下肢截肢中血管的損傷會導致血流的重新分布和血管末端阻力的變化，對心血管系統造成影響，但不同截肢水平造成的影響有何差異，缺乏動物實驗的說明。故本文建立膝上截肢（AKA）和膝下截肢（BKA）兩種動物模型，通過血液生化檢測及組織病理檢測，探究不同截肢水平對心血管系統的影響規律。結果表明，截肢會使動物的心血管系統出現內皮損傷、炎癥、血管硬化等病理改變，且膝上截肢對心血管系統造成的損傷程度高于膝下截肢。本研究將有助于深入探究截肢影響心血管系統的內在機制，并根據患者截肢水平的不同，在術后進行更全面和更有針對性的監測，并進行必要的干預以預防心血管疾病的發生。
引用本文： 閔磊, 蔣文濤, 李忠友, 李瀟, 刁珺杰, 劉任靜, 邰天翔, 白逃萍. 關于不同截肢水平對心血管系統影響的動物實驗研究. 生物醫學工程學雜志, 2023, 40(3): 515-521. doi: 10.7507/1001-5515.202211004 復制
0 引言
截肢是指經關節或骨頭將已喪失生理功能或危害患者生命的肢體予以切除的破壞性外科手術。截肢導致的人體血管和肌肉組織丟失，會引起血流的重新分布和血管末端阻力的變化[1]，進而影響人體的血流動力學分布。而血流動力學的改變，如血流速度、血壓、血管壁面剪切應力等，與心血管疾病密切相關[2-4]。大量研究及調查已經證明下肢截肢患者患心血管疾病的風險遠高于正常人[5-8]。此外，調查結果還發現，膝上截肢（above-knee amputation，AKA）患者心血管疾病發病率（76.6%）和死亡率（16.5%）高于膝下截肢（below-knee amputation，BKA）患者（63.1%、5.7%）[9-10]，雙側BKA患者的心血管疾病發病率（17.5%）高于單側BKA患者（11.8%）[11]。由此可見，心血管疾病的發病率會因患者下肢截肢而大大提高，且與截肢平面存在正相關性。越來越多的研究顯示，下肢截肢導致的血流動力學變化是影響心血管疾病發病率的重要原因[12-14]，且不同截肢水平導致的心血管疾病風險有一定差異[15]。因此，不同水平的下肢截肢術后，是否以及如何對心血管系統造成不同程度的影響，是一個值得深入研究的問題。
除臨床調研外，有學者采用數值方法研究了截肢水平對心血管系統的影響規律，發現隨截肢水平的提高，下肢截肢者患動脈粥樣硬化與腹主動脈瘤破裂的風險將增大[16]，且截肢后動脈瘤峰值壁面剪切應力增加48%，大大增加了動脈瘤破裂的風險[17]；下肢截肢后殘端內血流動力學的變化與肌肉萎縮及康復[18]和動脈粥樣硬化斑塊的形成[19]具有密切關系。雖然數值仿真結果從理論上證實了下肢截肢對血流動力學的影響，但血流動力學的改變將使心血管系統發生哪些變化，目前尚未見相關臨床和實驗研究。
因此，本文基于課題組關于截肢對心血管系統影響的動物模型[20]，采用動物實驗研究方法研究了AKA和BKA兩種不同截肢水平對動物心血管系統的影響，從動物實驗的角度完善了關于截肢對心血管系統影響的研究。
1 材料與方法
選用無特定病原體（specific pathogen free，SPF）新西蘭兔（［SCXK（川）2019-031］，成都達碩實驗動物有限公司）共18只，不論雌雄，體重（2.2 ± 0.31）kg，分為正常對照組（A組，n = 6）、膝上截肢組（B組，n = 6）、膝下截肢組（C組，n = 6）。A、B、C組均在動物籠中單籠飼養，均可在籠中自由活動、進食和飲水，室溫控制在25 ℃，12 h光照與黑暗循環交替。經過7天的適應喂養期后，B、C組行截肢術。麻醉（耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉）后剪毛并依次切開皮膚，分離肌層、淺深筋膜，游離血管、神經并于近心端結扎。AKA組和BKA組分別將兔膝關節以上股骨遠端、膝關節以下脛腓骨近端用手術鉗夾斷，并依次切斷肌肉、血管及神經，保留足夠的肌肉長度（截斷位置向前5 cm處），將肌肉縫合包住斷骨。術后將實驗兔放于加熱板上，待狀態穩定后，送回動物籠中，術后飼養三個月共92天。在飼養期中，實驗兔可在動物籠中自由活動，并且定期將三組實驗兔放出動物籠自由活動。術后觀察到，B、C組運動活力較好，保留了絕大部分運動能力，鑒于喂養兔料是未添加膽固醇等的低脂兔料，且有A組作為對照組，故因運動對實驗兔脂質水平造成的影響可以忽略不計。
