中性粒細胞釋放的胞外誘捕網（NETs）是一把雙刃劍，了解NETs的形成機制對疾病治療具有重要意義。然而，壽命短、個體差異大以及無法進行基因編輯使得中性粒細胞難以被用來破譯NETs的形成。因此，尋找模式細胞替代中性粒細胞來研究NETs的形成機制是非常有必要的。在本研究中，我們使用不同濃度（0、0.1、1和10 μmol/L）的全反式維甲酸（ATRA）對HL-60細胞進行不同天數的分化（1、3、5和7天）。通過檢測細胞活力和細胞核形態，我們證實HL-60細胞經ATRA處理5天后可以分化為中性粒細胞樣細胞（dHL-60）。使用免疫熒光染色檢測NETs的形成，結果表明1 μmol/L的ATRA分化5天得到的dHL-60細胞在佛波酯（PMA）刺激下產生的NETs與中性粒細胞產生的相當，且都不伴隨組蛋白H3瓜氨酸化。此外，dHL-60 細胞形成的NETs依賴于NADPH而不依賴于PAD4，這與中性粒細胞一致。這些結果表明，經1 μmol/L ATRA分化5天的dHL-60細胞可作為中性粒細胞的模式細胞，用于NETs形成機制的研究。
引用本文： 劉望, 方金花, 洪天添, 黃嘉祺, 趙柏松, 方穎, 吳建華, 林蔣國. 全反式維甲酸誘導分化的HL-60在佛波酯刺激下產生中性粒細胞胞外誘捕網的特性. 生物醫學工程學雜志, 2022, 39(5): 909-918. doi: 10.7507/1001-5515.202205002 復制
引言
中性粒細胞通過不同的機制清除入侵機體的微生物，包括吞噬、脫顆粒和形成中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）[1]。NETs是鑲嵌著多種抗菌蛋白的DNA網絡，包括瓜氨酸化組蛋白、彈性蛋白、過氧化物酶和肽酰基精氨酸脫亞氨酶4（peptidylarginine deiminase 4，PAD4）[2]。越來越多的證據表明NETs參與了多種疾病的發生發展，例如癌癥[3]、系統性紅斑狼瘡[4]和血栓[5]等。
多種刺激劑被報道可以引起NETs，包括佛波脂（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、活化的血小板和離子霉素[6-9]。值得注意的是，NETs形成的信號通路因刺激劑的不同而不同。PMA活化中性粒細胞的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）產生活性氧（reactive oxygen species，ROS），導致核膜和細胞膜的破裂，最終導致NETs釋放到胞外[10]。中性粒細胞的這一特殊死亡方式被稱為NETosis。NADPH依賴的NETs形成往往超過2 h，被稱為自殺型NETosis（suicidal NETosis）。相反，金黃色葡萄球菌可以在5 ～ 60 min內以非NADPH依賴的方式誘導NETs形成[11]。在這一快速過程中，DNA通過囊泡的方式被釋放到胞外，而細胞膜保持完整，被稱為活力型NETosis（vital NETosis）。
除了化學信號外，中性粒細胞所處的力學微環境也參與調控NETosis。血流動力學觸發無菌血栓性閉塞中的中性粒細胞快速產生NETs[12]。基底硬度通過黏著斑激酶的活化引起NETs形成[13]。力敏感蛋白整合素[14]、選擇素[15]、CD44[16]和細胞骨架蛋白[8,10]均被報道參與調控NETs形成。然而，力學信號和化學信號是如何協同介導NETs產生的，尚未完全清楚。其中一個原因是，中性粒細胞是終末分化細胞，不能進行基因改造，因而難以闡明不同蛋白在NETosis不同階段中的作用。因此，有必要利用一種合適的中性粒細胞細胞系模型來進一步破解NETs形成的機制。
HL-60細胞系是人早幼粒白血病細胞，可通過多種試劑［如全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、次黃嘌呤或二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF）］誘導分化為中性粒細胞樣細胞（dHL-60）[17-18]。dHL-60已被廣泛用于研究中性粒細胞的滾動、黏附、遷移和信號傳導等過程[19-20]。dHL-60也被用于NETs形成機制的研究[21-25]。DMSO誘導分化的HL-60（DMSO-dHL-60）在Ca2+刺激下產生的NETs依賴于PAD4，而在PMA刺激下產生的NETs依賴于NADPH[26]。然而，也有報道指出，DMSO-dHL-60在鈣離子載體A23187刺激下能釋放出NETs，而PMA刺激則不能產生NETs[27]。這可能是由于dHL-60的分化程度不同，從而導致不同的實驗結果。因此，本研究的目的是尋找一種合適的分化條件，在這種條件下，dHL-60可以作為中性粒細胞的模式細胞來研究NETs的形成。
DMSO和DMF都是有機試劑，會增加細胞的通透性，不利于NETs形成的研究[27]。ATRA是美國食品藥品監督管理局批準的治療急性早幼粒細胞白血病的藥物，被用于誘導分化HL-60細胞[28-29]。此外，ATRA誘導分化的HL-60細胞（ATRA-dHL-60）的吞噬能力與中性粒細胞相似，而DMSO-dHL-60與中性粒細胞相比沒有表現出類似的抗菌活性[30]。因此，我們使用了不同濃度（0、0.1、1和10 μmol/L）的ATRA對HL-60細胞進行不同時間（1、3、5和7天）的分化，以探索dHL-60產生NETs的條件。
1 材料與方法
1.1 細胞
HL-60細胞購自美國模式培養物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。中性粒細胞均分離自健康志愿者外周靜脈血。所有志愿者對此項研究知情，并簽署知情同意書。
1.2 主要試劑
RPMI1640細胞培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（Gibco，美國）；臺盼藍、吉姆薩染色液（碧云天，中國）；Hoechst 33342、Sytox Green（Invitrogen，美國）；抗瓜氨酸化組蛋白H3（citrullination histone 3，CitH3）抗體、山羊抗兔IgG H&L（Abcam，英國）；中性粒細胞分離液1119和1077、紅細胞裂解液、聚-L-賴氨酸（poly-L-lysine，PLL）、ATRA、PMA、二亞苯基碘鎓氯化物（diphenyleneiodonium chloride，DPI）、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）（Sigma，美國）；GSK484（Cayman Chemical Company，美國）；μ-slide 8孔腔室載玻片（Ibidi，德國）。
1.3 細胞培養和ATRA分化
在37 ℃、含5%二氧化碳的細胞培養箱中，用含10% FBS的RPMI1640培養基培養HL-60細胞。為分化HL-60細胞，將HL-60細胞與0.1、1或10 μmol/L ATRA分別培養1、3、5和7天，每天定時更換培養基。用不含ATRA（0 μmol/L）的培養基培養的HL-60細胞作為陰性對照。
1.4 細胞活力和核形態評估
在第1、3、5、7天，收集細胞分別用臺盼藍和吉姆薩染色法評估分化細胞的活力和細胞核形態。細胞用0.4%臺盼藍室溫染色5 min，吸取10 μL樣品制成臨時封片，顯微鏡觀察并計算HL-60細胞生存率。此外，將細胞以4×106個/孔的密度接種到提前孵育有PLL的載玻片上，待玻片風干后用吉姆薩染色液染色，100倍物鏡下隨機拍攝dHL-60細胞圖像，觀察細胞形態。
1.5 人中性粒細胞的分離
將中性粒細胞分離液1119和1077加入15 mL離心管底部，貼壁將人外周血緩慢加到分離液上層，室溫下700 g離心30 min。吸取中性粒細胞層，加入紅細胞裂解液在37 ℃裂解10 min，去除殘留紅細胞。最后用含10% FBS的RPMI1640培養基將細胞稀釋至3×106#/mL。
1.6 PMA誘導NETs形成和抑制試驗
將dHL-60細胞或中性粒細胞分別接種到PLL預處理的Ibidi 8孔板內，在細胞培養箱中培養30 min確保細胞穩定黏附。用100 ng/mL PMA刺激實驗組細胞4 h；同時，用含10% FBS的RPMI1640培養基孵育細胞用作陰性對照。在37 ℃下用2% BSA封閉1 h，以便進行免疫熒光染色。為定量精氨酸（R2+R8+R17）被瓜氨酸化的組蛋白H3含量，先用抗CitH3一抗（1∶200）孵育1 h，再用偶聯Alexa Fluor 594的山羊抗兔二抗（1∶200）孵育30 min。在非細胞滲透性DNA染料（Sytox Green）染色20 min后，加入細胞滲透性DNA染料（Hoechst 33342）染色20 min。用Nikon Ti2-U倒置熒光顯微鏡觀察并隨機拍攝細胞。在60倍鏡下，每孔至少拍攝10個視野，每個視野都拍攝明場白光和藍色（DAPI）、綠色（FITC）及紅色（Texared）熒光通道各一張。為探索NADPH和PAD4對dHL-60形成NETs的影響，在細胞黏附前用DPI（10 μmol/L）或GSK484（10 μmol/L）預處理細胞30 min。其余實驗步驟同上。
