為探討等離子體射流（PJ）和等離子體活化水（PAW）對變形鏈球菌（S. mutans）滅菌效果的影響并對比兩者優劣，以便于為齲齒的等離子體治療提供基礎，豐富齲齒治療手段，本文搭建了一種大氣壓等離子體激發系統，研究了不同激勵電壓（Ue）和不同激勵時間（te）下，PJ和PAW對S. mutans滅菌率的影響及處理過程中溫度和pH的變化。結果表明，在PJ處理中，當Ue = 7 kV且te = 60 s時，處理組與對照組之間S. mutans存活率的差異具有統計學意義（P = 0.007，d = 2.66），且在Ue = 8 kV，te = 120 s時，PJ處理可實現完全滅菌；而在PAW處理中，當Ue = 7 kV且te = 30 s時，處理組與對照組之間S. mutans存活率的差異具有統計學意義（P = 0.029，d = 1.71），且當Ue = 9 kV，te = 60 s時，PAW處理可實現完全滅菌。而對溫度和pH的監測表明，PJ和PAW處理過程中最大溫升不超過4.3 ℃，而PAW處理后的pH值最低會降至3.02。綜合而言，PJ最佳滅菌參數為Ue = 8 kV且90 s < te ≤ 120 s，而PAW最佳滅菌參數為Ue = 9 kV且30 s＜te ≤ 60 s，二者均能實現對S. mutans的非熱滅菌，其中PJ只需要更小的Ue就能實現完全滅菌，而在pH < 4.7時，PAW只需更短的te就能實現完全滅菌，但其酸性環境會對牙齒造成一定的化學損傷。本研究可為等離子體治療齲齒提供一定的參考價值。
引用本文： 覃思, 王閏寧, 李虎, 范鎧源, 王港, 張鐿議. 等離子體射流和等離子體活化水對變形鏈球菌滅菌效果的研究. 生物醫學工程學雜志, 2023, 40(3): 559-565. doi: 10.7507/1001-5515.202212030 復制
0 引言
齲齒是人類最常見的口腔疾病之一，嚴重危害人類身體健康。變形鏈球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）通常被認為是致齲過程中的關鍵病原體，它是一種革蘭氏陽性兼性厭氧菌，會產生胞外多糖形成牙菌斑，并且還會與其它細菌聯合作用產生乳酸為主的糖代謝產物引發齲齒[1-8]。目前主要的齲齒治療手段無法完全清除細菌又或者存在一些副作用[9-12]。
等離子體射流（plasma jet，PJ）作為一種新型的滅菌技術引起了醫學界廣泛的關注，它可以在日常環境下激發，產生大量氣相活性物質，將其通入水中后，各類氣相活性物質又會與水溶液發生一系列物理化學反應，形成富含更多種類液相活性物質的水溶液，即等離子體活化水（plasma activated water，PAW），這些氣相和液相活性物質統稱為活性氧和氮物質（reactive oxygen and nitrogen species，RONS），它們具有殺滅微生物的能力并且優點眾多[13-14]，因此在滅菌方面存在巨大潛能[15-16]，也為齲齒的無痛治療提供了可能。
針對PJ和PAW對S. mutans滅菌效果影響的研究中，現有的研究大都采用稀有氣體作為放電氣體，如氦氣（helium，He）、氬氣（argon，Ar）或混合氣體等[17-28]，通常僅研究固定參數下PJ或PAW單獨作用的滅菌效果。考慮到臨床上的副作用、經濟效益以及具體選擇PJ或PAW進行治療的優劣問題，本文在已有研究的基礎上，搭建了一種大氣壓等離子體激發系統，以空氣作為放電氣體，研究不同激勵條件［激勵電壓（Ue）、激勵時間（te）］下PJ和PAW處理后的溫度、pH對S. mutans的物理化學影響并對比兩者的滅菌效果，以期為等離子體治療齲齒提供實踐指導，并指明潛在風險。
1 材料與方法
1.1 大氣壓等離子體激發系統
本文搭建的大氣壓等離子體激發系統如圖1所示，主要由等離子體反應器、高壓交流電源、空氣采集器和測量裝置等部分組成。等離子體反應器采用同軸型針環放電結構，主要由高壓電極、介質管和地極組成，其中高壓電極為一根直徑為2 mm的鎢針，介質管為內徑5 mm、外徑7 mm、長度為110 mm的石英管，管外裹有銅箔并接地，等離子體射流激發區域位于鎢針和銅箔覆蓋的環隙之間；高壓交流電源由低壓直流電源和高頻逆變器組成，產生的Ue范圍為0~9 kV；空氣采集器由無刷隔膜氣泵（D50H-42H，成都海霖科技有限公司，中國）和流量計組成，提供空氣作為放電氣體，并將流速控制在3.5 L/min；測量裝置由高壓探頭（P6015A，Tektronix，美國）和示波器（TDS2024C，Tektronix，美國）組成，用于監測實時電壓波形。
圖1
大氣壓等離子體激發系統
Figure1.