1.1 生化指標檢測
人類心血管疾病的初篩一般采用抽血化驗，主要預警指標包括總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high density liptein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low density liptein cholesterol，LDL-C）[21]，其中TC、LDL-C含量的升高及HDL-C含量的降低被普遍認為是心血管疾病的主要危險因素[22]。基于兔子與人心血管系統的相似性[23]，這些檢測指標同樣可以作為實驗兔心血管系統發生變化的參照[24-25]。本研究采用獸用生化分析儀BS-240VET（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）檢測上述指標。
另外，本文引入心鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）和腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）及血管平滑肌肌動蛋白α（vascular smooth muscle α-actin，α-SMA）作為觀測指標，通過酶聯免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）進行定量檢測（ELISA試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司）。ANP主要由心房細胞分泌，由于心房擴張是ANP釋放的主要誘因，因此ANP含量與左心房壓、肺動脈收縮壓有著密切關系，ANP含量的變化表現出心血管系統對人體血壓的調控[26-27]。BNP主要由心室細胞合成及分泌，具有舒張血管平滑肌、擴張血管、抑制心肌纖維化等功能，當心臟壓力及負荷增加時，其含量會急劇升高，是反映心室功能較為敏感的指標，在評估心力衰竭程度、指導治療及評估預后上均具有一定價值[28]。許多研究表明，BNP在血漿中的含量可以作為慢性心力衰竭的診斷證據[29-30]。截肢術后，受到損傷的血管在再生修復過程中會分泌大量的血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、纖維母細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）[31-32]。而Messina等[33]的研究表明，FGF誘導的血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖與遷移，對血管狹窄的發生發展有促進作用，其增殖過程可以通過血液中α-SMA的含量來體現[34]。
各血液指標中，同屬于血脂類的LDL-C、HDL-C、TC含量在術后7天、21天、92天測量；同屬于激素類的ANP、BNP含量在術后7天、31天測量；屬于蛋白類的α-SMA含量于術后7天、92天測量。
1.2 動脈病理檢測
飼養期結束后，開展動物組織病理檢測工作。首先取實驗動物的心、肝、脾、肺、腎做基礎疾病分析，排除實驗動物本身疾病的干擾，然后取主動脈弓、胸主動脈、腹主動脈和股動脈按病理檢驗SOP程序作病理切片檢查[35]。使用數字切片掃描儀（Pannoramic 250，3DHISTECH，匈牙利）對切片進行觀察和圖像采集。采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法觀察各動脈組織細胞形態變化，染色后，每張切片先于40倍下觀察全部組織，察看大體病變情況，再選擇要觀察的區域采集100倍和400倍鏡下圖片，觀察具體病變。采用范基林（van Gieson，VG）染色法觀察動脈彈力纖維成分的變化，染色后，肌纖維呈黃色，膠原纖維呈紅色，彈力纖維呈黑色。VG染色后，每張切片先于40倍下觀察全部組織，再根據組織大小及表達情況分別選取3個區域于400倍鏡下采集圖像。
1.3 統計分析
所有數據均用SPSS 26.0軟件進行統計分析。所有數據表示為平均值±標準差。采用單因素方差分析比較A、B、C三組血液中的LDL-C、HDL-及TC含量，組間兩兩比較采用Bonferroni事后檢驗。所有的統計分析中，檢驗水準均為0.05。
