力學性能差和易引起細菌感染是牙科修復樹脂在臨床使用中所面臨的主要問題。基于此，本研究通過合成具有良好光催化性能的銀—二氧化鈦（Ag-TiO2）納米顆粒，并將其添加到復合樹脂中，以期改善樹脂的力學性能及光催化抗菌能力。首先，本文對Ag-TiO2納米顆粒及復合樹脂的微觀結構和化學成分進行表征。結果表明，Ag以單質和氧化態兩種形式存在于Ag-TiO2中，而Ag-TiO2納米顆粒又均勻分散在復合樹脂中。本文進一步的力學實驗結果顯示，Ag-TiO2的填充顯著提高了復合樹脂的力學性能。而抗菌實驗結果表明，在660 nm可見光照射下，由于光催化作用，Ag-TiO2納米顆粒填充復合樹脂10 min即可顯示出優良的抗菌能力；而在無光照條件下，隨著Ag離子的釋放，Ag-TiO2納米顆粒填充復合樹脂24 h后也可展現優良抗菌性能。綜上所述，本研究為牙科復合樹脂領域提供了抗菌新思路。
引用本文： 潘世奇, 魯舒心, 李若玉, 張翔宇, 陳維毅. 納米銀-二氧化鈦填充樹脂力學及光控抗菌性能研究. 生物醫學工程學雜志, 2022, 39(4): 749-758. doi: 10.7507/1001-5515.202112067 復制
引言
隨著人們生活水平的不斷提高，對于口腔衛生以及牙齒的美觀愈加重視。自從20世紀60年代光固化樹脂應用于牙科領域以來，各類修復樹脂材料得到了廣泛而深入的研究[1-2]。目前，復合樹脂臨床應用主要存在兩個問題: 一是機械性能較差，在使用過程中容易折斷；二是不具有抗菌性能，在口腔中長期使用易使其表面堆積菌斑形成生物膜，進而引發齲病[3-4] 。因此，通過填充納米顆粒改善樹脂力學性能，并賦予其優良抗菌活性對修復樹脂臨床應用具有重要意義[5-7]。
二氧化鈦（titanium dioxide，TiO2）作為光催化材料，由于其化學性質穩定、無毒、成本低，被廣泛應用于有機污染物分解、空氣凈化、消毒抗菌等領域[8-9]。然而，純TiO2能隙較寬，僅在紫外光照射下才具有催化殺菌效果[10]。研究表明，在TiO2中摻雜少量銀（argentum，Ag）即可減小帶隙寬度[11-12]，使其在可見光下具有優良殺菌性能。這是因為Ag的摻雜形成了肖特基勢壘，可以促進電子從TiO2向Ag納米顆粒的轉移，導致電子空穴對的分離以及表面等離子體效應[13-15]，有效提高了TiO2在可見光照射下的催化活性。此外，有文獻報道TiO2還可以減緩Ag離子的釋放，從而降低材料生理毒性[16]。
本文首先通過化學還原法制備了摻雜Ag的TiO2（Ag-TiO2）納米顆粒，然后將其分散在樹脂漿液中，用藍光進行光照使其完全固化，制備了具有光控抗菌能力的Ag-TiO2納米顆粒填充復合樹脂。雖然已有關于光輔助抗菌樹脂的文獻報道[17]，但對復合樹脂結構、廣譜抗菌性能、光輔助抗菌機制及力學性能未進行深入研究。本文對所合成的復合樹脂微觀結構進行了詳細表征，研究了Ag-TiO2納米顆粒含量對復合樹脂在660 nm 可見光照下抗菌能力及力學性能的影響，闡明了其抗菌機制。這種無需額外的藥物治療，只需通過可見光照射就可起到殺菌抗菌功效的作用機制，在抗菌牙科填充樹脂領域中極具臨床應用潛力。
1 材料與方法
1.1 主要試劑
硝酸銀（AgNO3）、無水葡萄糖、氨水、納米TiO2（粒徑<100 nm）、瓊脂、無水乙醇均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；十二烷基苯磺酸鈉（sodium dodecyl benzene sulfonate，SDBS），購于臨沂綠森化工有限公司；雙酚A甘油二酸酯二甲基丙烯酸酯（bisphenol—a diglycidyl methacrylate，Bis-GMA）、三（乙二醇）二甲基丙烯酸酯（triethylene glycol dimethacrylate，TEGDMA）、樟腦醌（camphorquinon，CQ）、4-二甲基氨基苯甲酸乙酯（ethyl 4-dimethylaminobenzoate，4-EDMAB）、溴乙啡錠二聚體、鈣黃綠素，購于阿拉丁試劑有限公司；金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus，S.aureus）、大腸桿菌（escherichia coli，E.coli）和變形鏈球菌（staphylococcus mutans，S. mutans）由北京疾病預防中心提供；實驗用水為自制去離子水（deionized water，DI）。
1.2 Ag-TiO2納米顆粒的制備
將5 g納米TiO2分散在200 mL DI中，加入1 g SDBS形成TiO2濃度為25 g/L的懸浮液。將0.039 g AgNO3溶解到10 mL DI中，然后加入1 mL氨水，形成銀氨溶液。將銀氨溶液加入到TiO2懸浮液中，加入2 g葡萄糖作為還原劑分散到懸浮液中。在35 ℃下攪拌24 h，得到Ag-TiO2懸浮液。離心得到沉淀物，用DI洗滌3次，70 ℃干燥4 h，得到Ag質量百分比為0.5%的Ag-TiO2納米顆粒。
1.3 Ag-TiO2納米顆粒填充復合樹脂的制備
復合樹脂糊劑由樹脂基質和Ag-TiO2納米顆粒填料組成。樹脂基質由單體混合物 Bis-GMA/TEGDMA（質量比為1∶1）、引發劑CQ（質量百分比為0.2%）和4-EDMAB（質量百分比為0.8%）組成。將Ag-TiO2納米顆粒加入到樹脂基質中，并充分攪拌使其均勻分散到基體中。對于不同的實驗測試需求，將復合樹脂漿液倒入尺寸不同的模具中用藍光固化即可。根據Ag-TiO2含量的不同，制備的復合樹脂分別為：不添加Ag-TiO2納米顆粒的純樹脂（設為純樹脂組）、Ag-TiO2質量百分比為5%的復合樹脂（設為Ag-TiO2 5%組）、Ag-TiO2質量百分比為10%的復合樹脂（設為Ag-TiO2 10%組）、Ag-TiO2質量百分比為15%的復合樹脂（設為Ag-TiO2 15%組）和Ag-TiO2質量百分比為30%的復合樹脂（設為Ag-TiO2 30%組）。另外，TiO2質量百分比為15%的復合樹脂作為對照（設為TiO2 15%組）。