Atmospheric pressure plasma excitation system
1.2 等離子體射流和等離子體活化水的獲取和使用
PJ處理實驗中，在Ue = 0、7、8、9 kV下，使用等離子體反應器對空氣進行te = 0、30、60、90、120 s的激發，在激發過程中直接對下方2 cm處腦心浸液瓊脂（brain heart infusion agar，BHIA）培養基上的S. mutans進行處理。PAW處理實驗中，在Ue = 0、7、8、9 kV下，使用等離子體反應器對9.9 mL去離子水進行te = 0、30、60、90、120 s的激活，然后將S. mutans菌液加入其中，搖勻浸泡處理10 min。
1.3 菌株和培養條件
首先將冷凍的S. mutans原液（ATCC25175，上海保藏生物技術中心，中國）解凍后，取0.1 mL原液加入3 mL無菌腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養基中，在37 ℃低氧條件下靜置培養48 h，接著取其中的1 mL菌液加入至100 mL無菌BHI培養基中，在37 ℃有氧條件下振蕩培養24 h，以菌落形成單位（colony forming units，CFU）計數法，獲得108~109 CFU/mL濃度的菌液。
1.4 等離子體射流滅菌處理
將高濃度的菌液稀釋至103~104 CFU/mL，各取0.1 mL菌液涂布于不同BHIA培養基上，將其分成以下3組：① 對照組：不作任何處理；② PJ處理Ⅰ組：在Ue = 0 kV、te = 120 s下，使用PJ直接處理；③ PJ處理Ⅱ組：在Ue = 7、8、9 kV，te = 30、60、90、120 s下，使用PJ直接處理。
1.5 等離子體活化水滅菌處理
將高濃度的菌液稀釋至106~107 CFU/mL，各取0.1 mL菌液分成以下3組：① 對照組：9.9 mL去離子水浸泡處理；② PAW處理Ⅰ組：在Ue = 0 kV，te = 120 s下，使用9.9 mL的PAW浸泡處理；③ PAW處理Ⅱ組：在Ue = 7、8、9 kV，te = 30、60、90、120 s下，使用9.9 mL的PAW浸泡處理。處理完成后分別取0.1 mL混合液涂布于BHIA培養基上。
1.6 溫度和pH測量
首先使用熱成像儀（UTi120S，優利德科技股份有限公司，中國）監測不同Ue下PJ和PAW處理區域在te = 0、120 s時的熱成像圖，然后通過熱成像圖左上角數據記錄te = 0 s時的溫度T1以及te = 120 s時的溫度T2，并計算前后溫差?T = T2 ? T1，用于定量分析PJ和PAW對S. mutans和牙齒的物理影響；使用pH計測量不同激勵條件下PAW的pH值，用于定量評估PAW對S. mutans和牙齒的化學影響。
1.7 菌落形成單位計數和滅菌率計算
將PJ和PAW處理后的BHIA培養基放入37 ℃恒溫箱中，靜置培養12 h后進行CFU計數，然后計算出相應的滅菌率，如式（1）所示，并繪制滅菌率變化曲線，通過滅菌率定量分析PJ和PAW對S. mutans的滅菌效果。
 |
其中，RS為滅菌率，NC為對照組菌落數，NT為實驗組菌落數。
1.8 統計學分析
統計學分析采用統計產品與服務解決方案軟件SPSS 26.0（SPSS Inc.，美國），采用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）考察不同激勵條件下PJ和PAW處理組與對照組之間S. mutans細胞濃度或存活率的差異是否具有統計學意義，事后多重比較采用最小顯著差異法（least significant difference，LSD）檢驗，P < 0.05表示差異具有統計學意義，效應值大小由科恩d值（Cohen’s d）（簡稱d值）衡量。
2 結果與討論
2.1 溫度監測結果
不同Ue下，PJ和PAW處理區域在te = 0、120 s的熱成像圖如圖2所示。既往的研究表明，等離子體放電具有熱效應，且S. mutans只有在超過60 ℃時才會失活[29-32]。
圖2
不同Ue下PJ和PAW處理區域在te = 0、120 s的熱成像圖
Figure2.
