神經刺激器是動物機器人的核心組成部分，盡管動物機器人的控制效果受到多種因素的影響，但神經刺激器的性能對動物機器人的調控效果具有決定性作用。面向動物機器人，利用柔性印制電路板技術研制了埋入式神經刺激器，不僅實現了刺激器通過控制信號產生參數可調的雙相電流脈沖，而且對其攜帶方式、材料以及尺寸等方面也進行了優化，克服了傳統背負式以及頭插式神經刺激器存在的隱蔽性差且易感染的缺點。刺激器的靜態、離體及在體性能測試結果表明，該刺激器不僅具有精確的脈沖波形輸出能力，而且重量輕、體積小，在實驗室和室外空間環境中均具有良好的在體工作性能。該項研究對于動物機器人的應用具有較高現實意義。
引用本文： 蘇振嶺, 王東云, 齊小敏, 楊晨光, 張業鑫, 劉凱歌, 秦月, 劉新玉. 面向動物機器人的柔性埋入式神經刺激器研制. 生物醫學工程學雜志, 2023, 40(2): 327-334. doi: 10.7507/1001-5515.202211030 復制
0 引言
動物機器人也稱機器人動物、動物-機器混合系統或賽博格（cyborg）[1]，是以動物作為主體，借助先進電子設備，用電刺激等信號對動物特定神經靶點進行刺激，使之能夠按照特定的指令行動。自從Talwar等[2]研制出機器人鼠之后，動物機器人逐漸得到了人們的關注和重視，相對于傳統機器人，它具有天然的隱蔽性和自主能量供給能力。神經刺激器是動物機器人的核心組成部分，其性能直接決定了動物機器人的行為調控效果。但是目前的神經刺激器大都采用置于體外的背負式或頭插式，在實際使用時存在諸多不便，主要包括：① 植入的神經接口和刺激器之間仍然存在經皮連接，增加了傷口感染風險；② 作為身體額外增加的部分，體外刺激器會影響動物的自然活動；③ 動物會因為暴露的設備受到機械應力而招致更高的二次受傷風險；④ 裸露在動物體外的設備也會有較大的損壞風險，甚至脫落。對于背負式或頭插式刺激器存在的上述問題，刺激器的皮下植入即埋入式刺激器是一種潛在的有效解決方案。
埋入式神經刺激器的研究由來已久，早在20世紀90年代便已被提出，并且在帕金森病等神經疾病的治療中得到了使用[3-4]。針對人體使用的埋入式神經刺激器由于使用對象的特殊性及應用標準的苛刻性，體積較大且價格十分昂貴，盡管可以擁有長達數十年的工作時長，但是并不適宜在動物機器人中使用。面向動物機器人，2007年墨爾本大學Millard等[5]設計了一種可完全植入的單通道埋入式神經刺激器，刺激器產生電荷平衡的雙相電流脈沖傳送到特定神經靶點，可用于對小型實驗室嚙齒類動物神經組織的慢性刺激；2019年，首爾大學Seo團隊[6]研制了一種用于大鼠的埋入式神經刺激器，通過有線連接的方式進行刺激參數的調節，之后通過無線方式實現大鼠的遠程控制；同年，該團隊[7]評估了刺激器在鳥類運動行為調控中的可行性，最終實現了對鴿子連續運動行為的人為調控。
無論是針對大鼠等嚙齒類動物，還是針對鴿子等鳥類動物，已有的埋入式神經刺激器均采用傳統的剛性印制電路板（printed circuit board，PCB）設計制作，較硬的材質使得刺激器埋入后與動物身體組織的貼合體積和重量較大，會引起動物的不適。為了克服上述缺陷，本研究采用柔性PCB制作了一種面向動物機器人的埋入式神經刺激器。與剛性PCB相比，柔性PCB的輕質和可彎折特性使刺激器重量輕、體積小且可被折疊成符合鴿子形體工學的外形，從而更適宜皮下植入。此外，該刺激器擁有四通道的可調參數的精確脈沖波形輸出，可以有效實現對動物運動行為的神經調控。
1 刺激器的方案設計
采用模塊化設計的神經刺激器設計框圖如圖1所示。刺激器主要由電源模塊、通信模塊、主控模塊和刺激生成模塊四部分組成，具體工作流程為：首先通信模塊接收到控制端發送的參數指令，主控模塊通過串口接收并驅動刺激生成模塊產生電荷平衡的雙相恒流脈沖，后經神經接口被傳輸到靶點腦區，最終實現對動物運動行為的神經調控。
圖1
刺激器設計框圖
Figure1.
