下肢截肢是對身體結構的顯著改變，肌肉、血管及血液的損失會導致血流的重新分布和血管末端阻力的變化。針對下肢截肢后心血管疾病患病率顯著增高但其機制尚不清楚等問題，本文旨在建立一個可驗證和探索截肢對心血管系統影響的動物研究模型，并為后續探究不同截肢水平對心血管系統影響的動物實驗提供模型和方法。選用無特定病原體（SPF）新西蘭兔并分為正常組（n = 6）和截肢組（n = 6），其中截肢組作膝上截肢處理，術后定期監測實驗兔血清中低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和總膽固醇（TC）等含量的變化，并取材做動脈病理檢測。結果表明，與正常組相比，截肢組血清LDL-C和TC含量均顯著增加（P <0.05）；血管出現了中膜層平滑肌細胞變性壞死、彈性纖維斷裂等病理改變；腹主動脈和主動脈弓的彈性纖維面積表達百分比（EFEP）較正常組有明顯下降。以上結果提示，兔的心血管系統在截肢術后有動脈彈性降低、血液中脂質沉積等病變的趨勢，標志著成功地建立了關于截肢對心血管系統影響的動物實驗模型，為進一步研究截肢影響心血管系統的機制提供了實驗平臺。
引用本文： 閔磊, 蔣文濤, 李忠友, 李瀟, 魏君如, 刁珺杰, 白逃萍, 晏菲. 研究截肢對心血管系統影響的動物模型建立. 生物醫學工程學雜志, 2022, 39(5): 991-996. doi: 10.7507/1001-5515.202203064 復制
引言
截肢術是指經關節或骨頭將已喪失生存能力、危害患者生命或已喪失生理功能的肢體切除的破壞性外科手術，行截肢術后患者將失去部分肌肉組織及血液循環系統。而據英國研究機構對戰后殘疾軍人的健康調查發現，下肢截肢軍人心血管疾病的發病率遠高于其他軍人［包括心肌梗死（42%[1]、19.8%[2]）、高血壓（43.6%[3]、42.7%[4]）、高膽固醇（38.9%[5]）、高血脂（37.6%[4]）、冠脈粥樣硬化（12.4%[6]）、主動脈瘤（5.8%[7]）、外周血管疾病（5%[4]）等］，特別是非創傷性下肢截肢者尤為明顯。已有研究表明，心血管疾病的形成與血流速度、血壓、血管壁面剪切應力等血流動力學參數密切相關[8-10]，而截肢導致的人體血管和肌肉組織的丟失，會引起血流的重新分布和血管末端阻力的變化[11]，進而影響人體的血流動力學分布。因此，截肢是否會對人體心血管系統產生影響自然成為一個值得深入研究的課題。
目前基于血流動力學的心血管系統研究通常采用計算流體力學方法結合血管成像技術，如計算機斷層掃描（computed tomography，CT）成像、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、超聲（ultrasound，US）成像和數字減影圖像等，以及三維重建技術進行數值模擬，雖然可以細致地獲得心血管系統內的血流動力學分布規律，但仍需再結合體外實驗、動物實驗或臨床試驗等進行驗證或開展更深入的心血管疾病發生發展規律和機制等方面的研究。其中，動物實驗被認為是心血管疾病研究從實驗室走向臨床治療中不可缺少的關鍵環節[12]。建立和使用合適的動物模型對動物實驗結果的合理性以及相關基礎研究和診療工具的發展具有重要的作用[13]，如遺傳性高血脂家兔（Watanabe heritable hyperlipidemic rabbit，WHHL）模型被證明是最適合研究動脈粥樣硬化的動物模型[14-15]，大鼠冠狀動脈結扎模型常用于研究心肌梗死[16-17]，而自發性高血壓大鼠模型則適用于研究先天性高血壓[18]。
