雙親性聚合物自組裝形成的膠束團聚體，因具有特殊的內核疏水、外殼親水的核/殼結構及納米尺寸，在藥物傳遞、基因傳遞和生物傳感器等領域具有廣泛應用。然而，聚合物膠束的結構穩定性容易受到環境因素影響，如溫度、pH、血液中存在的剪切力以及膠束表面修飾的基團與靶外細胞的相互作用等，作為藥物載體材料應用時易發生藥物泄露等問題。因此，膠束載體的結構完整性及體內分布行為研究對評價其治療效果及臨床應用可行性至關重要。目前，熒光共振能量轉移（FRET）技術被廣泛用于聚合物膠束的體內/外團聚、解離及分布情況的實時監測。本文對聚合物膠束、FRET技術的特點、FRET-聚合物膠束的結構及性質進行了簡要介紹，著重綜述了幾類常用熒光探針對與聚合物膠束復合的機制，以及FRET-聚合物膠束作為藥物載體的穩定性和體內/外分布行為研究進展，并對當前該技術面臨的一些問題及可能的發展方向進行了概述。
引用本文： 蔣林芮, 曾妮, 苗青山, 吳昌強, 陜紹云, 蘇紅瑩. 熒光共振能量轉移聚合物膠束及其作為藥物載體的研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2022, 39(5): 1022-1032. doi: 10.7507/1001-5515.202111040 復制
引言
聚合物膠束是由雙親性共聚物在水溶液中自組裝形成的外部親水、內部疏水的核/殼結構納米粒子。因其具有臨界膠束濃度（critical micelle concentration，CMC）低、尺寸小、制備簡單、增容性好、動力學穩定性高、毒性低以及易于進行表面功能基團修飾等優點，常被用于污水處理、環境凈化、微量物質的富集以及生物醫學領域。尤其是作為藥物載體應用時，膠束疏水內核可裝載各種抗癌藥物，提高藥物的穩定性和溶解度而不改變藥物的結構和性能；同時，其親水外殼易進行化學修飾從而實現高效精準的靶向藥物遞送；另外，膠束的納米級粒徑使其具有一定的被動靶向功能[1]。因此，聚合物膠束已成為最具吸引力的油溶性抗癌藥物載體之一[2-3]。
但是，聚合物膠束是一種通過疏水效應、靜電作用等可逆穩定力的作用而形成的熱力學自組裝結構，在復雜的體內/外環境下不可避免地會被多種失穩機制所瓦解，從而造成藥物泄漏、蛋白質吸附、蛋白質滲透以及被稀釋到臨界膠束濃度以下等情況。這些局限性使得膠束類納米載體系統的體內應用及臨床轉化受到了極大限制[4]。因此，研究聚合物膠束的體內外穩定性、進入機體后的體內分布情況及代謝行為，對膠束結構功能設計及判斷其作為生物醫學材料的應用潛力至關重要[5]。例如，膠束在血液中的穩定性和完整性作為一個基礎而又非常重要的課題一直受到人們的高度重視，因此，各領域學者提出多種穩定性檢測方法并進一步用于聚合物膠束結構穩定性的研究。例如：高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[6]、凝膠滲透色譜法（gel permeation chromatography，GPC）[7]、動態光散射（dynamic light scattering，DLS）[8]、熒光信號表征CMC值和熒光共振能量轉移技術（fluorescence resonance energy transfer，FRET）等。其中，FRET技術基于熒光團之間的非輻射能量轉移原理，具有高信噪比、高比率熒光讀數、高時空分辨率等優點[9]，可實時監測聚合物膠束體內/外完整性以及定量測定分子之間的距離[10-12]，已經成功用于檢測納米藥物與生物環境的相互作用，指導納米藥物的開發等相關研究[13-15]。因此，越來越多的研究人員通過物理包埋或化學鍵合的方法將熒光探針與兩親性聚合物復合形成FRET-聚合物膠束，使膠束具備熒光性能，繼而或以熒光對模擬藥物，或進一步采用疏水藥物與熒光染料形成FRET探針對，并在一定的激發波長下通過成像手段來監測FRET-聚合物膠束在體內/外的藥物釋放、動力學行為和FRET比率等，以此作為其穩定性及分布情況的評價指標。這種由FRET探針對與聚合物膠束復合形成的FRET-膠束為探究膠束在生物醫學方面實際應用的可行性，以及實現診療一體化提供了一種途徑。
本文簡單介紹了聚合物膠束的性質及其作為藥物載體的穩定性以及FRET技術的工作原理，著重綜述了幾類常用的FRET熒光探針與聚合物膠束復合形成FRET-聚合物膠束的方法，以及通過熒光光譜分析判斷FRET-聚合物膠束的體內/外團聚和解離行為，并對FRET-聚合物膠束作為藥物載體方面的應用前景和挑戰進行了總結和展望，希望能為聚合物膠束穩定性研究及其作為生物醫用材料的應用研究提供一定的參考。
1 熒光共振能量轉移技術
FRET是指當兩個熒光分子間距足夠小時，供體熒光分子通過偶極-偶極相互作用將能量以非輻射的方式轉移給鄰近的受體熒光分子，使得供體的熒光強度較其單獨存在時降低（熒光猝滅），而受體分子的熒光強度大大增強（敏化熒光）的現象[11]，該技術是監測兩個或多個熒光團之間非輻射能量轉移及分子間距的重要手段。20世紀40年代后期Theodor F?rster首次觀察到了FRET現象，并提出了著名F?rster理論公式（1），因此它也被稱為F?rster共振能量轉移[16]。
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其中，
是輻射速率（通常小于 
數量級），
是F?rster半徑。
F?rster公式的提出為非輻射能量傳遞提供了定量的解釋，解決了圍繞熒光猝滅實驗的謎題，揭示了FRET現象的原理[17]。從那時起FRET技術就在各種研究領域逐漸取得了重大應用研究進展，尤其是在生物醫學領域的診療一體化研究方面得到了廣泛應用。產生FRET現象需要兩個先決條件：第一是供體熒光分子的發射光譜和受體熒光分子的吸收光譜必須要有超過30%的光譜重疊；第二是供體分子和受體分子的距離要足夠近（< 10 nm）[18]，來自供體轉移的發射能量通常會觸發與之相距1～10 nm內的受體發射熒光[19-23]，從而產生一種非放射性能量轉移行為，即FRET現象，如圖1所示。
由于FRET技術的這種獨特機制，使其具有非常高的靈敏度、選擇性、較低的測量時間以及不受其他溶劑或分子的干擾等優點。因此，FRET技術已成為高度靈敏的檢測工具，用來探測生物領域中各種復雜現象[24-27]，尤其是將熒光探針對與聚合物膠束結合并通過共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）成像技術和公式（2）計算FRET效率[28]等手段來監測膠束在體內外的完整性、體內分布以及藥物控釋精準程度等，已成為該領域的重點研究方向。
FRET效率計算公式：
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其中，E是FRET效率，IDA是膠束中受體存在時供體的熒光積分強度，ID是膠束中沒有受體時供體的熒光積分強度。