Stimulator design block diagram
1.1 電源模塊設計
由于大腦組織阻抗較高，如果使用3.3 V供電電壓的鋰電池直接作為刺激電路的電源，電路驅動能力較弱，不能達到預期的刺激效果[8]。為了解決這一問題，采用LM2731升壓芯片設計了升壓電路，將系統的工作電壓由3.3 V提升到15 V，以提高刺激電路的驅動能力以及輸出電流脈沖的穩定性。升壓電路原理圖如圖2所示。
圖2
升壓電路原理圖
Figure2.
Boost circuit schematic
由圖2可知，（R4+R5）/R6的值決定了輸出電壓的大小，具體的輸出電壓VOUT計算公式為：
 |
為了獲得15 V的電壓幅值，需要（R4 + R5）/R6 = 11.35，且LM2731升壓芯片的FB引腳必須處于高電阻狀態。為了減小輸出電流分流，R4和R5應盡可能大，根據經驗選擇R4 = 100 kΩ，R5 = 51 kΩ，R6 = 13.3 kΩ。
1.2 通信模塊設計
通信模塊我們選用商業化的ZigBee模組（Z151，無錫谷雨電子有限公司，中國），該模組具有低功耗、體積小及高可靠性的特點，完全滿足控制器與刺激器之間的無線通信需求。Z151模塊可以在活動模式和睡眠模式之間切換，以實現功耗的最小化。當刺激器通電時，它每隔3 s輪詢控制器以檢查新的刺激指令，指令以9 600 Baud/s的速率通過美國信息交換標準代碼從控制端端口發送，如果有新命令可用，通信模塊被喚醒，再次接收到指令后，通信模塊則進入正常工作模式。若在設定的時間內沒有接收到來自控制端的指令，通信模塊又會自動進入休眠狀態，此過程無需主控芯片干預。
1.3 主控模塊設計
主控模塊選用四方扁平式封裝的C8051F410芯片作為主控芯片，以完成系統的電源控制、模擬波形輸出、邏輯判斷等環節。C8051F410作為混合信號系統級芯片，有4個通用16位計數器/定時器和兩個12位電流輸出數模轉換接口。同時擁有足夠多的4字節寬的通用數字輸入輸出接口引腳供刺激器使用，并且其所有外部輸入輸出接口都可以被關閉來進行低功耗的工作。
1.4 刺激生成模塊設計
刺激生成模塊中利用主控芯片的兩個12位電流輸出數模轉換接口和4個通用16位計數器/定時器資源，設計了一款“H橋”電路，電路圖如圖3所示，主要用于產生電荷平衡的雙相恒流脈沖。與恒壓刺激相比，恒流刺激消除了動物腦阻抗變化引起的電流不穩定，更有利于長期刺激實驗[9]。
圖3
“H橋”電路原理圖
Figure3.
"H-bridge" circuit schematic
2 刺激器的制作與封裝
本文采用柔性PCB板代替剛性PCB板進行刺激器的制作。柔性PCB板以聚酰亞胺或聚酯薄膜為基材，產品構造上是由軟性銅箔基板和軟性絕緣層通過接著劑貼附后壓合而成，具有高度的可靠性和絕佳的可撓性[10]。相對于剛性PCB板，它不僅重量輕、厚度薄而且能夠折疊成符合鴿子形體工學的外形，這使皮下植入更為容易，并在植入位置的選擇方面提供了更大的靈活性。
在埋入式神經刺激器封裝中，為確保在所需的植入壽命內免受體液的影響以及具有良好的生物相容性，整個刺激器由牙科水泥密封并用醫用硅橡膠封裝。封裝刺激器之前，在超聲波清洗機中使用專用清洗溶劑進行清洗，直到在顯微鏡下觀察時沒有焊劑或其他污染物殘留。隨后將兩面涂有丙烯酸膠的發泡泡棉貼附于刺激器表面，以防止在對板子折疊的過程中出現任何空隙。然后將牙科水泥均勻涂抹在刺激器表面。待徹底凝固后，添加一層醫用級硅橡膠包裹，并將導線（CW7159，Cooner Wire，美國）與刺激器的接口處用牙科水泥密封，然后用酒精和蒸餾水沖洗，最后使用過氧化氫溶液滅菌。刺激器封裝流程如圖4所示。
圖4
刺激器封裝流程圖
Figure4.