1.7 NETs定量
為量化細胞形成的NETs，使用ImageJ軟件統計明場視野中的細胞個數，并分析免疫熒光圖片中Sytox Green或CitH3陽性信號的面積和熒光強度。為排除細胞數量的影響，NETs或CitH3的面積和熒光強度均除以細胞總數。此外，為排除個體差異性，所有實驗結果均用陰性對照的平均值進行歸一化處理，用NETs或CitH3的相對面積和相對熒光強度表示。
1.8 統計學方法
使用 GraphPad Prism 7.0處理所有數據，數據表示為均數±標準誤（mean ± SEM）。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）、雙因素方差分析（two-way ANOVA）和Tukey多重比較，以及曼-惠特尼U檢驗（Mann Whitney test）分析各組數據間的差異。檢驗水準為0.05。
2 結果
2.1 ATRA誘導HL-60細胞向粒細胞樣分化
為了探索HL-60細胞形成NETs的適宜分化條件，我們用不同濃度（0、0.1、1和10 μmol/L）的ATRA處理HL-60細胞不同天數（1、3、5和7天）。未處理組（0 μmol/L）第7天的活細胞數量為第1天的10倍（見圖1a）。在0.1或1 μmol/L ATRA處理下，第7天活細胞數量僅為第1天的4倍左右。值得注意的是，在10 μmol/L ATRA處理下，HL-60細胞的數量幾乎保持恒定，表明高濃度的ATRA干擾了HL-60細胞的增殖能力（見圖1a）。
圖1
使用ATRA將HL-60細胞分化為中性粒細胞樣細胞
HL-60細胞分別用0、0.1、1、10 μmol/L的ATRA處理1、3、5和7天。a. 臺盼藍染色檢測細胞數量和細胞活力；b. 分化1、3、5、7天后的HL-60細胞，吉姆薩染色后的細胞形態，比例尺為30 µm；c. 細胞在分化過程中的5種類型。數據代表至少3次獨立實驗的平均值±標準誤
Figure1. HL-60 cells were differentiated to neutrophil-like cells by ATRAHL-60 cells were treated with 0, 0.1, 1, and 10 μmol/L ATRA for 1, 3, 5, and 7 days respectively. a. the cell numbers and viability of the cells were measured by the trypan blue method. b. cell morphology was shown by Giemsa stain after 1-, 3-, 5-, and 7-day differentiation. The scale bar was 30 µm. c. cells were classified into 5 types during the differentiation process. The data represent the mean ± SEM from at least 3 independent experiments
處于不同分化階段的HL-60細胞可分為早幼粒細胞、髓細胞、后髓細胞、帶狀細胞和多形核白細胞（polymorphonuclear leukocyte，PMN）[31]。正如預期的那樣，HL-60細胞的分化程度具有時間依賴性。在1 μmol/L和10 μmol/L ATRA處理條件下，第3天有37.52%的HL-60細胞開始變成PMN（見圖1b）；隨著分化時間的進一步增加，PMN在第5天分別增加到66.43%和70.46%，而在第7天則分別達到75.37%和74.68%（見圖1c）。相比之下，HL-60細胞的核形態在未誘導組（0 μmol/L組）從第1天到第7天都沒有顯著變化（見圖1b～c）。這些數據表明，在1或10 μmol/L ATRA的誘導下大多數HL-60細胞在5天后成功分化為中性粒細胞樣細胞。
2.2 1 μmol/L ATRA處理5天是dHL-60細胞在PMA刺激下有效形成NETs的最佳分化條件
為了探究不同分化條件下的HL-60細胞產生NETs的能力，我們利用100 ng/mL的PMA刺激dHL-60細胞產生NETs。分化1天后的HL-60細胞受到PMA刺激后，只有少數細胞呈現Sytox Green陽性且細胞形態變圓，但是沒有觀察到彌散的DNA結構。分化3天后的HL-60在受到PMA刺激后有部分細胞產生了NETs。然而，只有10 μmol/L ATRA組的NETs面積顯著高于未分化組，其余ATRA濃度組與未分化組之間沒有顯著差異。
與分化1天和3天后的HL-60細胞相比，分化5天后的HL-60細胞受到PMA刺激后能產生更強的Sytox Green信號，且在1 μmol/L和10 μmol/L ATRA組中均觀察到云霧狀的NET-DNA結構（見圖2a）。定量分析結果顯示，NET-DNA的面積和熒光強度隨著ATRA濃度的升高而升高。值得注意的是，與未分化組相比，1 μmol/L ATRA組和10 μmol/L ATRA組的NET-DNA面積分別增加至約7倍和8倍（見圖2b），NET-DNA熒光強度分別增加至約3倍和4倍（見圖2c）。這些數據表明，用1 μmol/L或10 μmol/L的ATRA分化處理5天后的HL-60細胞在受到PMA刺激時能產生明顯的NETs。我們同樣定量分析了分化5天后的HL-60細胞受PMA刺激后CitH3的形成情況（見圖2d）。與NET-DNA不同，分化組的CitH3面積和熒光強度與未分化組相比沒有顯著差異（見圖2e～f）。
圖2
分化5天后PMA刺激HL-60細胞形成NETs
HL-60細胞用不同濃度的ATRA（0、0.1、1和10 μmol/L）處理5天，并用100 ng/mL PMA 刺激4 h。a. HL-60細胞形成NETs的免疫熒光代表性圖片，比例尺為50 μm；b和c. PMA刺激后NETs相對面積和相對熒光強度的定量結果；d. HL-60細胞CitH3的免疫熒光代表性圖片，比例尺為50 μm；e和f. PMA刺激后CitH3相對面積和相對熒光強度的定量結果。數據代表至少3次獨立實驗的平均值±SEM。采用one-way ANOVA進行統計學分析，Tukey檢驗進行多重比較。NS，無顯著差異；*，
HL-60 cells were treated with different concentrations of ATRA (0, 0.1, 1, and 10 μmol/L) for five days, and stimulated by 100 ng/mL PMA for 4 h. a. the representative immunofluorescent images of NET formation by HL-60 cells, the scale bar was 50 μm; b and c. the quantitative results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity after PMA stimulated; d. the representative immunofluorescent images of CitH3, the scale bar was 50 μm; e and f. the quantitative results of relative CitH3 area and relative CitH3 fluorescent intensity after PMA stimulated. The data represent the mean ± SEM from at least 3 independent experiments. Statistical significance was analyzed by one-way ANOVA for multiple comparisons with Tukey’s test. NS, no significance; *,
