類器官是在體外通過細胞自組織生長而形成的三維結構，它具有許多與相應在體器官相類似的結構和功能。類器官培養技術發展迅速，起源細胞類型豐富，但是現有技術培養的類器官和真正的器官還具有很大差別，限制了類器官的廣泛應用。限制類器官的主要問題有組織結構不成熟和生長受限，而缺少功能性血管系統則是根本原因，如何在類器官模型中發展血管系統已成為亟待解決的問題。本文主要綜述了類器官的起源細胞以及類器官血管化的研究進展，為后續研究提供了線索。
引用本文： 沈鈞怡, 歐陽智, 鐘健, 龍怡岑, 孫譽珈, 曾燁. 類器官血管化的研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2023, 40(4): 625-631. doi: 10.7507/1001-5515.202211011 復制
0 引言
類器官是源自干細胞或器官祖細胞的三維細胞聚集體，它可以在體外模擬器官的三維空間結構和生理功能特征[1]。類器官有幾個重要的特征：首先，它必須是包含一種以上細胞類型的器官模型；第二，它應該能展現一些特定于該器官的功能；第三，細胞應該類似于器官本身進行自組織[2]。
相較于傳統的二維細胞培養模型，在三維環境中培養的類器官通過高度復雜的細胞與細胞以及細胞與細胞外基質的相互作用來調節細胞行為和器官發育，從而可以更加真實地模擬組織的結構和功能[3]。
類器官主要用于人類遺傳疾病的建模和治療策略的開發。類器官可模擬出生缺陷[4]、癌癥[5]、傳染病[6]、代謝性疾病[7]等疾病條件下器官發育和疾病發生發展進程。血管類器官已被用于糖尿病血管功能障礙的相關通路研究[7]。器官芯片未來有望替代小白鼠等動物模型，用于藥物篩選、藥物毒理和藥理作用研究，實現個體化治療。
但是，類器官的研究仍處于起步探索階段。類器官模型面臨的一個主要問題是生長受到限制，很多類器官大小僅有幾毫米，功能不成熟，類似于胚胎或胎兒器官而不是成人器官。類器官停止發育的主要原因被認為是血管系統的缺乏。血管系統是營養物質、氧氣和代謝廢物運輸的通道，在類器官發育中有重要作用[8]。如果沒有血管系統的灌注，三維培養的類器官只能依靠被動擴散來交換營養、氧氣和代謝廢物，但是，直徑超過200～400 μm以后，細胞將無法通過被動擴散獲得足夠的氧氣和營養，導致類器官中心區域的細胞壞死，干擾其正常發育[9]。體外接種在多孔支架上的大鼠成骨細胞會形成厚度不超過0.2 mm的活組織，胰島細胞與毛細血管間距離一旦大于0.1 mm就無法存活[10]。大于150 μm厚度的腦切片培養物，由于其循環系統被破壞后營養供應和氧氣擴散受限，導致組織缺血以至于最終壞死[9]。部分類器官在體移植后可以在宿主體內血管化。體外研究表明，具有血管網絡的類器官，其結構與功能與在體器官更為接近[11]。血管化的人類皮質類器官的功能較未血管化時更加成熟，并且獲得了更好的血腦屏障特性[12]。將未血管化的腦類器官移植到小鼠大腦內，發展出功能性的血管網絡后，軸突生長更為明顯，可以對麻醉觸發的生理刺激做出反應，說明類器官在體內血管化以后更加成熟[11]。類器官與宿主血管系統形成功能性吻合后功能會更加成熟，也表明了功能性血管系統對類器官構建的重要性。如何在類器官模型中發展血管系統已成為亟待解決的問題。本文綜述了用于類器官構建的起源細胞，以及類器官血管化的相關研究進展。
1 類器官的起源細胞
起源細胞類型決定了類器官的最終特征[13]。不同的起源細胞類型遵循不同的路徑，參與不同的發育階段[14]，因此在構建類器官時，選擇恰當的起源細胞群尤為重要。
1.1 干細胞
1.1.1 多能干細胞
多能干細胞（pluripotent stem cells，PSCs）具有自我更新和分化能力，可以相應地分化為外胚層、中胚層或內胚層的細胞[15]，能在體外無限擴增，是類器官的主要細胞來源[8]。PSCs包括胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）和誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）。目前有研究已利用iPSCs成功構建了大腦[16]、腎臟[17]、心臟[18]、胃[19]、皮膚[20]等類器官，也有研究利用ESCs構建了視杯[21]、皮質[22]、大腦[12]、腸道[23]、腎臟[24]等類器官。即使iPSCs和ESCs都可以用來構建類器官，但是事實上iPSCs應用得更為廣泛，因為它來源于體細胞，消除了ESCs涉及的倫理問題[25]。