值得注意的是，FRET效率尤其對供體和受體之間的距離變化高度敏感，這可能是由感知域的斷裂及隨后的供體和受體的擴散、FRET熒光探針對的構象變化以及機械張力三方面引起的[12]。并且，對于不同的熒光探針，在監測聚合物膠束穩定性以及載藥性能時，所展示的現象與機制也有所不同。目前常用于研究FRET-聚合物膠束結構及性能的FRET策略主要有兩種：① 熒光猝滅的FRET-ON到熒光恢復的FRET-OFF：形成膠束時因為猝滅劑的存在熒光消失，膠束解離時熒光與猝滅劑分開，逐漸恢復熒光強度[29]；② 受體熒光增強的FRET-ON到受體熒光減弱的FRET-OFF：即形成膠束時有明顯的供體能量轉移現象，膠束解離或在酶存在下使受體結構發生改變時FRET現象消失[30-32]。本文依據這兩種策略，對常用的幾種FRET熒光探針復合聚合物膠束的方法、產生的FRET現象以及FRET-聚合物膠束的穩定性、體內外分布情況和載藥性能研究進展進行了綜述。
2 幾種常用的FRET-聚合物膠束
FRET-聚合物膠束是指將FRET熒光探針對與聚合物膠束通過物理/化學作用復合形成的具有FRET現象的膠束團聚體。熒光探針對的種類及復合方式是決定所獲得聚合物膠束的FRET行為及應用性能的關鍵。常見的熒光染料有花菁（cyanine，Cy）類[33]、親酯性二烷基碳菁（dialkylcarbocyanines）類[34]、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）[35]、香豆素6[36]和羅丹明B（Rhodamine B，RhB）[37]等。大部分研究以熒光團模擬脂/水溶性的藥物，通過記錄FRET信號的變化，研究藥物在體內/外的分布情況以及從納米載體中釋放的動力學信息，指示膠束的團聚與解離行為[38]。由于FRET效率對供體和受體之間的距離變化高度敏感，所以對熒光染料的選擇也有要求。這一部分將主要介紹三類常用的熒光染料與聚合物膠束結合方法及相關結構性能的研究進展。
2.1 花菁類聚合物膠束
大多數染料在結構上都和唯一經過美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）認證的菁類染料-吲哚花菁綠（indocyanine green，ICG）有相似之處[39]。Cy染料即在其結構上引入了磺酸基團、N-羥基琥珀酰亞胺活性酯等基團來增加它的溶解性或提高活性[40]。與其他常見染料如FITC、香豆素6和羅丹明B相比，Cy類染料具有更高的熒光穩定性、更好的自熒光分離能力和更小的細胞損傷性[41-42]。因其獨特的共軛骨架結構以及優良的熒光性能，被廣泛應用于聚合物膠束團聚與解離以及生物成像研究。
Fu等[43]采用第一種FRET策略，即在FRET-膠束中染料和猝滅劑聚集時，特定的猝滅劑會猝滅熒光染料的熒光（FRET-ON），而當染料和猝滅劑分離以阻斷FRET過程時，染料的熒光信號再次出現（FRET-OFF）。該研究通過可逆加成-斷裂鏈轉移（reversible addition-fragmentation chain transfer，RAFT）聚合、開環聚合和點擊反應合成了聚甲基丙烯酸乙二醇酯（POEGMA）與聚L-天冬氨酸（PBLA）的兩親共聚物，進一步采用N，N-二異丙基乙二胺（DIEDA）和N，N-二丁基乙二胺（DBEDA）對PBLA鏈段進行氨基化反應，制得了可電離多種叔胺的兩親性嵌段共聚物。所得嵌段共聚物可在中性pH條件下自組裝形成穩定的膠束，并在弱酸性條件下解體。利用該聚合物的氨基分別與羧基修飾的Cy5.5和猝滅劑（fluorecent quencher，FQ）通過酰胺反應偶聯并自組裝形成具有pH敏感性的FRET-聚合物膠束。對FRET-膠束在不同環境pH作用下的FRET現象及釋藥行為研究表明：FRET效率與猝滅劑加入量成正比，且在pH 6.5～4.0環境下，釋藥率可高達80%以上；而pH 7.0～11條件下，其釋藥率僅為35%。這是因為酸性條件下猝滅劑上的叔胺基逐漸被質子化，膠束發生解體從而表現為較低的穩定性，而在中性及堿性環境下膠束穩定性高。類似的，Ruan等[44]也采用了同樣的熒光染料Cy5.5和猝滅劑FQ，制備了具有還原/氧化響應性的FRET-膠束。Cy5.5的羧基與多聚賴氨酸（PLYS）類嵌段聚合物POEGMA-PLYS的氨基以酰胺反應偶聯獲得兩親性聚合物POEGMA-b-PLYS-Cy（PCy），猝滅劑的羧基與POEGMA-SS聚合物的羥基通過酯化反應偶聯為含有二硫鍵的聚合物POEGMA-SS-Q（PFQ）（見圖2a）。PCy與PFQ混合自組裝形成具有氧化/還原響應性的PCQ膠束。通過熒光光譜分析和紫外光譜研究表明：FRET效率同樣與Cy5.5/FQ比值有關，且因PCQ膠束具備氧化/還原響應性，當其處于高谷胱甘肽（glutathione，GSH）濃度環境時，POEGMA和FQ之間的二硫鍵斷裂導致FQ脫落，膠束瓦解，對阿霉素（doxorubicin，DOX）24 h內累計釋放量可達60%，相對于不含GSH的PBS介質中藥物釋放率18%而言有顯著提升（見圖2b）。這類環境響應型FRET-膠束可實現裝載藥物的刺激響應釋放，是一類具有潛在應用價值的智能載藥系統。
圖2
PCQ膠束制備及釋藥性能
a. PCy及PFQ兩親共聚物的合成路線；b.最佳Cy/FQ物質的量之比的熒光強度及PCQ@DOX膠束DOX釋放曲線[44]
Figure2. Preparation and drug release properties of PCQ micellesa. the synthetic route of the PCy and PFQ amphiphilic copolymer; b. fluorescence intensity in optimum molar ratio of Cy/FQ and DOX delivery curves of the PCQ@DOX micelles. Reprinted with permission from ref. [44] (Ruan et al. 2018). Copyright 2018 American Chemical Society
與染料和猝滅劑組成的FRET-聚合物膠束發生熒光猝滅（FRET-ON）現象不同，Liang等[45]采用第二種FRET策略，更加直接地觀察到了聚合物形成膠束時受體熒光增強、供體熒光強度減弱（FRET-ON）到膠束裂解成聚合物時受體熒光減弱、供體熒光增強（FRET-OFF）的現象。該研究工作采用聚甲氧基聚乙二醇（mPEG）引發己內酯（ε-CL）單體開環聚合制備了聚甲氧基聚乙二醇-聚己內酯（mPEG-PCL）兩嵌段共聚物，進一步將羧基修飾的Cy5（受體）通過酯化反應與PCL的端羥基進行偶聯，獲得的兩親性聚合物mPEG-PCL-Cy5自組裝形成膠束，同時對羧基修飾的Cy3（供體）進行包埋形成了FRET-膠束。熒光光譜分析同樣發現：不同Cy3含量所產生的FRET現象不同，Cy3含量為5%～2%時，膠束的FRET比率在3.8～2.0左右，選用Cy3含量為4%的FRET-膠束研究了其穩定性與藥物釋放可行性。結果表明：12 h內Cy3的釋放率為68.1%并可持續釋放48 h。Saqr等[46]也采用了與Liang同樣的FRET策略探究了Cy3/Cy5.5與甲氧基聚氧乙烯-聚己內酯（PEO-PCL）制備的FRET-膠束作為靶向給藥載體的藥物釋放動力學和穩定性。通過對兩種FRET策略的研究不難發現，不論是化學偶聯還是物理包埋，熒光探針對的物質的量是決定FRET效率的關鍵因素。