接著，我們想探究延長分化時間是否有利于增強dHL-60細胞形成NETs的能力。意外的是分化處理7天的HL-60細胞在PMA刺激4 h后并沒有觀察到云霧狀DNA結構。定量結果表明，1 μmol/L和10 μmol/L ATRA組的NET-DNA與CitH3的熒光面積和熒光強度與未分化組相比差異沒有統計學意義。考慮到分化處理7天后HL-60活細胞的比例會下降（見圖1a），分化7天后HL-60細胞NETs形成能力的減弱可能是由于長時間孵育時ATRA的細胞毒性所導致的。
當將所有分化條件下的數據放在一起時，可觀察到以1 μmol/L或10 μmol/L ATRA分化處理5天的HL-60細胞的NET-DNA面積顯著高于其他分化條件組（見圖3a～b）。所有分化條件組之間的CitH3面積和熒光強度均沒有顯著差異（見圖3c～d）。用1 μmol/L或10 μmol/L ATRA分化處理5天的HL-60細胞的NETs形成能力相當，但1 μmol/L ATRA組具有更低的細胞毒性（見圖3a和圖1a）。因此，在本研究中分化HL-60的最優條件為1 μmol/L ATRA處理5天。
圖3
用不同濃度ATRA進行不同天數的分化處理后HL-60細胞在PMA刺激下的NETs形成
HL-60細胞分別用0、0.1、1、10 μmol/L的ATRA處理1、3、5和7天，用100 ng/mL PMA 刺激4 h。a和b. 不同分化條件下dHL-60細胞形成的NETs相對面積和相對熒光強度的定量結果；c和d. 不同分化條件下dHL-60細胞形成的CitH3相對面積和相對熒光強度的定量結果。數據代表至少3次獨立實驗的平均值±SEM。采用two-way ANOVA 分析，Tukey檢驗進行多重比較。*，
HL-60 cells were treated with 0, 0.1, 1, and 10 μmol/L ATRA for 1, 3, 5, and 7 days respectively, and then stimulated by 100 ng/mL PMA for 4 h. a and b. the summary quantification results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity formed by dHL-60 cells under different differentiation conditions; c and d. the summary quantitative results of relative CitH3 area and relative CitH3 fluorescent intensity formed by dHL-60 cells under different differentiation conditions. The data represent the mean ± SEM from at least 3 independent experiments. Statistical significance was analyzed by two-way ANOVA for multiple comparisons with Tukey’s test. *,
為了驗證ATRA-dHL-60細胞是否適合作為中性粒細胞的模式細胞用于研究NETs形成機制，我們比較了最優分化條件下的HL-60細胞和中性粒細胞在PMA刺激下的NETs形成能力。與各自的未刺激組相比，dHL-60細胞和中性粒細胞在受到PMA刺激后產生的NET-DNA面積分別增加至3倍和6倍，NET-DNA熒光強度分別增加至10倍和12倍（見圖4a～c）。與中性粒細胞相似，PMA刺激下的dHL-60呈現低水平的CitH3，且與未刺激組相比沒有顯著差異（見圖4d～f）。這些數據表明，以1 μmol/L ATRA處理5天獲得的dHL-60細胞在受到PMA刺激時產生NETs的能力與中性粒細胞相當。
圖4
PMA刺激下dHL-60細胞形成的NETs與中性粒細胞相當
dHL-60細胞（1 μmol/L ATRA分化5天）用PMA刺激并與中性粒細胞進行比較。a. NETs的代表性熒光圖像，比例尺為50 μm；b和c. PMA刺激后dHL-60細胞和中性粒細胞產生的NETs相對面積和相對熒光強度的定量結果；d. CitH3的代表性熒光圖像，比例尺為50 μm；e和f. PMA刺激后dHL-60細胞和中性粒細胞產生的相對CitH3面積和相對CitH3熒光強度的定量結果。數據代表至少3次獨立實驗的平均值± SEM。采用Mann Whitney檢驗進行統計學分析。NS，無顯著差異；**，
dHL-60 cells (1 μmol/L ATRA differentiated for 5 days) were stimulated with PMA and compared to blood-derived neutrophils (PMN). a. the representative immunofluorescent images of NETs, the scale bar was 50 μm; b and c. the quantitative results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity for dHL-60 cells and neutrophils after PMA stimulated; d. the representative immunofluorescent images of CitH3, the scale bar was 50 μm; e and f. the quantitative results of relative CitH3 area and relative CitH3 fluorescent intensity for dHL-60 cells and neutrophils after PMA stimulated. The data represent the mean ± SEM from at least 3 independent experiments. Statistical significance was analyzed by Mann Whitney test. NS, no significance; **,
2.3 NADPH在PMA誘導的dHL-60細胞NETs形成中起著重要作用
研究表明NADPH在PMA誘導的NETs形成中起著重要作用[32-33]。為了探究NADPH是否同樣在dHL-60細胞NETs形成中起著重要作用，我們使用NADPH抑制劑DPI預處理最佳分化條件下的dHL-60細胞30 min，然后使用PMA誘導其產生NETs。結果表明，經過DPI預處理后能顯著降低dHL-60細胞產生的NET-DNA面積（下降至未處理組的16.38%）和NET-DNA熒光強度（下降至未處理組的19.13%）。未處理組與溶劑對照組之間沒有顯著差異（見圖5）。這些數據表明PMA刺激dHL-60細胞產生NETs依賴于NADPH。
圖5
NADPH參與PMA刺激的NETs的形成
HL-60細胞用1 μmol/L ATRA處理5天，用100 ng/mL PMA 刺激4 h。a. PMA刺激的dHL-60細胞（Ctrl）、PMA刺激的dHL-60細胞在溶劑（DMSO）或DPI（NADPH抑制劑）存在下的NETs熒光圖像，比例尺為50 μm；b和c. 相對NETs面積和相對NETs熒光強度的定量結果；d. PMA刺激的dHL-60細胞（Ctrl）、PMA刺激的dHL-60細胞在溶劑（DMSO）或DPI存在下的CitH3熒光圖像，比例尺為50 μm；e和f. 相對CitH3面積和相對CitH3熒光強度的定量結果。數據代表至少3次獨立實驗的平均值±SEM。采用one-way ANOVA進行統計學分析，Tukey檢驗進行多重比較。NS，無顯著性差異；*，