在由PSCs誘導生成的類器官中，由于PSCs是未分化的干細胞，要進行增殖和分化，所以在此種類器官培養時一些信號通路就尤為重要，比如Wnt/β-catenin信號通路和轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路。其中，Wnt/β-catenin信號通路激活是哺乳動物成體干細胞自我更新和擴增所必不可少的[26]；而TGF-β信號通路可以通過激活ALKs/Smads誘導干細胞分化[27]。除了這些必要的信號分子，PSCs還需要一些特定的信號分子來誘導分化成相應類器官的組成細胞。
在腦類器官中，由ESCs衍生的腦類器官可以從具有低bFGF和ROCK抑制劑的培養基中培養獲得[22]。Cakir等[12]證明了轉錄因子人類ETS變體2的表達可以誘導人ESCs生成腦類器官，并且可以重新編程為內皮細胞，從而生成血管化腦類器官。
在腎臟類器官中，產生最終自組織的腎祖細胞群的信號通路除了Wnt還有成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）等[28]。Morizane等[17]通過GSK-3β抑制劑CHIR99201和骨形態發生蛋白-4（bone morphogenetic protein-4，BMP-4）抑制劑將hESCs或PSCs誘導生成腎祖細胞，最終產生了由多個腎小室組成的腎臟類器官。
在胃類器官中，使用激活素處理hPSCs可以生成定形內胚層，隨后添加BMP抑制劑和FGF、Wnt激活劑后形成前腸，再經視黃酸處理后分化為后前腸，最后在高濃度的表皮細胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）作用下形成胃類器官[19]。
在皮膚類器官中，Lee等通過逐步調節TGF-β和FGF信號通路，將由hiPSCs聚集成的球形細胞誘導分化為顱骨上皮細胞和神經嵴細胞。之后在4～5個月內，觀察到了由分層表皮、富含脂肪的真皮和帶有皮脂腺的色素毛囊組成的囊腫樣皮膚類器官[20]。
1.1.2 成體干細胞或祖細胞
雖然PSCs是類器官構建的主要起源細胞，但成體干細胞（adult stem cells，ASCs）也可以在特異性生長因子混合物的作用下，構建其相應原發組織的類器官模型。ASCs產生的類器官在整體結構、分化細胞類型和功能特異性方面也與相應組織有一定的相似性[29-30]。
2009年利用ASCs構建了小鼠小腸隱窩絨毛類器官[31]，后續許多ASCs衍生的類器官被快速建立。目前已經有腸道[32]、腎小管[33]、脂肪[34]等由ASCs衍生的類器官。有研究發現，來自受損小鼠肝臟的LGR5+肝干細胞可以在體外擴增生長產生肝臟類器官，這種類器官可以在體外分化，并在移植到體內時產生功能性肝細胞[35]。也有人把羊膜干細胞、間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）和人臍靜脈內皮細胞在三維共培養系統中組合生成肝臟類器官[36]。Pleguezuelos-Manzano等[37]建立了一種從小腸或結腸的新鮮活組織中由人類腸道ASCs衍生的類器官培養物的方法。該方法通過使用基底膜提取物將組織解離成小的上皮碎片，將這些碎片嵌入到細胞外基質，然后補充含有生長因子的培養基以維持類器官的生長。
祖細胞和干細胞相似，存在于所有成人組織中。干細胞產生祖細胞，與祖細胞的區別在于它們通過不對稱細胞分裂過程進行自我更新或自我再生的能力。祖細胞的自我更新能力有限，致力于向不同或更分化的表型發展[10]。類器官只有少數來自祖細胞，尤其是胎兒祖細胞。比如從小鼠胎兒（胚胎10.5天）背胰分離的細胞產生胰腺類器官[38]，從人類胎兒腸組織分離的細胞產生胎兒型腸類器官[39]，從大鼠和小鼠的胎兒腎臟分離腎祖細胞產生種間嵌合腎類器官[40]，以及由小鼠前列腺上皮祖細胞生成的前列腺類器官[41]。
1.1.3 間充質干細胞
MSCs通常來源于骨髓或脂肪[42]，可以分化為多種組織類型，包括脂肪[43]、骨骼[44]、平滑肌和軟骨[45]。