1.4 Ag-TiO2納米顆粒的表征
通過透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）（JEM-2010，日本電子，日本）觀察并分析納米顆粒的形貌及結構。利用X射線衍射儀（X-ray diffraction，XRD）（DX-2700，丹東方圓，中國）分析Ag-TiO2納米顆粒的相組成，在室溫下20°～80 °范圍內采集衍射圖。采用X射線光電子能譜儀（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）（ESCALAB Xi+，賽默飛世爾，英國）分析納米顆粒中Ag元素的化學價態。采用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）（JSM-7001F，日本電子，日本）觀察長條復合樹脂（25 mm × 2 mm × 2 mm）截面形貌，并利用其附帶的X射線能譜儀（energy dispersive spectrometer，EDS），（QX200，Bruker，德國）分析元素組成和分布，截面是從萬能力學實驗機（RGM-6005，深圳瑞格爾，中國）在三點彎曲實驗后斷裂的試樣中選取的較為平整的斷面。所有樣品測試前用DI洗滌后干燥即可，不需要進行打磨處理，以免破壞材料表面結構及元素分布。
1.5 復合樹脂力學性能測試
復合樹脂的彎曲強度（flexure stress，FS）（符號設為FS）、彎曲模量（flexural modulus，FM）（符號設為FM）和抗壓強度（compre-ssive strength，CS）（符號設為CS）通過萬能力學實驗機測試。根據行業標準《牙科學 聚合物基修復材料》（YY 1042-2011）[18]，每組制備了6個矩形樣品（25 mm × 2 mm × 2 mm，n = 6），并在測試前存儲在37 °C的水中。通過三點彎曲實驗在20 mm跨度和0.8 mm/min十字頭速度下測試樣品。FS和FM的計算如式(1)、式(2)所示：
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其中，F是破壞載荷，L是跨度長度，b是試樣寬度，h是試樣高度，F1是直線部分最大載荷，d是載荷F1下的撓度。準備6個圓柱形樣品（4 mm × 6 mm，n = 6），在0.8 mm/min十字頭速度下測試樣品抗壓強度。為進行維克斯顯微硬度（Vickers-hardness，VM）測試，將方形試樣（7 mm × 7 mm × 2 mm，n = 3）用600、1 200、2 000、3 000粒度的砂紙打磨，并用絲布進行拋光處理。將錫膏（250 nm金剛石懸浮液）涂在自動拋光機上（P20903，廣東和力實業有限公司，中國）。操作顯微硬度測試儀（HMAS-D30，上海鹽潤輕工技術有限公司，中國）用50 g載荷在10 s內測試樣品，每個樣品表面隨機選擇6個點進行檢測。
1.6 復合樹脂光催化性能及抗菌性能測試
活性氧（reactive oxygen species，ROS）包括羥基自由基（·OH）和單線態氧（1O2）等。甲基紫（methyl violet，MV）可與·OH反應，1, 3-二苯基異苯并呋喃（1, 3-diphenylisobenzofuran，DPBF）可與1O2反應，采用MV和DPBF作為指示劑，通過紫外—可見分光光度計（UV-1800PC，上海美譜達，中國）測量580 nm和420 nm處峰強，可間接評價樹脂產生·OH和1O2的量。將待測正方形片狀試樣（7 mm × 7 mm × 2 mm）置于24孔板中，將各組樣品分別浸泡在2 mL的MV和DPBF溶液中靜置25 min用于達到吸附平衡，測量光照前的光密度值（optical density，OD）（符號設為OD）。然后用660 nm（0.6 W/cm2）激光器進行20 min光照，每5 min用移液槍吸取待測溶液轉移至石英比色皿中，通過紫外—可見分光光度計檢測其在5、10、15、20 min的OD值。降解率計算公式(3)如下：
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其中，OD原為光照前溶液峰值，OD后為光照后溶液峰值。
通過平板涂布和熒光活/死染色法評價復合樹脂對S.aureus、E.coli和S. mutans的光控抗菌性能。在抗菌實驗中，將測試樣品（7 mm × 7 mm × 2 mm）純樹脂組、TiO2 15%組和Ag-TiO2 15%組，用75%酒精消毒，并用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌3次。具體步驟如下: 將所有樣品分別置于24孔板中，每孔加入1 mL濃度為7 × 106 CFU/mL的菌液。每種樣本分為3組，分別在660 nm 可見光照射10、20 min后，取100 μL菌液，用PBS稀釋100倍，將100 μL稀釋后的溶液滴入瓊脂板均勻涂布。最后，將每個瓊脂平板在37 ℃下培養24 h，觀察各樣品的表面菌落數量。同時，利用吖啶橙（acridine orange，AO）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）熒光染色來進一步評價抗菌能力。光照后吸取樹脂表面菌液，滴至蓋玻片上。兩種染色劑的濃度均為1 μL/mL，取 50 μL 的混合染色劑均勻滴在蓋玻片的表面，并在室溫下避光染色 20 min。樣品經 PBS 漂洗并倒置放于載玻片上，隨后用激光共聚焦顯微鏡（C2 Plus，Nikon，日本）隨機選擇3個視野采集圖片。此外，采用上述平板培養法，測量無光照下，樣品表面與細菌接觸24 h后的抗菌能力。抗菌率R的計算如式(4)所示：
