統和實驗方案，開展了不同組分、不同體積和不同激光能量下的液滴凍融實驗，分析結晶現象，并探究實現無冰凍融的外部條件。
2.1 玻璃化冷凍影響因素
2.1.1 溶液組分對玻璃化冷凍的影響
為了探究不同組分對液滴玻璃化冷凍的影響以及系統的極限冷凍性能，對無冷凍保護液的GNR溶液、2M PG、2M、2M + 0.5、3M + 0.5和4M + 0.5六組工況進行獨立實驗，液滴體積固定為2 μL，當溶液達到平衡狀態（10 s）后的可視化圖像如圖4所示。
圖4
2μL液滴在不同保護劑組分下的最終冷凍狀態
Figure4.
Final freezing state of 2 μL droplet under different protectant components
當溶液未添加冷凍保護劑時，只含有GNR的液滴呈現出完全結晶現象，而隨著單組份冷凍保護劑PG的加入，液滴呈現出不同的結晶過程，并在最終達到平衡狀態時呈現底部玻璃化而上半部分結晶的分化現象，如2M PG組所示。將兩種滲透性CPA混合加入后，局部結晶的冷凍狀態被進一步強化，結晶起始位置發生在2M混合組的液滴腰部。在2M+0.5組中，隨著0.5M非滲透性保護劑海藻糖的加入，液滴的玻璃化區域進一步擴大，液滴的最終結晶程度大幅降低，結晶狀態從區域性的晶態分布轉變至上腰部區域的點狀分布。該組實驗證明了非滲透性CPA海藻糖結合一定濃度的混合滲透性CPA組合可以有效提高玻璃化冷凍效果。其原因在于海藻糖和混合CPA組合都能夠提高溶液整體的玻璃轉變溫度，進一步降低溶液的結晶溫區ΔTcrystallization范圍，減少凍融過程的結晶現象。在總濃度達到3M+0.5后液滴實現完全玻璃化冷凍，此時繼續增加滲透性保護劑的濃度至4M+0.5，液滴仍然呈現完全玻璃化狀態。
不同組分溶液結晶方式不同。添加單組份滲透性CPA后的液滴結晶如圖5a所示，呈現點狀隨機分布、自下而上放射性生長的特點。在0.2 s左右，液滴底部邊緣出現隨機分布的冰晶成核點，隨后成核點的數量沿液滴邊緣自下而上逐漸增多，冰晶的體積也呈現圓形、放射狀的增長趨勢。0.4 s左右時，固液接觸面附近大部分被冰晶覆蓋，0.5 s時液滴的大部分區域都已經結晶，結晶區域逐漸擴散至液滴頂部，并在1.0 s左右完成結晶過程。與GNR溶液的最終結晶狀態相比，2M PG液滴在固液接觸面附近仍存在局部的玻璃化區域，且整體結晶并不均勻，呈現鋸齒狀的邊緣形態。
圖5
液滴結晶過程圖
a. 組分為2M PG的液滴; b. 組分為2M混合的液滴
Figure5. Crystallization process of dropletsa. concentration of 2M PG; b. concentration of 2M mixture
在混合CPA工況下，盡管總濃度未發生變化，但液滴的結晶過程和最終結晶狀態都發生了較大變化。如圖5b所示，在混合CPA的作用下，玻璃化與結晶的分界點為液滴腰部的某一平面位置，隨后冰晶以該界面為出發點，沿液滴外緣側均勻向上生長至頂部，最后的結晶狀態表現為具有清晰的玻璃態與晶態交界面，且晶態分布較為均勻規律。
對于2 μL體積的液滴而言，當組分濃度為3M + 0.5時不再觀測到冰晶，即認為實現玻璃化冷凍，隨著溶液中滲透性CPA濃度的進一步提高，4M + 0.5工況同樣如此。因此可以認為本系統能夠實現低濃度（≤ 4 mol/L）下液滴的快速玻璃化冷凍過程。
2.1.2 液滴體積對玻璃化冷凍特性的影響
為了進一步探究冷凍過程中的結晶狀態以及系統的冷凍性能，在溶液組分濃度確定的基礎上進一步開展了不同體積下的玻璃化冷凍實驗。受限于單次可滴落液滴的體積限制，針對3M + 0.5之后的每種濃度工況分別進行了1、2、4、6、8 μL體積的液滴玻璃化冷凍實驗.