Stimulator packaging flow chart
3 刺激器的性能測試
為了驗證刺激器的工作性能，本文從靜態性能、離體性能和在體性能三個方面對刺激器進行了測試。
3.1 靜態性能測試
在靜態性能測試中，主要針對刺激器的重量與尺寸（長×寬×高）進行了測量。在重量測試中，選用精度為0.01 g的電子分析天平（FA1004，力辰科技，中國）對刺激器進行稱重；在尺寸測試中，選用精度為0.01 mm電子數顯卡尺（111-101，三量，日本）進行刺激器的尺寸測量。
3.2 離體性能測試
離體性能測試的重點是測試控制器與刺激器之間的通信以及脈沖波形輸出的準確性。在開始測試之前，刺激器需要在生理鹽水中保存至少兩周以上用于模擬在體環境，后選擇一個2 kΩ的電阻模擬大腦的阻抗，并使用示波器（DS01102B，漢泰，中國）來記錄電阻兩端的波形。通過示波器與控制器參數對比，驗證脈沖波形輸出的準確性。
3.3 在體性能測試
在體性能測試中，以月齡6個月以上的成年鴿子為對象（450～550 g，雄雌不限），首先胸肌注射濃度為3%的戊巴比妥鈉進行麻醉（0.12 mL/100 g），待鴿子麻醉后剃掉鴿子頭部絨毛，使用濃度2%的利多卡因試劑和濃度5%的腎上腺素試劑的混合物在手術區皮下注射做進一步的局部麻醉。待疼痛反射消失后，將鴿子的頭部放置在定制的立體定位支架上。切開頭皮中線，刮除顱骨表面殘余的結締組織，根據鴿子的腦定位圖像確定腦區位置[11]，植入直徑為25.4 μm的絕緣不銹鋼電極（761000，A-M Systems，美國），之后用牙科水泥固定。最后將神經接口分別與電極和刺激器焊接在一起，并在其周圍涂抹牙科水泥進行封裝。神經接口處理好后，將導線穿過從頸部到背部的皮下隧道，把刺激器置于背部合適位置。刺激器植入電極后的手術流程圖如圖5所示。殺菌消毒后，傷口用真絲線（1/2 7*17，源利康，中國）縫合，恢復5～7天后進行實驗測試。
圖5
刺激器植入電極后的手術流程圖
Figure5.
Surgical flow chart after stimulator implantation of electrodes
在體性能測試中開展了室內和室外兩項測試實驗。在室內測試中，通過調節控制器的脈沖參數測試鴿子在實驗室環境中的人為調控效果。在室外測試中，通過對比未受刺激和電刺激狀態下鴿子的軌跡變化來檢驗刺激器在自由空間下的在體工作性能。
4 測試結果
近兩年的時間中，累計進行了149套埋入式神經刺激器的制作，并對其進行了靜態、離體和在體三方面的性能測試。
4.1 靜態性能測試結果
經測量，149個神經刺激器（含電池、Zigbee模塊）平均重量為5.2 g，總體標準差為0.4 g。平均尺寸為21 mm×17 mm×12 mm，體積的總體標準差為0.63 cm3。隨機抽取的10個刺激器的靜態性能參數如表1所示。
表1
隨機抽取的10個刺激器的靜態性能參數
Table1.
Static performance parameters of 10 randomly selected stimulators
4.2 離體性能測試結果
在電刺激脈沖的可調參數中，頻率F、脈沖個數N以及電流強度A起到關鍵作用[11]。為了測試刺激器輸出波形的準確性，在保持其他參數不變的前提下，逐次改變頻率F、脈沖個數N以及電流強度A的大小，并將輸出波形參數與波形設置參數進行對比來驗證刺激器的離體性能，測試結果如圖6所示。
圖6
脈沖隨參數改變的實測圖
Figure6.
Measured graph of pulse change with parameters
由圖6可知，隨著控制器輸入頻率F、脈沖個數N以及電流強度A大小的改變，示波器的波形輸出也隨之改變，且輸出與輸入值變化保持一致。經計算149個刺激器的輸出電流和輸入電流的絕對誤差分布于1.35~3.13 μA之間，在整個測試范圍內絕對誤差先是上升后又略降最終趨于穩定。該結果表明刺激器具有精確的脈沖波形輸出能力。
4.3 在體性能測試結果
在室內測試中，對每只鴿子分別進行三個通道的刺激。其中124只鴿子均做出相應動作，18只鴿子響應兩次調控，7只鴿子響應一次或未響應，三通道均可使用的成功率為83%。該結果表明刺激器在埋入鴿子體內的情況下仍具有優異的刺激性能。鴿子在實驗室環境下電刺激誘發的起飛和轉向行為如圖7所示。
圖7
實驗室環境下鴿子電刺激誘發行為
Figure7.