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其中，βcontrol為對照組（純樹脂組）細菌數，βsample為實驗組（TiO2 15%組和Ag-TiO2 15%組）細菌數。
1.7 復合樹脂生物相容性測試
采用熒光活/死染色和噻唑藍溴化四唑（3-(4, 5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-2,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT）法對Ag-TiO2 15%組和Ag-TiO2 30%組的細胞毒性進行評價。首先將樣品（7 mm × 7 mm × 2 mm）用75%的酒精消毒30 min，并用PBS沖洗3次放入24孔板中。每孔加入1 mL培養基，在37 ℃下孵育24 h，收集浸提液供進一步使用。然后，將1 mL密度為2 × 104 個/cm2的成骨細胞與浸提液混合，培養在圓形顯微鏡蓋玻片1、3 d。對于熒光活/死染色，將樣品用無菌PBS漂洗3次，然后在黑暗中用50 μL含2 μL/ mL溴乙啡錠二聚體和0.5 μL/ mL鈣黃綠素的染色液在37 °C下染色30 min。利用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞活力和數量。對于MTT分析，將標本用PBS沖洗3次，轉移至新的24孔板中，然后，立即將900 μL新鮮培養基和100 μL MTT溶液添加到每個孔中，并在37 °C下孵育4 h。隨后加入1 mL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解樣品表面紫色結晶。用酶標儀（Infinite F50，TECAN，瑞士）在492 nm下測量所得每種溶液的OD值。
1.8 統計分析
所有實驗均重復3次以上，數據均采用均數 ± 標準差的形式。采用單因素方差法在統計分析軟件SPSS （26.0，IBM公司，美國）分析組間差異性。
2 結果與討論
2.1 Ag-TiO2納米顆粒的微觀結構
如圖1所示為合成的Ag-TiO2納米顆粒的微觀結構。由SEM和TEM圖可以看出，納米顆粒尺寸均勻，粒徑小于100 nm，實驗結果與文獻[19]報道一致。由高分辨率（high resolution，HR）-TEM（HR-TEM）圖片可見，0.35 nm晶格間距對應于銳鈦礦型TiO2的（101）晶面，而0.23 nm和0.27 nm晶格間距分別對應于單質Ag和氧化銀（Ag2O）的（111）晶面[20]，說明Ag-TiO2納米顆粒中Ag是以單質和氧化態兩種形式存在。由TiO2和Ag-TiO2納米顆粒的XRD圖譜（橫坐標的2θ是X射線的衍射角），可以看出兩種納米顆粒都是由銳鈦礦相組成，A表示銳鈦礦的特征峰。從Ag-TiO2圖譜中未發現含Ag相的峰，這可能是由于納米顆粒中Ag含量較低，且在TiO2中均勻分布所致[21]。在Ag的高分辨XPS圖譜中368 、374 eV兩個結合能對應于單質Ag，而366、372 eV兩個結合能對應于Ag2O中的Ag+。XPS結果與HR-TEM結果一致。
圖1
Ag-TiO2納米顆粒的微觀結構
Figure1.
Microstructure of Ag-TiO2 nanoparticles
2.2 復合樹脂的微觀結構及親水性
如圖2所示為純樹脂組、Ag-TiO2 15%組和Ag-TiO2 30%組的復合樹脂斷面SEM照片。添加Ag-TiO2納米顆粒后，樹脂表面出現大量納米顆粒凸起物，且隨著納米顆粒含量增加，樹脂中凸起物也逐漸增多。Ag-TiO2 15%組EDS結果表明，Ag、鈦（Ti）、碳（C）及氧（O）元素均勻分布在樹脂表面，說明納米顆粒在樹脂中均勻分散。接觸角圖顯示，隨著納米顆粒含量增加，復合樹脂的接觸角逐漸減小，說明親水性改善，當納米顆粒含量從15%增加到30%時，親水性不再變化。生物材料表面親水性對細胞行為起著重要作用，良好的親水性能使細胞更好地黏附，并且有助于成骨細胞分化等[22]。對于牙科修復復合樹脂材料，通過手術替換或修補壞牙的操作都會對周圍正常的口腔組織細胞造成一定損傷，而本研究所制得的復合樹脂親水性高，有利于術后牙床細胞與修復體的重新貼合。
圖2
復合樹脂斷面SEM圖、Ag-TiO2 15%組復合樹脂斷面的EDS元素分布圖、表面接觸角
Figure2.
SEM images of the cross-section of the composite resins, EDS element distribution map of the cross-section of composite resin with 15% Ag-TiO2 and contact angles
2.3 復合樹脂的力學性能
為了評價復合樹脂的力學性能，本文中不同質量百分比Ag-TiO2納米顆粒填充復合樹脂的FS、FM、CS和VM的結果如圖3所示。當復合樹脂中納米顆粒含量小于15%時，隨著含量的增加，復合樹脂的力學性能和顯微硬度逐漸提高。含量為15%時，力學性能最佳，FS、FM、CS和VM分別為99.57 MPa、3.42 GPa、341.29 MPa和31.38 HV，與純樹脂組相比分別提高了79.66%、73.60%、23.49%和76.39%。添加Ag-TiO2納米顆粒后力學性能改善，是因為納米顆粒的比表面積較大，樹脂基體與納米顆粒的接觸面積變大[23]。當添加Ag-TiO2納米顆粒含量達到30%時，復合樹脂力學性能下降，是由于納米顆粒過多發生了團聚[24] 。
圖3
復合樹脂材料的力學性能
Figure3.