HL-60 cells were treated with 1 μmol/L ATRA for 5 days and then stimulated by 100 ng/mL PMA for 4 h. a. the representative NETs images of PMA stimulated dHL-60 cells (Ctrl), PMA stimulated dHL-60 cells in presence of the vehicle (DMSO) or DPI (NADPH inhibitor), the scale bar was 50 μm; b and c. the quantitative results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity; d. the representative CitH3 images of PMA stimulated dHL-60 cells (Ctrl), PMA stimulated dHL-60 cells in presence of the vehicle (DMSO) or DPI, the scale bar was 50 μm; e and f. the quantitative results of relative CitH3 area and relative CitH3 fluorescent intensity. The data represent the mean ± SEM from at least 3 independent experiments. Statistical significance was analyzed by one-way ANOVA for multiple comparisons with Tukey’s test. NS, no significance; *,
2.4 PMA刺激dHL-60細胞形成NETs不依賴于PAD4
研究報道PAD4參與NETs的形成，其機制是PAD4能將組蛋白上的精氨酸轉變為瓜氨酸，使組蛋白表面正電荷減少，從而促進染色質的解聚[34-35]。因此，CitH3的水平被用于反映PAD4的活性和作為NETs形成的標志物[22]。然而，同樣有文獻報道存在不依賴于PAD4的NETs形成機制[36]。為了探究PMA誘導的dHL-60細胞NETs形成是否依賴于PAD4，我們使用PAD4抑制劑GSK484預處理最優分化條件下的dHL-60細胞30 min，再使用PMA誘導NETs形成。結果表明，抑制PAD4對NET-DNA的面積和熒光強度沒有影響（見圖6a～c）。與未處理組相比，PAD4抑制組的CitH3面積和熒光強度均顯著降低（分別降低至21.33%和10.55%）（見圖6d～f）。這些數據表明PAD4沒有參與PMA刺激dHL-60-細胞的NETs形成。
圖6
PAD4不參與PMA刺激的NETs的形成
HL-60細胞用1 μmol/L ATRA處理5天，用100 ng/mL PMA 刺激4 h。a. PMA刺激的dHL-60細胞（Ctrl）、PMA刺激的dHL-60細胞在溶劑（DMSO）或GSK484（PAD4抑制劑）存在下的NETs熒光圖像，比例尺為50 μm；b和c. 相對NETs面積和相對NETs熒光強度的定量結果；d. PMA刺激的dHL-60細胞（Ctrl）、PMA刺激的dHL-60細胞在溶劑（DMSO）或GSK484存在下的CitH3熒光圖像，比例尺為50 μm；e和f. 相對CitH3面積和相對CitH3熒光強度的定量結果。數據代表至少3次獨立實驗的平均值±SEM。采用one-way ANOVA進行統計學分析，Tukey檢驗進行多重比較。NS，無顯著差異；*，
HL-60 cells were treated with 1 μmol/L ATRA for 5 days and then stimulated by 100 ng/mL PMA for 4 h. a. the representative NETs images of PMA stimulated dHL-60 cells (Ctrl), PMA stimulated dHL-60 cells in presence of the vehicle (DMSO) or GSK484 (PAD4 inhibitor), the scale bar was 50 μm; b and c. the quantitative results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity; d. the representative CitH3 images of PMA stimulated dHL-60 cells (Ctrl), PMA stimulated dHL-60 cells in presence of the vehicle (DMSO) or GSK484, the scale bar was 50 μm; e and f. the quantitative results of relative CitH3 area and relative CitH3 fluorescent intensity. The data represent the mean ± SEM from at least 3 independent experiments. Statistical significance was analyzed by one-way ANOVA for multiple comparisons with Tukey’s test. NS, no significance; *,
3 討論
NETs可以保護機體免受微生物入侵，然而它是把雙刃劍，正如在自身免疫性疾病、凝血障礙、癌癥轉移、敗血癥和COVID-19研究中報道的那樣，過多的NETs產生是有害的[37-38]。因此，了解NETs形成和降解的機制對于有效治療細菌感染和NETs相關疾病具有重要意義。
從新鮮血液中獲得的中性粒細胞數目有限，供體個體間的差異可能會影響研究結果。此外，中性粒細胞處于終末分化狀態，無法進一步進行基因改造，使得NETs形成的機制研究存在困難。盡管基因動物模型及其中性粒細胞被用于探索NETs的形成，但由于物種差異，動物研究中的一些發現可能無法直接反映到人類身上。因此，有必要利用人中性粒細胞樣細胞模型來研究NETs形成的機制。為此，我們在本研究中采用ATRA來誘導分化HL-60，并用PMA刺激dHL-60以研究NETs的形成。我們用不同濃度（0、0.1、1和10 μmol/L）的ATRA對HL-60進行不同天數（1、3、5和7天）的分化。通過分析細胞活力和核形態，我們發現HL-60細胞在分化5天后成為中性粒細胞樣細胞（見圖1）。我們的結果還表明，dHL-60細胞在100 ng/mL PMA刺激下可以形成NETs。
此前的一項研究使用不同的誘導劑對HL-60細胞進行誘導分化5天，結果表明，ATRA-dHL-60細胞僅在PMA刺激下釋放NETs，DMSO-dHL-60細胞僅在A23187刺激下釋放NETs，而DMF-dHL-60細胞在上述兩種刺激劑下均能釋放NETs[27]。Kawakami等[21]用1 μmol/L的ATRA誘導分化HL-60細胞3天，然而在PMA刺激4小時后，只有少數dHL-60細胞產生云霧狀的NETs結構，這與本研究的結果一致。類似地，最近一項研究表明，當HL-60細胞用DMSO誘導分化3天時，在PMA或金黃色葡萄球菌刺激下，dHL-60細胞產生NETs的能力受到限制[30]。這些觀察結果表明無論是用ATRA還是DMSO，分化3天的dHL-60細胞在PMA刺激下產生的NETs有限。這可能是因為分化時間不夠所導致的。然而，由于ATRA存在細胞毒性，HL-60分化超過6天后細胞活力顯著降低[24]，NETs形成的能力下降。Guo等[24]根據細胞表面標記物和細胞活力判斷，ATRA誘導分化HL-60細胞5天是最佳條件，這與我們的結果一致（見圖1）。我們的研究結果還表明：1 μmol/L的ATRA處理HL-60細胞5天是獲得dHL-60細胞的最佳條件，這一條件下處理的細胞在PMA刺激時能產生大量的NETs（見圖2和圖3a）。
NADPH氧化酶產生ROS在自殺型NETosis中扮演著重要的角色。在PMA引起的NETosis中，NADPH活性和ROS生成顯著增加[27,39]。DPI處理幾乎完全消除了ROS的產生和NETs的形成[40]。在我們的研究中，DPI抑制了PMA刺激下dHL-60細胞NETs的形成，表明這一過程依賴于NADPH。此前的研究也表明，在PMA刺激下，不同誘導劑誘導分化的dHL-60產生NETs依賴于NADPH[21,26]。
PAD4在NETosis中具有重要作用[34-35]。PAD4將組蛋白中帶正電荷的精氨酸轉化為不帶電荷的瓜氨酸，導致染色質解聚和NETosis[22]。值得注意的是，PMA引起的NETs形成既可以依賴于PAD4[41]，也可以不依賴于PAD4[14,42-43]。本研究顯示，PMA刺激ATRA-dHL-60產生的NETs不依賴于PAD4（見圖4），盡管PAD4的抑制劑GSK484抑制了H3的瓜氨酸化（見圖6）。這些結果與此前報道的一致，PMA刺激人中性粒細胞和dHL-60并未導致組蛋白瓜氨酸化水平增加[24,27]。
4 總結