Thermograms of PJ and PAW treatment regions at te = 0, 120 s under different Ue
在PJ處理區域中，不同Ue下PJ處理后，?T > 0 ℃，且隨著Ue的增大，|?T|逐漸增大，在Ue = 9 kV時，前后溫差最大值|?T|max = 4.3 ℃。當Ue = 7、8、9 kV時，處理區域的溫度T2分別為26.8、30.2、33.9 ℃，均小于60 ℃，不會導致S. mutans死亡，而牙齒能夠耐受的溫度范圍為10～50 ℃，T2最小值T2min = 26.8 ℃>10 ℃且T2最大值T2max = 33.9 ℃<50 ℃，所以不會對牙齒造成物理損傷。
在PAW處理區域中，不同Ue下PAW處理后?T < 0 ℃，且隨著Ue的增大，|?T|逐漸減小，這是由于Ue較小時，氣泡使PAW在處理過程中散發的熱量大于熱效應增加的熱量，在Ue = 7 kV時，|?T|max = 3.9 ℃。當Ue = 7、8、9 kV時，處理區域的溫度T2分別為29.0、30.3、33.2 ℃，均小于60 ℃，不會導致S. mutans死亡，由于T2min = 29.0 ℃ > 10 ℃且T2max = 33.2 ℃ < 50 ℃，所以也不會對牙齒造成物理損傷。
由此可見，PJ和PAW在處理過程中引起的微小溫度變化不會導致S. mutans死亡，并且其處理區域的最低溫度T2min和最高溫度T2max都在牙齒的耐受范圍內，所以不會對牙齒造成物理損傷。
2.2 pH測量結果
不同Ue下PAW的pH值隨te的變化情況如圖3所示。既往的研究表明，S. mutans具有產酸和耐酸的特性，pH低于3時才會造成其死亡[33]。由圖3可知，PAW的pH值隨著Ue和te的增加呈現逐漸降低的趨勢，當Ue = 9 kV，te = 120 s時，PAW的最低pH=3.02 > 3，不會導致S. mutans死亡，而牙釉質脫礦的臨界pH值約為5.5。由圖3可知，在以下3種情況：① Ue = 7 kV且te > 90 s；② Ue = 8 kV且te > 60 s；③ Ue = 9 kV且te > 30 s時，相應的pH < 5.5，會對牙齒造成一定的腐蝕，因此PAW處理過程中引起的pH值變化不會導致S. mutans死亡，但會對牙齒表面產生一定的化學損傷。
圖3
不同Ue下PAW的pH值隨te的變化情況
Figure3.
Variation of pH value of PAW with te at different Ue
2.3 等離子體射流和等離子體活化水滅菌實驗結果
不同Ue下PJ和PAW處理后的滅菌情況和細胞濃度（te = 120 s）如圖4、圖5所示。由圖4和圖5可知，在Ue = 0 kV時，通過LSD檢驗可知，處理組與對照組之間S. mutans細胞濃度的差異都不具有統計學意義（PJ處理Ⅰ組：P = 0.911；PAW處理Ⅰ組：P = 0.203）；而在Ue = 7、8、9 kV時，S. mutans細胞濃度都不同程度地減少，通過LSD檢驗可知，處理組與對照組之間S. mutans細胞濃度的差異均具有統計學意義（P < 0.001，PJ處理Ⅱ組：d = 4.31、15.98、15.98；PAW處理Ⅱ組：d = 4.38、10.07、12.08）。由此可見，在Ue = 0 kV下，空氣激發的PJ和PAW處理后均不會導致S. mutans死亡。
圖4
不同Ue下PJ和PAW處理后的滅菌情況（te = 120 s）
Figure4.
Sterilization after PJ and PAW treatment at different Ue (te = 120 s)
圖5
不同Ue下PJ和PAW處理后的細胞濃度（te = 120 s）
Figure5.