Electrically stimulated evoked behavior of pigeons in a laboratory setting
在室外測試中，以鴿子腦區是否受到電刺激作為變量，通過對比未受刺激和電刺激狀態下鴿子的軌跡變化，檢驗刺激器自由空間下的在體工作性能。經測試，上述124只三通道均可使用的鴿子在沒有受到電刺激的情況下，121只鴿子均直接飛回鴿巢，而在對鴿子大腦施加刺激后，其中113只鴿子按照規定軌跡飛回巢位，刺激成功率為91%，占總體的76%。該結果表明，刺激器在自由空間下仍然具有良好的在體性能。
圖8為上述113只鴿子中隨機挑選的3只鴿子在自由空間下電刺激誘發的行為變化。不同的刺激誘發行為用不同的標記符號區別標注，右側中腦網狀結構（formation reticularis medialis mesencephali，FRM）刺激用▲表示，左側FRM刺激用■表示，強迫起飛用★表示，刺激無效用●表示。圖中的每一個點都對應于一個有效的刺激狀態，刺激誘發的行為變化用方框進行了標注和突出顯示。
圖8
自由空間下鴿子電刺激誘發行為
Figure8.
Electrically stimulated evoked behavior in pigeons under free space
5 討論與結論
刺激器底板材料的選擇和封裝是目前限制刺激器微型化的主要原因之一。傳統剛性PCB板雖然有著成本低廉、結構穩定等優點，但是其材質的影響增加了埋入后動物的不適感。為了克服這一缺點，本文利用柔性PCB工藝可將神經刺激器折疊成符合鴿子形體工學的形狀，與此同時縮小了它的尺寸和重量，為神經刺激器向埋入式、微型化以及高可靠方向發展奠定了良好的基礎。此外，電池也是限制刺激器微型化的瓶頸之一，目前還缺乏微型高密度電池以保證刺激器埋入后能有更長的工作時間。針對這個問題，植入式設備的能量收集是很好的解決方案[12-13]，這將是本研究下一步的優化方向。
動物機器人對于刺激器的重量有著嚴格要求。成年健康鴿子的體重在480 g左右，鴿子在起飛時的最大承載力為其體重的25%～27%[14]，由表2[7, 15-17]可知，本文設計的刺激器重量為5.2 g，不足鴿子體重的5%，且低于同類產品。與置于體外的背負式或頭插式刺激器相比，埋入式神經刺激器有更嚴苛的要求。在刺激器埋入前，我們對刺激器的防撞性、在體防水性和防腐蝕性等都進行了嚴格測試，但是在實際操作中仍然出現了很多問題。比如，經過一段時間的埋入后，刺激器與神經接口之間的電纜導線出現了粉碎性的折斷，可能原因是隨著動物脖子扭動次數的增加，導線出現金屬疲勞損傷，最終導致物理性折斷。動物對植入物的反應是未知的，如何提高埋入式刺激器的長期工作穩定性還有很多工作要做。
表2
同類產品對比
Table2.