Mechanical property of composite resin with different content of Ag-TiO2
2.4 復合樹脂的光催化與抗菌性能
根據力學實驗結果，選擇綜合性能優異的Ag-TiO2 15%組復合樹脂進行光催化和抗菌性能測試。分別采用MV和DPBF檢測復合樹脂在660 nm 光照下產生·OH和1O2的能力，進而評價其光催化性能[25-26]。如圖4所示，隨著光照時間的延長，MV和DPBF的降解量都逐漸增加，意味著產生的ROS逐漸增多，說明復合樹脂在光照條件下具有優良的光催化性能。
圖4
660 nm光照射下Ag-TiO2 15%組復合樹脂光催化性能
Figure4.
ROS generation of composite resin with 15% Ag-TiO2 under 660 nm light irradiaition
抗菌實驗采用 S.aureus、E.coli和S. mutans作為測試菌種。S.aureus和E.coli分別是常見的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的典型代表，而S. mutans是引起齲齒的主要致病菌。先采用平板培養法評價復合樹脂在660 nm光照下的抗菌性能，結果如圖5所示。不含Ag的TiO2 15%組光照20 min后未展現出明顯抗菌能力，Ag-TiO2 15%組在無光照下培養20 min對三種細菌也都沒有顯示出明顯抗菌能力，說明短時間內Ag離子的釋放量有限，未能起到抗菌效果。而Ag-TiO2 15%組光照10 min后對S.aureus、E.coli和S. mutans三種細菌就展現出了優良的抗菌能力，抗菌率分別是85.83%、94.23%和84.3%。光照20 min后，對三種細菌的抗菌率都達到99.99%，這是由于Ag-TiO2 15%組光照下具有優良的光催化作用，產生的大量ROS短時間內快速殺滅了細菌[27-30]。
圖5
660 nm光照射下Ag-TiO2 15%組復合樹脂表面抗菌效果圖及對應抗菌率
Figure5.
Representative colony forming unit images and the corresponding antibacterial rate of composite resin with 15% Ag-TiO2 under 660 nm light irradiaition
采用熒光活/死染色法進一步評價了Ag-TiO2 15%組復合樹脂光催化殺菌性能。如圖6所示，光照20 min后，兩組對照樣品表面都被綠點覆蓋，說明表面細菌都是活的，而Ag-TiO2 15%組表面只有少數綠點存在，表明光催化殺滅了大多數細菌。
圖6
660 nm 光照射下Ag-TiO2 15%組復合樹脂表面細菌熒 光活/死照片
Figure6.
Fluorescence images of alive/dead bacteria on the surface of composite resin with 15% Ag-TiO2 under 660 nm light irradiaition
采用平板培養法對Ag-TiO2 15%組在無光照條件下24 h接觸抗菌進行了測試，結果如圖7所示。Ag-TiO2 15%組對三種細菌都展現了優良的抗菌能力，這是由于長時間接觸后，復合樹脂釋放了大量Ag離子[31-33]。
圖7
Ag-TiO2 15%組復合樹脂表面無光照射下細菌培養24 h抗菌效果圖及對應抗菌率
Figure7.
Representative colony forming unit images and the corresponding antibacterial rate of composite resin with 15% Ag-TiO2 after culturing for 24 h
綜上所述，Ag-TiO2 15%組復合樹脂在光照下短時間內可以快速殺菌，無光照下長時間接觸也可有效殺滅黏附的細菌，這對臨床上齲齒的預防和治療具有積極作用。
2.5 復合樹脂的生物相容性
采用熒光活/死染色和MTT評價了Ag-TiO2納米顆粒填充復合樹脂對成骨細胞的生物相容性。如圖8所示，經過1 d培養，四組樣品表面細胞活力和數量都沒有明顯區別。培養3 d之后，與其它三組相比，Ag-TiO2 30%組表面細胞數量明顯較少，說明大量Ag離子的釋放影響了成骨細胞增殖，而Ag-TiO2 15%組仍表現出良好的生物相容性，表明這組樣品釋放的Ag離子含量在細胞安全范圍之內。此外，本課題組之前已經在光催化抗菌方面進行了大量研究，產生大量ROS時，會對細胞增殖產生一定抑制作用，但繼續培養后，細胞能夠恢復活力。且不同于植入體材料，本文研究的是用于修復牙齒齲壞的光固化填充復合樹脂，材料接觸更多的是牙齒，幾乎不直接接觸周圍正常的口腔細胞，所產生的ROS也幾乎不會損傷到口腔細胞[28, 34]。
圖8
成骨細胞在樣品表面培養1、3 d后的熒光染色圖和MTT分析結果
Figure8.