不同體積的液滴最終結晶狀態如圖6所示。液滴與預冷表面的接觸角隨著體積的增大而減小，且1～6 μL體積都可實現玻璃化冷凍。當液滴體積增大至8 μL時，仍然沒有觀測到明顯的晶態區域，但此時液滴頂部區域以及整體的透光度略微下降，認為是處于即將結晶的狀態。
圖6
3M+0.5濃度下不同體積液滴的最終結晶狀態圖
Figure6.
Final crystallization state of droplets with different volumes at 3M+0.5 concentration
3M + 0.5濃度下不同體積液滴的降溫曲線和降溫速率如圖7所示。由于液滴在1～8 μL都可以實現較高程度的玻璃化，因此液滴的初始溫度變化較為迅速。隨著液滴體積增大，整體的降溫速率會呈現如圖7b所示的指數下降的趨勢。1 μL時降溫速率可高達9.2 × 103 ℃/min，但當體積達到8 μL后，降溫速率會降低至1.1 × 103 ℃/min。需要注意的是，盡管降溫速度隨著體積的增加而大幅下降，但在3M + 0.5的濃度下仍然可以實現最大6 μL液滴的成像清澈透明。
圖7
3M+0.5濃度下不同體積液滴的降溫曲線和降溫速率圖
a. 降溫曲線圖；b. 降溫速率點線圖
Figure7. Cooling curve and cooling rate of different volume droplets at 3M+0.5 concentrationa. temperature varies with the cooling time; b. cooling rate varies with volumes of droplets
表3總結了不同保護劑濃度配比及液滴體積組合的結晶和非結晶冷凍情況，為了更清晰地展現玻璃化狀態，表中將局部結晶和完全結晶均歸類為結晶狀態“I（Icing）”，玻璃化狀態歸類為非結晶狀態表示為“V（Vitrification）”。結果表明不同濃度液滴的冷凍過程均會受體積的影響，且隨著體積的增大而更難實現玻璃化。在2 mol/L PG + 2 mol/L EG + 0.5 mol/L TRE的保護劑濃度下，本藍寶石片表面冷凍法能實現的最高玻璃化體積為8 μL。
表3
不同液滴體積和組分濃度下的冷凍情況
Table3.
Vitrification state at different droplet volumes and component concentrations
2.2 激光復溫影響因素分析
在確保液滴具有較高玻璃化程度的前提下，獲得了不同激光功率照射10 ms后的液滴復溫狀態圖，如圖8所示。
圖8
不同激光功率下的液滴復溫狀態圖
Figure8.
Droplet rewarming state diagram under different laser power
改變激光能量輸入，液滴的最終復溫狀態會發生較大改變，除理想情況下的無冰復溫外，還有對流結晶、加熱不充分以及過度沸騰狀態。在不注入額外激光能量時，液滴僅通過對流方式與常溫空氣進行換熱，此時液滴表面先出現由空氣中水氣凝結而成的顆粒狀冰晶，隨后隨著主體溫度的升高，內部結晶程度也會逐漸增加直至整體呈現白色的晶態球形；當激光注入功率在1 400～1 600 W范圍內時，液滴周圍會產生可觀測到的汽化煙霧現象，由于復溫位置的切換而下降的透明度也將回升至液態時的狀態，此時玻璃態液滴將升溫至熔化溫度Tm以上并重新變為液態；當激光注入功率小于1 400 W時，液滴內部主體區域會發生明顯的重結晶現象，即由于加熱不充分而使終溫落在了結晶溫區之內并發生內部結晶；當激光注入功率大于1 600 W時，液滴過熱，表現為其內部瞬時產生大量氣泡，并熔化為接觸角極小的液體狀態。