因此，在針對前述截肢與心血管系統關系的研究中，采用動物實驗驗證和探索截肢能否對心血管系統產生影響是十分必要的。如何建立動物模型、利用哪些指標監測心血管系統變化等是首先需要解決的問題。雖然已有研究采用截肢動物研究截肢過程中動物心臟功能的變化[19]（術后即處死實驗動物），但就截肢對于動物心血管系統的長期影響還未見相應的研究模型。
為此，本文選擇兔作為實驗對象，截肢并行肌肉成形術，通過監測總膽固醇（total cholesterol，TC）和低密度脂蛋白膽固醇（low density liptein cholesterol，LDL-C）等生化指標及動脈病理檢測［蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色、范基林（van Gieson，VG）染色］來獲取兔心血管系統的改變，以期建立一種成活率高、穩定性好、便于監測的動物實驗模型，為后續進一步深入研究截肢對心血管系統的影響提供動物實驗平臺。
1 材料與方法
本文的動物實驗研究主要分為三個階段：截肢手術、動物生化指標檢測以及動物病理組織檢測。
1.1 實驗動物選擇
選擇合適的動物品種對于能否成功造模非常重要。常規動物實驗通常選擇大鼠、小鼠、豬、狗、兔等作為研究對象，其中豬[20]和兔[21]是兩種心血管系統與人類最為相似的動物，但考慮到動物模型的制作難度及取材的便利性，實驗兔模型具有造模時間短而且成本低的特點，因此本文選擇兔作為實驗動物研究對象。
實驗室環境下兔子的平均壽命為10年[22]，針對成年期這一階段，對于實驗兔來說，18.25天的時間相當于人類壽命的一年（365天）[23]，因此本文進行合理假設，將實驗兔截肢術后7天、14天、60天的心血管系統變化類比人類截肢后約18周、36周、3年的心血管系統變化。
本實驗選用健康活力好、無運動障礙、無皮膚病的無特定病原體（specefic pathogen free，SPF）新西蘭兔［SCXK（川）2019-031］，體重（2.2 ± 0.31）kg，購自成都達碩實驗動物有限公司。動物的飼養及實驗過程依照《成都市實驗動物管理條例》相關規定進行，經四川大學醫學倫理委員會批準通過。
1.2 截肢手術
截肢方法采用已在臨床廣泛使用的肌肉成形術，可以減少截肢手術過程對實驗兔血液循環系統的影響。
實驗兔共12只，分為正常組（n = 6）和截肢組（n = 6），均在動物籠中單籠飼養（如圖1a所示）。兩組實驗兔在籠中均可自由活動、進食和飲水，室溫控制在25 ℃左右，12 h光照與黑暗循環交替。經過7天的適應期喂養后，對截肢組實施手術。用3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉，常規剪毛后依次切開皮膚，分離肌層、淺深筋膜，游離血管、神經并于近心端結扎，膝關節以上股骨遠端用手術鉗夾斷，依次切斷肌肉、血管及神經，保留足夠的肌肉長度（截斷位置向前5 cm處），將肌肉縫合包住股骨（如圖1b所示）。術后將實驗兔放于加熱板上，待狀態穩定后，送入原來的動物籠中。術后連續三天為截肢組注射抗生素（青霉素11 000～22 000 U/kg，肌肉注射），以避免截肢組實驗兔因傷口感染死亡。
圖1
實驗動物及截肢手術
a. 單籠飼養實驗兔的生活環境；b. 實驗兔膝上截肢手術
Figure1. Experimental animals and amputationa. the living environment of experimental rabbits; b. lower limb amputation
1.3 血液生化檢查