Fluorescence images of osteoblasts on the samples after culturing for 1, 3 days and MTT assay results
3 結論
本文通過化學還原法制備了Ag-TiO2納米顆粒，并將其作為填料填充到復合樹脂中，經光固化聚合反應合成了Ag-TiO2納米顆粒填充復合樹脂。物相分析表明，本研究所制納米顆粒在樹脂中均勻分散，顯著改善了樹脂的親水性能。力學實驗和抗菌實驗初步證實了Ag-TiO2納米顆粒填充復合樹脂具有高效的光控抗菌能力和較好的力學性能，即當Ag-TiO2納米顆粒填料質量百分比為15%時，復合樹脂的綜合機械性能最佳；并在660 nm光照下展現出高效抗菌能力，在無光照條件下，隨著時間延長，由于Ag離子的釋放作用，復合樹脂也具有接觸抗菌能力；并且Ag-TiO2 15%組復合樹脂具有良好的生物相容性。
研究基于納米技術和光催化技術，嘗試構建多功能納米顆粒填料，對復合樹脂進行改性以改善其抗菌和力學性能，制備綜合性能優異的牙科復合樹脂。經實驗初步證實，制備的Ag-TiO2納米顆粒材料具有優異的理化性能，對復合樹脂的力學性能、抗菌性能具有很好的改善作用，在牙科修復復合樹脂領域具有潛在的應用前景，但仍有一定的不足，還需從以下方面開展進一步探索：盡管細胞實驗也證明了Ag-TiO2納米顆粒填充復合樹脂具有較好的生物相容性，但Ag離子的長期釋放是否會對人體產生毒副作用及釋放量是否在安全劑量之內，仍需大量研究進行分析與驗證。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：潘世奇負責實驗操作、分析與整理數據及論文撰寫，李若玉和魯舒心協助實驗，張翔宇和陳維毅參與論文相關實驗結果的分析及論文修改。
引言
隨著人們生活水平的不斷提高，對于口腔衛生以及牙齒的美觀愈加重視。自從20世紀60年代光固化樹脂應用于牙科領域以來，各類修復樹脂材料得到了廣泛而深入的研究[1-2]。目前，復合樹脂臨床應用主要存在兩個問題: 一是機械性能較差，在使用過程中容易折斷；二是不具有抗菌性能，在口腔中長期使用易使其表面堆積菌斑形成生物膜，進而引發齲病[3-4] 。因此，通過填充納米顆粒改善樹脂力學性能，并賦予其優良抗菌活性對修復樹脂臨床應用具有重要意義[5-7]。
二氧化鈦（titanium dioxide，TiO2）作為光催化材料，由于其化學性質穩定、無毒、成本低，被廣泛應用于有機污染物分解、空氣凈化、消毒抗菌等領域[8-9]。然而，純TiO2能隙較寬，僅在紫外光照射下才具有催化殺菌效果[10]。研究表明，在TiO2中摻雜少量銀（argentum，Ag）即可減小帶隙寬度[11-12]，使其在可見光下具有優良殺菌性能。這是因為Ag的摻雜形成了肖特基勢壘，可以促進電子從TiO2向Ag納米顆粒的轉移，導致電子空穴對的分離以及表面等離子體效應[13-15]，有效提高了TiO2在可見光照射下的催化活性。此外，有文獻報道TiO2還可以減緩Ag離子的釋放，從而降低材料生理毒性[16]。
本文首先通過化學還原法制備了摻雜Ag的TiO2（Ag-TiO2）納米顆粒，然后將其分散在樹脂漿液中，用藍光進行光照使其完全固化，制備了具有光控抗菌能力的Ag-TiO2納米顆粒填充復合樹脂。雖然已有關于光輔助抗菌樹脂的文獻報道[17]，但對復合樹脂結構、廣譜抗菌性能、光輔助抗菌機制及力學性能未進行深入研究。本文對所合成的復合樹脂微觀結構進行了詳細表征，研究了Ag-TiO2納米顆粒含量對復合樹脂在660 nm 可見光照下抗菌能力及力學性能的影響，闡明了其抗菌機制。這種無需額外的藥物治療，只需通過可見光照射就可起到殺菌抗菌功效的作用機制，在抗菌牙科填充樹脂領域中極具臨床應用潛力。
1 材料與方法
1.1 主要試劑
硝酸銀（AgNO3）、無水葡萄糖、氨水、納米TiO2（粒徑<100 nm）、瓊脂、無水乙醇均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；十二烷基苯磺酸鈉（sodium dodecyl benzene sulfonate，SDBS），購于臨沂綠森化工有限公司；雙酚A甘油二酸酯二甲基丙烯酸酯（bisphenol—a diglycidyl methacrylate，Bis-GMA）、三（乙二醇）二甲基丙烯酸酯（triethylene glycol dimethacrylate，TEGDMA）、樟腦醌（camphorquinon，CQ）、4-二甲基氨基苯甲酸乙酯（ethyl 4-dimethylaminobenzoate，4-EDMAB）、溴乙啡錠二聚體、鈣黃綠素，購于阿拉丁試劑有限公司；金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus，S.aureus）、大腸桿菌（escherichia coli，E.coli）和變形鏈球菌（staphylococcus mutans，S. mutans）由北京疾病預防中心提供；實驗用水為自制去離子水（deionized water，DI）。
1.2 Ag-TiO2納米顆粒的制備
將5 g納米TiO2分散在200 mL DI中，加入1 g SDBS形成TiO2濃度為25 g/L的懸浮液。將0.039 g AgNO3溶解到10 mL DI中，然后加入1 mL氨水，形成銀氨溶液。將銀氨溶液加入到TiO2懸浮液中，加入2 g葡萄糖作為還原劑分散到懸浮液中。在35 ℃下攪拌24 h，得到Ag-TiO2懸浮液。離心得到沉淀物，用DI洗滌3次，70 ℃干燥4 h，得到Ag質量百分比為0.5%的Ag-TiO2納米顆粒。
1.3 Ag-TiO2納米顆粒填充復合樹脂的制備
復合樹脂糊劑由樹脂基質和Ag-TiO2納米顆粒填料組成。樹脂基質由單體混合物 Bis-GMA/TEGDMA（質量比為1∶1）、引發劑CQ（質量百分比為0.2%）和4-EDMAB（質量百分比為0.8%）組成。將Ag-TiO2納米顆粒加入到樹脂基質中，并充分攪拌使其均勻分散到基體中。對于不同的實驗測試需求，將復合樹脂漿液倒入尺寸不同的模具中用藍光固化即可。根據Ag-TiO2含量的不同，制備的復合樹脂分別為：不添加Ag-TiO2納米顆粒的純樹脂（設為純樹脂組）、Ag-TiO2質量百分比為5%的復合樹脂（設為Ag-TiO2 5%組）、Ag-TiO2質量百分比為10%的復合樹脂（設為Ag-TiO2 10%組）、Ag-TiO2質量百分比為15%的復合樹脂（設為Ag-TiO2 15%組）和Ag-TiO2質量百分比為30%的復合樹脂（設為Ag-TiO2 30%組）。另外，TiO2質量百分比為15%的復合樹脂作為對照（設為TiO2 15%組）。