Comparison of similar products
面向動物機器人，本文研制了一款柔性埋入式神經刺激器，不僅實現了通過控制信號產生參數可調的雙相電流脈沖，還綜合考慮了刺激器的攜帶方式、材料以及尺寸等方面的優化。具體總結如下：① 神經刺激器采用皮下植入的攜帶方式，克服了傳統背負式或頭插式神經刺激器存在的易感染、隱蔽性差等缺點，不僅對刺激器起到了很好的保護作用，而且提高了動物機器人的隱蔽性；② 神經刺激器采用模塊化獨立設計，并在元器件選擇上均采用最小的封裝，不僅保證了刺激器的電氣效應而且滿足了其微型化的設計標準；③ 神經刺激器采用柔性PCB板代替剛性PCB板，不僅重量輕，而且可將之折疊成符合鴿子形體工學的形狀，這使外科植入更為容易，并為植入位置的選擇提供了更大的靈活性；④ 刺激器的靜態、離體及在體實驗測試結果表明，該刺激器不僅具有精確的脈沖輸出能力，而且在埋入動物體內后仍然具有穩定的工作性能。這不僅對于動物機器人的應用具有較高實際意義，而且對于癲癇等神經性疾病的腦深度刺激也具有一定的參考價值[18-20]。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：蘇振嶺負責軟硬件平臺搭建以及論文撰寫、修訂。王東云負責動物實驗的設計與指導。齊小敏負責軟件平臺指導與維護。楊晨光負責實驗平臺的搭建。張業鑫負責硬件平臺的制作與維護。劉凱歌負責實驗動物的飼養與培育。秦月負責實驗數據的的記錄。劉新玉負責研究計劃安排、動物實驗手術以及論文審閱修訂。
倫理聲明：本研究通過了黃淮學院生物醫學倫理委員會的審批（批文編號：LL20220003）。
0 引言
動物機器人也稱機器人動物、動物-機器混合系統或賽博格（cyborg）[1]，是以動物作為主體，借助先進電子設備，用電刺激等信號對動物特定神經靶點進行刺激，使之能夠按照特定的指令行動。自從Talwar等[2]研制出機器人鼠之后，動物機器人逐漸得到了人們的關注和重視，相對于傳統機器人，它具有天然的隱蔽性和自主能量供給能力。神經刺激器是動物機器人的核心組成部分，其性能直接決定了動物機器人的行為調控效果。但是目前的神經刺激器大都采用置于體外的背負式或頭插式，在實際使用時存在諸多不便，主要包括：① 植入的神經接口和刺激器之間仍然存在經皮連接，增加了傷口感染風險；② 作為身體額外增加的部分，體外刺激器會影響動物的自然活動；③ 動物會因為暴露的設備受到機械應力而招致更高的二次受傷風險；④ 裸露在動物體外的設備也會有較大的損壞風險，甚至脫落。對于背負式或頭插式刺激器存在的上述問題，刺激器的皮下植入即埋入式刺激器是一種潛在的有效解決方案。
埋入式神經刺激器的研究由來已久，早在20世紀90年代便已被提出，并且在帕金森病等神經疾病的治療中得到了使用[3-4]。針對人體使用的埋入式神經刺激器由于使用對象的特殊性及應用標準的苛刻性，體積較大且價格十分昂貴，盡管可以擁有長達數十年的工作時長，但是并不適宜在動物機器人中使用。面向動物機器人，2007年墨爾本大學Millard等[5]設計了一種可完全植入的單通道埋入式神經刺激器，刺激器產生電荷平衡的雙相電流脈沖傳送到特定神經靶點，可用于對小型實驗室嚙齒類動物神經組織的慢性刺激；2019年，首爾大學Seo團隊[6]研制了一種用于大鼠的埋入式神經刺激器，通過有線連接的方式進行刺激參數的調節，之后通過無線方式實現大鼠的遠程控制；同年，該團隊[7]評估了刺激器在鳥類運動行為調控中的可行性，最終實現了對鴿子連續運動行為的人為調控。
無論是針對大鼠等嚙齒類動物，還是針對鴿子等鳥類動物，已有的埋入式神經刺激器均采用傳統的剛性印制電路板（printed circuit board，PCB）設計制作，較硬的材質使得刺激器埋入后與動物身體組織的貼合體積和重量較大，會引起動物的不適。為了克服上述缺陷，本研究采用柔性PCB制作了一種面向動物機器人的埋入式神經刺激器。與剛性PCB相比，柔性PCB的輕質和可彎折特性使刺激器重量輕、體積小且可被折疊成符合鴿子形體工學的外形，從而更適宜皮下植入。此外，該刺激器擁有四通道的可調參數的精確脈沖波形輸出，可以有效實現對動物運動行為的神經調控。
1 刺激器的方案設計
采用模塊化設計的神經刺激器設計框圖如圖1所示。刺激器主要由電源模塊、通信模塊、主控模塊和刺激生成模塊四部分組成，具體工作流程為：首先通信模塊接收到控制端發送的參數指令，主控模塊通過串口接收并驅動刺激生成模塊產生電荷平衡的雙相恒流脈沖，后經神經接口被傳輸到靶點腦區，最終實現對動物運動行為的神經調控。
圖1
刺激器設計框圖
Figure1.
Stimulator design block diagram
1.1 電源模塊設計
由于大腦組織阻抗較高，如果使用3.3 V供電電壓的鋰電池直接作為刺激電路的電源，電路驅動能力較弱，不能達到預期的刺激效果[8]。為了解決這一問題，采用LM2731升壓芯片設計了升壓電路，將系統的工作電壓由3.3 V提升到15 V，以提高刺激電路的驅動能力以及輸出電流脈沖的穩定性。升壓電路原理圖如圖2所示。
圖2
升壓電路原理圖
Figure2.