在類器官的構建中，MSCs可與其他細胞一起構建類器官。如MSCs可與原代肝細胞共培養構建肝類器官。原代肝細胞雖然具有較高的功能，但在體外培養時無法維持其功能。當MSCs與肝細胞共培養時，MSCs可增強肝細胞功能并維持肝細胞代謝[46]。在肺類器官中，MSCs可以與肺祖細胞共培養，結果表明MSCs的添加可以促進肺泡的分化[47]。MSCs除了以上作用，它們還可以與內皮細胞或微血管一起促進類器官的血管化。比如在骨髓來源的MSCs誘導分化脂肪類器官的過程中，植入的微血管在MSCs協助下可以更好地促進類器官的血管化[48]。
已有實驗表明，骨髓源性MSCs通過三維培養及成骨分化可以形成骨的類器官，并可以植入機體發揮特定的作用[49]。這種骨類器官模型的構建，不僅可以為骨質疏松等相關疾病研究提供更多方法，還可在骨組織移植及修復等組織工程學中發揮重要作用。
來自骨髓或脂肪組織的MSCs具有來源受限和侵入性等缺點，所以研究人員發現可以用臍帶血單核細胞作為MSCs的替代來源。Bhang等[42]使用懸滴法從源自人類臍帶血的MSCs中得到了球體結構，移植到小鼠體內后，發現球體顯著增加了小鼠缺血肢體中微血管和平滑肌α-肌動蛋白陽性血管的數量，并減輕了肢體的壞死。因此提示，發展類器官促進新生血管形成有利于組織修復。
1.2 非干細胞
1.2.1 癌細胞
由于遺傳和環境因素，在正常細胞中積累的突變會導致癌癥的發展。要了解包括腫瘤異質性在內的癌癥生物學，并將這些知識進行臨床轉化，需要恰當的臨床前癌癥模型，因此，隨著類器官技術的發展與成熟，類器官在癌癥模型方面得到了越來越廣泛的應用[50]。腫瘤類器官可以從離體腫瘤組織中產生，并在特定條件下擴增[51]。
最近已有研究成功地利用來源于結直腸癌[52]、乳腺癌[53]、膠質母細胞瘤[54]等患者的癌細胞建立了腫瘤類器官。患者活檢和切除組織可以發展成模仿原始癌組織的類器官。Tindle等[55]將肺組織解離獲得碎片，通過Wnt3、R-spondin和Noggin等因子誘導，產生了具有近端氣道和遠端肺泡上皮細胞的成人肺類器官。Cheaito等[5]利用前列腺癌患者的新鮮原代組織標本，成功獲得了前列腺癌類器官。
1.2.2 其他細胞
類器官除了上述細胞來源以外，還有一些其他非干細胞來源，這些細胞可能是終末分化細胞。Hallett等[56]利用從未用于肝移植的人類肝臟中提取的人類膽管上皮細胞，構建了膽管類器官模型。有研究表明，綠蜥蜴尾巴胚芽的成纖維細胞結締組織細胞，可形成微量胚芽類器官，并在體外產生軟骨[57]。
總體而言，iPSCs是類器官構建最常見的起源細胞，其技術也相對成熟。但是根據特定的需求，不同類型的細胞如腫瘤細胞等也開始被用作起源細胞（見表1），但相關技術還不夠成熟。
表1
類器官的起源細胞類型及血管化方法
Table1.
Origin cell types and vascularization methods of organoids
2 類器官血管化及其方法
本部分對類器官的血管化及其方法的研究進展進行了綜述。
2.1 利用血管內皮細胞血管化
在類器官中，預血管化的常用手段是利用血管內皮細胞（endothelial cells，ECs）使類器官中產生血管，不同起源細胞的類器官利用ECs血管化的方法也有所不同（見表1）。當前，將ECs與起源細胞共培養，已成功獲得了肝臟、大腦、腎臟、心臟等血管化類器官，形成了CD31+的血管網絡，使類器官移植到體內后可以存活更長時間。在肝臟類器官中，當人臍靜脈血管內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）與iPSCs誘導的肝內胚層細胞（induced pluripotent stem cells-hepatic endoderm cells，iPSC-HEs）共培養時，HUVECs形成被iPSC-HEs包圍的具有CD31+的管狀結構；同樣將MSCs與iPSC-HEs共培養也可以形成被iPSC-HEs包圍的具有CD31+的管狀結構。研究還發現iPSC-HEs只有與非實質細胞（如HUVECs 和MSCs）表面接觸時才能形成有三維結構的肝類器官[58]。還有研究表明，將由hiPSCs衍生的iPSC-HEs、HUVECs和MSCs共培養，形成肝芽后移植到預先形成的免疫缺陷小鼠的顱窗中，發現肝芽在移植48 h后迅速與受體血管連接形成功能性血管網絡。但是在沒有內皮細胞的情況下移植的人類iPSC-HEs未能血管化和存活[59]。在腎臟類器官中，外源性內皮細胞（如HUVECs或人腎小球微血管內皮細胞）與源于hPSCs的腎類器官共培養時，類器官內可形成血管網絡[60]。