臨床通常采用LDL-C和TC[24]等指標進行心血管疾病的初篩。TC水平與較高的心血管疾病死亡率相關[25-27]；LDL-C與冠心病風險呈正相關，與動脈粥樣硬化[28]之間存在劑量依賴關系。因此，TC和LDL-C升高被普遍認為是心血管疾病的主要危險因素[29]，而它們同樣可以作為實驗兔心血管系統發生變化的參照[30-31]。故本文采用獸用生化分析儀（BS-240VET，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）對兔血清中的TC及LDL-C含量進行檢測。
1.4 組織病理切片檢查
為與生化指標結果相結合進一步驗證實驗兔心血管系統的變化，飼養期結束后，開展動物模型的組織病理檢測工作。在兔體內，動脈粥樣硬化病變主要分布在主動脈弓、胸主動脈、肋間動脈起源處[21]，故取股動脈、主動脈弓、腹主動脈、胸主動脈作病理切片檢查（HE染色），同時進行VG染色以標明血管中的肌纖維（呈黃色）、膠原纖維（呈紅色）和彈力纖維（呈黑色）。另取實驗動物的心、肝、脾、肺、腎做基礎疾病分析，排除實驗動物本身疾病對于心血管系統的影響。解剖之后取材制標本，并按病理檢驗SOP程序進行。采用數字切片掃描儀（Pannoramic 250，3DHISTECH，匈牙利）對切片進行觀察和圖像采集。VG染色后，每張切片先于40倍鏡下觀察全部組織，再根據組織大小及表達情況分別選取3個區域放大400倍采集圖像。HE染色后，每張切片先于40倍鏡下觀察全部組織，察看大體病變情況，再選擇要觀察的區域采集放大100倍和400倍的圖片，觀察具體病變。
1.5 統計分析
所有數據均用SPSS 26.0軟件進行統計分析。所有數據表示為均值±標準差。采用單因素方差分析比較正常組和截肢組血清中的LDL-C及TC含量。所有的統計分析中，檢驗水準均為0.05。
2 結果
術后實驗兔存活良好，進食進水無異常，且能夠在缺損肢體的情況下進行正常活動。動物模型的存活意味著造模成功，是實驗后續開展的基礎。
行截肢術后，各組實驗兔血清中的LDL-C含量、TC含量如圖2所示。截肢組LDL-C含量、TC含量與正常組的差異有統計學意義（P<0.05），說明截肢組這兩項危險指標在術后發生顯著變化。
圖2
LDL-C含量、TC含量對比圖
*
*
VG染色觀察彈性纖維的形態及變化情況如圖3所示，動脈血管中層彈力膜呈黑色波浪線型，由內向外層狀排列。定性比較發現，正常組實驗兔彈性纖維層總體厚度寬于截肢組。因實驗兔本身體重有差異導致內臟大小不完全相同，故采用彈性纖維面積表達百分比（elastic fiber area expression percentage，EFEP）作為動脈病變程度的指標更為合理。正常組主動脈弓及腹主動脈處的EFEP分別為20.69%和13.26%，截肢組分別為11.28%和7.8%。
圖3
術后60天截肢組主動脈弓及腹主動脈VG染色圖像
彈性纖維由圖中黃色箭頭標示
Figure3. Van Gieson stained images of aortic arch and abdominal aorta 60 days after amputationelastic fibers are indicated by yellow arrows in the figures
主動脈弓及腹主動脈的HE染色結果如圖4所示，在光鏡觀察下，本實驗部分動脈出現內膜層內皮細胞脫落、中膜層平滑肌細胞變性壞死、彈性纖維斷裂、黏液樣物質沉積和管腔內紅細胞蓄積等病理改變。
圖4
術后60天截肢組主動脈弓及腹主動脈HE染色圖像
中膜層平滑肌細胞變性壞死由綠色箭頭標示，彈性纖維斷裂由黑色箭頭標示，黏液樣物質沉積由藍色箭頭標示