Cell concentration after PJ and PAW treatment at different Ue (te = 120 s)
不同Ue下PJ和PAW滅菌率隨te的變化情況如圖6所示。由圖6可知，PJ和PAW的滅菌率隨Ue和te的增大都呈現逐漸升高的趨勢。
圖6
不同Ue下PJ和PAW滅菌率隨te的變化情況
Figure6.
Variation of PJ and PAW sterilization rate with te at different Ue
在PJ處理實驗中，當Ue = 7 kV且te = 60 s時，通過LSD檢驗可知，處理組與對照組之間S. mutans存活率的差異具有統計學意義（P = 0.007，d = 2.66），并且隨著Ue和te的增加，PJ對S. mutans的滅菌效果逐漸增強。在Ue ≥ 8 kV且te ≥ 30 s時，滅菌率的變化趨勢逐漸趨于平緩，當Ue = 8 kV，te = 120 s時，PJ處理可實現完全滅菌，由此可知PJ滅菌的最佳激勵電壓Ue = 8 kV，最佳激勵時間90 s < te ≤ 120 s。
在PAW處理實驗中，當Ue = 7 kV且te = 30 s時，通過LSD檢驗可知，處理組與對照組之間S. mutans存活率的差異具有統計學意義（P = 0.029，d = 1.71），并且隨著Ue和te的增加，PAW對S. mutans的滅菌效果逐漸增強。在Ue ≥ 9 kV且te ≥ 30 s時，滅菌率的變化趨勢逐漸趨于平緩，當Ue = 9 kV，te = 60 s時，PAW處理可實現完全滅菌，由此可知本實驗中PAW滅菌的最佳激勵電壓Ue = 9 kV，最佳激勵時間30 s < te ≤ 60 s。
由圖6還可知，當Ue較低（即Ue = 7 kV）時，PJ和PAW的最高滅菌率均在40%左右，這主要是因為本系統激發等離子體的臨界電壓為7 kV左右，此時激發產生的RONS數量十分有限，導致滅菌率較低。而當Ue升高到8 kV后，PJ的滅菌率在短暫的te = 30 s內便快速到達94%以上，而PAW在te <120 s時，PAW的滅菌率均低于90%，且對應的pH值均大于4.7，但當pH值低于4.7時，PAW的滅菌率均在90%以上，說明確實存在pH值約為4.7的快速滅菌臨界值，這與既往的研究一致[34-35]。當Ue升高到一定程度后，滅菌率逐漸飽和，這是由于RONS到達完全滅菌的最大需求量，滅菌率由于細菌數量接近檢出限而趨于飽和。
由此可見，PJ和PAW均對S. mutans具有較強的殺滅作用，且滅菌效果隨Ue、te的增大而逐漸增大，其中PJ只需要更小的Ue就能實現完全滅菌，而PAW則存在明顯的過渡過程，表現出對pH值強烈的依賴性。
3 結論
本文搭建了一個大氣壓等離子體激發系統，以空氣作為放電氣體，對比研究了不同激勵條件下PJ和PAW處理后的溫度、pH對S. mutans的物理化學影響以及相應的滅菌效果。本文的主要研究結論如下：
（1）PJ和PAW處理過程中最大溫升不超過4.3 ℃，此溫升不會導致S. mutans死亡，也不會對牙齒表面造成物理損傷，對S. mutans的成功滅活是低溫等離子體中活性基團作用的結果，從而實現了對S. mutans的非熱滅菌處理。
（2）PAW處理后的最低pH值為3.02，該酸性環境不會導致S. mutans死亡，但會對牙齒表面造成一定的化學損傷，為實踐應用指明了潛在風險和應注意的問題。
（3）PJ和PAW均對S. mutans具有較強的殺滅作用，且PJ和PAW的滅菌率均與Ue和te呈正相關，當Ue = 8 kV，te = 120 s時，PJ處理后可實現完全滅菌；當Ue = 9 kV，te = 60 s時，PAW處理后可實現完全滅菌。