2.2 親酯性二烷基碳菁類聚合物膠束
親酯性二烷基碳菁類染料是一類環境敏感型親脂性膜染料，這類探針在進入細胞膜之前熒光非常弱，當它們與膜結合或者與親脂性生物分子（例如蛋白質）結合時，其熒光強度顯著增強，因此主要用于標記細胞膜以及其他脂溶性生物結構。其中DiO（3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate）和DiI（1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate）由于在近紅外（near infrared，NIR）區域活性弱、激發波長短、組織穿透性差，多應用于體外細胞水平。DiR（1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindotricarbocyaine iodide）在NIR區域活性強，具有熒光干擾小、組織滲透深度大等優點，在活體研究（如小鼠和斑馬魚模型）中得到了廣泛的應用。
Gupta等[47]制備了一種聚硫丙烯（PS74-CEP）與N，N-二甲基丙烯酰胺（DMA）的兩嵌段聚合物（PS74-b-DMA310），并復合熒光探針對模擬疏水藥物對形成的膠束靶向釋藥性能進行了研究。實驗以常用鏈轉移劑4-氰基-4-（乙基亞砜基硫羰基亞砜基）戊酸（4-cyano-4-(ethylsulfanylthiocarbonylsulfanyl) pentanoic acid，CEP）與硫丙烷（propylene sulfide，PS）為原料，采用硫代酰基轉移法制備了聚（PS74-CEP）大分子，并用所得的聚（PS74-CEP）大分子與DMA通過RAFT法獲得了PS74-b-DMA310嵌段聚合物，再將DiI和DiO熒光對采用物理包埋的方法與膠束復合形成FRET-聚合物膠束。體外藥物釋放行為研究表明：以DiO為模型藥物測得膠束最大載藥率為63%，藥物釋放率可達90%以上，且聚（PS74-b-DMA310）膠束在較寬的濃度范圍內具有良好的細胞相容性。李瑞等[48]在Gupta的基礎上也采用了DiO-DiI熒光對，將其物理包埋在聚合物PEG-PCL（M）膠束疏水內核中，形成了具有FRET現象的DiO-DiI-M膠束。同時通過酰胺反應將FITC通過化學鍵與PEG-PCL偶聯，再物理包載熒光DiI制備了FITC-DiI-M聚合物膠束（FITC-DiI熒光對與DiO-DiI形成對照）。其中FITC的熒光指示著膠束本身的變化，DiI熒光指示著包載物的釋放，因此兩種膠束FRET變化的差異主要是由膠束的解離產生的。通過監測膠束在PBS介質中的熒光光譜發現，4 h內膠束都能保持完整結構。與其他染料可化學偶聯不同，親酯性二烷基碳菁類熒光染料多采用物理包埋的方式與聚合物膠束進行復合，這種方式使獲得的FRET-膠束會因染料的泄露等情況造成熒光假象從而只能在短時間內對FRET-膠束的穩定性做出定量評價。
2.3 與藥物配對的熒光聚合物膠束
相對于其他熒光探針組合，通過熒光探針與自身具有熒光特性的藥物組成的探針對的研究，不僅能夠以FRET現象研究膠束的團聚與解離情況，而且可以對藥物釋放行為及路徑進行直接檢測，實現真正意義上的藥物釋放研究。
Zhou等[49]制備了一種物理包埋DOX的還原型熒光聚合物膠束，研究了由還原劑引發的FRET-聚合物膠束的解離和藥物釋放動力學。該研究以甲基丙烯酸丁酯（BMA）和還原響應型四苯乙烯-偶氮苯衍生甲基丙烯酸甲酯（TPE-AZO-MA）為單體，在1，4-二氧六環/水混合溶劑中通過RAFT反應合成了兩親性聚合物。隨后，用聚合誘導自組裝法（polymerization-induced self-assembly，PISA）成功制備了原位負載DOX的還原型聚合物膠束。在偶氮還原酶作用下膠束結構中的偶氮鍵斷裂導致膠束粒徑增大或發生解離，DOX的釋放使得TPE的聚集誘導熒光性能因FRET-OFF而被有效地激活，并且載藥膠束在酶水解環境下24 h內顯示出58.5%的DOX釋放量，可觀察到溶液中明顯的DOX熒光的增強現象。
與物理包埋藥物不同，Yang等[50]開發了一類化學偶聯表阿霉素（epirubicin，EPI）的生物可降解聚合物給藥系統，并采用FRET技術對其藥物釋放進行了無創監測。該研究以常用多肽縮合試劑2-（7-氮雜苯并三氮唑）-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）為偶聯劑，N-甲基丙烯酰甘氨酰苯丙酰亮氨酸（MA-GFLG-OH）和EPI為單體，通過RAFT和酰胺反應，制備了聚合物MA-GFLG-EPI[51]，再與Cy5-NH2進行氨解反應制得具有FRET效應的聚合物膠束。熒光光譜分析（激發光：490 nm）發現：EPI與Cy5的FRET比率為0.89，表明大部分膠束結構完整，與細胞孵育4 h后FRET比率為0.84，24 h后比率降至0.77。FRET比率的變化表明：隨著時間的變化膠束開始瓦解，EPI分子從膠束中釋放出來。Wang等[52]以四苯乙烯（tetraphenylethene，TPE）染料作為FERT供體通過酰胺鍵化學偶聯到雙親性聚合物mPEG-Plys上，并進一步通過含二硫鍵的小分子中間體偶聯姜黃素（Cur）作為藥物和FRET受體，得到的兩親性聚合物mPEG-Plys（Cur）-TPE自組裝成膠束（見圖3a）。該FRET膠束在還原性環境（GSH或MCF-7細胞）下（見圖3b），二硫鍵斷裂釋放Cur導致AIE熒光的“開啟”和FRET信號的“關閉”，從而引發TPE和Cur的熒光增強。同時，MCF-7細胞在標記后一段時間也因為膠束結構瓦解而觀察到了兩種熒光信號的增強，且熒光強度隨時間延長呈現增強趨勢。該研究將FRET和TPE整合在一個膠束納米平臺上的新型策略，不僅研究了氧化/還原敏感膠束中姜黃素的釋放動力學，而且相較于傳統熒光染料，TPE類熒光染料不會因聚集熒光猝滅效應（aggregation-caused quenching，ACQ）在短時間內發生熒光猝滅現象，具有強抗光漂白能力，從而可在一定時間內持續對膠束載藥性能進行監測并做出評價。
圖3
氧化還原響應性FRET-膠束熒光強度
a. FRET機制；b.還原性環境下FRET-膠束中TPE和Cur的熒光強度隨時間變化[52]