2 結果
生化儀檢測結果如圖1所示。A、B、C三組血液中的LDL-C含量和TC含量的組間差異有統計學意義（P < 0.05），均表現為：A組小于B、C組；B、C兩組組間隨時間的推遲表現出不同的趨勢。A、B、C三組血液中的HDL-C含量的組間差異有統計學意義（P < 0.05），含量表現為A組 > B組 > C組。
圖1
三組LDL-C、HDL-C、TC含量比較
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術后血液中α-SMA、ANP、BNP含量的檢測結果如圖2所示。術后7天A、B、C三組α-SMA含量的組間差異有統計學意義（P < 0.05），術后92天各組α-SMA含量差異無統計學意義。術后一月內各組ANP含量的組間差異有統計學意義（P < 0.05），表現為：A組 < B組 < C組。術后7天各組BNP含量的組間差異有統計學意義（P < 0.05），含量表現為：A組 < B組 < C組；術后31天，A組與B組、C組的BNP含量的組間差異有統計學意義（P < 0.05）。
圖2
三組α-SMA、ANP、BNP含量比較
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HE染色發現內臟無明顯病理改變；胸主動脈處和腹主動處各組變化無明顯差異。病變發生在主動脈弓以及股動脈處（如圖3所示）：主動脈弓處B組出現中度內皮細胞壞死，C組出現輕度彈性纖維斷裂；股動脈處B組出現輕度平滑肌細胞變性壞死，C組出現中度平滑肌細胞變性壞死。
圖3
術后92天A、B、C組主動脈弓及股動脈HE染色圖像
黑色箭頭表示彈性纖維斷裂，藍色箭頭表示內皮細胞壞死，黃色箭頭表示平滑肌細胞變性壞死
Figure3. Hematoxylin-eosin stained images of aortic arch and femoral artery 92 days after amputationblack arrows indicate breakage of elastic fibers, blue arrows indicate necrosis of endothelial cells, and yellow arrows indicate degeneration and necrosis of smooth muscle cells
腹主動脈和股動脈處的VG染色結果如圖4所示。為衡量動脈彈性變化，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統測定所采集全部圖像的光密度和面積，計算彈性纖維組織表達面積百分比（elastic fiber area expression percentage，EFEP）以分析動脈彈性。計算結果顯示，腹主動脈處A、B、C各組EFEP分別為11.32%、7.62%、9.56%，股動脈處A、B、C各組EFEP分別為3.37%、4.48%、4.76%，組間差異均有統計學意義（P < 0.05）。
圖4
術后92天A、B、C組腹主動脈及股動脈VG染色圖像
彈性纖維由綠色箭頭標示
Figure4. Van Gieson stained images of abdominal aorta and femoral artery 92 days after amputationelastic fibers are indicated by green arrows in the figure
3 討論
本文使用兔建立截肢動物模型，在實驗周期設計上參照實驗室環境下兔子平均壽命為10年[36]，且成年期人類壽命1年相當于兔子的18.25天[37]兩個標準，設計實驗周期為3個月共92天，時間上等同于人類截肢后4~5年的心血管系統變化。