（4）PJ的最佳滅菌參數為Ue = 8 kV且90 s < te ≤ 120 s，而PAW的最佳滅菌參數為Ue = 9 kV且30 s < te ≤ 60 s，其中PJ只需要更小的Ue就能實現完全滅菌，而PAW對pH值存在一定的依賴性，約在pH為4.7以下，PAW滅菌率在很短的te內顯著提升。
此外，相比于Emi等[17]，Ye等[18]和Li等[19]的研究，首先本研究所設計的大氣壓等離子體激發系統實現完全滅菌所需的總處理時間更短，節省了一定的時間成本，其次本文給出了PJ和PAW最佳滅菌參數的范圍，為具體實踐應用提供了參考值，最后本文增加了對PJ和PAW在處理過程中溫度和pH變化的研究，為PJ和PAW的實際應用指明了一些潛在的風險。在后續的研究中，可結合本文所獲得的研究結果，進一步對激發參數和處理過程進行優化，實現更為理想的滅菌效果并規避處理過程中的潛在危害，同時可對PJ和PAW中活性成分的作用機制進行更深入的探討。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：覃思和王閏寧參與論文的選題、實驗以及論文初稿的撰寫，李虎負責實驗方案的優化，范鎧源負責實驗設備的搭建，王港負責論文審校，張鐿議為論文提供了資助和支持。
0 引言
齲齒是人類最常見的口腔疾病之一，嚴重危害人類身體健康。變形鏈球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）通常被認為是致齲過程中的關鍵病原體，它是一種革蘭氏陽性兼性厭氧菌，會產生胞外多糖形成牙菌斑，并且還會與其它細菌聯合作用產生乳酸為主的糖代謝產物引發齲齒[1-8]。目前主要的齲齒治療手段無法完全清除細菌又或者存在一些副作用[9-12]。
等離子體射流（plasma jet，PJ）作為一種新型的滅菌技術引起了醫學界廣泛的關注，它可以在日常環境下激發，產生大量氣相活性物質，將其通入水中后，各類氣相活性物質又會與水溶液發生一系列物理化學反應，形成富含更多種類液相活性物質的水溶液，即等離子體活化水（plasma activated water，PAW），這些氣相和液相活性物質統稱為活性氧和氮物質（reactive oxygen and nitrogen species，RONS），它們具有殺滅微生物的能力并且優點眾多[13-14]，因此在滅菌方面存在巨大潛能[15-16]，也為齲齒的無痛治療提供了可能。
針對PJ和PAW對S. mutans滅菌效果影響的研究中，現有的研究大都采用稀有氣體作為放電氣體，如氦氣（helium，He）、氬氣（argon，Ar）或混合氣體等[17-28]，通常僅研究固定參數下PJ或PAW單獨作用的滅菌效果。考慮到臨床上的副作用、經濟效益以及具體選擇PJ或PAW進行治療的優劣問題，本文在已有研究的基礎上，搭建了一種大氣壓等離子體激發系統，以空氣作為放電氣體，研究不同激勵條件［激勵電壓（Ue）、激勵時間（te）］下PJ和PAW處理后的溫度、pH對S. mutans的物理化學影響并對比兩者的滅菌效果，以期為等離子體治療齲齒提供實踐指導，并指明潛在風險。
1 材料與方法
1.1 大氣壓等離子體激發系統
本文搭建的大氣壓等離子體激發系統如圖1所示，主要由等離子體反應器、高壓交流電源、空氣采集器和測量裝置等部分組成。等離子體反應器采用同軸型針環放電結構，主要由高壓電極、介質管和地極組成，其中高壓電極為一根直徑為2 mm的鎢針，介質管為內徑5 mm、外徑7 mm、長度為110 mm的石英管，管外裹有銅箔并接地，等離子體射流激發區域位于鎢針和銅箔覆蓋的環隙之間；高壓交流電源由低壓直流電源和高頻逆變器組成，產生的Ue范圍為0~9 kV；空氣采集器由無刷隔膜氣泵（D50H-42H，成都海霖科技有限公司，中國）和流量計組成，提供空氣作為放電氣體，并將流速控制在3.5 L/min；測量裝置由高壓探頭（P6015A，Tektronix，美國）和示波器（TDS2024C，Tektronix，美國）組成，用于監測實時電壓波形。
圖1
大氣壓等離子體激發系統
Figure1.