Figure4. Hematoxylin-eosin stained images of aortic arch and abdominal aorta 60 days after amputationdegeneration and necrosis of smooth muscle cells in the middle membrane are marked by green arrows, elastic fiber breakage is marked by black arrow, and myxoid deposition is marked by blue arrow
3 討論
本文選用兔作為實驗動物是基于兔子與人心血管系統的相似性[32]，與嚙齒類動物相比，兔子在進化上更接近靈長類動物[13]，特別是家兔的脂蛋白譜及對膽固醇的敏感性與人類完全相同，使得兔動脈粥樣硬化的病理演化過程中，從早期到晚期病變都與人類相似[33]。
血液中TC含量作為心血管系統發生病變的重要因素[30]，與較高的心血管疾病死亡率相關[25-27]，實驗兔在截肢術后TC含量急劇升高，說明截肢術后實驗兔的心血管系統有脂質沉積等病變的趨勢。正常狀態下，TC含量中的50% ～ 60%由LDL-C組成[34]，占比最大，故血液中的LDL-C含量變化將直接影響TC含量。相比正常組，截肢組血清中LDL-C含量顯著增高，說明其TC含量升高的主要原因是LDL-C含量的變化。而LDL-C含量的增大會引起泡沫細胞的形成及增殖，后者刺激血管平滑肌細胞及纖維組織增生，以致粥樣斑塊形成并導致動脈粥樣硬化[35-36]和冠心病[37-38]等心血管疾病的發生。常用的心血管疾病動物模型WHHL兔[15]則因缺少LDL-C受體而極易患動脈粥樣硬化、心肌梗死等心血管疾病，表明LDL-C含量的升高會使實驗兔有患心血管疾病的趨勢。結合前述中TC作為心血管系統發生病變的主要因素，術后截肢組血清中TC和LDL-C含量顯著高于正常組的這一現象，表明截肢組患心血管疾病的風險增大。
生化檢測結果初步預測實驗兔的心血管系統發生了病變，而動脈病理檢測結果則證實了這一預測。實驗兔動脈的VG染色結果顯示，截肢組主動脈弓和腹主動脈切片的EFEP與正常組相比明顯下降（腹主動脈：7.8%比13.26%；主動脈弓：11.28%比20.69%），表明截肢術后兔的動脈彈性變小。動脈彈性功能不僅是收縮壓、舒張壓、脈壓等血流動力學參數的重要決定因素, 而且反映了動脈內皮功能狀況[39]。同時，動脈彈性功能的減退也是心血管疾病危險因素的重要標志[40]。而HE染色結果顯示，截肢組術后動脈發生了彈力纖維斷裂、平滑肌細胞壞死、黏液物質沉積等病理現象，說明在動脈彈性發生變化的基礎上，截肢組發生了心血管系統病變，標志著該動物模型的成功建立。
因兔腿部的骨骼和肌肉結構與人相似，本文采用適用于人體的肌肉成形術進行動物造模，術后各組實驗兔存活良好，表明該方法完全適用于動物截肢，并且能夠有效防止術后實驗兔因運動造成傷口的裂開及斷骨露出。術后對實驗兔心血管系統的動態監測，是通過采血進行生化檢測來實現，在采血周期為一周的前提下幾近于無創檢測，對動物模型沒有本質上的影響，方便快捷，安全性高。另外，動物的飼養環節也非常簡便，只需定期給予動物水和飼料（無高膽固醇物質）即可。從經濟層面講，該方法成本較低，便于大規模地制作動物模型以開展研究。
4 結論
本文對截肢兔進行長時間的喂養，期間監測實驗兔的生理指標，實驗結束后對實驗兔進行組織病理檢測，結果顯示截肢術后兔的心血管系統發生了病變且病變程度隨時間增長進一步加重，標志著成功地建立了關于截肢對心血管影響研究的動物模型，為研究截肢對心血管系統的影響提供了一種方法，也為后續深入研究截肢后心血管疾病的發生機制、不同截肢水平對心血管系統的影響程度提供了經濟適用的動物實驗平臺。同時，該動物模型同樣可以投喂特定的藥物或者特種飼料來建立特定心血管疾病的動物模型，可用于指導截肢患者的飲食及用藥，以防患者因飲食習慣或不當用藥引起或加重自身的心血管疾病。