研究還報道，除與類器官起源細胞共培養外，內皮細胞與組織碎片共培養，也可以迅速形成具有血管網絡的類器官，這些組織包括胰島、腦碎片、心臟碎片、腸碎片、腎臟碎片、肝臟碎片、肺碎片，甚至iPSCs的球狀體[61]。
此外，利用類器官起源細胞的多向分化能力，也可直接形成血管化的類器官。通過這種方法，目前已成功生成了大腦、皮質、血管等血管化類器官。在腦類器官中，Pham等[16]誘導hiPSCs生成全腦類器官，同時誘導iPSCs分化為ECs，實驗發現只有含有ECs的類器官才具有CD31+的網狀結構，且毛細血管已滲透到類器官的中心。而非血管化全腦類器官在移植到小鼠體內2周后，就無法存活。
在人類皮質類器官中，Cakir等[12]誘導ESCs生成了皮質類器官，并通過轉錄因子人類ETS變體2使ESCs分化為ECs，結果發現皮質類器官中形成了復雜的血管樣網絡，形成了類似于早期產前大腦的血管系統，從而促進了類器官功能的成熟。
Wimmer等[62]通過誘導hPSCs生成了由血管內皮細胞和周細胞組成的人類血管類器官，將它移植到免疫功能低下小鼠的腎包膜中，可以形成一個穩定且功能強大的人類脈管系統，其穩定時間超過6個月，期間不需要聯合移植小鼠MSCs。
2.2 利用機械力血管化
血管系統的在體發育受到各種機械力信號的調控，主要包括細胞外基質對血管壁施加的牽張應力和循環血流對血管壁施加的流體剪切力[63]。類器官模型灌注主要受限于內部血管系統和周圍功能血管之間是否能形成功能性吻合。當前，研究主要利用微流體技術對類器官施加流體剪切力，從而促進類器官血管網絡的發育與成熟[64]。研究表明，通過使用3D細胞培養和微流體技術，構建微流體裝置，提供基質、細胞和血管生成刺激因子，可以使內皮細胞和成纖維細胞自組裝成毛細血管網絡，并與相鄰的流體通道吻合，從而實現了血管網絡的體外灌注[65]。雖然機械力因素在脈管系統和類器官的發育中起著重要作用，但對于它們的研究遠沒有生化因素深入。
隨著類器官技術的進步，研究人員利用各種水凝膠在體外構建了不同的功能性血管系統，主要包括自組織和預圖案化兩類。第一種模仿體內血管生成，利用微流體裝置使ECs自組織成具有可灌注管腔的血管網絡。預圖案化方法通常從構建水凝膠支架開始，預定義血管的結構、方向和幾何形狀，再使用ECs填充這些預定義的通道，從而形成血管網絡[66]。Rajasekar等[67]設計了一個微流控裝置，使患者來源的結腸類器官得到自組裝血管網絡的循環灌注。與傳統的靜態培養相比，結腸類器官在這樣的平臺上能夠進行持續灌注，生長得更好。
微流體技術可以使類器官突破生長的限制。運用間質微流體灌注技術可以得到厚達700 μm的腦切片，與未灌注相比，切片能夠培養更長時間，且具有功能活性，并保留了在體細胞的形態[9]。
Homan等[60]發現，利用微流控芯片在流動條件下培養腎臟類器官，形成了具有壁細胞包圍的血管網絡，該類器官較靜態條件產生了更成熟的足細胞和腎小管。Lee等[68]開發了一個腎臟類器官芯片系統，在優化細胞外基質條件下提供流體剪切力，與靜態培養條件相比，類器官中形成了更成熟的足細胞和血管結構，同時流動在維持腎臟類器官的許多生理功能方面也發揮著重要作用。
此外，Nashimoto等[69]構建了一個包含可灌注血管網絡的腫瘤球體模型，球體中的成纖維細胞誘導出芽性血管生成，形成了可灌注的血管網絡，灌注24 h后能顯著提高腫瘤細胞的增殖活性，降低腫瘤細胞的死亡。
3 結論與展望
類器官研究進展迅速，起源細胞豐富，干細胞及腫瘤細胞等都可發展成為類器官，但其結構與功能與在體器官仍存在差異，而缺乏功能性血管是主要的原因。雖然腦、心、腎等類器官的血管化均有報道，但如何精確誘導類器官血管化仍缺少有效手段。在一些情況下，通過在體移植，使宿主血管侵入類器官可以獲得血液灌注，如無血管網絡的人腦類器官移植入小鼠大腦皮層后，可誘導小鼠血管侵入類器官中，提高了細胞的存活和成熟[11]。但現有研究更多是通過混合血管內皮細胞或誘導多能干細胞分化為血管內皮細胞，或利用微流控芯片對起源細胞提供流體剪切力刺激，從而使類器官中形成無序的血管網絡。利用預圖案的方法可以使類器官形成有序、功能化的可灌注血管網絡。隨著生物打印和支架技術的快速發展，血管網絡的定制能力也將提高。該方法與ECs自組裝的相關研究在一段時間內會得到進一步強化。現有研究還提示，在適當的微環境下，很多類型的類器官都可以借助現有的血管床實現血管化，但其產生機制尚不明確，對合理控制該過程尚缺乏手段。因此，如何讓類器官形成有序、功能化的血管，以更好地模擬在體器官的結構與功能，尚需要進一步研究。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：沈鈞怡為綜述主要撰寫人，負責相關文獻的收集、整理和分析；歐陽智、鐘健、龍怡岑、孫譽珈參與文獻資料分析，并對論文提出撰寫和修改建議；曾燁負責論文選題、修改和審校。