我們發現1 μmol/L的ATRA誘導分化HL-60細胞5天是獲得dHL-60的最佳條件，此條件處理后的dHL-60在PMA刺激下可以產生足夠的NETs。在PMA刺激下，ATRA-dHL-60產生NETs依賴于NADPH而不依賴于PAD4，這與人中性粒細胞一致。因此，dHL-60可以作為中性粒細胞的模型細胞研究NETs形成，便于用來探索細菌感染和NETs相關疾病的分子機制。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：林蔣國和劉望設計了實驗；劉望、方金花、洪天添和黃嘉祺負責實數據收集和數據分析。林蔣國和劉望撰寫論文初稿；劉望、方金花、趙柏松、方穎、吳建華和林蔣國修改和完善論文手稿。
倫理聲明：本研究通過了廣州市婦女兒童醫療中心倫理委員會的審批（批文編號：2019-37001）。
引言
中性粒細胞通過不同的機制清除入侵機體的微生物，包括吞噬、脫顆粒和形成中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）[1]。NETs是鑲嵌著多種抗菌蛋白的DNA網絡，包括瓜氨酸化組蛋白、彈性蛋白、過氧化物酶和肽酰基精氨酸脫亞氨酶4（peptidylarginine deiminase 4，PAD4）[2]。越來越多的證據表明NETs參與了多種疾病的發生發展，例如癌癥[3]、系統性紅斑狼瘡[4]和血栓[5]等。
多種刺激劑被報道可以引起NETs，包括佛波脂（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、活化的血小板和離子霉素[6-9]。值得注意的是，NETs形成的信號通路因刺激劑的不同而不同。PMA活化中性粒細胞的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）產生活性氧（reactive oxygen species，ROS），導致核膜和細胞膜的破裂，最終導致NETs釋放到胞外[10]。中性粒細胞的這一特殊死亡方式被稱為NETosis。NADPH依賴的NETs形成往往超過2 h，被稱為自殺型NETosis（suicidal NETosis）。相反，金黃色葡萄球菌可以在5 ～ 60 min內以非NADPH依賴的方式誘導NETs形成[11]。在這一快速過程中，DNA通過囊泡的方式被釋放到胞外，而細胞膜保持完整，被稱為活力型NETosis（vital NETosis）。
除了化學信號外，中性粒細胞所處的力學微環境也參與調控NETosis。血流動力學觸發無菌血栓性閉塞中的中性粒細胞快速產生NETs[12]。基底硬度通過黏著斑激酶的活化引起NETs形成[13]。力敏感蛋白整合素[14]、選擇素[15]、CD44[16]和細胞骨架蛋白[8,10]均被報道參與調控NETs形成。然而，力學信號和化學信號是如何協同介導NETs產生的，尚未完全清楚。其中一個原因是，中性粒細胞是終末分化細胞，不能進行基因改造，因而難以闡明不同蛋白在NETosis不同階段中的作用。因此，有必要利用一種合適的中性粒細胞細胞系模型來進一步破解NETs形成的機制。
HL-60細胞系是人早幼粒白血病細胞，可通過多種試劑［如全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、次黃嘌呤或二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF）］誘導分化為中性粒細胞樣細胞（dHL-60）[17-18]。dHL-60已被廣泛用于研究中性粒細胞的滾動、黏附、遷移和信號傳導等過程[19-20]。dHL-60也被用于NETs形成機制的研究[21-25]。DMSO誘導分化的HL-60（DMSO-dHL-60）在Ca2+刺激下產生的NETs依賴于PAD4，而在PMA刺激下產生的NETs依賴于NADPH[26]。然而，也有報道指出，DMSO-dHL-60在鈣離子載體A23187刺激下能釋放出NETs，而PMA刺激則不能產生NETs[27]。這可能是由于dHL-60的分化程度不同，從而導致不同的實驗結果。因此，本研究的目的是尋找一種合適的分化條件，在這種條件下，dHL-60可以作為中性粒細胞的模式細胞來研究NETs的形成。
DMSO和DMF都是有機試劑，會增加細胞的通透性，不利于NETs形成的研究[27]。ATRA是美國食品藥品監督管理局批準的治療急性早幼粒細胞白血病的藥物，被用于誘導分化HL-60細胞[28-29]。此外，ATRA誘導分化的HL-60細胞（ATRA-dHL-60）的吞噬能力與中性粒細胞相似，而DMSO-dHL-60與中性粒細胞相比沒有表現出類似的抗菌活性[30]。因此，我們使用了不同濃度（0、0.1、1和10 μmol/L）的ATRA對HL-60細胞進行不同時間（1、3、5和7天）的分化，以探索dHL-60產生NETs的條件。
1 材料與方法
1.1 細胞
HL-60細胞購自美國模式培養物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。中性粒細胞均分離自健康志愿者外周靜脈血。所有志愿者對此項研究知情，并簽署知情同意書。
1.2 主要試劑
RPMI1640細胞培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（Gibco，美國）；臺盼藍、吉姆薩染色液（碧云天，中國）；Hoechst 33342、Sytox Green（Invitrogen，美國）；抗瓜氨酸化組蛋白H3（citrullination histone 3，CitH3）抗體、山羊抗兔IgG H&L（Abcam，英國）；中性粒細胞分離液1119和1077、紅細胞裂解液、聚-L-賴氨酸（poly-L-lysine，PLL）、ATRA、PMA、二亞苯基碘鎓氯化物（diphenyleneiodonium chloride，DPI）、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）（Sigma，美國）；GSK484（Cayman Chemical Company，美國）；μ-slide 8孔腔室載玻片（Ibidi，德國）。
1.3 細胞培養和ATRA分化
在37 ℃、含5%二氧化碳的細胞培養箱中，用含10% FBS的RPMI1640培養基培養HL-60細胞。為分化HL-60細胞，將HL-60細胞與0.1、1或10 μmol/L ATRA分別培養1、3、5和7天，每天定時更換培養基。用不含ATRA（0 μmol/L）的培養基培養的HL-60細胞作為陰性對照。
1.4 細胞活力和核形態評估
在第1、3、5、7天，收集細胞分別用臺盼藍和吉姆薩染色法評估分化細胞的活力和細胞核形態。細胞用0.4%臺盼藍室溫染色5 min，吸取10 μL樣品制成臨時封片，顯微鏡觀察并計算HL-60細胞生存率。此外，將細胞以4×106個/孔的密度接種到提前孵育有PLL的載玻片上，待玻片風干后用吉姆薩染色液染色，100倍物鏡下隨機拍攝dHL-60細胞圖像，觀察細胞形態。
1.5 人中性粒細胞的分離
將中性粒細胞分離液1119和1077加入15 mL離心管底部，貼壁將人外周血緩慢加到分離液上層，室溫下700 g離心30 min。吸取中性粒細胞層，加入紅細胞裂解液在37 ℃裂解10 min，去除殘留紅細胞。最后用含10% FBS的RPMI1640培養基將細胞稀釋至3×106#/mL。
1.6 PMA誘導NETs形成和抑制試驗
將dHL-60細胞或中性粒細胞分別接種到PLL預處理的Ibidi 8孔板內，在細胞培養箱中培養30 min確保細胞穩定黏附。用100 ng/mL PMA刺激實驗組細胞4 h；同時，用含10% FBS的RPMI1640培養基孵育細胞用作陰性對照。在37 ℃下用2% BSA封閉1 h，以便進行免疫熒光染色。為定量精氨酸（R2+R8+R17）被瓜氨酸化的組蛋白H3含量，先用抗CitH3一抗（1∶200）孵育1 h，再用偶聯Alexa Fluor 594的山羊抗兔二抗（1∶200）孵育30 min。在非細胞滲透性DNA染料（Sytox Green）染色20 min后，加入細胞滲透性DNA染料（Hoechst 33342）染色20 min。用Nikon Ti2-U倒置熒光顯微鏡觀察并隨機拍攝細胞。在60倍鏡下，每孔至少拍攝10個視野，每個視野都拍攝明場白光和藍色（DAPI）、綠色（FITC）及紅色（Texared）熒光通道各一張。為探索NADPH和PAD4對dHL-60形成NETs的影響，在細胞黏附前用DPI（10 μmol/L）或GSK484（10 μmol/L）預處理細胞30 min。其余實驗步驟同上。
1.7 NETs定量