Atmospheric pressure plasma excitation system
1.2 等離子體射流和等離子體活化水的獲取和使用
PJ處理實驗中，在Ue = 0、7、8、9 kV下，使用等離子體反應器對空氣進行te = 0、30、60、90、120 s的激發，在激發過程中直接對下方2 cm處腦心浸液瓊脂（brain heart infusion agar，BHIA）培養基上的S. mutans進行處理。PAW處理實驗中，在Ue = 0、7、8、9 kV下，使用等離子體反應器對9.9 mL去離子水進行te = 0、30、60、90、120 s的激活，然后將S. mutans菌液加入其中，搖勻浸泡處理10 min。
1.3 菌株和培養條件
首先將冷凍的S. mutans原液（ATCC25175，上海保藏生物技術中心，中國）解凍后，取0.1 mL原液加入3 mL無菌腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養基中，在37 ℃低氧條件下靜置培養48 h，接著取其中的1 mL菌液加入至100 mL無菌BHI培養基中，在37 ℃有氧條件下振蕩培養24 h，以菌落形成單位（colony forming units，CFU）計數法，獲得108~109 CFU/mL濃度的菌液。
1.4 等離子體射流滅菌處理
將高濃度的菌液稀釋至103~104 CFU/mL，各取0.1 mL菌液涂布于不同BHIA培養基上，將其分成以下3組：① 對照組：不作任何處理；② PJ處理Ⅰ組：在Ue = 0 kV、te = 120 s下，使用PJ直接處理；③ PJ處理Ⅱ組：在Ue = 7、8、9 kV，te = 30、60、90、120 s下，使用PJ直接處理。
1.5 等離子體活化水滅菌處理
將高濃度的菌液稀釋至106~107 CFU/mL，各取0.1 mL菌液分成以下3組：① 對照組：9.9 mL去離子水浸泡處理；② PAW處理Ⅰ組：在Ue = 0 kV，te = 120 s下，使用9.9 mL的PAW浸泡處理；③ PAW處理Ⅱ組：在Ue = 7、8、9 kV，te = 30、60、90、120 s下，使用9.9 mL的PAW浸泡處理。處理完成后分別取0.1 mL混合液涂布于BHIA培養基上。
1.6 溫度和pH測量
首先使用熱成像儀（UTi120S，優利德科技股份有限公司，中國）監測不同Ue下PJ和PAW處理區域在te = 0、120 s時的熱成像圖，然后通過熱成像圖左上角數據記錄te = 0 s時的溫度T1以及te = 120 s時的溫度T2，并計算前后溫差?T = T2 ? T1，用于定量分析PJ和PAW對S. mutans和牙齒的物理影響；使用pH計測量不同激勵條件下PAW的pH值，用于定量評估PAW對S. mutans和牙齒的化學影響。
1.7 菌落形成單位計數和滅菌率計算
將PJ和PAW處理后的BHIA培養基放入37 ℃恒溫箱中，靜置培養12 h后進行CFU計數，然后計算出相應的滅菌率，如式（1）所示，并繪制滅菌率變化曲線，通過滅菌率定量分析PJ和PAW對S. mutans的滅菌效果。
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其中，RS為滅菌率，NC為對照組菌落數，NT為實驗組菌落數。
1.8 統計學分析
統計學分析采用統計產品與服務解決方案軟件SPSS 26.0（SPSS Inc.，美國），采用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）考察不同激勵條件下PJ和PAW處理組與對照組之間S. mutans細胞濃度或存活率的差異是否具有統計學意義，事后多重比較采用最小顯著差異法（least significant difference，LSD）檢驗，P < 0.05表示差異具有統計學意義，效應值大小由科恩d值（Cohen’s d）（簡稱d值）衡量。
2 結果與討論
2.1 溫度監測結果
不同Ue下，PJ和PAW處理區域在te = 0、120 s的熱成像圖如圖2所示。既往的研究表明，等離子體放電具有熱效應，且S. mutans只有在超過60 ℃時才會失活[29-32]。
圖2
不同Ue下PJ和PAW處理區域在te = 0、120 s的熱成像圖
Figure2.