本文的實驗方法仍然存在可以改進的地方，如是否需要對正常組進行“假手術”以防動物心理對實驗結果產生影響。另外，在本實驗基礎上進一步提高動物的存活率、將該動物模型的造模方法應用于其他動物等仍需進一步的研究。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：蔣文濤主要負責項目主持、實驗設計以及論文審閱修訂；閔磊主要負責動物實驗方案的制定及實施、實驗數據分析及論文編寫；李忠友主要負責數據分析指導以及論文修訂；李瀟、魏君如、刁珺杰參與結果討論及論文修訂；白逃萍和晏菲主要負責實驗方案設計指導。
倫理聲明：本實驗通過了四川大學醫學倫理委員會的審批（批文編號：K2022002）。
引言
截肢術是指經關節或骨頭將已喪失生存能力、危害患者生命或已喪失生理功能的肢體切除的破壞性外科手術，行截肢術后患者將失去部分肌肉組織及血液循環系統。而據英國研究機構對戰后殘疾軍人的健康調查發現，下肢截肢軍人心血管疾病的發病率遠高于其他軍人［包括心肌梗死（42%[1]、19.8%[2]）、高血壓（43.6%[3]、42.7%[4]）、高膽固醇（38.9%[5]）、高血脂（37.6%[4]）、冠脈粥樣硬化（12.4%[6]）、主動脈瘤（5.8%[7]）、外周血管疾病（5%[4]）等］，特別是非創傷性下肢截肢者尤為明顯。已有研究表明，心血管疾病的形成與血流速度、血壓、血管壁面剪切應力等血流動力學參數密切相關[8-10]，而截肢導致的人體血管和肌肉組織的丟失，會引起血流的重新分布和血管末端阻力的變化[11]，進而影響人體的血流動力學分布。因此，截肢是否會對人體心血管系統產生影響自然成為一個值得深入研究的課題。
目前基于血流動力學的心血管系統研究通常采用計算流體力學方法結合血管成像技術，如計算機斷層掃描（computed tomography，CT）成像、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、超聲（ultrasound，US）成像和數字減影圖像等，以及三維重建技術進行數值模擬，雖然可以細致地獲得心血管系統內的血流動力學分布規律，但仍需再結合體外實驗、動物實驗或臨床試驗等進行驗證或開展更深入的心血管疾病發生發展規律和機制等方面的研究。其中，動物實驗被認為是心血管疾病研究從實驗室走向臨床治療中不可缺少的關鍵環節[12]。建立和使用合適的動物模型對動物實驗結果的合理性以及相關基礎研究和診療工具的發展具有重要的作用[13]，如遺傳性高血脂家兔（Watanabe heritable hyperlipidemic rabbit，WHHL）模型被證明是最適合研究動脈粥樣硬化的動物模型[14-15]，大鼠冠狀動脈結扎模型常用于研究心肌梗死[16-17]，而自發性高血壓大鼠模型則適用于研究先天性高血壓[18]。
因此，在針對前述截肢與心血管系統關系的研究中，采用動物實驗驗證和探索截肢能否對心血管系統產生影響是十分必要的。如何建立動物模型、利用哪些指標監測心血管系統變化等是首先需要解決的問題。雖然已有研究采用截肢動物研究截肢過程中動物心臟功能的變化[19]（術后即處死實驗動物），但就截肢對于動物心血管系統的長期影響還未見相應的研究模型。
為此，本文選擇兔作為實驗對象，截肢并行肌肉成形術，通過監測總膽固醇（total cholesterol，TC）和低密度脂蛋白膽固醇（low density liptein cholesterol，LDL-C）等生化指標及動脈病理檢測［蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色、范基林（van Gieson，VG）染色］來獲取兔心血管系統的改變，以期建立一種成活率高、穩定性好、便于監測的動物實驗模型，為后續進一步深入研究截肢對心血管系統的影響提供動物實驗平臺。