為量化細胞形成的NETs，使用ImageJ軟件統計明場視野中的細胞個數，并分析免疫熒光圖片中Sytox Green或CitH3陽性信號的面積和熒光強度。為排除細胞數量的影響，NETs或CitH3的面積和熒光強度均除以細胞總數。此外，為排除個體差異性，所有實驗結果均用陰性對照的平均值進行歸一化處理，用NETs或CitH3的相對面積和相對熒光強度表示。
1.8 統計學方法
使用 GraphPad Prism 7.0處理所有數據，數據表示為均數±標準誤（mean ± SEM）。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）、雙因素方差分析（two-way ANOVA）和Tukey多重比較，以及曼-惠特尼U檢驗（Mann Whitney test）分析各組數據間的差異。檢驗水準為0.05。
2 結果
2.1 ATRA誘導HL-60細胞向粒細胞樣分化
為了探索HL-60細胞形成NETs的適宜分化條件，我們用不同濃度（0、0.1、1和10 μmol/L）的ATRA處理HL-60細胞不同天數（1、3、5和7天）。未處理組（0 μmol/L）第7天的活細胞數量為第1天的10倍（見圖1a）。在0.1或1 μmol/L ATRA處理下，第7天活細胞數量僅為第1天的4倍左右。值得注意的是，在10 μmol/L ATRA處理下，HL-60細胞的數量幾乎保持恒定，表明高濃度的ATRA干擾了HL-60細胞的增殖能力（見圖1a）。
圖1
使用ATRA將HL-60細胞分化為中性粒細胞樣細胞
HL-60細胞分別用0、0.1、1、10 μmol/L的ATRA處理1、3、5和7天。a. 臺盼藍染色檢測細胞數量和細胞活力；b. 分化1、3、5、7天后的HL-60細胞，吉姆薩染色后的細胞形態，比例尺為30 µm；c. 細胞在分化過程中的5種類型。數據代表至少3次獨立實驗的平均值±標準誤
Figure1. HL-60 cells were differentiated to neutrophil-like cells by ATRAHL-60 cells were treated with 0, 0.1, 1, and 10 μmol/L ATRA for 1, 3, 5, and 7 days respectively. a. the cell numbers and viability of the cells were measured by the trypan blue method. b. cell morphology was shown by Giemsa stain after 1-, 3-, 5-, and 7-day differentiation. The scale bar was 30 µm. c. cells were classified into 5 types during the differentiation process. The data represent the mean ± SEM from at least 3 independent experiments
處于不同分化階段的HL-60細胞可分為早幼粒細胞、髓細胞、后髓細胞、帶狀細胞和多形核白細胞（polymorphonuclear leukocyte，PMN）[31]。正如預期的那樣，HL-60細胞的分化程度具有時間依賴性。在1 μmol/L和10 μmol/L ATRA處理條件下，第3天有37.52%的HL-60細胞開始變成PMN（見圖1b）；隨著分化時間的進一步增加，PMN在第5天分別增加到66.43%和70.46%，而在第7天則分別達到75.37%和74.68%（見圖1c）。相比之下，HL-60細胞的核形態在未誘導組（0 μmol/L組）從第1天到第7天都沒有顯著變化（見圖1b～c）。這些數據表明，在1或10 μmol/L ATRA的誘導下大多數HL-60細胞在5天后成功分化為中性粒細胞樣細胞。
2.2 1 μmol/L ATRA處理5天是dHL-60細胞在PMA刺激下有效形成NETs的最佳分化條件
為了探究不同分化條件下的HL-60細胞產生NETs的能力，我們利用100 ng/mL的PMA刺激dHL-60細胞產生NETs。分化1天后的HL-60細胞受到PMA刺激后，只有少數細胞呈現Sytox Green陽性且細胞形態變圓，但是沒有觀察到彌散的DNA結構。分化3天后的HL-60在受到PMA刺激后有部分細胞產生了NETs。然而，只有10 μmol/L ATRA組的NETs面積顯著高于未分化組，其余ATRA濃度組與未分化組之間沒有顯著差異。
與分化1天和3天后的HL-60細胞相比，分化5天后的HL-60細胞受到PMA刺激后能產生更強的Sytox Green信號，且在1 μmol/L和10 μmol/L ATRA組中均觀察到云霧狀的NET-DNA結構（見圖2a）。定量分析結果顯示，NET-DNA的面積和熒光強度隨著ATRA濃度的升高而升高。值得注意的是，與未分化組相比，1 μmol/L ATRA組和10 μmol/L ATRA組的NET-DNA面積分別增加至約7倍和8倍（見圖2b），NET-DNA熒光強度分別增加至約3倍和4倍（見圖2c）。這些數據表明，用1 μmol/L或10 μmol/L的ATRA分化處理5天后的HL-60細胞在受到PMA刺激時能產生明顯的NETs。我們同樣定量分析了分化5天后的HL-60細胞受PMA刺激后CitH3的形成情況（見圖2d）。與NET-DNA不同，分化組的CitH3面積和熒光強度與未分化組相比沒有顯著差異（見圖2e～f）。
圖2
分化5天后PMA刺激HL-60細胞形成NETs
HL-60細胞用不同濃度的ATRA（0、0.1、1和10 μmol/L）處理5天，并用100 ng/mL PMA 刺激4 h。a. HL-60細胞形成NETs的免疫熒光代表性圖片，比例尺為50 μm；b和c. PMA刺激后NETs相對面積和相對熒光強度的定量結果；d. HL-60細胞CitH3的免疫熒光代表性圖片，比例尺為50 μm；e和f. PMA刺激后CitH3相對面積和相對熒光強度的定量結果。數據代表至少3次獨立實驗的平均值±SEM。采用one-way ANOVA進行統計學分析，Tukey檢驗進行多重比較。NS，無顯著差異；*，
HL-60 cells were treated with different concentrations of ATRA (0, 0.1, 1, and 10 μmol/L) for five days, and stimulated by 100 ng/mL PMA for 4 h. a. the representative immunofluorescent images of NET formation by HL-60 cells, the scale bar was 50 μm; b and c. the quantitative results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity after PMA stimulated; d. the representative immunofluorescent images of CitH3, the scale bar was 50 μm; e and f. the quantitative results of relative CitH3 area and relative CitH3 fluorescent intensity after PMA stimulated. The data represent the mean ± SEM from at least 3 independent experiments. Statistical significance was analyzed by one-way ANOVA for multiple comparisons with Tukey’s test. NS, no significance; *,
接著，我們想探究延長分化時間是否有利于增強dHL-60細胞形成NETs的能力。意外的是分化處理7天的HL-60細胞在PMA刺激4 h后并沒有觀察到云霧狀DNA結構。定量結果表明，1 μmol/L和10 μmol/L ATRA組的NET-DNA與CitH3的熒光面積和熒光強度與未分化組相比差異沒有統計學意義。考慮到分化處理7天后HL-60活細胞的比例會下降（見圖1a），分化7天后HL-60細胞NETs形成能力的減弱可能是由于長時間孵育時ATRA的細胞毒性所導致的。
當將所有分化條件下的數據放在一起時，可觀察到以1 μmol/L或10 μmol/L ATRA分化處理5天的HL-60細胞的NET-DNA面積顯著高于其他分化條件組（見圖3a～b）。所有分化條件組之間的CitH3面積和熒光強度均沒有顯著差異（見圖3c～d）。用1 μmol/L或10 μmol/L ATRA分化處理5天的HL-60細胞的NETs形成能力相當，但1 μmol/L ATRA組具有更低的細胞毒性（見圖3a和圖1a）。因此，在本研究中分化HL-60的最優條件為1 μmol/L ATRA處理5天。