0 引言
類器官是源自干細胞或器官祖細胞的三維細胞聚集體，它可以在體外模擬器官的三維空間結構和生理功能特征[1]。類器官有幾個重要的特征：首先，它必須是包含一種以上細胞類型的器官模型；第二，它應該能展現一些特定于該器官的功能；第三，細胞應該類似于器官本身進行自組織[2]。
相較于傳統的二維細胞培養模型，在三維環境中培養的類器官通過高度復雜的細胞與細胞以及細胞與細胞外基質的相互作用來調節細胞行為和器官發育，從而可以更加真實地模擬組織的結構和功能[3]。
類器官主要用于人類遺傳疾病的建模和治療策略的開發。類器官可模擬出生缺陷[4]、癌癥[5]、傳染病[6]、代謝性疾病[7]等疾病條件下器官發育和疾病發生發展進程。血管類器官已被用于糖尿病血管功能障礙的相關通路研究[7]。器官芯片未來有望替代小白鼠等動物模型，用于藥物篩選、藥物毒理和藥理作用研究，實現個體化治療。
但是，類器官的研究仍處于起步探索階段。類器官模型面臨的一個主要問題是生長受到限制，很多類器官大小僅有幾毫米，功能不成熟，類似于胚胎或胎兒器官而不是成人器官。類器官停止發育的主要原因被認為是血管系統的缺乏。血管系統是營養物質、氧氣和代謝廢物運輸的通道，在類器官發育中有重要作用[8]。如果沒有血管系統的灌注，三維培養的類器官只能依靠被動擴散來交換營養、氧氣和代謝廢物，但是，直徑超過200～400 μm以后，細胞將無法通過被動擴散獲得足夠的氧氣和營養，導致類器官中心區域的細胞壞死，干擾其正常發育[9]。體外接種在多孔支架上的大鼠成骨細胞會形成厚度不超過0.2 mm的活組織，胰島細胞與毛細血管間距離一旦大于0.1 mm就無法存活[10]。大于150 μm厚度的腦切片培養物，由于其循環系統被破壞后營養供應和氧氣擴散受限，導致組織缺血以至于最終壞死[9]。部分類器官在體移植后可以在宿主體內血管化。體外研究表明，具有血管網絡的類器官，其結構與功能與在體器官更為接近[11]。血管化的人類皮質類器官的功能較未血管化時更加成熟，并且獲得了更好的血腦屏障特性[12]。將未血管化的腦類器官移植到小鼠大腦內，發展出功能性的血管網絡后，軸突生長更為明顯，可以對麻醉觸發的生理刺激做出反應，說明類器官在體內血管化以后更加成熟[11]。類器官與宿主血管系統形成功能性吻合后功能會更加成熟，也表明了功能性血管系統對類器官構建的重要性。如何在類器官模型中發展血管系統已成為亟待解決的問題。本文綜述了用于類器官構建的起源細胞，以及類器官血管化的相關研究進展。
1 類器官的起源細胞
起源細胞類型決定了類器官的最終特征[13]。不同的起源細胞類型遵循不同的路徑，參與不同的發育階段[14]，因此在構建類器官時，選擇恰當的起源細胞群尤為重要。
1.1 干細胞
1.1.1 多能干細胞
多能干細胞（pluripotent stem cells，PSCs）具有自我更新和分化能力，可以相應地分化為外胚層、中胚層或內胚層的細胞[15]，能在體外無限擴增，是類器官的主要細胞來源[8]。PSCs包括胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）和誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）。目前有研究已利用iPSCs成功構建了大腦[16]、腎臟[17]、心臟[18]、胃[19]、皮膚[20]等類器官，也有研究利用ESCs構建了視杯[21]、皮質[22]、大腦[12]、腸道[23]、腎臟[24]等類器官。即使iPSCs和ESCs都可以用來構建類器官，但是事實上iPSCs應用得更為廣泛，因為它來源于體細胞，消除了ESCs涉及的倫理問題[25]。
在由PSCs誘導生成的類器官中，由于PSCs是未分化的干細胞，要進行增殖和分化，所以在此種類器官培養時一些信號通路就尤為重要，比如Wnt/β-catenin信號通路和轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路。其中，Wnt/β-catenin信號通路激活是哺乳動物成體干細胞自我更新和擴增所必不可少的[26]；而TGF-β信號通路可以通過激活ALKs/Smads誘導干細胞分化[27]。除了這些必要的信號分子，PSCs還需要一些特定的信號分子來誘導分化成相應類器官的組成細胞。