1 材料與方法
本文的動物實驗研究主要分為三個階段：截肢手術、動物生化指標檢測以及動物病理組織檢測。
1.1 實驗動物選擇
選擇合適的動物品種對于能否成功造模非常重要。常規動物實驗通常選擇大鼠、小鼠、豬、狗、兔等作為研究對象，其中豬[20]和兔[21]是兩種心血管系統與人類最為相似的動物，但考慮到動物模型的制作難度及取材的便利性，實驗兔模型具有造模時間短而且成本低的特點，因此本文選擇兔作為實驗動物研究對象。
實驗室環境下兔子的平均壽命為10年[22]，針對成年期這一階段，對于實驗兔來說，18.25天的時間相當于人類壽命的一年（365天）[23]，因此本文進行合理假設，將實驗兔截肢術后7天、14天、60天的心血管系統變化類比人類截肢后約18周、36周、3年的心血管系統變化。
本實驗選用健康活力好、無運動障礙、無皮膚病的無特定病原體（specefic pathogen free，SPF）新西蘭兔［SCXK（川）2019-031］，體重（2.2 ± 0.31）kg，購自成都達碩實驗動物有限公司。動物的飼養及實驗過程依照《成都市實驗動物管理條例》相關規定進行，經四川大學醫學倫理委員會批準通過。
1.2 截肢手術
截肢方法采用已在臨床廣泛使用的肌肉成形術，可以減少截肢手術過程對實驗兔血液循環系統的影響。
實驗兔共12只，分為正常組（n = 6）和截肢組（n = 6），均在動物籠中單籠飼養（如圖1a所示）。兩組實驗兔在籠中均可自由活動、進食和飲水，室溫控制在25 ℃左右，12 h光照與黑暗循環交替。經過7天的適應期喂養后，對截肢組實施手術。用3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉，常規剪毛后依次切開皮膚，分離肌層、淺深筋膜，游離血管、神經并于近心端結扎，膝關節以上股骨遠端用手術鉗夾斷，依次切斷肌肉、血管及神經，保留足夠的肌肉長度（截斷位置向前5 cm處），將肌肉縫合包住股骨（如圖1b所示）。術后將實驗兔放于加熱板上，待狀態穩定后，送入原來的動物籠中。術后連續三天為截肢組注射抗生素（青霉素11 000～22 000 U/kg，肌肉注射），以避免截肢組實驗兔因傷口感染死亡。
圖1
實驗動物及截肢手術
a. 單籠飼養實驗兔的生活環境；b. 實驗兔膝上截肢手術
Figure1. Experimental animals and amputationa. the living environment of experimental rabbits; b. lower limb amputation
1.3 血液生化檢查
臨床通常采用LDL-C和TC[24]等指標進行心血管疾病的初篩。TC水平與較高的心血管疾病死亡率相關[25-27]；LDL-C與冠心病風險呈正相關，與動脈粥樣硬化[28]之間存在劑量依賴關系。因此，TC和LDL-C升高被普遍認為是心血管疾病的主要危險因素[29]，而它們同樣可以作為實驗兔心血管系統發生變化的參照[30-31]。故本文采用獸用生化分析儀（BS-240VET，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）對兔血清中的TC及LDL-C含量進行檢測。
1.4 組織病理切片檢查