Figure3. Fluorescence intensity of redox responsive FRET-micellesa. FRET principle; b. the fluorescence intensities of TPE and Cur in FRET-micelles in response to reducing environment varied with time. Reprinted with permission from ref. [52] (Wang et al. 2018). Copyright 2018 Wiley-VCH
3 FRET-膠束作為藥物載體的應用
3.1 FRET-膠束完整性及藥物釋放行為體外研究
如上所述，穩定性、高效給藥能力及良好的生物相容性是膠束作為納米藥物載體進入臨床研究的關鍵。而直接監測膠束在體外的動態藥物釋放行為及生物相容性，對評估膠束能否進行體內實驗和臨床研究至關重要。
Miteva等[53]采用Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 546作為熒光探針對模擬藥物，物理包埋到四組不同物質的量的比的聚二甲氨基乙酯嵌段共聚物（PD-b-pDPB）/聚乙二醇嵌段共聚物（PEG-b-pDPB）（100D/no PEG、50D/5K PEG、50D/10K PEG、50D/20K PEG）的聚合物中，形成FRET-膠束，并對具有細胞內遞送障礙的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）進行遞送。將該膠束與Luc-3T3細胞共孵育，通過CLSM在細胞水平上可視化監測siRNA釋放過程。研究結果表明：當熒光分子被包裹在膠束中，探針對距離較近，FRET信號高；隨著膠束結構的破壞，膠束逐漸解離，熒光分子被釋放，FRET信號減弱，siRNA被有效釋放。通過計算四組膠束在細胞內的FRET比率研究藥物釋放動力學發現：理想混合膠束配方為50D/20K PEG時，FRET比率低至20%左右，siRNA胞內有效釋放為60%以上。
與通過熒光探針模擬藥物不同，Chen等[54]成功研制了負載黃芩素的Pluronic P85/F68膠束（B-MCs），并將其用于克服耐藥蛋白2（MRP2）介導的黃芩素外排治療帕金森病（見圖4a）。所獲得的B-MCs膠束能提高黃芩素在細胞中的累積量和通透性。該研究將DiO/DiI探針對物理包埋入膠束再與過表達MRP2的犬腎細胞（MDCK-MRP2）共孵育，然后采用CLSM成像技術觀察FRET現象（見圖4b），結果如下：在前15 min細胞表現出很低的綠色熒光（DiO信號），MCs膠束主要以完整的形式被細胞攝取，DiO和DiI是在細胞內釋放的，解決了因MRP2在胃腸道和血腦屏障中過度表達而影響藥物高效遞送的難題，且B-MCs膠束在24 h內黃芩素的累計釋放率可達96%。這為研究Pluronic膠束通過細胞的完整性、藥物釋放性能以及逆轉MRP2的機制奠定了基礎。類似的，Chen等[55]將Cy5（受體）通過酰胺反應與雙親性棕櫚酰殼聚糖進行偶聯，并將其形成的膠束用于負載DOX（供體），制備了一種具有pH響應性的FRET-聚合物膠束納米粒子（Cy5-NPCS NPs）。該膠束在中性pH環境下具有高穩定性，酸性條件下易瓦解。進一步將該膠束與HT1080細胞孵育后對藥物在細胞內的釋放及分布情況進行了研究發現：FRET-膠束在30 min～4 h隨著DOX的釋放逐漸瓦解，完成FRET ON到FRET OFF的轉變。該研究工作將Cy5和DOX作為熒光探針對，實現了細胞內膠束結構完整性的實時監測，相對于其他以熒光探針模擬藥物釋放的研究[56-58]，更加直接地對藥物分子的胞內釋放行為及分布情況進行了監測。
圖4
DiO/DiI-MCs膠束體外完整性研究
a. DiO/DiI-MCs膠束克服MPR2機制示意圖；b. DiO/DiI-MCs膠束與MDCK-MRP2共孵育CLSM成像圖及FRET光譜圖[54]
Figure4. In vitro integrity study of DiO/DiI-MCs micellesa. schematic illustration of the mechanism on overcoming MRP2 of DiO/DiI-MCs; b. CLSM images and FRET spectra of the MDCK-MRP2 cells incubated with DiO/DiI-MCs micelles. Reprinted with permission from ref. [54] (Chen et al. 2017). Copyright 2017 American Chemical Society
通過對FRET-膠束完整性及藥物釋放行為的體外研究不難發現，FRET-膠束在解決藥物細胞內遞送難點、增加藥物在細胞中的累積量及通透性等研究領域有著重要的應用價值。
3.2 FRET-膠束體內分布及完整性研究
FRET-聚合物膠束的體內完整性及生物分布研究，能為膠束在血液中的穩定性以及在生物學方面應用的可行性判斷提供重要依據。但由于技術挑戰，大多數研究局限于體外藥物釋放研究，很少能實現關鍵的體內表征[59]，而且因體內、外釋藥行為缺乏統一性，膠束難以在體內顯示出預期的精準靶向治療優勢[60-61]。因此，進一步了解聚合物膠束在體內的穩定性及生物分布情況具有重要研究價值[62]。
Chen等[63]將DiO（供體）/DiI（受體）熒光分子按質量比1/1（聚合物質量的0.5%）物理包埋到甲氧基聚乙二醇-乳酸乙醇酸嵌段共聚物（mPEG-PLGA）中制備了FRET-膠束（DiO/DiI-NPs），并對其體內完整性和藥物的釋放及分布進行了研究。斑馬魚活體成像系統（living imaging system，IVIS）成像實驗表明：膠束在體內孵育1 h后FRET比率為0.84，大多數納米顆粒在體內保持完整結構；孵育1～8 h，FRET比率從0.84下降到0.59，這表明納米粒子在體內逐漸解離，導致DiO和DiI的分離。值得注意的是，在孵育48 h后，FRET信號仍然存在，FRET比率為0.32，這表明在體內仍然有少量的納米顆粒保持完整結構。同時，在整個實驗過程中，經DiO/DiI-NPs處理的斑馬魚沒有表現出明顯的毒性效應，證明該DiO/DiI-NPs具有良好的生物相容性。另外，Morton等[64]也使用含聚乙二醇的兩親性嵌段共聚物PEG-b-PPLG與Cy5.5（供體）和Cy7（受體）制備了FRET-聚合物膠束。該研究將FRET-膠束（大約為臨界膠束濃度的三倍）通過尾靜脈注射入實驗小鼠體內，基于FRET現象利用IVIS對該聚合物膠束在小鼠體內的解離情況進行了實時監測，結果表明：膠束剛注入小鼠體內時FRET效率為96%，其結構非常穩定；比Chen的研究更進一步的是該PEG-b-PPLG膠束注射入體內后，72 h內FRET效率仍保持在50%～85%之間，證明此類膠束具有更高的體內穩定性。