在腦類器官中，由ESCs衍生的腦類器官可以從具有低bFGF和ROCK抑制劑的培養基中培養獲得[22]。Cakir等[12]證明了轉錄因子人類ETS變體2的表達可以誘導人ESCs生成腦類器官，并且可以重新編程為內皮細胞，從而生成血管化腦類器官。
在腎臟類器官中，產生最終自組織的腎祖細胞群的信號通路除了Wnt還有成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）等[28]。Morizane等[17]通過GSK-3β抑制劑CHIR99201和骨形態發生蛋白-4（bone morphogenetic protein-4，BMP-4）抑制劑將hESCs或PSCs誘導生成腎祖細胞，最終產生了由多個腎小室組成的腎臟類器官。
在胃類器官中，使用激活素處理hPSCs可以生成定形內胚層，隨后添加BMP抑制劑和FGF、Wnt激活劑后形成前腸，再經視黃酸處理后分化為后前腸，最后在高濃度的表皮細胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）作用下形成胃類器官[19]。
在皮膚類器官中，Lee等通過逐步調節TGF-β和FGF信號通路，將由hiPSCs聚集成的球形細胞誘導分化為顱骨上皮細胞和神經嵴細胞。之后在4～5個月內，觀察到了由分層表皮、富含脂肪的真皮和帶有皮脂腺的色素毛囊組成的囊腫樣皮膚類器官[20]。
1.1.2 成體干細胞或祖細胞
雖然PSCs是類器官構建的主要起源細胞，但成體干細胞（adult stem cells，ASCs）也可以在特異性生長因子混合物的作用下，構建其相應原發組織的類器官模型。ASCs產生的類器官在整體結構、分化細胞類型和功能特異性方面也與相應組織有一定的相似性[29-30]。
2009年利用ASCs構建了小鼠小腸隱窩絨毛類器官[31]，后續許多ASCs衍生的類器官被快速建立。目前已經有腸道[32]、腎小管[33]、脂肪[34]等由ASCs衍生的類器官。有研究發現，來自受損小鼠肝臟的LGR5+肝干細胞可以在體外擴增生長產生肝臟類器官，這種類器官可以在體外分化，并在移植到體內時產生功能性肝細胞[35]。也有人把羊膜干細胞、間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）和人臍靜脈內皮細胞在三維共培養系統中組合生成肝臟類器官[36]。Pleguezuelos-Manzano等[37]建立了一種從小腸或結腸的新鮮活組織中由人類腸道ASCs衍生的類器官培養物的方法。該方法通過使用基底膜提取物將組織解離成小的上皮碎片，將這些碎片嵌入到細胞外基質，然后補充含有生長因子的培養基以維持類器官的生長。
祖細胞和干細胞相似，存在于所有成人組織中。干細胞產生祖細胞，與祖細胞的區別在于它們通過不對稱細胞分裂過程進行自我更新或自我再生的能力。祖細胞的自我更新能力有限，致力于向不同或更分化的表型發展[10]。類器官只有少數來自祖細胞，尤其是胎兒祖細胞。比如從小鼠胎兒（胚胎10.5天）背胰分離的細胞產生胰腺類器官[38]，從人類胎兒腸組織分離的細胞產生胎兒型腸類器官[39]，從大鼠和小鼠的胎兒腎臟分離腎祖細胞產生種間嵌合腎類器官[40]，以及由小鼠前列腺上皮祖細胞生成的前列腺類器官[41]。
1.1.3 間充質干細胞
MSCs通常來源于骨髓或脂肪[42]，可以分化為多種組織類型，包括脂肪[43]、骨骼[44]、平滑肌和軟骨[45]。
在類器官的構建中，MSCs可與其他細胞一起構建類器官。如MSCs可與原代肝細胞共培養構建肝類器官。原代肝細胞雖然具有較高的功能，但在體外培養時無法維持其功能。當MSCs與肝細胞共培養時，MSCs可增強肝細胞功能并維持肝細胞代謝[46]。在肺類器官中，MSCs可以與肺祖細胞共培養，結果表明MSCs的添加可以促進肺泡的分化[47]。MSCs除了以上作用，它們還可以與內皮細胞或微血管一起促進類器官的血管化。比如在骨髓來源的MSCs誘導分化脂肪類器官的過程中，植入的微血管在MSCs協助下可以更好地促進類器官的血管化[48]。