Boost circuit schematic
由圖2可知，（R4+R5）/R6的值決定了輸出電壓的大小，具體的輸出電壓VOUT計算公式為：
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為了獲得15 V的電壓幅值，需要（R4 + R5）/R6 = 11.35，且LM2731升壓芯片的FB引腳必須處于高電阻狀態。為了減小輸出電流分流，R4和R5應盡可能大，根據經驗選擇R4 = 100 kΩ，R5 = 51 kΩ，R6 = 13.3 kΩ。
1.2 通信模塊設計
通信模塊我們選用商業化的ZigBee模組（Z151，無錫谷雨電子有限公司，中國），該模組具有低功耗、體積小及高可靠性的特點，完全滿足控制器與刺激器之間的無線通信需求。Z151模塊可以在活動模式和睡眠模式之間切換，以實現功耗的最小化。當刺激器通電時，它每隔3 s輪詢控制器以檢查新的刺激指令，指令以9 600 Baud/s的速率通過美國信息交換標準代碼從控制端端口發送，如果有新命令可用，通信模塊被喚醒，再次接收到指令后，通信模塊則進入正常工作模式。若在設定的時間內沒有接收到來自控制端的指令，通信模塊又會自動進入休眠狀態，此過程無需主控芯片干預。
1.3 主控模塊設計
主控模塊選用四方扁平式封裝的C8051F410芯片作為主控芯片，以完成系統的電源控制、模擬波形輸出、邏輯判斷等環節。C8051F410作為混合信號系統級芯片，有4個通用16位計數器/定時器和兩個12位電流輸出數模轉換接口。同時擁有足夠多的4字節寬的通用數字輸入輸出接口引腳供刺激器使用，并且其所有外部輸入輸出接口都可以被關閉來進行低功耗的工作。
1.4 刺激生成模塊設計
刺激生成模塊中利用主控芯片的兩個12位電流輸出數模轉換接口和4個通用16位計數器/定時器資源，設計了一款“H橋”電路，電路圖如圖3所示，主要用于產生電荷平衡的雙相恒流脈沖。與恒壓刺激相比，恒流刺激消除了動物腦阻抗變化引起的電流不穩定，更有利于長期刺激實驗[9]。
圖3
“H橋”電路原理圖
Figure3.
"H-bridge" circuit schematic
2 刺激器的制作與封裝
本文采用柔性PCB板代替剛性PCB板進行刺激器的制作。柔性PCB板以聚酰亞胺或聚酯薄膜為基材，產品構造上是由軟性銅箔基板和軟性絕緣層通過接著劑貼附后壓合而成，具有高度的可靠性和絕佳的可撓性[10]。相對于剛性PCB板，它不僅重量輕、厚度薄而且能夠折疊成符合鴿子形體工學的外形，這使皮下植入更為容易，并在植入位置的選擇方面提供了更大的靈活性。
在埋入式神經刺激器封裝中，為確保在所需的植入壽命內免受體液的影響以及具有良好的生物相容性，整個刺激器由牙科水泥密封并用醫用硅橡膠封裝。封裝刺激器之前，在超聲波清洗機中使用專用清洗溶劑進行清洗，直到在顯微鏡下觀察時沒有焊劑或其他污染物殘留。隨后將兩面涂有丙烯酸膠的發泡泡棉貼附于刺激器表面，以防止在對板子折疊的過程中出現任何空隙。然后將牙科水泥均勻涂抹在刺激器表面。待徹底凝固后，添加一層醫用級硅橡膠包裹，并將導線（CW7159，Cooner Wire，美國）與刺激器的接口處用牙科水泥密封，然后用酒精和蒸餾水沖洗，最后使用過氧化氫溶液滅菌。刺激器封裝流程如圖4所示。
圖4
刺激器封裝流程圖
Figure4.