1.4 Ag-TiO2納米顆粒的表征
通過透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）（JEM-2010，日本電子，日本）觀察并分析納米顆粒的形貌及結構。利用X射線衍射儀（X-ray diffraction，XRD）（DX-2700，丹東方圓，中國）分析Ag-TiO2納米顆粒的相組成，在室溫下20°～80 °范圍內采集衍射圖。采用X射線光電子能譜儀（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）（ESCALAB Xi+，賽默飛世爾，英國）分析納米顆粒中Ag元素的化學價態。采用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）（JSM-7001F，日本電子，日本）觀察長條復合樹脂（25 mm × 2 mm × 2 mm）截面形貌，并利用其附帶的X射線能譜儀（energy dispersive spectrometer，EDS），（QX200，Bruker，德國）分析元素組成和分布，截面是從萬能力學實驗機（RGM-6005，深圳瑞格爾，中國）在三點彎曲實驗后斷裂的試樣中選取的較為平整的斷面。所有樣品測試前用DI洗滌后干燥即可，不需要進行打磨處理，以免破壞材料表面結構及元素分布。
1.5 復合樹脂力學性能測試
復合樹脂的彎曲強度（flexure stress，FS）（符號設為FS）、彎曲模量（flexural modulus，FM）（符號設為FM）和抗壓強度（compre-ssive strength，CS）（符號設為CS）通過萬能力學實驗機測試。根據行業標準《牙科學 聚合物基修復材料》（YY 1042-2011）[18]，每組制備了6個矩形樣品（25 mm × 2 mm × 2 mm，n = 6），并在測試前存儲在37 °C的水中。通過三點彎曲實驗在20 mm跨度和0.8 mm/min十字頭速度下測試樣品。FS和FM的計算如式(1)、式(2)所示：
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其中，F是破壞載荷，L是跨度長度，b是試樣寬度，h是試樣高度，F1是直線部分最大載荷，d是載荷F1下的撓度。準備6個圓柱形樣品（4 mm × 6 mm，n = 6），在0.8 mm/min十字頭速度下測試樣品抗壓強度。為進行維克斯顯微硬度（Vickers-hardness，VM）測試，將方形試樣（7 mm × 7 mm × 2 mm，n = 3）用600、1 200、2 000、3 000粒度的砂紙打磨，并用絲布進行拋光處理。將錫膏（250 nm金剛石懸浮液）涂在自動拋光機上（P20903，廣東和力實業有限公司，中國）。操作顯微硬度測試儀（HMAS-D30，上海鹽潤輕工技術有限公司，中國）用50 g載荷在10 s內測試樣品，每個樣品表面隨機選擇6個點進行檢測。
1.6 復合樹脂光催化性能及抗菌性能測試
活性氧（reactive oxygen species，ROS）包括羥基自由基（·OH）和單線態氧（1O2）等。甲基紫（methyl violet，MV）可與·OH反應，1, 3-二苯基異苯并呋喃（1, 3-diphenylisobenzofuran，DPBF）可與1O2反應，采用MV和DPBF作為指示劑，通過紫外—可見分光光度計（UV-1800PC，上海美譜達，中國）測量580 nm和420 nm處峰強，可間接評價樹脂產生·OH和1O2的量。將待測正方形片狀試樣（7 mm × 7 mm × 2 mm）置于24孔板中，將各組樣品分別浸泡在2 mL的MV和DPBF溶液中靜置25 min用于達到吸附平衡，測量光照前的光密度值（optical density，OD）（符號設為OD）。然后用660 nm（0.6 W/cm2）激光器進行20 min光照，每5 min用移液槍吸取待測溶液轉移至石英比色皿中，通過紫外—可見分光光度計檢測其在5、10、15、20 min的OD值。降解率計算公式(3)如下：
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其中，OD原為光照前溶液峰值，OD后為光照后溶液峰值。
通過平板涂布和熒光活/死染色法評價復合樹脂對S.aureus、E.coli和S. mutans的光控抗菌性能。在抗菌實驗中，將測試樣品（7 mm × 7 mm × 2 mm）純樹脂組、TiO2 15%組和Ag-TiO2 15%組，用75%酒精消毒，并用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌3次。具體步驟如下: 將所有樣品分別置于24孔板中，每孔加入1 mL濃度為7 × 106 CFU/mL的菌液。每種樣本分為3組，分別在660 nm 可見光照射10、20 min后，取100 μL菌液，用PBS稀釋100倍，將100 μL稀釋后的溶液滴入瓊脂板均勻涂布。最后，將每個瓊脂平板在37 ℃下培養24 h，觀察各樣品的表面菌落數量。同時，利用吖啶橙（acridine orange，AO）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）熒光染色來進一步評價抗菌能力。光照后吸取樹脂表面菌液，滴至蓋玻片上。兩種染色劑的濃度均為1 μL/mL，取 50 μL 的混合染色劑均勻滴在蓋玻片的表面，并在室溫下避光染色 20 min。樣品經 PBS 漂洗并倒置放于載玻片上，隨后用激光共聚焦顯微鏡（C2 Plus，Nikon，日本）隨機選擇3個視野采集圖片。此外，采用上述平板培養法，測量無光照下，樣品表面與細菌接觸24 h后的抗菌能力。抗菌率R的計算如式(4)所示：