Thermograms of PJ and PAW treatment regions at te = 0, 120 s under different Ue
在PJ處理區域中，不同Ue下PJ處理后，?T > 0 ℃，且隨著Ue的增大，|?T|逐漸增大，在Ue = 9 kV時，前后溫差最大值|?T|max = 4.3 ℃。當Ue = 7、8、9 kV時，處理區域的溫度T2分別為26.8、30.2、33.9 ℃，均小于60 ℃，不會導致S. mutans死亡，而牙齒能夠耐受的溫度范圍為10～50 ℃，T2最小值T2min = 26.8 ℃>10 ℃且T2最大值T2max = 33.9 ℃<50 ℃，所以不會對牙齒造成物理損傷。
在PAW處理區域中，不同Ue下PAW處理后?T < 0 ℃，且隨著Ue的增大，|?T|逐漸減小，這是由于Ue較小時，氣泡使PAW在處理過程中散發的熱量大于熱效應增加的熱量，在Ue = 7 kV時，|?T|max = 3.9 ℃。當Ue = 7、8、9 kV時，處理區域的溫度T2分別為29.0、30.3、33.2 ℃，均小于60 ℃，不會導致S. mutans死亡，由于T2min = 29.0 ℃ > 10 ℃且T2max = 33.2 ℃ < 50 ℃，所以也不會對牙齒造成物理損傷。
由此可見，PJ和PAW在處理過程中引起的微小溫度變化不會導致S. mutans死亡，并且其處理區域的最低溫度T2min和最高溫度T2max都在牙齒的耐受范圍內，所以不會對牙齒造成物理損傷。
2.2 pH測量結果
不同Ue下PAW的pH值隨te的變化情況如圖3所示。既往的研究表明，S. mutans具有產酸和耐酸的特性，pH低于3時才會造成其死亡[33]。由圖3可知，PAW的pH值隨著Ue和te的增加呈現逐漸降低的趨勢，當Ue = 9 kV，te = 120 s時，PAW的最低pH=3.02 > 3，不會導致S. mutans死亡，而牙釉質脫礦的臨界pH值約為5.5。由圖3可知，在以下3種情況：① Ue = 7 kV且te > 90 s；② Ue = 8 kV且te > 60 s；③ Ue = 9 kV且te > 30 s時，相應的pH < 5.5，會對牙齒造成一定的腐蝕，因此PAW處理過程中引起的pH值變化不會導致S. mutans死亡，但會對牙齒表面產生一定的化學損傷。
圖3
不同Ue下PAW的pH值隨te的變化情況
Figure3.
Variation of pH value of PAW with te at different Ue
2.3 等離子體射流和等離子體活化水滅菌實驗結果
不同Ue下PJ和PAW處理后的滅菌情況和細胞濃度（te = 120 s）如圖4、圖5所示。由圖4和圖5可知，在Ue = 0 kV時，通過LSD檢驗可知，處理組與對照組之間S. mutans細胞濃度的差異都不具有統計學意義（PJ處理Ⅰ組：P = 0.911；PAW處理Ⅰ組：P = 0.203）；而在Ue = 7、8、9 kV時，S. mutans細胞濃度都不同程度地減少，通過LSD檢驗可知，處理組與對照組之間S. mutans細胞濃度的差異均具有統計學意義（P < 0.001，PJ處理Ⅱ組：d = 4.31、15.98、15.98；PAW處理Ⅱ組：d = 4.38、10.07、12.08）。由此可見，在Ue = 0 kV下，空氣激發的PJ和PAW處理后均不會導致S. mutans死亡。
圖4
不同Ue下PJ和PAW處理后的滅菌情況（te = 120 s）
Figure4.
Sterilization after PJ and PAW treatment at different Ue (te = 120 s)
圖5
不同Ue下PJ和PAW處理后的細胞濃度（te = 120 s）
Figure5.
Cell concentration after PJ and PAW treatment at different Ue (te = 120 s)
不同Ue下PJ和PAW滅菌率隨te的變化情況如圖6所示。由圖6可知，PJ和PAW的滅菌率隨Ue和te的增大都呈現逐漸升高的趨勢。
圖6
不同Ue下PJ和PAW滅菌率隨te的變化情況
Figure6.