Stimulator packaging flow chart
3 刺激器的性能測試
為了驗證刺激器的工作性能，本文從靜態性能、離體性能和在體性能三個方面對刺激器進行了測試。
3.1 靜態性能測試
在靜態性能測試中，主要針對刺激器的重量與尺寸（長×寬×高）進行了測量。在重量測試中，選用精度為0.01 g的電子分析天平（FA1004，力辰科技，中國）對刺激器進行稱重；在尺寸測試中，選用精度為0.01 mm電子數顯卡尺（111-101，三量，日本）進行刺激器的尺寸測量。
3.2 離體性能測試
離體性能測試的重點是測試控制器與刺激器之間的通信以及脈沖波形輸出的準確性。在開始測試之前，刺激器需要在生理鹽水中保存至少兩周以上用于模擬在體環境，后選擇一個2 kΩ的電阻模擬大腦的阻抗，并使用示波器（DS01102B，漢泰，中國）來記錄電阻兩端的波形。通過示波器與控制器參數對比，驗證脈沖波形輸出的準確性。
3.3 在體性能測試
在體性能測試中，以月齡6個月以上的成年鴿子為對象（450～550 g，雄雌不限），首先胸肌注射濃度為3%的戊巴比妥鈉進行麻醉（0.12 mL/100 g），待鴿子麻醉后剃掉鴿子頭部絨毛，使用濃度2%的利多卡因試劑和濃度5%的腎上腺素試劑的混合物在手術區皮下注射做進一步的局部麻醉。待疼痛反射消失后，將鴿子的頭部放置在定制的立體定位支架上。切開頭皮中線，刮除顱骨表面殘余的結締組織，根據鴿子的腦定位圖像確定腦區位置[11]，植入直徑為25.4 μm的絕緣不銹鋼電極（761000，A-M Systems，美國），之后用牙科水泥固定。最后將神經接口分別與電極和刺激器焊接在一起，并在其周圍涂抹牙科水泥進行封裝。神經接口處理好后，將導線穿過從頸部到背部的皮下隧道，把刺激器置于背部合適位置。刺激器植入電極后的手術流程圖如圖5所示。殺菌消毒后，傷口用真絲線（1/2 7*17，源利康，中國）縫合，恢復5～7天后進行實驗測試。
圖5
刺激器植入電極后的手術流程圖
Figure5.
Surgical flow chart after stimulator implantation of electrodes
在體性能測試中開展了室內和室外兩項測試實驗。在室內測試中，通過調節控制器的脈沖參數測試鴿子在實驗室環境中的人為調控效果。在室外測試中，通過對比未受刺激和電刺激狀態下鴿子的軌跡變化來檢驗刺激器在自由空間下的在體工作性能。
4 測試結果
近兩年的時間中，累計進行了149套埋入式神經刺激器的制作，并對其進行了靜態、離體和在體三方面的性能測試。
4.1 靜態性能測試結果
經測量，149個神經刺激器（含電池、Zigbee模塊）平均重量為5.2 g，總體標準差為0.4 g。平均尺寸為21 mm×17 mm×12 mm，體積的總體標準差為0.63 cm3。隨機抽取的10個刺激器的靜態性能參數如表1所示。
表1
隨機抽取的10個刺激器的靜態性能參數
Table1.
Static performance parameters of 10 randomly selected stimulators
4.2 離體性能測試結果
在電刺激脈沖的可調參數中，頻率F、脈沖個數N以及電流強度A起到關鍵作用[11]。為了測試刺激器輸出波形的準確性，在保持其他參數不變的前提下，逐次改變頻率F、脈沖個數N以及電流強度A的大小，并將輸出波形參數與波形設置參數進行對比來驗證刺激器的離體性能，測試結果如圖6所示。
圖6
脈沖隨參數改變的實測圖
Figure6.
Measured graph of pulse change with parameters
由圖6可知，隨著控制器輸入頻率F、脈沖個數N以及電流強度A大小的改變，示波器的波形輸出也隨之改變，且輸出與輸入值變化保持一致。經計算149個刺激器的輸出電流和輸入電流的絕對誤差分布于1.35~3.13 μA之間，在整個測試范圍內絕對誤差先是上升后又略降最終趨于穩定。該結果表明刺激器具有精確的脈沖波形輸出能力。
4.3 在體性能測試結果
在室內測試中，對每只鴿子分別進行三個通道的刺激。其中124只鴿子均做出相應動作，18只鴿子響應兩次調控，7只鴿子響應一次或未響應，三通道均可使用的成功率為83%。該結果表明刺激器在埋入鴿子體內的情況下仍具有優異的刺激性能。鴿子在實驗室環境下電刺激誘發的起飛和轉向行為如圖7所示。
圖7
實驗室環境下鴿子電刺激誘發行為
Figure7.