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其中，βcontrol為對照組（純樹脂組）細菌數，βsample為實驗組（TiO2 15%組和Ag-TiO2 15%組）細菌數。
1.7 復合樹脂生物相容性測試
采用熒光活/死染色和噻唑藍溴化四唑（3-(4, 5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-2,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT）法對Ag-TiO2 15%組和Ag-TiO2 30%組的細胞毒性進行評價。首先將樣品（7 mm × 7 mm × 2 mm）用75%的酒精消毒30 min，并用PBS沖洗3次放入24孔板中。每孔加入1 mL培養基，在37 ℃下孵育24 h，收集浸提液供進一步使用。然后，將1 mL密度為2 × 104 個/cm2的成骨細胞與浸提液混合，培養在圓形顯微鏡蓋玻片1、3 d。對于熒光活/死染色，將樣品用無菌PBS漂洗3次，然后在黑暗中用50 μL含2 μL/ mL溴乙啡錠二聚體和0.5 μL/ mL鈣黃綠素的染色液在37 °C下染色30 min。利用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞活力和數量。對于MTT分析，將標本用PBS沖洗3次，轉移至新的24孔板中，然后，立即將900 μL新鮮培養基和100 μL MTT溶液添加到每個孔中，并在37 °C下孵育4 h。隨后加入1 mL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解樣品表面紫色結晶。用酶標儀（Infinite F50，TECAN，瑞士）在492 nm下測量所得每種溶液的OD值。
1.8 統計分析
所有實驗均重復3次以上，數據均采用均數 ± 標準差的形式。采用單因素方差法在統計分析軟件SPSS （26.0，IBM公司，美國）分析組間差異性。
2 結果與討論
2.1 Ag-TiO2納米顆粒的微觀結構
如圖1所示為合成的Ag-TiO2納米顆粒的微觀結構。由SEM和TEM圖可以看出，納米顆粒尺寸均勻，粒徑小于100 nm，實驗結果與文獻[19]報道一致。由高分辨率（high resolution，HR）-TEM（HR-TEM）圖片可見，0.35 nm晶格間距對應于銳鈦礦型TiO2的（101）晶面，而0.23 nm和0.27 nm晶格間距分別對應于單質Ag和氧化銀（Ag2O）的（111）晶面[20]，說明Ag-TiO2納米顆粒中Ag是以單質和氧化態兩種形式存在。由TiO2和Ag-TiO2納米顆粒的XRD圖譜（橫坐標的2θ是X射線的衍射角），可以看出兩種納米顆粒都是由銳鈦礦相組成，A表示銳鈦礦的特征峰。從Ag-TiO2圖譜中未發現含Ag相的峰，這可能是由于納米顆粒中Ag含量較低，且在TiO2中均勻分布所致[21]。在Ag的高分辨XPS圖譜中368 、374 eV兩個結合能對應于單質Ag，而366、372 eV兩個結合能對應于Ag2O中的Ag+。XPS結果與HR-TEM結果一致。
圖1
Ag-TiO2納米顆粒的微觀結構
Figure1.
Microstructure of Ag-TiO2 nanoparticles
2.2 復合樹脂的微觀結構及親水性
如圖2所示為純樹脂組、Ag-TiO2 15%組和Ag-TiO2 30%組的復合樹脂斷面SEM照片。添加Ag-TiO2納米顆粒后，樹脂表面出現大量納米顆粒凸起物，且隨著納米顆粒含量增加，樹脂中凸起物也逐漸增多。Ag-TiO2 15%組EDS結果表明，Ag、鈦（Ti）、碳（C）及氧（O）元素均勻分布在樹脂表面，說明納米顆粒在樹脂中均勻分散。接觸角圖顯示，隨著納米顆粒含量增加，復合樹脂的接觸角逐漸減小，說明親水性改善，當納米顆粒含量從15%增加到30%時，親水性不再變化。生物材料表面親水性對細胞行為起著重要作用，良好的親水性能使細胞更好地黏附，并且有助于成骨細胞分化等[22]。對于牙科修復復合樹脂材料，通過手術替換或修補壞牙的操作都會對周圍正常的口腔組織細胞造成一定損傷，而本研究所制得的復合樹脂親水性高，有利于術后牙床細胞與修復體的重新貼合。
圖2
復合樹脂斷面SEM圖、Ag-TiO2 15%組復合樹脂斷面的EDS元素分布圖、表面接觸角
Figure2.
SEM images of the cross-section of the composite resins, EDS element distribution map of the cross-section of composite resin with 15% Ag-TiO2 and contact angles
2.3 復合樹脂的力學性能
為了評價復合樹脂的力學性能，本文中不同質量百分比Ag-TiO2納米顆粒填充復合樹脂的FS、FM、CS和VM的結果如圖3所示。當復合樹脂中納米顆粒含量小于15%時，隨著含量的增加，復合樹脂的力學性能和顯微硬度逐漸提高。含量為15%時，力學性能最佳，FS、FM、CS和VM分別為99.57 MPa、3.42 GPa、341.29 MPa和31.38 HV，與純樹脂組相比分別提高了79.66%、73.60%、23.49%和76.39%。添加Ag-TiO2納米顆粒后力學性能改善，是因為納米顆粒的比表面積較大，樹脂基體與納米顆粒的接觸面積變大[23]。當添加Ag-TiO2納米顆粒含量達到30%時，復合樹脂力學性能下降，是由于納米顆粒過多發生了團聚[24] 。
圖3
復合樹脂材料的力學性能
Figure3.
Mechanical property of composite resin with different content of Ag-TiO2
2.4 復合樹脂的光催化與抗菌性能
根據力學實驗結果，選擇綜合性能優異的Ag-TiO2 15%組復合樹脂進行光催化和抗菌性能測試。分別采用MV和DPBF檢測復合樹脂在660 nm 光照下產生·OH和1O2的能力，進而評價其光催化性能[25-26]。如圖4所示，隨著光照時間的延長，MV和DPBF的降解量都逐漸增加，意味著產生的ROS逐漸增多，說明復合樹脂在光照條件下具有優良的光催化性能。
圖4
660 nm光照射下Ag-TiO2 15%組復合樹脂光催化性能
Figure4.