為了進一步獲取復溫過程中液滴的實際升溫情況，利用熱容極小的極細熱電偶（50 μm）測得了中低激光功率下（400～1 200 W）的液滴升溫曲線，如圖9a所示。激光功率的增加將導致其復溫結束后液滴終溫的同步上升，1 200 W時終溫將升至220 K，液滴將處于加熱不充分的狀態。如圖9b所示，液滴的升溫速率與激光功率呈現較好的線性關系，且在400～1 200 W的功率范圍內升溫速率都高于106 ℃/min數量級，比冷凍時的降溫速率高出2～3個數量級。根據臨界速率理論[15-18]，復溫速率比相應的冷凍速率高2～3個數量級即可近似認為實現了無重結晶現象的無冰復溫過程。然而，在激光功率為1 200 W時的成像過程顯示，液滴的局部加熱不充分仍為冰晶。因此，不可簡單地將測溫過程作為無重結晶無冰復溫的單一判定依據。激光復溫過程較為復雜，本系統將成像和測溫耦合可提高判定被冷凍液滴激光復溫的有效性。
圖9
不同激光功率下的液滴升溫特性
a. 不同激光功率下的液滴升溫曲線；b. 不同激光功率下的液滴升溫速率
Figure9. Warming curve and rate diagram of droplet under different laser powera. temperature varies with laser energy; b. rewarming rate varies with laser energy
3 結論
本文以細胞凍融的實際臨床應用為出發點，研制了基于固體表面冷凍和激光復溫方法的細胞凍融可視化系統，并利用該系統開展了不同組分、不同體積保護劑和不同激光能量下的液滴凍融實驗，得到了液滴的結晶特性、無冰凍融的判定方法以及實現無冰凍融的外部條件，可為相關研究提供一種新的工具。得到的主要結論如下：
（1）從可視化觀測和溫度曲線兩個維度將液滴的冷凍效果分為完全結晶、局部結晶和玻璃態三個狀態。
（2）在玻璃化冷凍階段，本系統可實現體積為1 μL液滴9.2×103 ℃/min的降溫速率（1.5 mol/L PG + 1.5 mol/L EG + 0.5 mol/L TRE）；實現最低玻璃化冷凍保護劑濃度為1 mol/L PG + 1 mol/L EG + 0.5 mol/L TRE；當低溫保護劑為2 mol/L PG + 2 mol/L EG + 0.5 mol/L TRE時，本系統單次最大玻璃化冷凍體積為8 μL。
（3）在溶液組分方面，混合滲透性CPA和海藻糖的組合在玻璃化冷凍效果上最佳，且與單組份滲透性CPA的隨機成核方式相比，其冰晶成核點分布在液滴腰部位置并向上均勻生長。
（4）在激光復溫階段，確定了1 400～1 600 W為可以實現無冰復溫的激光功率范圍，并利用極細熱電偶和數據分析手段首次捕捉到了玻璃態液滴在激光復溫過程中約為106 ℃/min數量級（高于水浴復溫2～3個數量級）的升溫速率以及與激光功率的線性關系。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：本文全體作者分工明確，朱文欣負責實驗、數據分析及寫作，潘平安負責實驗臺搭建和實驗，黃永華負責實驗規劃和稿件審閱，陳威負責復溫方法可行性分析，韓廈負責部分數據分析，李錚負責冷凍流程優化，程錦生負責冷凍設備技術支持。
0 引言
生物材料的低溫凍融技術主要涉及冷凍、保存和復溫三個過程。冷凍過程通過降溫方式抑制處于冷凍保護劑（cryoprotectant agent, CPA）溶液中的細胞代謝活動，如在–196 ℃液氮溫度下生物材料內部化學反應幾乎停滯，進而讓生物材料在保存過程中實現延時的保存。目前冷凍過程主要采用玻璃化快速冷凍的方式[1]，通過高濃度CPA以及快速的非平衡冷卻將生物樣品從液態直接轉化為玻璃態。然而高濃度的CPA意味著較高的生物毒性[2-3]。與采用階梯式降溫的傳統慢速冷凍相比，玻璃化冷凍避免了冷凍過程中冰晶的產生，可最小化乃至消除低溫損傷[4-5]。復溫是指在需要的時候對已經冷凍好的生物樣本進行復溫解凍，使之恢復到正常生理狀態的技術。目前研究人員通過降低樣品體積以及應用多物理場方式，進一步降低了復溫過程中重結晶帶來的細胞損傷。凍融技術的出現，消除了獲取和使用生物材料之間的時間、空間差距[6-7]，緩解了生物樣本在輔助生殖、干細胞治療、再生醫學等生物醫學應用中的供需矛盾[8]。