圖3
用不同濃度ATRA進行不同天數的分化處理后HL-60細胞在PMA刺激下的NETs形成
HL-60細胞分別用0、0.1、1、10 μmol/L的ATRA處理1、3、5和7天，用100 ng/mL PMA 刺激4 h。a和b. 不同分化條件下dHL-60細胞形成的NETs相對面積和相對熒光強度的定量結果；c和d. 不同分化條件下dHL-60細胞形成的CitH3相對面積和相對熒光強度的定量結果。數據代表至少3次獨立實驗的平均值±SEM。采用two-way ANOVA 分析，Tukey檢驗進行多重比較。*，
HL-60 cells were treated with 0, 0.1, 1, and 10 μmol/L ATRA for 1, 3, 5, and 7 days respectively, and then stimulated by 100 ng/mL PMA for 4 h. a and b. the summary quantification results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity formed by dHL-60 cells under different differentiation conditions; c and d. the summary quantitative results of relative CitH3 area and relative CitH3 fluorescent intensity formed by dHL-60 cells under different differentiation conditions. The data represent the mean ± SEM from at least 3 independent experiments. Statistical significance was analyzed by two-way ANOVA for multiple comparisons with Tukey’s test. *,
為了驗證ATRA-dHL-60細胞是否適合作為中性粒細胞的模式細胞用于研究NETs形成機制，我們比較了最優分化條件下的HL-60細胞和中性粒細胞在PMA刺激下的NETs形成能力。與各自的未刺激組相比，dHL-60細胞和中性粒細胞在受到PMA刺激后產生的NET-DNA面積分別增加至3倍和6倍，NET-DNA熒光強度分別增加至10倍和12倍（見圖4a～c）。與中性粒細胞相似，PMA刺激下的dHL-60呈現低水平的CitH3，且與未刺激組相比沒有顯著差異（見圖4d～f）。這些數據表明，以1 μmol/L ATRA處理5天獲得的dHL-60細胞在受到PMA刺激時產生NETs的能力與中性粒細胞相當。
圖4
PMA刺激下dHL-60細胞形成的NETs與中性粒細胞相當
dHL-60細胞（1 μmol/L ATRA分化5天）用PMA刺激并與中性粒細胞進行比較。a. NETs的代表性熒光圖像，比例尺為50 μm；b和c. PMA刺激后dHL-60細胞和中性粒細胞產生的NETs相對面積和相對熒光強度的定量結果；d. CitH3的代表性熒光圖像，比例尺為50 μm；e和f. PMA刺激后dHL-60細胞和中性粒細胞產生的相對CitH3面積和相對CitH3熒光強度的定量結果。數據代表至少3次獨立實驗的平均值± SEM。采用Mann Whitney檢驗進行統計學分析。NS，無顯著差異；**，
dHL-60 cells (1 μmol/L ATRA differentiated for 5 days) were stimulated with PMA and compared to blood-derived neutrophils (PMN). a. the representative immunofluorescent images of NETs, the scale bar was 50 μm; b and c. the quantitative results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity for dHL-60 cells and neutrophils after PMA stimulated; d. the representative immunofluorescent images of CitH3, the scale bar was 50 μm; e and f. the quantitative results of relative CitH3 area and relative CitH3 fluorescent intensity for dHL-60 cells and neutrophils after PMA stimulated. The data represent the mean ± SEM from at least 3 independent experiments. Statistical significance was analyzed by Mann Whitney test. NS, no significance; **,
2.3 NADPH在PMA誘導的dHL-60細胞NETs形成中起著重要作用
研究表明NADPH在PMA誘導的NETs形成中起著重要作用[32-33]。為了探究NADPH是否同樣在dHL-60細胞NETs形成中起著重要作用，我們使用NADPH抑制劑DPI預處理最佳分化條件下的dHL-60細胞30 min，然后使用PMA誘導其產生NETs。結果表明，經過DPI預處理后能顯著降低dHL-60細胞產生的NET-DNA面積（下降至未處理組的16.38%）和NET-DNA熒光強度（下降至未處理組的19.13%）。未處理組與溶劑對照組之間沒有顯著差異（見圖5）。這些數據表明PMA刺激dHL-60細胞產生NETs依賴于NADPH。
圖5
NADPH參與PMA刺激的NETs的形成
HL-60細胞用1 μmol/L ATRA處理5天，用100 ng/mL PMA 刺激4 h。a. PMA刺激的dHL-60細胞（Ctrl）、PMA刺激的dHL-60細胞在溶劑（DMSO）或DPI（NADPH抑制劑）存在下的NETs熒光圖像，比例尺為50 μm；b和c. 相對NETs面積和相對NETs熒光強度的定量結果；d. PMA刺激的dHL-60細胞（Ctrl）、PMA刺激的dHL-60細胞在溶劑（DMSO）或DPI存在下的CitH3熒光圖像，比例尺為50 μm；e和f. 相對CitH3面積和相對CitH3熒光強度的定量結果。數據代表至少3次獨立實驗的平均值±SEM。采用one-way ANOVA進行統計學分析，Tukey檢驗進行多重比較。NS，無顯著性差異；*，
HL-60 cells were treated with 1 μmol/L ATRA for 5 days and then stimulated by 100 ng/mL PMA for 4 h. a. the representative NETs images of PMA stimulated dHL-60 cells (Ctrl), PMA stimulated dHL-60 cells in presence of the vehicle (DMSO) or DPI (NADPH inhibitor), the scale bar was 50 μm; b and c. the quantitative results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity; d. the representative CitH3 images of PMA stimulated dHL-60 cells (Ctrl), PMA stimulated dHL-60 cells in presence of the vehicle (DMSO) or DPI, the scale bar was 50 μm; e and f. the quantitative results of relative CitH3 area and relative CitH3 fluorescent intensity. The data represent the mean ± SEM from at least 3 independent experiments. Statistical significance was analyzed by one-way ANOVA for multiple comparisons with Tukey’s test. NS, no significance; *,