Variation of PJ and PAW sterilization rate with te at different Ue
在PJ處理實驗中，當Ue = 7 kV且te = 60 s時，通過LSD檢驗可知，處理組與對照組之間S. mutans存活率的差異具有統計學意義（P = 0.007，d = 2.66），并且隨著Ue和te的增加，PJ對S. mutans的滅菌效果逐漸增強。在Ue ≥ 8 kV且te ≥ 30 s時，滅菌率的變化趨勢逐漸趨于平緩，當Ue = 8 kV，te = 120 s時，PJ處理可實現完全滅菌，由此可知PJ滅菌的最佳激勵電壓Ue = 8 kV，最佳激勵時間90 s < te ≤ 120 s。
在PAW處理實驗中，當Ue = 7 kV且te = 30 s時，通過LSD檢驗可知，處理組與對照組之間S. mutans存活率的差異具有統計學意義（P = 0.029，d = 1.71），并且隨著Ue和te的增加，PAW對S. mutans的滅菌效果逐漸增強。在Ue ≥ 9 kV且te ≥ 30 s時，滅菌率的變化趨勢逐漸趨于平緩，當Ue = 9 kV，te = 60 s時，PAW處理可實現完全滅菌，由此可知本實驗中PAW滅菌的最佳激勵電壓Ue = 9 kV，最佳激勵時間30 s < te ≤ 60 s。
由圖6還可知，當Ue較低（即Ue = 7 kV）時，PJ和PAW的最高滅菌率均在40%左右，這主要是因為本系統激發等離子體的臨界電壓為7 kV左右，此時激發產生的RONS數量十分有限，導致滅菌率較低。而當Ue升高到8 kV后，PJ的滅菌率在短暫的te = 30 s內便快速到達94%以上，而PAW在te <120 s時，PAW的滅菌率均低于90%，且對應的pH值均大于4.7，但當pH值低于4.7時，PAW的滅菌率均在90%以上，說明確實存在pH值約為4.7的快速滅菌臨界值，這與既往的研究一致[34-35]。當Ue升高到一定程度后，滅菌率逐漸飽和，這是由于RONS到達完全滅菌的最大需求量，滅菌率由于細菌數量接近檢出限而趨于飽和。
由此可見，PJ和PAW均對S. mutans具有較強的殺滅作用，且滅菌效果隨Ue、te的增大而逐漸增大，其中PJ只需要更小的Ue就能實現完全滅菌，而PAW則存在明顯的過渡過程，表現出對pH值強烈的依賴性。
3 結論
本文搭建了一個大氣壓等離子體激發系統，以空氣作為放電氣體，對比研究了不同激勵條件下PJ和PAW處理后的溫度、pH對S. mutans的物理化學影響以及相應的滅菌效果。本文的主要研究結論如下：
（1）PJ和PAW處理過程中最大溫升不超過4.3 ℃，此溫升不會導致S. mutans死亡，也不會對牙齒表面造成物理損傷，對S. mutans的成功滅活是低溫等離子體中活性基團作用的結果，從而實現了對S. mutans的非熱滅菌處理。
（2）PAW處理后的最低pH值為3.02，該酸性環境不會導致S. mutans死亡，但會對牙齒表面造成一定的化學損傷，為實踐應用指明了潛在風險和應注意的問題。
（3）PJ和PAW均對S. mutans具有較強的殺滅作用，且PJ和PAW的滅菌率均與Ue和te呈正相關，當Ue = 8 kV，te = 120 s時，PJ處理后可實現完全滅菌；當Ue = 9 kV，te = 60 s時，PAW處理后可實現完全滅菌。
（4）PJ的最佳滅菌參數為Ue = 8 kV且90 s < te ≤ 120 s，而PAW的最佳滅菌參數為Ue = 9 kV且30 s < te ≤ 60 s，其中PJ只需要更小的Ue就能實現完全滅菌，而PAW對pH值存在一定的依賴性，約在pH為4.7以下，PAW滅菌率在很短的te內顯著提升。
此外，相比于Emi等[17]，Ye等[18]和Li等[19]的研究，首先本研究所設計的大氣壓等離子體激發系統實現完全滅菌所需的總處理時間更短，節省了一定的時間成本，其次本文給出了PJ和PAW最佳滅菌參數的范圍，為具體實踐應用提供了參考值，最后本文增加了對PJ和PAW在處理過程中溫度和pH變化的研究，為PJ和PAW的實際應用指明了一些潛在的風險。在后續的研究中，可結合本文所獲得的研究結果，進一步對激發參數和處理過程進行優化，實現更為理想的滅菌效果并規避處理過程中的潛在危害，同時可對PJ和PAW中活性成分的作用機制進行更深入的探討。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：覃思和王閏寧參與論文的選題、實驗以及論文初稿的撰寫，李虎負責實驗方案的優化，范鎧源負責實驗設備的搭建，王港負責論文審校，張鐿議為論文提供了資助和支持。