細胞低溫凍融的核心目標之一在于先最小化生物樣本再玻璃化冷凍和復溫，降低低溫損傷，確保其活性和生理功能正常。而以往的研究表明，升降溫速率是影響冰晶生長的主要因素，因此廣大研究者致力于通過不同的冷凍和復溫策略來提高升降溫速率，并希望結合可視化和測溫手段探究凍融過程中的結晶規律。目前，采用最小體積法強化冷凍速率的方式仍無法滿足臨床醫學大體積樣本的冷凍需求，而采用冷凍載體法則使可視化和測溫變得尤為困難[9-10]；此外，傳統恒溫水浴復溫方式無法達到無冰凍融所需的臨界升溫速率。
本文基于藍寶石固體表面接觸式冷凍和激光復溫組合方式，搭建了具有高變溫速率、微尺度觀察及測溫能力的低溫凍融可視化系統，以不同組分的冷凍保護劑液滴為對象，在確保升降溫速率能夠滿足無冰凍融要求的同時，實現凍融全過程的可視化觀測和溫度測量，并探究了實現無冰凍融的外部影響因素，提高了液滴無冰凍融的綜合判斷方法的可靠性，為深入研究采用表面冷凍法和激光復溫法的液滴提供了新的技術手段。
1 凍融可視化系統及方案
1.1 固體表面冷凍-激光復溫可視化系統設計
根據上述研究目標，設計并搭建的系統包含以藍寶石載物臺為核心的多個子系統，其構成如圖1所示。
圖1
基于固體表面冷凍和激光復溫凍融可視化系統
a. 整體可視化凍融系統；b. 熱電偶布置示意；c. 藍寶石片及液滴
Figure1. Schematic design drawing of visualization system based on solid surface vitrification and laser rewarminga. integrated visual freeze-thaw system; b. schematic arrangement of thermocouple; c. sapphire film and droplets
如圖1a所示，整套凍融平臺置于光學平臺上以減小輕微震動對可視化觀察的影響，高頻數據采集儀（單通道采樣頻率為50 kHz）實現對液滴在微秒分辨率下的溫度記錄，高速相機結合氙燈冷光源實現對液滴在微米空間分辨率和毫秒級時間分辨率下的狀態記錄。滑動絲桿可通過轉動和升降二個自由度，將藍寶石載物臺在加熱工位（激光加熱）和冷凍工位（液氮杜瓦冷卻）之間互相切換。冷凍工位下，如圖1b～c所示，載物臺由10 mm直徑、0.2 mm厚的藍寶石片制成，藍寶石片裝載在聚四氟乙烯碗具中間，與液氮杜瓦中的液氮直接接觸，從而預冷藍寶石片至77 K，再利用藍寶石片在低溫下的高熱導率特性實現對樣品液滴的玻璃化冷凍。同時，線徑50 μm的熱電偶置于待滴液處的中部區，將測溫探頭布置于液滴縱向中部位置，液滴中部的溫度近似為液滴的平均溫度[11]。熱電偶的測溫頭直徑50 μm，將測溫頭近似為半徑25 μm的球體，其體積為 = 65 449.8 μm3，約占液滴體積的0.02%。為了減少熱電偶對液滴的影響，盡量僅使測溫探頭頭部和極少部分的熱電偶引線接觸液滴，保守估計測溫頭和熱電偶絲的總體積約占1 μL液滴體積的0.1%以內。加熱工位下，系統采用2 000 W單模連續光纖激光器，輸出的高斯激光波長為（1 064±10）nm。由于藍寶石玻璃本身的高透光性（約90%），樣品臺反射給液滴的激光能量可忽略不計，確保玻璃化液滴的受熱均勻性和升溫可控性，從而實現系統的冷凍復溫一體化操作。同時，冷凍保護溶液以及生物細胞的主要成分是水，對紅外激光的吸收率低，對1 064 nm激光吸收率僅為3.5%[12]。為了實現玻璃化液滴在激光復溫過程中均勻且快速的受熱，在溶液中均勻添加長67 nm、直徑10 nm的高生物相容性的金納米顆粒（gold nanorods，GNR），具有高穩定性的金納米顆粒在冷凍前均勻分散于液滴內部且無沉降，可作為空間內熱源在液滴內部均勻傳熱。由于本文旨在關注凍融瞬間液滴的溫度和樣態變化，時間尺度極短，均在10 s內，因此采用開放式凍融系統時，外界環境內的結霜對本文所要研究的液滴冷凍和復溫瞬間的影響較小，且便于高速相機更清晰無阻擋地捕捉到樣品的凍融過程。更多本系統涉及的設備信息如表1所示。
表1
主要系統設備及其不確定度
Table1.