2.4 PMA刺激dHL-60細胞形成NETs不依賴于PAD4
研究報道PAD4參與NETs的形成，其機制是PAD4能將組蛋白上的精氨酸轉變為瓜氨酸，使組蛋白表面正電荷減少，從而促進染色質的解聚[34-35]。因此，CitH3的水平被用于反映PAD4的活性和作為NETs形成的標志物[22]。然而，同樣有文獻報道存在不依賴于PAD4的NETs形成機制[36]。為了探究PMA誘導的dHL-60細胞NETs形成是否依賴于PAD4，我們使用PAD4抑制劑GSK484預處理最優分化條件下的dHL-60細胞30 min，再使用PMA誘導NETs形成。結果表明，抑制PAD4對NET-DNA的面積和熒光強度沒有影響（見圖6a～c）。與未處理組相比，PAD4抑制組的CitH3面積和熒光強度均顯著降低（分別降低至21.33%和10.55%）（見圖6d～f）。這些數據表明PAD4沒有參與PMA刺激dHL-60-細胞的NETs形成。
圖6
PAD4不參與PMA刺激的NETs的形成
HL-60細胞用1 μmol/L ATRA處理5天，用100 ng/mL PMA 刺激4 h。a. PMA刺激的dHL-60細胞（Ctrl）、PMA刺激的dHL-60細胞在溶劑（DMSO）或GSK484（PAD4抑制劑）存在下的NETs熒光圖像，比例尺為50 μm；b和c. 相對NETs面積和相對NETs熒光強度的定量結果；d. PMA刺激的dHL-60細胞（Ctrl）、PMA刺激的dHL-60細胞在溶劑（DMSO）或GSK484存在下的CitH3熒光圖像，比例尺為50 μm；e和f. 相對CitH3面積和相對CitH3熒光強度的定量結果。數據代表至少3次獨立實驗的平均值±SEM。采用one-way ANOVA進行統計學分析，Tukey檢驗進行多重比較。NS，無顯著差異；*，
HL-60 cells were treated with 1 μmol/L ATRA for 5 days and then stimulated by 100 ng/mL PMA for 4 h. a. the representative NETs images of PMA stimulated dHL-60 cells (Ctrl), PMA stimulated dHL-60 cells in presence of the vehicle (DMSO) or GSK484 (PAD4 inhibitor), the scale bar was 50 μm; b and c. the quantitative results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity; d. the representative CitH3 images of PMA stimulated dHL-60 cells (Ctrl), PMA stimulated dHL-60 cells in presence of the vehicle (DMSO) or GSK484, the scale bar was 50 μm; e and f. the quantitative results of relative CitH3 area and relative CitH3 fluorescent intensity. The data represent the mean ± SEM from at least 3 independent experiments. Statistical significance was analyzed by one-way ANOVA for multiple comparisons with Tukey’s test. NS, no significance; *,
3 討論
NETs可以保護機體免受微生物入侵，然而它是把雙刃劍，正如在自身免疫性疾病、凝血障礙、癌癥轉移、敗血癥和COVID-19研究中報道的那樣，過多的NETs產生是有害的[37-38]。因此，了解NETs形成和降解的機制對于有效治療細菌感染和NETs相關疾病具有重要意義。
從新鮮血液中獲得的中性粒細胞數目有限，供體個體間的差異可能會影響研究結果。此外，中性粒細胞處于終末分化狀態，無法進一步進行基因改造，使得NETs形成的機制研究存在困難。盡管基因動物模型及其中性粒細胞被用于探索NETs的形成，但由于物種差異，動物研究中的一些發現可能無法直接反映到人類身上。因此，有必要利用人中性粒細胞樣細胞模型來研究NETs形成的機制。為此，我們在本研究中采用ATRA來誘導分化HL-60，并用PMA刺激dHL-60以研究NETs的形成。我們用不同濃度（0、0.1、1和10 μmol/L）的ATRA對HL-60進行不同天數（1、3、5和7天）的分化。通過分析細胞活力和核形態，我們發現HL-60細胞在分化5天后成為中性粒細胞樣細胞（見圖1）。我們的結果還表明，dHL-60細胞在100 ng/mL PMA刺激下可以形成NETs。
此前的一項研究使用不同的誘導劑對HL-60細胞進行誘導分化5天，結果表明，ATRA-dHL-60細胞僅在PMA刺激下釋放NETs，DMSO-dHL-60細胞僅在A23187刺激下釋放NETs，而DMF-dHL-60細胞在上述兩種刺激劑下均能釋放NETs[27]。Kawakami等[21]用1 μmol/L的ATRA誘導分化HL-60細胞3天，然而在PMA刺激4小時后，只有少數dHL-60細胞產生云霧狀的NETs結構，這與本研究的結果一致。類似地，最近一項研究表明，當HL-60細胞用DMSO誘導分化3天時，在PMA或金黃色葡萄球菌刺激下，dHL-60細胞產生NETs的能力受到限制[30]。這些觀察結果表明無論是用ATRA還是DMSO，分化3天的dHL-60細胞在PMA刺激下產生的NETs有限。這可能是因為分化時間不夠所導致的。然而，由于ATRA存在細胞毒性，HL-60分化超過6天后細胞活力顯著降低[24]，NETs形成的能力下降。Guo等[24]根據細胞表面標記物和細胞活力判斷，ATRA誘導分化HL-60細胞5天是最佳條件，這與我們的結果一致（見圖1）。我們的研究結果還表明：1 μmol/L的ATRA處理HL-60細胞5天是獲得dHL-60細胞的最佳條件，這一條件下處理的細胞在PMA刺激時能產生大量的NETs（見圖2和圖3a）。
NADPH氧化酶產生ROS在自殺型NETosis中扮演著重要的角色。在PMA引起的NETosis中，NADPH活性和ROS生成顯著增加[27,39]。DPI處理幾乎完全消除了ROS的產生和NETs的形成[40]。在我們的研究中，DPI抑制了PMA刺激下dHL-60細胞NETs的形成，表明這一過程依賴于NADPH。此前的研究也表明，在PMA刺激下，不同誘導劑誘導分化的dHL-60產生NETs依賴于NADPH[21,26]。
PAD4在NETosis中具有重要作用[34-35]。PAD4將組蛋白中帶正電荷的精氨酸轉化為不帶電荷的瓜氨酸，導致染色質解聚和NETosis[22]。值得注意的是，PMA引起的NETs形成既可以依賴于PAD4[41]，也可以不依賴于PAD4[14,42-43]。本研究顯示，PMA刺激ATRA-dHL-60產生的NETs不依賴于PAD4（見圖4），盡管PAD4的抑制劑GSK484抑制了H3的瓜氨酸化（見圖6）。這些結果與此前報道的一致，PMA刺激人中性粒細胞和dHL-60并未導致組蛋白瓜氨酸化水平增加[24,27]。
4 總結
我們發現1 μmol/L的ATRA誘導分化HL-60細胞5天是獲得dHL-60的最佳條件，此條件處理后的dHL-60在PMA刺激下可以產生足夠的NETs。在PMA刺激下，ATRA-dHL-60產生NETs依賴于NADPH而不依賴于PAD4，這與人中性粒細胞一致。因此，dHL-60可以作為中性粒細胞的模型細胞研究NETs形成，便于用來探索細菌感染和NETs相關疾病的分子機制。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：林蔣國和劉望設計了實驗；劉望、方金花、洪天添和黃嘉祺負責實數據收集和數據分析。林蔣國和劉望撰寫論文初稿；劉望、方金花、趙柏松、方穎、吳建華和林蔣國修改和完善論文手稿。
倫理聲明：本研究通過了廣州市婦女兒童醫療中心倫理委員會的審批（批文編號：2019-37001）。