為與生化指標結果相結合進一步驗證實驗兔心血管系統的變化，飼養期結束后，開展動物模型的組織病理檢測工作。在兔體內，動脈粥樣硬化病變主要分布在主動脈弓、胸主動脈、肋間動脈起源處[21]，故取股動脈、主動脈弓、腹主動脈、胸主動脈作病理切片檢查（HE染色），同時進行VG染色以標明血管中的肌纖維（呈黃色）、膠原纖維（呈紅色）和彈力纖維（呈黑色）。另取實驗動物的心、肝、脾、肺、腎做基礎疾病分析，排除實驗動物本身疾病對于心血管系統的影響。解剖之后取材制標本，并按病理檢驗SOP程序進行。采用數字切片掃描儀（Pannoramic 250，3DHISTECH，匈牙利）對切片進行觀察和圖像采集。VG染色后，每張切片先于40倍鏡下觀察全部組織，再根據組織大小及表達情況分別選取3個區域放大400倍采集圖像。HE染色后，每張切片先于40倍鏡下觀察全部組織，察看大體病變情況，再選擇要觀察的區域采集放大100倍和400倍的圖片，觀察具體病變。
1.5 統計分析
所有數據均用SPSS 26.0軟件進行統計分析。所有數據表示為均值±標準差。采用單因素方差分析比較正常組和截肢組血清中的LDL-C及TC含量。所有的統計分析中，檢驗水準均為0.05。
2 結果
術后實驗兔存活良好，進食進水無異常，且能夠在缺損肢體的情況下進行正常活動。動物模型的存活意味著造模成功，是實驗后續開展的基礎。
行截肢術后，各組實驗兔血清中的LDL-C含量、TC含量如圖2所示。截肢組LDL-C含量、TC含量與正常組的差異有統計學意義（P<0.05），說明截肢組這兩項危險指標在術后發生顯著變化。
圖2
LDL-C含量、TC含量對比圖
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VG染色觀察彈性纖維的形態及變化情況如圖3所示，動脈血管中層彈力膜呈黑色波浪線型，由內向外層狀排列。定性比較發現，正常組實驗兔彈性纖維層總體厚度寬于截肢組。因實驗兔本身體重有差異導致內臟大小不完全相同，故采用彈性纖維面積表達百分比（elastic fiber area expression percentage，EFEP）作為動脈病變程度的指標更為合理。正常組主動脈弓及腹主動脈處的EFEP分別為20.69%和13.26%，截肢組分別為11.28%和7.8%。
圖3
術后60天截肢組主動脈弓及腹主動脈VG染色圖像
彈性纖維由圖中黃色箭頭標示
Figure3. Van Gieson stained images of aortic arch and abdominal aorta 60 days after amputationelastic fibers are indicated by yellow arrows in the figures
主動脈弓及腹主動脈的HE染色結果如圖4所示，在光鏡觀察下，本實驗部分動脈出現內膜層內皮細胞脫落、中膜層平滑肌細胞變性壞死、彈性纖維斷裂、黏液樣物質沉積和管腔內紅細胞蓄積等病理改變。
圖4
術后60天截肢組主動脈弓及腹主動脈HE染色圖像
中膜層平滑肌細胞變性壞死由綠色箭頭標示，彈性纖維斷裂由黑色箭頭標示，黏液樣物質沉積由藍色箭頭標示
Figure4. Hematoxylin-eosin stained images of aortic arch and abdominal aorta 60 days after amputationdegeneration and necrosis of smooth muscle cells in the middle membrane are marked by green arrows, elastic fiber breakage is marked by black arrow, and myxoid deposition is marked by blue arrow
3 討論
本文選用兔作為實驗動物是基于兔子與人心血管系統的相似性[32]，與嚙齒類動物相比，兔子在進化上更接近靈長類動物[13]，特別是家兔的脂蛋白譜及對膽固醇的敏感性與人類完全相同，使得兔動脈粥樣硬化的病理演化過程中，從早期到晚期病變都與人類相似[33]。