此外，Hsiao等[65]不僅研究了膠束的體內穩定性，還對其生物分布進行了監測。該研究團隊采用聚（環氧乙烷）類聚合物（PEO-PPO-PEO，pluronic F-68），以FITC（供體）及RhB（受體）為FRET探針對，制備了FRET-膠束（PM）。不同的供體/配體比例證明：受體含量相對較多時FRET現象更明顯[66]，選用最高FRET比率0.8（膠束完整度最高）的PM通過CLSM監測其在活體眼角膜中給藥時的穩定性和生物分布：小鼠眼睛局部給藥1 h后，角膜組織中發現不溶性熒光團或親水性質粒DNA與PM共定位，表明給藥1 h后PM在角膜內仍然保持完整性，膠束能夠從角膜上皮向眼睛輸送藥物，證實了PM作為藥物載體的可行性和穩定性。
浙江大學申有青團隊[67]采用高穩定性的PEG-PS聚合物膠束為對照組，對已應用于臨床研究的PEG-PCL[或聚乳酸（polylactic acid，PLA]膠束的穩定性和體內分布情況進行了研究。該研究將疏水熒光探針Cy5-NHS-easter、Cy5.5-NHS-easter通過酰胺反應偶聯在聚合物上形成FRET-膠束（見圖5a），這種膠束只有在解離時才會導致FRET現象消失，排除了因物理包埋而引起的熒光假象，可通過FRET效率計算膠束在體內的完整度并實時追蹤其分布情況。將PEG-PCL（PS）-Cy5.5膠束與Cy5標記的鼠白蛋白（MSA-Cy5）通過尾靜脈注射到小鼠體內，靜脈共聚焦FRET圖像表明：由于血液剪切力的作用，大部分膠束發生解離，1 h內FRET-PEG-PCL膠束在血液中的FRET比率可達0.73，對照組FRET-PEG-PS膠束FRET比率最高為0.52，因此僅有20%左右的膠束保持完整（見圖5b）。采用IVIS分別監測不同時間段FRET-膠束的小鼠體內成像和生物分布情況發現：FRET-PEG-PCL膠束在血液中迅速解離并被轉移至全身，兩小時后在肝臟中占比約36%。之后將正常肝臟與肝臟腫瘤組織分別切開，FRET-PEG-PCL膠束的腫瘤區切片的FRET效率達0.73，膠束完整度為88%（見圖5c），即在血液剪切力的作用下保持完整結構的膠束能夠到達腫瘤組織。該研究工作表明：FRET-PEG-PCL（PLA）類軟核膠束進入血液循環系統后，由于血液剪切力和血漿蛋白的作用，膠束快速解離為聚合物單鏈并被清除，部分未解離的膠束則可到達腫瘤部位。因此，這類生物相容性高的FRET-膠束作為藥物載體的體內完整性及給藥分布研究，是實現體內精準靶向給藥，讓材料從實驗室走向生活的關鍵研究手段。
圖5
FRET-PEG-PCL膠束體內分布及完整性研究
a. FRET-PEG-PCL膠束的制備示意圖；b.小鼠尾靜脈注射FRET-膠束后靜脈CLSM圖像和FRET光譜圖；c. FRET-膠束靜脈注射活體顯像和生物分布[67]
Figure5. In vitro distribution and integrity of FRET-PEG-PCL micellesa. schematic illustration of the preparation of PEG-PCL-FRET micelles; b. CLSM image and FRET spectra of a mouse vein after injection of FRET-micelles via the tail vein; c. the IVIS and biodistribution images of FRET-micelles. Reprinted with permission from ref. [67] (Sun et al. 2018). Copyright 2018 American Chemical Society
4 結論與展望
在膠束中以物理包埋或化學鍵合等方式引入FRET熒光探針對形成FRET-膠束，不僅可實現對油溶性抗癌藥物的包埋，研究藥物釋放動力學和膠束體內/外穩定性，還能實現實時監測膠束體內分布情況和靶向治療效果等目的，拓展聚合物膠束在藥物釋放方面的研究深度，為聚合物膠束作為載體系統的應用研究提供大量理論依據。
然而，大部分研究工作以熒光探針模擬藥物進行膠束的藥物釋放和體內分布研究，極少將藥物與熒光染料結合形成FRET熒光探針對，從真正意義上對藥物釋放動力學、膠束進入體內后的生物分布和靶向治療效果進行研究。因此，將藥物與染料組成FRET熒光探針對，研究膠束的體內藥物釋放動力學和分布情況，是該領域的一個重要發展方向。其次，由于現階段大部分熒光染料存在聚集熒光猝滅效應，無法達到長期的熒光信號成像追蹤效果，因此由唐本忠院士課題組提出的聚集誘導發光新概念的熒光探針因其獨特的抗洗脫、抗光漂白能力強、對活體損傷小、穿透力強等優勢已成為制備FRET-聚合物膠束用于研究膠束穩定性及藥物釋放動力學的發展趨勢。最后，因大部分染料在納米顆粒中，存在組織滲透深度有限、靶向性差和生物相容性差等問題，將FRET技術應用于納米藥物生物活性臨床研究的報道比較有限，因此，由生物發光分子作為熒光供體的生物發光共振能量轉移（bioluminescent resonance energy transfer，BRET）技術因不需要外部激發光源而消除了熒光染料光漂白，在富含血細胞或血紅色素的組織及活體成像中，由于生物體內光吸收、自發熒光的減少，使BRET在信噪比方面具有明顯優勢，被認為是熒光共振能量轉移成像技術的新方向。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：蔣林芮完成文章的撰寫；曾妮、苗青山進行文獻收集工作；蘇紅瑩、陜紹云、吳昌強進行文章指導工作。
引言
聚合物膠束是由雙親性共聚物在水溶液中自組裝形成的外部親水、內部疏水的核/殼結構納米粒子。因其具有臨界膠束濃度（critical micelle concentration，CMC）低、尺寸小、制備簡單、增容性好、動力學穩定性高、毒性低以及易于進行表面功能基團修飾等優點，常被用于污水處理、環境凈化、微量物質的富集以及生物醫學領域。尤其是作為藥物載體應用時，膠束疏水內核可裝載各種抗癌藥物，提高藥物的穩定性和溶解度而不改變藥物的結構和性能；同時，其親水外殼易進行化學修飾從而實現高效精準的靶向藥物遞送；另外，膠束的納米級粒徑使其具有一定的被動靶向功能[1]。因此，聚合物膠束已成為最具吸引力的油溶性抗癌藥物載體之一[2-3]。