ROS generation of composite resin with 15% Ag-TiO2 under 660 nm light irradiaition
抗菌實驗采用 S.aureus、E.coli和S. mutans作為測試菌種。S.aureus和E.coli分別是常見的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的典型代表，而S. mutans是引起齲齒的主要致病菌。先采用平板培養法評價復合樹脂在660 nm光照下的抗菌性能，結果如圖5所示。不含Ag的TiO2 15%組光照20 min后未展現出明顯抗菌能力，Ag-TiO2 15%組在無光照下培養20 min對三種細菌也都沒有顯示出明顯抗菌能力，說明短時間內Ag離子的釋放量有限，未能起到抗菌效果。而Ag-TiO2 15%組光照10 min后對S.aureus、E.coli和S. mutans三種細菌就展現出了優良的抗菌能力，抗菌率分別是85.83%、94.23%和84.3%。光照20 min后，對三種細菌的抗菌率都達到99.99%，這是由于Ag-TiO2 15%組光照下具有優良的光催化作用，產生的大量ROS短時間內快速殺滅了細菌[27-30]。
圖5
660 nm光照射下Ag-TiO2 15%組復合樹脂表面抗菌效果圖及對應抗菌率
Figure5.
Representative colony forming unit images and the corresponding antibacterial rate of composite resin with 15% Ag-TiO2 under 660 nm light irradiaition
采用熒光活/死染色法進一步評價了Ag-TiO2 15%組復合樹脂光催化殺菌性能。如圖6所示，光照20 min后，兩組對照樣品表面都被綠點覆蓋，說明表面細菌都是活的，而Ag-TiO2 15%組表面只有少數綠點存在，表明光催化殺滅了大多數細菌。
圖6
660 nm 光照射下Ag-TiO2 15%組復合樹脂表面細菌熒 光活/死照片
Figure6.
Fluorescence images of alive/dead bacteria on the surface of composite resin with 15% Ag-TiO2 under 660 nm light irradiaition
采用平板培養法對Ag-TiO2 15%組在無光照條件下24 h接觸抗菌進行了測試，結果如圖7所示。Ag-TiO2 15%組對三種細菌都展現了優良的抗菌能力，這是由于長時間接觸后，復合樹脂釋放了大量Ag離子[31-33]。
圖7
Ag-TiO2 15%組復合樹脂表面無光照射下細菌培養24 h抗菌效果圖及對應抗菌率
Figure7.
Representative colony forming unit images and the corresponding antibacterial rate of composite resin with 15% Ag-TiO2 after culturing for 24 h
綜上所述，Ag-TiO2 15%組復合樹脂在光照下短時間內可以快速殺菌，無光照下長時間接觸也可有效殺滅黏附的細菌，這對臨床上齲齒的預防和治療具有積極作用。
2.5 復合樹脂的生物相容性
采用熒光活/死染色和MTT評價了Ag-TiO2納米顆粒填充復合樹脂對成骨細胞的生物相容性。如圖8所示，經過1 d培養，四組樣品表面細胞活力和數量都沒有明顯區別。培養3 d之后，與其它三組相比，Ag-TiO2 30%組表面細胞數量明顯較少，說明大量Ag離子的釋放影響了成骨細胞增殖，而Ag-TiO2 15%組仍表現出良好的生物相容性，表明這組樣品釋放的Ag離子含量在細胞安全范圍之內。此外，本課題組之前已經在光催化抗菌方面進行了大量研究，產生大量ROS時，會對細胞增殖產生一定抑制作用，但繼續培養后，細胞能夠恢復活力。且不同于植入體材料，本文研究的是用于修復牙齒齲壞的光固化填充復合樹脂，材料接觸更多的是牙齒，幾乎不直接接觸周圍正常的口腔細胞，所產生的ROS也幾乎不會損傷到口腔細胞[28, 34]。
圖8
成骨細胞在樣品表面培養1、3 d后的熒光染色圖和MTT分析結果
Figure8.
Fluorescence images of osteoblasts on the samples after culturing for 1, 3 days and MTT assay results
3 結論
本文通過化學還原法制備了Ag-TiO2納米顆粒，并將其作為填料填充到復合樹脂中，經光固化聚合反應合成了Ag-TiO2納米顆粒填充復合樹脂。物相分析表明，本研究所制納米顆粒在樹脂中均勻分散，顯著改善了樹脂的親水性能。力學實驗和抗菌實驗初步證實了Ag-TiO2納米顆粒填充復合樹脂具有高效的光控抗菌能力和較好的力學性能，即當Ag-TiO2納米顆粒填料質量百分比為15%時，復合樹脂的綜合機械性能最佳；并在660 nm光照下展現出高效抗菌能力，在無光照條件下，隨著時間延長，由于Ag離子的釋放作用，復合樹脂也具有接觸抗菌能力；并且Ag-TiO2 15%組復合樹脂具有良好的生物相容性。
研究基于納米技術和光催化技術，嘗試構建多功能納米顆粒填料，對復合樹脂進行改性以改善其抗菌和力學性能，制備綜合性能優異的牙科復合樹脂。經實驗初步證實，制備的Ag-TiO2納米顆粒材料具有優異的理化性能，對復合樹脂的力學性能、抗菌性能具有很好的改善作用，在牙科修復復合樹脂領域具有潛在的應用前景，但仍有一定的不足，還需從以下方面開展進一步探索：盡管細胞實驗也證明了Ag-TiO2納米顆粒填充復合樹脂具有較好的生物相容性，但Ag離子的長期釋放是否會對人體產生毒副作用及釋放量是否在安全劑量之內，仍需大量研究進行分析與驗證。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：潘世奇負責實驗操作、分析與整理數據及論文撰寫，李若玉和魯舒心協助實驗，張翔宇和陳維毅參與論文相關實驗結果的分析及論文修改。