Details and uncertainties of the main devices
1.2 凍融實驗條件及判定依據
基于藍寶石玻璃載物臺的固體表面冷凍及納米激光復溫策略，以玻璃化冷凍和無冰復溫為目標，通過改變液滴體積、保護劑組分和激光能量，探究不同因素對液滴凍融狀態的影響，并確定實現無冰凍融的外部條件。
1.2.1 冷凍保護劑
冷凍保護液由GNR溶液、滲透性CPA和海藻糖組成。GNR溶液采用安比奇生物BR-10-1064號產品，濃度為3.63 × 1011 NPs/mL。此外，考慮到細胞毒性問題[13]，冷凍保護液中滲透性CPA采用毒性較小的丙二醇（propylene glycol，PG）和乙二醇（ethylene glycol，EG）組合液，同時純度 ≥ 98.5%的α-海藻糖（trehalose，TRE）作為非滲透性CPA。配比標準采用物質的量濃度（mol/L），TRE濃度固定為0.5 mol/L，GNR溶液的體積占比固定為溶液總體積的25%。具體組分配比以5 mL的溶液總體積為例，如表2所示。
表2
不同濃度下的溶液組分配比
Table2.
Solution fraction at different concentrations
1.2.2 無冰凍融判定方法
通過可視化圖像與溫度曲線綜合給出無冰凍融的判定標準。在可視化圖像方面，冷凍效果主要由高時間和高空間分辨率的高速相機捕捉穩定后的狀態來實現。可視化冰晶的觀測原理是液滴內部產生的結晶現象將導致局部折射率發生較大變化。Zhan等[14]通過拉曼散射和X光衍射等手段證明了微米級空間分辨率的可視化設備觀測是判斷是否實現玻璃化冷凍的高效方法，即視野中未捕捉到明顯的白色結晶現象可認為玻璃化冷凍成功。通過此判別方式，本文在冷凍過程中獲得的冷凍狀態可分為如圖2所示的三類：完全結晶、部分結晶和玻璃化。完全結晶液滴的固液界面至液滴頂部全部被白色冰晶覆蓋，液滴與藍寶石玻璃表面發生粘連，無法完整分離冷凍液滴。冷凍全過程肉眼和圖像處理軟件都未捕捉到白色結晶，且液滴保持清澈透明，可以判定為成功實現玻璃化冷凍。在玻璃化和完全結晶狀態之間，存在一種局部玻璃化、局部結晶的過渡狀態，玻璃化區域一般處于液滴下方即傳熱路徑更小而降溫速率更高的部分，結晶位置則從液滴頂部區域開始生成，隨后擴散至外部。
圖2
液滴基于固體表面冷凍的三種冷凍狀態
Figure2.