Electrically stimulated evoked behavior of pigeons in a laboratory setting
在室外測試中，以鴿子腦區是否受到電刺激作為變量，通過對比未受刺激和電刺激狀態下鴿子的軌跡變化，檢驗刺激器自由空間下的在體工作性能。經測試，上述124只三通道均可使用的鴿子在沒有受到電刺激的情況下，121只鴿子均直接飛回鴿巢，而在對鴿子大腦施加刺激后，其中113只鴿子按照規定軌跡飛回巢位，刺激成功率為91%，占總體的76%。該結果表明，刺激器在自由空間下仍然具有良好的在體性能。
圖8為上述113只鴿子中隨機挑選的3只鴿子在自由空間下電刺激誘發的行為變化。不同的刺激誘發行為用不同的標記符號區別標注，右側中腦網狀結構（formation reticularis medialis mesencephali，FRM）刺激用▲表示，左側FRM刺激用■表示，強迫起飛用★表示，刺激無效用●表示。圖中的每一個點都對應于一個有效的刺激狀態，刺激誘發的行為變化用方框進行了標注和突出顯示。
圖8
自由空間下鴿子電刺激誘發行為
Figure8.
Electrically stimulated evoked behavior in pigeons under free space
5 討論與結論
刺激器底板材料的選擇和封裝是目前限制刺激器微型化的主要原因之一。傳統剛性PCB板雖然有著成本低廉、結構穩定等優點，但是其材質的影響增加了埋入后動物的不適感。為了克服這一缺點，本文利用柔性PCB工藝可將神經刺激器折疊成符合鴿子形體工學的形狀，與此同時縮小了它的尺寸和重量，為神經刺激器向埋入式、微型化以及高可靠方向發展奠定了良好的基礎。此外，電池也是限制刺激器微型化的瓶頸之一，目前還缺乏微型高密度電池以保證刺激器埋入后能有更長的工作時間。針對這個問題，植入式設備的能量收集是很好的解決方案[12-13]，這將是本研究下一步的優化方向。
動物機器人對于刺激器的重量有著嚴格要求。成年健康鴿子的體重在480 g左右，鴿子在起飛時的最大承載力為其體重的25%～27%[14]，由表2[7, 15-17]可知，本文設計的刺激器重量為5.2 g，不足鴿子體重的5%，且低于同類產品。與置于體外的背負式或頭插式刺激器相比，埋入式神經刺激器有更嚴苛的要求。在刺激器埋入前，我們對刺激器的防撞性、在體防水性和防腐蝕性等都進行了嚴格測試，但是在實際操作中仍然出現了很多問題。比如，經過一段時間的埋入后，刺激器與神經接口之間的電纜導線出現了粉碎性的折斷，可能原因是隨著動物脖子扭動次數的增加，導線出現金屬疲勞損傷，最終導致物理性折斷。動物對植入物的反應是未知的，如何提高埋入式刺激器的長期工作穩定性還有很多工作要做。
表2
同類產品對比
Table2.
Comparison of similar products
面向動物機器人，本文研制了一款柔性埋入式神經刺激器，不僅實現了通過控制信號產生參數可調的雙相電流脈沖，還綜合考慮了刺激器的攜帶方式、材料以及尺寸等方面的優化。具體總結如下：① 神經刺激器采用皮下植入的攜帶方式，克服了傳統背負式或頭插式神經刺激器存在的易感染、隱蔽性差等缺點，不僅對刺激器起到了很好的保護作用，而且提高了動物機器人的隱蔽性；② 神經刺激器采用模塊化獨立設計，并在元器件選擇上均采用最小的封裝，不僅保證了刺激器的電氣效應而且滿足了其微型化的設計標準；③ 神經刺激器采用柔性PCB板代替剛性PCB板，不僅重量輕，而且可將之折疊成符合鴿子形體工學的形狀，這使外科植入更為容易，并為植入位置的選擇提供了更大的靈活性；④ 刺激器的靜態、離體及在體實驗測試結果表明，該刺激器不僅具有精確的脈沖輸出能力，而且在埋入動物體內后仍然具有穩定的工作性能。這不僅對于動物機器人的應用具有較高實際意義，而且對于癲癇等神經性疾病的腦深度刺激也具有一定的參考價值[18-20]。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：蘇振嶺負責軟硬件平臺搭建以及論文撰寫、修訂。王東云負責動物實驗的設計與指導。齊小敏負責軟件平臺指導與維護。楊晨光負責實驗平臺的搭建。張業鑫負責硬件平臺的制作與維護。劉凱歌負責實驗動物的飼養與培育。秦月負責實驗數據的的記錄。劉新玉負責研究計劃安排、動物實驗手術以及論文審閱修訂。
倫理聲明：本研究通過了黃淮學院生物醫學倫理委員會的審批（批文編號：LL20220003）。