已有實驗表明，骨髓源性MSCs通過三維培養及成骨分化可以形成骨的類器官，并可以植入機體發揮特定的作用[49]。這種骨類器官模型的構建，不僅可以為骨質疏松等相關疾病研究提供更多方法，還可在骨組織移植及修復等組織工程學中發揮重要作用。
來自骨髓或脂肪組織的MSCs具有來源受限和侵入性等缺點，所以研究人員發現可以用臍帶血單核細胞作為MSCs的替代來源。Bhang等[42]使用懸滴法從源自人類臍帶血的MSCs中得到了球體結構，移植到小鼠體內后，發現球體顯著增加了小鼠缺血肢體中微血管和平滑肌α-肌動蛋白陽性血管的數量，并減輕了肢體的壞死。因此提示，發展類器官促進新生血管形成有利于組織修復。
1.2 非干細胞
1.2.1 癌細胞
由于遺傳和環境因素，在正常細胞中積累的突變會導致癌癥的發展。要了解包括腫瘤異質性在內的癌癥生物學，并將這些知識進行臨床轉化，需要恰當的臨床前癌癥模型，因此，隨著類器官技術的發展與成熟，類器官在癌癥模型方面得到了越來越廣泛的應用[50]。腫瘤類器官可以從離體腫瘤組織中產生，并在特定條件下擴增[51]。
最近已有研究成功地利用來源于結直腸癌[52]、乳腺癌[53]、膠質母細胞瘤[54]等患者的癌細胞建立了腫瘤類器官。患者活檢和切除組織可以發展成模仿原始癌組織的類器官。Tindle等[55]將肺組織解離獲得碎片，通過Wnt3、R-spondin和Noggin等因子誘導，產生了具有近端氣道和遠端肺泡上皮細胞的成人肺類器官。Cheaito等[5]利用前列腺癌患者的新鮮原代組織標本，成功獲得了前列腺癌類器官。
1.2.2 其他細胞
類器官除了上述細胞來源以外，還有一些其他非干細胞來源，這些細胞可能是終末分化細胞。Hallett等[56]利用從未用于肝移植的人類肝臟中提取的人類膽管上皮細胞，構建了膽管類器官模型。有研究表明，綠蜥蜴尾巴胚芽的成纖維細胞結締組織細胞，可形成微量胚芽類器官，并在體外產生軟骨[57]。
總體而言，iPSCs是類器官構建最常見的起源細胞，其技術也相對成熟。但是根據特定的需求，不同類型的細胞如腫瘤細胞等也開始被用作起源細胞（見表1），但相關技術還不夠成熟。
表1
類器官的起源細胞類型及血管化方法
Table1.
Origin cell types and vascularization methods of organoids
2 類器官血管化及其方法
本部分對類器官的血管化及其方法的研究進展進行了綜述。
2.1 利用血管內皮細胞血管化
在類器官中，預血管化的常用手段是利用血管內皮細胞（endothelial cells，ECs）使類器官中產生血管，不同起源細胞的類器官利用ECs血管化的方法也有所不同（見表1）。當前，將ECs與起源細胞共培養，已成功獲得了肝臟、大腦、腎臟、心臟等血管化類器官，形成了CD31+的血管網絡，使類器官移植到體內后可以存活更長時間。在肝臟類器官中，當人臍靜脈血管內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）與iPSCs誘導的肝內胚層細胞（induced pluripotent stem cells-hepatic endoderm cells，iPSC-HEs）共培養時，HUVECs形成被iPSC-HEs包圍的具有CD31+的管狀結構；同樣將MSCs與iPSC-HEs共培養也可以形成被iPSC-HEs包圍的具有CD31+的管狀結構。研究還發現iPSC-HEs只有與非實質細胞（如HUVECs 和MSCs）表面接觸時才能形成有三維結構的肝類器官[58]。還有研究表明，將由hiPSCs衍生的iPSC-HEs、HUVECs和MSCs共培養，形成肝芽后移植到預先形成的免疫缺陷小鼠的顱窗中，發現肝芽在移植48 h后迅速與受體血管連接形成功能性血管網絡。但是在沒有內皮細胞的情況下移植的人類iPSC-HEs未能血管化和存活[59]。在腎臟類器官中，外源性內皮細胞（如HUVECs或人腎小球微血管內皮細胞）與源于hPSCs的腎類器官共培養時，類器官內可形成血管網絡[60]。
研究還報道，除與類器官起源細胞共培養外，內皮細胞與組織碎片共培養，也可以迅速形成具有血管網絡的類器官，這些組織包括胰島、腦碎片、心臟碎片、腸碎片、腎臟碎片、肝臟碎片、肺碎片，甚至iPSCs的球狀體[61]。