Three cooling states of liquid droplets based on SSV method
溫度曲線通過極細熱電偶和高頻數據采集儀獲得。對2 μL的液滴在不同冷凍效果下的降溫曲線如圖3所示，三種不同冷凍狀態下的降溫在速率和平滑性上有較大的不同：液滴玻璃化的程度越高，相比于結晶態的降溫速率就越慢，在150～250 K左右的危險溫區內，完全結晶、局部玻璃化和玻璃化的降溫速率分別為7.8 × 103、5.3 × 103、3.3 × 10 3 ℃/min。對于發生結晶的冷凍過程而言，其曲線會由于溶液熱力學參數的劇變而出現明顯的降溫臺階，而玻璃化程度越高，其降溫曲線就越平滑。由此可以將可視化方法結合溫度曲線的平滑性綜合判定被測液滴的玻璃化程度。
圖3
2μL液滴在不同冷凍效果下的降溫曲線
Figure3.
Cooling curve of 2 μL droplet under different freezing effects
2 結果分析
基于上述實驗系統和實驗方案，開展了不同組分、不同體積和不同激光能量下的液滴凍融實驗，分析結晶現象，并探究實現無冰凍融的外部條件。
2.1 玻璃化冷凍影響因素
2.1.1 溶液組分對玻璃化冷凍的影響
為了探究不同組分對液滴玻璃化冷凍的影響以及系統的極限冷凍性能，對無冷凍保護液的GNR溶液、2M PG、2M、2M + 0.5、3M + 0.5和4M + 0.5六組工況進行獨立實驗，液滴體積固定為2 μL，當溶液達到平衡狀態（10 s）后的可視化圖像如圖4所示。
圖4
2μL液滴在不同保護劑組分下的最終冷凍狀態
Figure4.
Final freezing state of 2 μL droplet under different protectant components
當溶液未添加冷凍保護劑時，只含有GNR的液滴呈現出完全結晶現象，而隨著單組份冷凍保護劑PG的加入，液滴呈現出不同的結晶過程，并在最終達到平衡狀態時呈現底部玻璃化而上半部分結晶的分化現象，如2M PG組所示。將兩種滲透性CPA混合加入后，局部結晶的冷凍狀態被進一步強化，結晶起始位置發生在2M混合組的液滴腰部。在2M+0.5組中，隨著0.5M非滲透性保護劑海藻糖的加入，液滴的玻璃化區域進一步擴大，液滴的最終結晶程度大幅降低，結晶狀態從區域性的晶態分布轉變至上腰部區域的點狀分布。該組實驗證明了非滲透性CPA海藻糖結合一定濃度的混合滲透性CPA組合可以有效提高玻璃化冷凍效果。其原因在于海藻糖和混合CPA組合都能夠提高溶液整體的玻璃轉變溫度，進一步降低溶液的結晶溫區ΔTcrystallization范圍，減少凍融過程的結晶現象。在總濃度達到3M+0.5后液滴實現完全玻璃化冷凍，此時繼續增加滲透性保護劑的濃度至4M+0.5，液滴仍然呈現完全玻璃化狀態。
不同組分溶液結晶方式不同。添加單組份滲透性CPA后的液滴結晶如圖5a所示，呈現點狀隨機分布、自下而上放射性生長的特點。在0.2 s左右，液滴底部邊緣出現隨機分布的冰晶成核點，隨后成核點的數量沿液滴邊緣自下而上逐漸增多，冰晶的體積也呈現圓形、放射狀的增長趨勢。0.4 s左右時，固液接觸面附近大部分被冰晶覆蓋，0.5 s時液滴的大部分區域都已經結晶，結晶區域逐漸擴散至液滴頂部，并在1.0 s左右完成結晶過程。與GNR溶液的最終結晶狀態相比，2M PG液滴在固液接觸面附近仍存在局部的玻璃化區域，且整體結晶并不均勻，呈現鋸齒狀的邊緣形態。
圖5
液滴結晶過程圖
a. 組分為2M PG的液滴; b. 組分為2M混合的液滴
Figure5. Crystallization process of dropletsa. concentration of 2M PG; b. concentration of 2M mixture
在混合CPA工況下，盡管總濃度未發生變化，但液滴的結晶過程和最終結晶狀態都發生了較大變化。如圖5b所示，在混合CPA的作用下，玻璃化與結晶的分界點為液滴腰部的某一平面位置，隨后冰晶以該界面為出發點，沿液滴外緣側均勻向上生長至頂部，最后的結晶狀態表現為具有清晰的玻璃態與晶態交界面，且晶態分布較為均勻規律。
對于2 μL體積的液滴而言，當組分濃度為3M + 0.5時不再觀測到冰晶，即認為實現玻璃化冷凍，隨著溶液中滲透性CPA濃度的進一步提高，4M + 0.5工況同樣如此。因此可以認為本系統能夠實現低濃度（≤ 4 mol/L）下液滴的快速玻璃化冷凍過程。
2.1.2 液滴體積對玻璃化冷凍特性的影響
為了進一步探究冷凍過程中的結晶狀態以及系統的冷凍性能，在溶液組分濃度確定的基礎上進一步開展了不同體積下的玻璃化冷凍實驗。受限于單次可滴落液滴的體積限制，針對3M + 0.5之后的每種濃度工況分別進行了1、2、4、6、8 μL體積的液滴玻璃化冷凍實驗.