但是，聚合物膠束是一種通過疏水效應、靜電作用等可逆穩定力的作用而形成的熱力學自組裝結構，在復雜的體內/外環境下不可避免地會被多種失穩機制所瓦解，從而造成藥物泄漏、蛋白質吸附、蛋白質滲透以及被稀釋到臨界膠束濃度以下等情況。這些局限性使得膠束類納米載體系統的體內應用及臨床轉化受到了極大限制[4]。因此，研究聚合物膠束的體內外穩定性、進入機體后的體內分布情況及代謝行為，對膠束結構功能設計及判斷其作為生物醫學材料的應用潛力至關重要[5]。例如，膠束在血液中的穩定性和完整性作為一個基礎而又非常重要的課題一直受到人們的高度重視，因此，各領域學者提出多種穩定性檢測方法并進一步用于聚合物膠束結構穩定性的研究。例如：高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[6]、凝膠滲透色譜法（gel permeation chromatography，GPC）[7]、動態光散射（dynamic light scattering，DLS）[8]、熒光信號表征CMC值和熒光共振能量轉移技術（fluorescence resonance energy transfer，FRET）等。其中，FRET技術基于熒光團之間的非輻射能量轉移原理，具有高信噪比、高比率熒光讀數、高時空分辨率等優點[9]，可實時監測聚合物膠束體內/外完整性以及定量測定分子之間的距離[10-12]，已經成功用于檢測納米藥物與生物環境的相互作用，指導納米藥物的開發等相關研究[13-15]。因此，越來越多的研究人員通過物理包埋或化學鍵合的方法將熒光探針與兩親性聚合物復合形成FRET-聚合物膠束，使膠束具備熒光性能，繼而或以熒光對模擬藥物，或進一步采用疏水藥物與熒光染料形成FRET探針對，并在一定的激發波長下通過成像手段來監測FRET-聚合物膠束在體內/外的藥物釋放、動力學行為和FRET比率等，以此作為其穩定性及分布情況的評價指標。這種由FRET探針對與聚合物膠束復合形成的FRET-膠束為探究膠束在生物醫學方面實際應用的可行性，以及實現診療一體化提供了一種途徑。
本文簡單介紹了聚合物膠束的性質及其作為藥物載體的穩定性以及FRET技術的工作原理，著重綜述了幾類常用的FRET熒光探針與聚合物膠束復合形成FRET-聚合物膠束的方法，以及通過熒光光譜分析判斷FRET-聚合物膠束的體內/外團聚和解離行為，并對FRET-聚合物膠束作為藥物載體方面的應用前景和挑戰進行了總結和展望，希望能為聚合物膠束穩定性研究及其作為生物醫用材料的應用研究提供一定的參考。
1 熒光共振能量轉移技術
FRET是指當兩個熒光分子間距足夠小時，供體熒光分子通過偶極-偶極相互作用將能量以非輻射的方式轉移給鄰近的受體熒光分子，使得供體的熒光強度較其單獨存在時降低（熒光猝滅），而受體分子的熒光強度大大增強（敏化熒光）的現象[11]，該技術是監測兩個或多個熒光團之間非輻射能量轉移及分子間距的重要手段。20世紀40年代后期Theodor F?rster首次觀察到了FRET現象，并提出了著名F?rster理論公式（1），因此它也被稱為F?rster共振能量轉移[16]。
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其中， 是輻射速率（通常小于 數量級）， 是F?rster半徑。
F?rster公式的提出為非輻射能量傳遞提供了定量的解釋，解決了圍繞熒光猝滅實驗的謎題，揭示了FRET現象的原理[17]。從那時起FRET技術就在各種研究領域逐漸取得了重大應用研究進展，尤其是在生物醫學領域的診療一體化研究方面得到了廣泛應用。產生FRET現象需要兩個先決條件：第一是供體熒光分子的發射光譜和受體熒光分子的吸收光譜必須要有超過30%的光譜重疊；第二是供體分子和受體分子的距離要足夠近（< 10 nm）[18]，來自供體轉移的發射能量通常會觸發與之相距1～10 nm內的受體發射熒光[19-23]，從而產生一種非放射性能量轉移行為，即FRET現象，如圖1所示。
由于FRET技術的這種獨特機制，使其具有非常高的靈敏度、選擇性、較低的測量時間以及不受其他溶劑或分子的干擾等優點。因此，FRET技術已成為高度靈敏的檢測工具，用來探測生物領域中各種復雜現象[24-27]，尤其是將熒光探針對與聚合物膠束結合并通過共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）成像技術和公式（2）計算FRET效率[28]等手段來監測膠束在體內外的完整性、體內分布以及藥物控釋精準程度等，已成為該領域的重點研究方向。
FRET效率計算公式：
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其中，E是FRET效率，IDA是膠束中受體存在時供體的熒光積分強度，ID是膠束中沒有受體時供體的熒光積分強度。
值得注意的是，FRET效率尤其對供體和受體之間的距離變化高度敏感，這可能是由感知域的斷裂及隨后的供體和受體的擴散、FRET熒光探針對的構象變化以及機械張力三方面引起的[12]。并且，對于不同的熒光探針，在監測聚合物膠束穩定性以及載藥性能時，所展示的現象與機制也有所不同。目前常用于研究FRET-聚合物膠束結構及性能的FRET策略主要有兩種：① 熒光猝滅的FRET-ON到熒光恢復的FRET-OFF：形成膠束時因為猝滅劑的存在熒光消失，膠束解離時熒光與猝滅劑分開，逐漸恢復熒光強度[29]；② 受體熒光增強的FRET-ON到受體熒光減弱的FRET-OFF：即形成膠束時有明顯的供體能量轉移現象，膠束解離或在酶存在下使受體結構發生改變時FRET現象消失[30-32]。本文依據這兩種策略，對常用的幾種FRET熒光探針復合聚合物膠束的方法、產生的FRET現象以及FRET-聚合物膠束的穩定性、體內外分布情況和載藥性能研究進展進行了綜述。
2 幾種常用的FRET-聚合物膠束
FRET-聚合物膠束是指將FRET熒光探針對與聚合物膠束通過物理/化學作用復合形成的具有FRET現象的膠束團聚體。熒光探針對的種類及復合方式是決定所獲得聚合物膠束的FRET行為及應用性能的關鍵。常見的熒光染料有花菁（cyanine，Cy）類[33]、親酯性二烷基碳菁（dialkylcarbocyanines）類[34]、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）[35]、香豆素6[36]和羅丹明B（Rhodamine B，RhB）[37]等。大部分研究以熒光團模擬脂/水溶性的藥物，通過記錄FRET信號的變化，研究藥物在體內/外的分布情況以及從納米載體中釋放的動力學信息，指示膠束的團聚與解離行為[38]。由于FRET效率對供體和受體之間的距離變化高度敏感，所以對熒光染料的選擇也有要求。這一部分將主要介紹三類常用的熒光染料與聚合物膠束結合方法及相關結構性能的研究進展。
2.1 花菁類聚合物膠束
大多數染料在結構上都和唯一經過美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）認證的菁類染料-吲哚花菁綠（indocyanine green，ICG）有相似之處[39]。Cy染料即在其結構上引入了磺酸基團、N-羥基琥珀酰亞胺活性酯等基團來增加它的溶解性或提高活性[40]。與其他常見染料如FITC、香豆素6和羅丹明B相比，Cy類染料具有更高的熒光穩定性、更好的自熒光分離能力和更小的細胞損傷性[41-42]。因其獨特的共軛骨架結構以及優良的熒光性能，被廣泛應用于聚合物膠束團聚與解離以及生物成像研究。