LDL-C含量的升高會引起泡沫細胞的生成及增殖，后者刺激VSMC增殖，將促進動脈粥樣硬化斑塊的發生與發展[38-39]。而本文實驗結果發現，相比A組實驗兔，B組和C組血液中LDL-C含量均明顯偏高（P < 0.05），這表明截肢術后實驗兔的心血管系統抵抗動脈粥樣硬化的能力變弱了，結合前文血液中LDL-C的含量升高能夠說明脂質在血管內部有沉積的現象。同時，B、C兩組LDL-C含量差異有統計學意義，說明不同截肢水平對血液中LDL-C含量的影響是不同的，由此產生的心血管疾病的潛在風險是不同的。另一方面，HDL-C具有清潔疏通動脈的功能，含量越高，動物患心血管疾病的風險越小[40]，而血液中HDL-C含量表現為A組 > B組 > C組。LDL-C和HDL-C是TC的主要成分，占比高達80%~90%[41]，血液中TC含量檢測結果為A組 < B組、C組，這與截肢術后體內LDL-C含量的升高與HDL-C含量的減少有直接聯系。關于下肢截肢者動脈硬化的研究中提到，下肢截肢者體內TC水平（195.6 vs 183.8，單位：mg/dL，P = 0.006）及LDL-C水平（136.1 vs 117.2，單位：mg/dL，P = 0.002）顯著高于正常人，而HDL水平則剛好相反（40.0 vs 45.7，單位：mg/dL，P = 0.004）[42]，動物實驗的研究結果也與此相符。
研究表明血壓水平可由ANP及BNP調控[26-30]，截肢術后血液中ANP、BNP含量的升高說明動物體內血壓升高，動物機體的血壓自我調節在這一過程中起到作用，以此達到降壓效果。此外，因截肢使血管受到嚴重損傷，受損血管將再生[31-33]。術后7天B、C組與A組的α-SMA組間含量差異有統計學意義（P < 0.05），這表明截肢后VSMC由收縮型向增殖和活動型的表型轉換，是修復受損血管的生理反應。此外，截肢導致的血管內皮損傷和炎癥會使得增殖的VSMC通過內膜，吞噬沉積于此的脂質，促進動脈粥樣硬化斑塊的形成[32]。
對比不同截肢水平組的生化檢測結果，發現B組血液中LDL-C、TC、ANP和BNP的含量低于C組，而HDL-C含量偏高。出現這種反常現象的原因是由于BKA相比于AKA，雖然受創面更小，但恢復速度更慢，即截肢水平高傷口恢復速度反而更快。有研究針對AKA和BKA患者作了長期的跟隨觀察，發現AKA患者的傷愈率和傷愈速度均高于BKA患者（91% vs 81%）[43-44]；同時，AKA患者出現傷口感染的概率小于BKA患者（22.6% vs 29.4%）[45]。2004年美國機構對下肢截肢的印第安人進行調查，發現AKA患者患糖尿病的概率遠低于BKA患者[46]。另有研究表明，AKA患者的傷愈速度大于BKA患者，但死亡率方面，AKA患者的三年存活率小于BKA患者（55% vs 78%）[47]。相關研究表明，AKA手術雖然丟失肌肉和血管更多，但由于無需傳輸血液到心臟遠端，負荷減小，故術后恢復速度更快；與AKA患者不同的是，殘端的血液供應對BKA患者傷口的愈合非常重要，這與傷愈速度直接相關[48]。截肢術后傷愈速度的快慢與體內炎癥及血管內皮損傷持續的時間有直接聯系，這也從另一方面表明為何術后初期BKA患者心血管系統受損的程度大于AKA患者。但AKA手術畢竟會導致大量失血并且是人體形態的巨大改變，手術對身體的影響會隨時間的增加而日益加重，造成數年后死亡率高于BKA組的情況。
HE染色結果表明主動脈弓處B組出現中度內皮細胞壞死，C組出現輕度彈性纖維斷裂，說明BKA對主動脈弓的損傷小于AKA；由VG染色結果計算得到的EFEP可知，B組腹主動脈處的血管硬化程度高于C組，結合主動脈弓處的HE染色結果，說明AKA對主干動脈的損傷大于BKA，這可能是AKA致死率更高的一個重要因素[49-50]。股動脈處HE染色結果表明因截肢處血液循環被阻斷，將直接影響血管的血液運輸情況，局部血流動力學發生改變導致血管壓力驟然增大，故血管極有可能受到機械損傷。而股動脈處的EFEP結果表明，B、C組的血管彈性大于A組，這表明在截肢末端處，因修復損傷血管導致血管生長，使得血管彈性升高[50-51]。
4 結論
為探究不同截肢水平對心血管系統的影響有何不同，本文基于兔子與人類心血管系統的相似性選擇兔子作為研究模型，建立不同截肢水平（AKA、BKA）的動物模型，通過對比各組血液指標參數及各組織的損傷程度、形態學差異，發現截肢水平不同會對動物心血管系統造成不同程度的損傷，且截肢水平越高對心血管系統造成的損傷越大，AKA相較BKA手術會使主干動脈受到更嚴重的損傷，這是AKA患者術后五年生存率低于BKA患者的主要原因。此外，實驗也發現截肢處受損血管會再生，使得截肢處側肌纖維變小、變少，血管側支增多。本研究將有助于進一步探究截肢影響心血管系統的內在機制，并根據患者截肢水平的不同，在術后進行更全面且更有針對性的監測，進行必要的干預以預防心血管疾病的發生。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：蔣文濤主要負責項目主持、實驗設計以及論文審閱修訂；閔磊主要負責動物實驗方案的制定及實施、實驗數據分析及論文編寫；李忠友主要負責數據分析指導以及論文修訂；劉任靜、刁珺杰和邰天翔參與結果討論及論文修訂；李瀟和白逃萍主要負責實驗方案設計指導。