不同體積的液滴最終結晶狀態如圖6所示。液滴與預冷表面的接觸角隨著體積的增大而減小，且1～6 μL體積都可實現玻璃化冷凍。當液滴體積增大至8 μL時，仍然沒有觀測到明顯的晶態區域，但此時液滴頂部區域以及整體的透光度略微下降，認為是處于即將結晶的狀態。
圖6
3M+0.5濃度下不同體積液滴的最終結晶狀態圖
Figure6.
Final crystallization state of droplets with different volumes at 3M+0.5 concentration
3M + 0.5濃度下不同體積液滴的降溫曲線和降溫速率如圖7所示。由于液滴在1～8 μL都可以實現較高程度的玻璃化，因此液滴的初始溫度變化較為迅速。隨著液滴體積增大，整體的降溫速率會呈現如圖7b所示的指數下降的趨勢。1 μL時降溫速率可高達9.2 × 103 ℃/min，但當體積達到8 μL后，降溫速率會降低至1.1 × 103 ℃/min。需要注意的是，盡管降溫速度隨著體積的增加而大幅下降，但在3M + 0.5的濃度下仍然可以實現最大6 μL液滴的成像清澈透明。
圖7
3M+0.5濃度下不同體積液滴的降溫曲線和降溫速率圖
a. 降溫曲線圖；b. 降溫速率點線圖
Figure7. Cooling curve and cooling rate of different volume droplets at 3M+0.5 concentrationa. temperature varies with the cooling time; b. cooling rate varies with volumes of droplets
表3總結了不同保護劑濃度配比及液滴體積組合的結晶和非結晶冷凍情況，為了更清晰地展現玻璃化狀態，表中將局部結晶和完全結晶均歸類為結晶狀態“I（Icing）”，玻璃化狀態歸類為非結晶狀態表示為“V（Vitrification）”。結果表明不同濃度液滴的冷凍過程均會受體積的影響，且隨著體積的增大而更難實現玻璃化。在2 mol/L PG + 2 mol/L EG + 0.5 mol/L TRE的保護劑濃度下，本藍寶石片表面冷凍法能實現的最高玻璃化體積為8 μL。
表3
不同液滴體積和組分濃度下的冷凍情況
Table3.
Vitrification state at different droplet volumes and component concentrations
2.2 激光復溫影響因素分析
在確保液滴具有較高玻璃化程度的前提下，獲得了不同激光功率照射10 ms后的液滴復溫狀態圖，如圖8所示。
圖8
不同激光功率下的液滴復溫狀態圖
Figure8.