血液中TC含量作為心血管系統發生病變的重要因素[30]，與較高的心血管疾病死亡率相關[25-27]，實驗兔在截肢術后TC含量急劇升高，說明截肢術后實驗兔的心血管系統有脂質沉積等病變的趨勢。正常狀態下，TC含量中的50% ～ 60%由LDL-C組成[34]，占比最大，故血液中的LDL-C含量變化將直接影響TC含量。相比正常組，截肢組血清中LDL-C含量顯著增高，說明其TC含量升高的主要原因是LDL-C含量的變化。而LDL-C含量的增大會引起泡沫細胞的形成及增殖，后者刺激血管平滑肌細胞及纖維組織增生，以致粥樣斑塊形成并導致動脈粥樣硬化[35-36]和冠心病[37-38]等心血管疾病的發生。常用的心血管疾病動物模型WHHL兔[15]則因缺少LDL-C受體而極易患動脈粥樣硬化、心肌梗死等心血管疾病，表明LDL-C含量的升高會使實驗兔有患心血管疾病的趨勢。結合前述中TC作為心血管系統發生病變的主要因素，術后截肢組血清中TC和LDL-C含量顯著高于正常組的這一現象，表明截肢組患心血管疾病的風險增大。
生化檢測結果初步預測實驗兔的心血管系統發生了病變，而動脈病理檢測結果則證實了這一預測。實驗兔動脈的VG染色結果顯示，截肢組主動脈弓和腹主動脈切片的EFEP與正常組相比明顯下降（腹主動脈：7.8%比13.26%；主動脈弓：11.28%比20.69%），表明截肢術后兔的動脈彈性變小。動脈彈性功能不僅是收縮壓、舒張壓、脈壓等血流動力學參數的重要決定因素, 而且反映了動脈內皮功能狀況[39]。同時，動脈彈性功能的減退也是心血管疾病危險因素的重要標志[40]。而HE染色結果顯示，截肢組術后動脈發生了彈力纖維斷裂、平滑肌細胞壞死、黏液物質沉積等病理現象，說明在動脈彈性發生變化的基礎上，截肢組發生了心血管系統病變，標志著該動物模型的成功建立。
因兔腿部的骨骼和肌肉結構與人相似，本文采用適用于人體的肌肉成形術進行動物造模，術后各組實驗兔存活良好，表明該方法完全適用于動物截肢，并且能夠有效防止術后實驗兔因運動造成傷口的裂開及斷骨露出。術后對實驗兔心血管系統的動態監測，是通過采血進行生化檢測來實現，在采血周期為一周的前提下幾近于無創檢測，對動物模型沒有本質上的影響，方便快捷，安全性高。另外，動物的飼養環節也非常簡便，只需定期給予動物水和飼料（無高膽固醇物質）即可。從經濟層面講，該方法成本較低，便于大規模地制作動物模型以開展研究。
4 結論
本文對截肢兔進行長時間的喂養，期間監測實驗兔的生理指標，實驗結束后對實驗兔進行組織病理檢測，結果顯示截肢術后兔的心血管系統發生了病變且病變程度隨時間增長進一步加重，標志著成功地建立了關于截肢對心血管影響研究的動物模型，為研究截肢對心血管系統的影響提供了一種方法，也為后續深入研究截肢后心血管疾病的發生機制、不同截肢水平對心血管系統的影響程度提供了經濟適用的動物實驗平臺。同時，該動物模型同樣可以投喂特定的藥物或者特種飼料來建立特定心血管疾病的動物模型，可用于指導截肢患者的飲食及用藥，以防患者因飲食習慣或不當用藥引起或加重自身的心血管疾病。本文的實驗方法仍然存在可以改進的地方，如是否需要對正常組進行“假手術”以防動物心理對實驗結果產生影響。另外，在本實驗基礎上進一步提高動物的存活率、將該動物模型的造模方法應用于其他動物等仍需進一步的研究。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：蔣文濤主要負責項目主持、實驗設計以及論文審閱修訂；閔磊主要負責動物實驗方案的制定及實施、實驗數據分析及論文編寫；李忠友主要負責數據分析指導以及論文修訂；李瀟、魏君如、刁珺杰參與結果討論及論文修訂；白逃萍和晏菲主要負責實驗方案設計指導。
倫理聲明：本實驗通過了四川大學醫學倫理委員會的審批（批文編號：K2022002）。