倫理聲明：本實驗通過了四川大學醫學倫理委員會的審批（批文編號：K2022002）。
0 引言
截肢是指經關節或骨頭將已喪失生理功能或危害患者生命的肢體予以切除的破壞性外科手術。截肢導致的人體血管和肌肉組織丟失，會引起血流的重新分布和血管末端阻力的變化[1]，進而影響人體的血流動力學分布。而血流動力學的改變，如血流速度、血壓、血管壁面剪切應力等，與心血管疾病密切相關[2-4]。大量研究及調查已經證明下肢截肢患者患心血管疾病的風險遠高于正常人[5-8]。此外，調查結果還發現，膝上截肢（above-knee amputation，AKA）患者心血管疾病發病率（76.6%）和死亡率（16.5%）高于膝下截肢（below-knee amputation，BKA）患者（63.1%、5.7%）[9-10]，雙側BKA患者的心血管疾病發病率（17.5%）高于單側BKA患者（11.8%）[11]。由此可見，心血管疾病的發病率會因患者下肢截肢而大大提高，且與截肢平面存在正相關性。越來越多的研究顯示，下肢截肢導致的血流動力學變化是影響心血管疾病發病率的重要原因[12-14]，且不同截肢水平導致的心血管疾病風險有一定差異[15]。因此，不同水平的下肢截肢術后，是否以及如何對心血管系統造成不同程度的影響，是一個值得深入研究的問題。
除臨床調研外，有學者采用數值方法研究了截肢水平對心血管系統的影響規律，發現隨截肢水平的提高，下肢截肢者患動脈粥樣硬化與腹主動脈瘤破裂的風險將增大[16]，且截肢后動脈瘤峰值壁面剪切應力增加48%，大大增加了動脈瘤破裂的風險[17]；下肢截肢后殘端內血流動力學的變化與肌肉萎縮及康復[18]和動脈粥樣硬化斑塊的形成[19]具有密切關系。雖然數值仿真結果從理論上證實了下肢截肢對血流動力學的影響，但血流動力學的改變將使心血管系統發生哪些變化，目前尚未見相關臨床和實驗研究。
因此，本文基于課題組關于截肢對心血管系統影響的動物模型[20]，采用動物實驗研究方法研究了AKA和BKA兩種不同截肢水平對動物心血管系統的影響，從動物實驗的角度完善了關于截肢對心血管系統影響的研究。
1 材料與方法
選用無特定病原體（specific pathogen free，SPF）新西蘭兔（［SCXK（川）2019-031］，成都達碩實驗動物有限公司）共18只，不論雌雄，體重（2.2 ± 0.31）kg，分為正常對照組（A組，n = 6）、膝上截肢組（B組，n = 6）、膝下截肢組（C組，n = 6）。A、B、C組均在動物籠中單籠飼養，均可在籠中自由活動、進食和飲水，室溫控制在25 ℃，12 h光照與黑暗循環交替。經過7天的適應喂養期后，B、C組行截肢術。麻醉（耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉）后剪毛并依次切開皮膚，分離肌層、淺深筋膜，游離血管、神經并于近心端結扎。AKA組和BKA組分別將兔膝關節以上股骨遠端、膝關節以下脛腓骨近端用手術鉗夾斷，并依次切斷肌肉、血管及神經，保留足夠的肌肉長度（截斷位置向前5 cm處），將肌肉縫合包住斷骨。術后將實驗兔放于加熱板上，待狀態穩定后，送回動物籠中，術后飼養三個月共92天。在飼養期中，實驗兔可在動物籠中自由活動，并且定期將三組實驗兔放出動物籠自由活動。術后觀察到，B、C組運動活力較好，保留了絕大部分運動能力，鑒于喂養兔料是未添加膽固醇等的低脂兔料，且有A組作為對照組，故因運動對實驗兔脂質水平造成的影響可以忽略不計。
1.1 生化指標檢測
人類心血管疾病的初篩一般采用抽血化驗，主要預警指標包括總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high density liptein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low density liptein cholesterol，LDL-C）[21]，其中TC、LDL-C含量的升高及HDL-C含量的降低被普遍認為是心血管疾病的主要危險因素[22]。基于兔子與人心血管系統的相似性[23]，這些檢測指標同樣可以作為實驗兔心血管系統發生變化的參照[24-25]。本研究采用獸用生化分析儀BS-240VET（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）檢測上述指標。