Droplet rewarming state diagram under different laser power
改變激光能量輸入，液滴的最終復溫狀態會發生較大改變，除理想情況下的無冰復溫外，還有對流結晶、加熱不充分以及過度沸騰狀態。在不注入額外激光能量時，液滴僅通過對流方式與常溫空氣進行換熱，此時液滴表面先出現由空氣中水氣凝結而成的顆粒狀冰晶，隨后隨著主體溫度的升高，內部結晶程度也會逐漸增加直至整體呈現白色的晶態球形；當激光注入功率在1 400～1 600 W范圍內時，液滴周圍會產生可觀測到的汽化煙霧現象，由于復溫位置的切換而下降的透明度也將回升至液態時的狀態，此時玻璃態液滴將升溫至熔化溫度Tm以上并重新變為液態；當激光注入功率小于1 400 W時，液滴內部主體區域會發生明顯的重結晶現象，即由于加熱不充分而使終溫落在了結晶溫區之內并發生內部結晶；當激光注入功率大于1 600 W時，液滴過熱，表現為其內部瞬時產生大量氣泡，并熔化為接觸角極小的液體狀態。
為了進一步獲取復溫過程中液滴的實際升溫情況，利用熱容極小的極細熱電偶（50 μm）測得了中低激光功率下（400～1 200 W）的液滴升溫曲線，如圖9a所示。激光功率的增加將導致其復溫結束后液滴終溫的同步上升，1 200 W時終溫將升至220 K，液滴將處于加熱不充分的狀態。如圖9b所示，液滴的升溫速率與激光功率呈現較好的線性關系，且在400～1 200 W的功率范圍內升溫速率都高于106 ℃/min數量級，比冷凍時的降溫速率高出2～3個數量級。根據臨界速率理論[15-18]，復溫速率比相應的冷凍速率高2～3個數量級即可近似認為實現了無重結晶現象的無冰復溫過程。然而，在激光功率為1 200 W時的成像過程顯示，液滴的局部加熱不充分仍為冰晶。因此，不可簡單地將測溫過程作為無重結晶無冰復溫的單一判定依據。激光復溫過程較為復雜，本系統將成像和測溫耦合可提高判定被冷凍液滴激光復溫的有效性。
圖9
不同激光功率下的液滴升溫特性
a. 不同激光功率下的液滴升溫曲線；b. 不同激光功率下的液滴升溫速率
Figure9. Warming curve and rate diagram of droplet under different laser powera. temperature varies with laser energy; b. rewarming rate varies with laser energy
3 結論
本文以細胞凍融的實際臨床應用為出發點，研制了基于固體表面冷凍和激光復溫方法的細胞凍融可視化系統，并利用該系統開展了不同組分、不同體積保護劑和不同激光能量下的液滴凍融實驗，得到了液滴的結晶特性、無冰凍融的判定方法以及實現無冰凍融的外部條件，可為相關研究提供一種新的工具。得到的主要結論如下：
（1）從可視化觀測和溫度曲線兩個維度將液滴的冷凍效果分為完全結晶、局部結晶和玻璃態三個狀態。
（2）在玻璃化冷凍階段，本系統可實現體積為1 μL液滴9.2×103 ℃/min的降溫速率（1.5 mol/L PG + 1.5 mol/L EG + 0.5 mol/L TRE）；實現最低玻璃化冷凍保護劑濃度為1 mol/L PG + 1 mol/L EG + 0.5 mol/L TRE；當低溫保護劑為2 mol/L PG + 2 mol/L EG + 0.5 mol/L TRE時，本系統單次最大玻璃化冷凍體積為8 μL。
（3）在溶液組分方面，混合滲透性CPA和海藻糖的組合在玻璃化冷凍效果上最佳，且與單組份滲透性CPA的隨機成核方式相比，其冰晶成核點分布在液滴腰部位置并向上均勻生長。
（4）在激光復溫階段，確定了1 400～1 600 W為可以實現無冰復溫的激光功率范圍，并利用極細熱電偶和數據分析手段首次捕捉到了玻璃態液滴在激光復溫過程中約為106 ℃/min數量級（高于水浴復溫2～3個數量級）的升溫速率以及與激光功率的線性關系。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：本文全體作者分工明確，朱文欣負責實驗、數據分析及寫作，潘平安負責實驗臺搭建和實驗，黃永華負責實驗規劃和稿件審閱，陳威負責復溫方法可行性分析，韓廈負責部分數據分析，李錚負責冷凍流程優化，程錦生負責冷凍設備技術支持。