Fu等[43]采用第一種FRET策略，即在FRET-膠束中染料和猝滅劑聚集時，特定的猝滅劑會猝滅熒光染料的熒光（FRET-ON），而當染料和猝滅劑分離以阻斷FRET過程時，染料的熒光信號再次出現（FRET-OFF）。該研究通過可逆加成-斷裂鏈轉移（reversible addition-fragmentation chain transfer，RAFT）聚合、開環聚合和點擊反應合成了聚甲基丙烯酸乙二醇酯（POEGMA）與聚L-天冬氨酸（PBLA）的兩親共聚物，進一步采用N，N-二異丙基乙二胺（DIEDA）和N，N-二丁基乙二胺（DBEDA）對PBLA鏈段進行氨基化反應，制得了可電離多種叔胺的兩親性嵌段共聚物。所得嵌段共聚物可在中性pH條件下自組裝形成穩定的膠束，并在弱酸性條件下解體。利用該聚合物的氨基分別與羧基修飾的Cy5.5和猝滅劑（fluorecent quencher，FQ）通過酰胺反應偶聯并自組裝形成具有pH敏感性的FRET-聚合物膠束。對FRET-膠束在不同環境pH作用下的FRET現象及釋藥行為研究表明：FRET效率與猝滅劑加入量成正比，且在pH 6.5～4.0環境下，釋藥率可高達80%以上；而pH 7.0～11條件下，其釋藥率僅為35%。這是因為酸性條件下猝滅劑上的叔胺基逐漸被質子化，膠束發生解體從而表現為較低的穩定性，而在中性及堿性環境下膠束穩定性高。類似的，Ruan等[44]也采用了同樣的熒光染料Cy5.5和猝滅劑FQ，制備了具有還原/氧化響應性的FRET-膠束。Cy5.5的羧基與多聚賴氨酸（PLYS）類嵌段聚合物POEGMA-PLYS的氨基以酰胺反應偶聯獲得兩親性聚合物POEGMA-b-PLYS-Cy（PCy），猝滅劑的羧基與POEGMA-SS聚合物的羥基通過酯化反應偶聯為含有二硫鍵的聚合物POEGMA-SS-Q（PFQ）（見圖2a）。PCy與PFQ混合自組裝形成具有氧化/還原響應性的PCQ膠束。通過熒光光譜分析和紫外光譜研究表明：FRET效率同樣與Cy5.5/FQ比值有關，且因PCQ膠束具備氧化/還原響應性，當其處于高谷胱甘肽（glutathione，GSH）濃度環境時，POEGMA和FQ之間的二硫鍵斷裂導致FQ脫落，膠束瓦解，對阿霉素（doxorubicin，DOX）24 h內累計釋放量可達60%，相對于不含GSH的PBS介質中藥物釋放率18%而言有顯著提升（見圖2b）。這類環境響應型FRET-膠束可實現裝載藥物的刺激響應釋放，是一類具有潛在應用價值的智能載藥系統。
圖2
PCQ膠束制備及釋藥性能
a. PCy及PFQ兩親共聚物的合成路線；b.最佳Cy/FQ物質的量之比的熒光強度及PCQ@DOX膠束DOX釋放曲線[44]
Figure2. Preparation and drug release properties of PCQ micellesa. the synthetic route of the PCy and PFQ amphiphilic copolymer; b. fluorescence intensity in optimum molar ratio of Cy/FQ and DOX delivery curves of the PCQ@DOX micelles. Reprinted with permission from ref. [44] (Ruan et al. 2018). Copyright 2018 American Chemical Society
與染料和猝滅劑組成的FRET-聚合物膠束發生熒光猝滅（FRET-ON）現象不同，Liang等[45]采用第二種FRET策略，更加直接地觀察到了聚合物形成膠束時受體熒光增強、供體熒光強度減弱（FRET-ON）到膠束裂解成聚合物時受體熒光減弱、供體熒光增強（FRET-OFF）的現象。該研究工作采用聚甲氧基聚乙二醇（mPEG）引發己內酯（ε-CL）單體開環聚合制備了聚甲氧基聚乙二醇-聚己內酯（mPEG-PCL）兩嵌段共聚物，進一步將羧基修飾的Cy5（受體）通過酯化反應與PCL的端羥基進行偶聯，獲得的兩親性聚合物mPEG-PCL-Cy5自組裝形成膠束，同時對羧基修飾的Cy3（供體）進行包埋形成了FRET-膠束。熒光光譜分析同樣發現：不同Cy3含量所產生的FRET現象不同，Cy3含量為5%～2%時，膠束的FRET比率在3.8～2.0左右，選用Cy3含量為4%的FRET-膠束研究了其穩定性與藥物釋放可行性。結果表明：12 h內Cy3的釋放率為68.1%并可持續釋放48 h。Saqr等[46]也采用了與Liang同樣的FRET策略探究了Cy3/Cy5.5與甲氧基聚氧乙烯-聚己內酯（PEO-PCL）制備的FRET-膠束作為靶向給藥載體的藥物釋放動力學和穩定性。通過對兩種FRET策略的研究不難發現，不論是化學偶聯還是物理包埋，熒光探針對的物質的量是決定FRET效率的關鍵因素。
2.2 親酯性二烷基碳菁類聚合物膠束
親酯性二烷基碳菁類染料是一類環境敏感型親脂性膜染料，這類探針在進入細胞膜之前熒光非常弱，當它們與膜結合或者與親脂性生物分子（例如蛋白質）結合時，其熒光強度顯著增強，因此主要用于標記細胞膜以及其他脂溶性生物結構。其中DiO（3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate）和DiI（1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate）由于在近紅外（near infrared，NIR）區域活性弱、激發波長短、組織穿透性差，多應用于體外細胞水平。DiR（1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindotricarbocyaine iodide）在NIR區域活性強，具有熒光干擾小、組織滲透深度大等優點，在活體研究（如小鼠和斑馬魚模型）中得到了廣泛的應用。