另外，本文引入心鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）和腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）及血管平滑肌肌動蛋白α（vascular smooth muscle α-actin，α-SMA）作為觀測指標，通過酶聯免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）進行定量檢測（ELISA試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司）。ANP主要由心房細胞分泌，由于心房擴張是ANP釋放的主要誘因，因此ANP含量與左心房壓、肺動脈收縮壓有著密切關系，ANP含量的變化表現出心血管系統對人體血壓的調控[26-27]。BNP主要由心室細胞合成及分泌，具有舒張血管平滑肌、擴張血管、抑制心肌纖維化等功能，當心臟壓力及負荷增加時，其含量會急劇升高，是反映心室功能較為敏感的指標，在評估心力衰竭程度、指導治療及評估預后上均具有一定價值[28]。許多研究表明，BNP在血漿中的含量可以作為慢性心力衰竭的診斷證據[29-30]。截肢術后，受到損傷的血管在再生修復過程中會分泌大量的血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、纖維母細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）[31-32]。而Messina等[33]的研究表明，FGF誘導的血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖與遷移，對血管狹窄的發生發展有促進作用，其增殖過程可以通過血液中α-SMA的含量來體現[34]。
各血液指標中，同屬于血脂類的LDL-C、HDL-C、TC含量在術后7天、21天、92天測量；同屬于激素類的ANP、BNP含量在術后7天、31天測量；屬于蛋白類的α-SMA含量于術后7天、92天測量。
1.2 動脈病理檢測
飼養期結束后，開展動物組織病理檢測工作。首先取實驗動物的心、肝、脾、肺、腎做基礎疾病分析，排除實驗動物本身疾病的干擾，然后取主動脈弓、胸主動脈、腹主動脈和股動脈按病理檢驗SOP程序作病理切片檢查[35]。使用數字切片掃描儀（Pannoramic 250，3DHISTECH，匈牙利）對切片進行觀察和圖像采集。采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法觀察各動脈組織細胞形態變化，染色后，每張切片先于40倍下觀察全部組織，察看大體病變情況，再選擇要觀察的區域采集100倍和400倍鏡下圖片，觀察具體病變。采用范基林（van Gieson，VG）染色法觀察動脈彈力纖維成分的變化，染色后，肌纖維呈黃色，膠原纖維呈紅色，彈力纖維呈黑色。VG染色后，每張切片先于40倍下觀察全部組織，再根據組織大小及表達情況分別選取3個區域于400倍鏡下采集圖像。
1.3 統計分析
所有數據均用SPSS 26.0軟件進行統計分析。所有數據表示為平均值±標準差。采用單因素方差分析比較A、B、C三組血液中的LDL-C、HDL-及TC含量，組間兩兩比較采用Bonferroni事后檢驗。所有的統計分析中，檢驗水準均為0.05。
2 結果
生化儀檢測結果如圖1所示。A、B、C三組血液中的LDL-C含量和TC含量的組間差異有統計學意義（P < 0.05），均表現為：A組小于B、C組；B、C兩組組間隨時間的推遲表現出不同的趨勢。A、B、C三組血液中的HDL-C含量的組間差異有統計學意義（P < 0.05），含量表現為A組 > B組 > C組。
圖1
三組LDL-C、HDL-C、TC含量比較