此外，利用類器官起源細胞的多向分化能力，也可直接形成血管化的類器官。通過這種方法，目前已成功生成了大腦、皮質、血管等血管化類器官。在腦類器官中，Pham等[16]誘導hiPSCs生成全腦類器官，同時誘導iPSCs分化為ECs，實驗發現只有含有ECs的類器官才具有CD31+的網狀結構，且毛細血管已滲透到類器官的中心。而非血管化全腦類器官在移植到小鼠體內2周后，就無法存活。
在人類皮質類器官中，Cakir等[12]誘導ESCs生成了皮質類器官，并通過轉錄因子人類ETS變體2使ESCs分化為ECs，結果發現皮質類器官中形成了復雜的血管樣網絡，形成了類似于早期產前大腦的血管系統，從而促進了類器官功能的成熟。
Wimmer等[62]通過誘導hPSCs生成了由血管內皮細胞和周細胞組成的人類血管類器官，將它移植到免疫功能低下小鼠的腎包膜中，可以形成一個穩定且功能強大的人類脈管系統，其穩定時間超過6個月，期間不需要聯合移植小鼠MSCs。
2.2 利用機械力血管化
血管系統的在體發育受到各種機械力信號的調控，主要包括細胞外基質對血管壁施加的牽張應力和循環血流對血管壁施加的流體剪切力[63]。類器官模型灌注主要受限于內部血管系統和周圍功能血管之間是否能形成功能性吻合。當前，研究主要利用微流體技術對類器官施加流體剪切力，從而促進類器官血管網絡的發育與成熟[64]。研究表明，通過使用3D細胞培養和微流體技術，構建微流體裝置，提供基質、細胞和血管生成刺激因子，可以使內皮細胞和成纖維細胞自組裝成毛細血管網絡，并與相鄰的流體通道吻合，從而實現了血管網絡的體外灌注[65]。雖然機械力因素在脈管系統和類器官的發育中起著重要作用，但對于它們的研究遠沒有生化因素深入。
隨著類器官技術的進步，研究人員利用各種水凝膠在體外構建了不同的功能性血管系統，主要包括自組織和預圖案化兩類。第一種模仿體內血管生成，利用微流體裝置使ECs自組織成具有可灌注管腔的血管網絡。預圖案化方法通常從構建水凝膠支架開始，預定義血管的結構、方向和幾何形狀，再使用ECs填充這些預定義的通道，從而形成血管網絡[66]。Rajasekar等[67]設計了一個微流控裝置，使患者來源的結腸類器官得到自組裝血管網絡的循環灌注。與傳統的靜態培養相比，結腸類器官在這樣的平臺上能夠進行持續灌注，生長得更好。
微流體技術可以使類器官突破生長的限制。運用間質微流體灌注技術可以得到厚達700 μm的腦切片，與未灌注相比，切片能夠培養更長時間，且具有功能活性，并保留了在體細胞的形態[9]。
Homan等[60]發現，利用微流控芯片在流動條件下培養腎臟類器官，形成了具有壁細胞包圍的血管網絡，該類器官較靜態條件產生了更成熟的足細胞和腎小管。Lee等[68]開發了一個腎臟類器官芯片系統，在優化細胞外基質條件下提供流體剪切力，與靜態培養條件相比，類器官中形成了更成熟的足細胞和血管結構，同時流動在維持腎臟類器官的許多生理功能方面也發揮著重要作用。
此外，Nashimoto等[69]構建了一個包含可灌注血管網絡的腫瘤球體模型，球體中的成纖維細胞誘導出芽性血管生成，形成了可灌注的血管網絡，灌注24 h后能顯著提高腫瘤細胞的增殖活性，降低腫瘤細胞的死亡。
3 結論與展望
類器官研究進展迅速，起源細胞豐富，干細胞及腫瘤細胞等都可發展成為類器官，但其結構與功能與在體器官仍存在差異，而缺乏功能性血管是主要的原因。雖然腦、心、腎等類器官的血管化均有報道，但如何精確誘導類器官血管化仍缺少有效手段。在一些情況下，通過在體移植，使宿主血管侵入類器官可以獲得血液灌注，如無血管網絡的人腦類器官移植入小鼠大腦皮層后，可誘導小鼠血管侵入類器官中，提高了細胞的存活和成熟[11]。但現有研究更多是通過混合血管內皮細胞或誘導多能干細胞分化為血管內皮細胞，或利用微流控芯片對起源細胞提供流體剪切力刺激，從而使類器官中形成無序的血管網絡。利用預圖案的方法可以使類器官形成有序、功能化的可灌注血管網絡。隨著生物打印和支架技術的快速發展，血管網絡的定制能力也將提高。該方法與ECs自組裝的相關研究在一段時間內會得到進一步強化。現有研究還提示，在適當的微環境下，很多類型的類器官都可以借助現有的血管床實現血管化，但其產生機制尚不明確，對合理控制該過程尚缺乏手段。因此，如何讓類器官形成有序、功能化的血管，以更好地模擬在體器官的結構與功能，尚需要進一步研究。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：沈鈞怡為綜述主要撰寫人，負責相關文獻的收集、整理和分析；歐陽智、鐘健、龍怡岑、孫譽珈參與文獻資料分析，并對論文提出撰寫和修改建議；曾燁負責論文選題、修改和審校。