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術后血液中α-SMA、ANP、BNP含量的檢測結果如圖2所示。術后7天A、B、C三組α-SMA含量的組間差異有統計學意義（P < 0.05），術后92天各組α-SMA含量差異無統計學意義。術后一月內各組ANP含量的組間差異有統計學意義（P < 0.05），表現為：A組 < B組 < C組。術后7天各組BNP含量的組間差異有統計學意義（P < 0.05），含量表現為：A組 < B組 < C組；術后31天，A組與B組、C組的BNP含量的組間差異有統計學意義（P < 0.05）。
圖2
三組α-SMA、ANP、BNP含量比較
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HE染色發現內臟無明顯病理改變；胸主動脈處和腹主動處各組變化無明顯差異。病變發生在主動脈弓以及股動脈處（如圖3所示）：主動脈弓處B組出現中度內皮細胞壞死，C組出現輕度彈性纖維斷裂；股動脈處B組出現輕度平滑肌細胞變性壞死，C組出現中度平滑肌細胞變性壞死。
圖3
術后92天A、B、C組主動脈弓及股動脈HE染色圖像
黑色箭頭表示彈性纖維斷裂，藍色箭頭表示內皮細胞壞死，黃色箭頭表示平滑肌細胞變性壞死
Figure3. Hematoxylin-eosin stained images of aortic arch and femoral artery 92 days after amputationblack arrows indicate breakage of elastic fibers, blue arrows indicate necrosis of endothelial cells, and yellow arrows indicate degeneration and necrosis of smooth muscle cells
腹主動脈和股動脈處的VG染色結果如圖4所示。為衡量動脈彈性變化，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統測定所采集全部圖像的光密度和面積，計算彈性纖維組織表達面積百分比（elastic fiber area expression percentage，EFEP）以分析動脈彈性。計算結果顯示，腹主動脈處A、B、C各組EFEP分別為11.32%、7.62%、9.56%，股動脈處A、B、C各組EFEP分別為3.37%、4.48%、4.76%，組間差異均有統計學意義（P < 0.05）。
圖4
術后92天A、B、C組腹主動脈及股動脈VG染色圖像
彈性纖維由綠色箭頭標示
Figure4. Van Gieson stained images of abdominal aorta and femoral artery 92 days after amputationelastic fibers are indicated by green arrows in the figure
3 討論
本文使用兔建立截肢動物模型，在實驗周期設計上參照實驗室環境下兔子平均壽命為10年[36]，且成年期人類壽命1年相當于兔子的18.25天[37]兩個標準，設計實驗周期為3個月共92天，時間上等同于人類截肢后4~5年的心血管系統變化。
LDL-C含量的升高會引起泡沫細胞的生成及增殖，后者刺激VSMC增殖，將促進動脈粥樣硬化斑塊的發生與發展[38-39]。而本文實驗結果發現，相比A組實驗兔，B組和C組血液中LDL-C含量均明顯偏高（P < 0.05），這表明截肢術后實驗兔的心血管系統抵抗動脈粥樣硬化的能力變弱了，結合前文血液中LDL-C的含量升高能夠說明脂質在血管內部有沉積的現象。同時，B、C兩組LDL-C含量差異有統計學意義，說明不同截肢水平對血液中LDL-C含量的影響是不同的，由此產生的心血管疾病的潛在風險是不同的。另一方面，HDL-C具有清潔疏通動脈的功能，含量越高，動物患心血管疾病的風險越小[40]，而血液中HDL-C含量表現為A組 > B組 > C組。LDL-C和HDL-C是TC的主要成分，占比高達80%~90%[41]，血液中TC含量檢測結果為A組 < B組、C組，這與截肢術后體內LDL-C含量的升高與HDL-C含量的減少有直接聯系。關于下肢截肢者動脈硬化的研究中提到，下肢截肢者體內TC水平（195.6 vs 183.8，單位：mg/dL，P = 0.006）及LDL-C水平（136.1 vs 117.2，單位：mg/dL，P = 0.002）顯著高于正常人，而HDL水平則剛好相反（40.0 vs 45.7，單位：mg/dL，P = 0.004）[42]，動物實驗的研究結果也與此相符。
研究表明血壓水平可由ANP及BNP調控[26-30]，截肢術后血液中ANP、BNP含量的升高說明動物體內血壓升高，動物機體的血壓自我調節在這一過程中起到作用，以此達到降壓效果。此外，因截肢使血管受到嚴重損傷，受損血管將再生[31-33]。術后7天B、C組與A組的α-SMA組間含量差異有統計學意義（P < 0.05），這表明截肢后VSMC由收縮型向增殖和活動型的表型轉換，是修復受損血管的生理反應。此外，截肢導致的血管內皮損傷和炎癥會使得增殖的VSMC通過內膜，吞噬沉積于此的脂質，促進動脈粥樣硬化斑塊的形成[32]。
對比不同截肢水平組的生化檢測結果，發現B組血液中LDL-C、TC、ANP和BNP的含量低于C組，而HDL-C含量偏高。出現這種反常現象的原因是由于BKA相比于AKA，雖然受創面更小，但恢復速度更慢，即截肢水平高傷口恢復速度反而更快。有研究針對AKA和BKA患者作了長期的跟隨觀察，發現AKA患者的傷愈率和傷愈速度均高于BKA患者（91% vs 81%）[43-44]；同時，AKA患者出現傷口感染的概率小于BKA患者（22.6% vs 29.4%）[45]。2004年美國機構對下肢截肢的印第安人進行調查，發現AKA患者患糖尿病的概率遠低于BKA患者[46]。另有研究表明，AKA患者的傷愈速度大于BKA患者，但死亡率方面，AKA患者的三年存活率小于BKA患者（55% vs 78%）[47]。相關研究表明，AKA手術雖然丟失肌肉和血管更多，但由于無需傳輸血液到心臟遠端，負荷減小，故術后恢復速度更快；與AKA患者不同的是，殘端的血液供應對BKA患者傷口的愈合非常重要，這與傷愈速度直接相關[48]。截肢術后傷愈速度的快慢與體內炎癥及血管內皮損傷持續的時間有直接聯系，這也從另一方面表明為何術后初期BKA患者心血管系統受損的程度大于AKA患者。但AKA手術畢竟會導致大量失血并且是人體形態的巨大改變，手術對身體的影響會隨時間的增加而日益加重，造成數年后死亡率高于BKA組的情況。
HE染色結果表明主動脈弓處B組出現中度內皮細胞壞死，C組出現輕度彈性纖維斷裂，說明BKA對主動脈弓的損傷小于AKA；由VG染色結果計算得到的EFEP可知，B組腹主動脈處的血管硬化程度高于C組，結合主動脈弓處的HE染色結果，說明AKA對主干動脈的損傷大于BKA，這可能是AKA致死率更高的一個重要因素[49-50]。股動脈處HE染色結果表明因截肢處血液循環被阻斷，將直接影響血管的血液運輸情況，局部血流動力學發生改變導致血管壓力驟然增大，故血管極有可能受到機械損傷。而股動脈處的EFEP結果表明，B、C組的血管彈性大于A組，這表明在截肢末端處，因修復損傷血管導致血管生長，使得血管彈性升高[50-51]。
4 結論
為探究不同截肢水平對心血管系統的影響有何不同，本文基于兔子與人類心血管系統的相似性選擇兔子作為研究模型，建立不同截肢水平（AKA、BKA）的動物模型，通過對比各組血液指標參數及各組織的損傷程度、形態學差異，發現截肢水平不同會對動物心血管系統造成不同程度的損傷，且截肢水平越高對心血管系統造成的損傷越大，AKA相較BKA手術會使主干動脈受到更嚴重的損傷，這是AKA患者術后五年生存率低于BKA患者的主要原因。此外，實驗也發現截肢處受損血管會再生，使得截肢處側肌纖維變小、變少，血管側支增多。本研究將有助于進一步探究截肢影響心血管系統的內在機制，并根據患者截肢水平的不同，在術后進行更全面且更有針對性的監測，進行必要的干預以預防心血管疾病的發生。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：蔣文濤主要負責項目主持、實驗設計以及論文審閱修訂；閔磊主要負責動物實驗方案的制定及實施、實驗數據分析及論文編寫；李忠友主要負責數據分析指導以及論文修訂；劉任靜、刁珺杰和邰天翔參與結果討論及論文修訂；李瀟和白逃萍主要負責實驗方案設計指導。
倫理聲明：本實驗通過了四川大學醫學倫理委員會的審批（批文編號：K2022002）。