Gupta等[47]制備了一種聚硫丙烯（PS74-CEP）與N，N-二甲基丙烯酰胺（DMA）的兩嵌段聚合物（PS74-b-DMA310），并復合熒光探針對模擬疏水藥物對形成的膠束靶向釋藥性能進行了研究。實驗以常用鏈轉移劑4-氰基-4-（乙基亞砜基硫羰基亞砜基）戊酸（4-cyano-4-(ethylsulfanylthiocarbonylsulfanyl) pentanoic acid，CEP）與硫丙烷（propylene sulfide，PS）為原料，采用硫代酰基轉移法制備了聚（PS74-CEP）大分子，并用所得的聚（PS74-CEP）大分子與DMA通過RAFT法獲得了PS74-b-DMA310嵌段聚合物，再將DiI和DiO熒光對采用物理包埋的方法與膠束復合形成FRET-聚合物膠束。體外藥物釋放行為研究表明：以DiO為模型藥物測得膠束最大載藥率為63%，藥物釋放率可達90%以上，且聚（PS74-b-DMA310）膠束在較寬的濃度范圍內具有良好的細胞相容性。李瑞等[48]在Gupta的基礎上也采用了DiO-DiI熒光對，將其物理包埋在聚合物PEG-PCL（M）膠束疏水內核中，形成了具有FRET現象的DiO-DiI-M膠束。同時通過酰胺反應將FITC通過化學鍵與PEG-PCL偶聯，再物理包載熒光DiI制備了FITC-DiI-M聚合物膠束（FITC-DiI熒光對與DiO-DiI形成對照）。其中FITC的熒光指示著膠束本身的變化，DiI熒光指示著包載物的釋放，因此兩種膠束FRET變化的差異主要是由膠束的解離產生的。通過監測膠束在PBS介質中的熒光光譜發現，4 h內膠束都能保持完整結構。與其他染料可化學偶聯不同，親酯性二烷基碳菁類熒光染料多采用物理包埋的方式與聚合物膠束進行復合，這種方式使獲得的FRET-膠束會因染料的泄露等情況造成熒光假象從而只能在短時間內對FRET-膠束的穩定性做出定量評價。
2.3 與藥物配對的熒光聚合物膠束
相對于其他熒光探針組合，通過熒光探針與自身具有熒光特性的藥物組成的探針對的研究，不僅能夠以FRET現象研究膠束的團聚與解離情況，而且可以對藥物釋放行為及路徑進行直接檢測，實現真正意義上的藥物釋放研究。
Zhou等[49]制備了一種物理包埋DOX的還原型熒光聚合物膠束，研究了由還原劑引發的FRET-聚合物膠束的解離和藥物釋放動力學。該研究以甲基丙烯酸丁酯（BMA）和還原響應型四苯乙烯-偶氮苯衍生甲基丙烯酸甲酯（TPE-AZO-MA）為單體，在1，4-二氧六環/水混合溶劑中通過RAFT反應合成了兩親性聚合物。隨后，用聚合誘導自組裝法（polymerization-induced self-assembly，PISA）成功制備了原位負載DOX的還原型聚合物膠束。在偶氮還原酶作用下膠束結構中的偶氮鍵斷裂導致膠束粒徑增大或發生解離，DOX的釋放使得TPE的聚集誘導熒光性能因FRET-OFF而被有效地激活，并且載藥膠束在酶水解環境下24 h內顯示出58.5%的DOX釋放量，可觀察到溶液中明顯的DOX熒光的增強現象。
與物理包埋藥物不同，Yang等[50]開發了一類化學偶聯表阿霉素（epirubicin，EPI）的生物可降解聚合物給藥系統，并采用FRET技術對其藥物釋放進行了無創監測。該研究以常用多肽縮合試劑2-（7-氮雜苯并三氮唑）-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）為偶聯劑，N-甲基丙烯酰甘氨酰苯丙酰亮氨酸（MA-GFLG-OH）和EPI為單體，通過RAFT和酰胺反應，制備了聚合物MA-GFLG-EPI[51]，再與Cy5-NH2進行氨解反應制得具有FRET效應的聚合物膠束。熒光光譜分析（激發光：490 nm）發現：EPI與Cy5的FRET比率為0.89，表明大部分膠束結構完整，與細胞孵育4 h后FRET比率為0.84，24 h后比率降至0.77。FRET比率的變化表明：隨著時間的變化膠束開始瓦解，EPI分子從膠束中釋放出來。Wang等[52]以四苯乙烯（tetraphenylethene，TPE）染料作為FERT供體通過酰胺鍵化學偶聯到雙親性聚合物mPEG-Plys上，并進一步通過含二硫鍵的小分子中間體偶聯姜黃素（Cur）作為藥物和FRET受體，得到的兩親性聚合物mPEG-Plys（Cur）-TPE自組裝成膠束（見圖3a）。該FRET膠束在還原性環境（GSH或MCF-7細胞）下（見圖3b），二硫鍵斷裂釋放Cur導致AIE熒光的“開啟”和FRET信號的“關閉”，從而引發TPE和Cur的熒光增強。同時，MCF-7細胞在標記后一段時間也因為膠束結構瓦解而觀察到了兩種熒光信號的增強，且熒光強度隨時間延長呈現增強趨勢。該研究將FRET和TPE整合在一個膠束納米平臺上的新型策略，不僅研究了氧化/還原敏感膠束中姜黃素的釋放動力學，而且相較于傳統熒光染料，TPE類熒光染料不會因聚集熒光猝滅效應（aggregation-caused quenching，ACQ）在短時間內發生熒光猝滅現象，具有強抗光漂白能力，從而可在一定時間內持續對膠束載藥性能進行監測并做出評價。
圖3
氧化還原響應性FRET-膠束熒光強度
a. FRET機制；b.還原性環境下FRET-膠束中TPE和Cur的熒光強度隨時間變化[52]
Figure3. Fluorescence intensity of redox responsive FRET-micellesa. FRET principle; b. the fluorescence intensities of TPE and Cur in FRET-micelles in response to reducing environment varied with time. Reprinted with permission from ref. [52] (Wang et al. 2018). Copyright 2018 Wiley-VCH
3 FRET-膠束作為藥物載體的應用
3.1 FRET-膠束完整性及藥物釋放行為體外研究
如上所述，穩定性、高效給藥能力及良好的生物相容性是膠束作為納米藥物載體進入臨床研究的關鍵。而直接監測膠束在體外的動態藥物釋放行為及生物相容性，對評估膠束能否進行體內實驗和臨床研究至關重要。
Miteva等[53]采用Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 546作為熒光探針對模擬藥物，物理包埋到四組不同物質的量的比的聚二甲氨基乙酯嵌段共聚物（PD-b-pDPB）/聚乙二醇嵌段共聚物（PEG-b-pDPB）（100D/no PEG、50D/5K PEG、50D/10K PEG、50D/20K PEG）的聚合物中，形成FRET-膠束，并對具有細胞內遞送障礙的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）進行遞送。將該膠束與Luc-3T3細胞共孵育，通過CLSM在細胞水平上可視化監測siRNA釋放過程。研究結果表明：當熒光分子被包裹在膠束中，探針對距離較近，FRET信號高；隨著膠束結構的破壞，膠束逐漸解離，熒光分子被釋放，FRET信號減弱，siRNA被有效釋放。通過計算四組膠束在細胞內的FRET比率研究藥物釋放動力學發現：理想混合膠束配方為50D/20K PEG時，FRET比率低至20%左右，siRNA胞內有效釋放為60%以上。
與通過熒光探針模擬藥物不同，Chen等[54]成功研制了負載黃芩素的Pluronic P85/F68膠束（B-MCs），并將其用于克服耐藥蛋白2（MRP2）介導的黃芩素外排治療帕金森病（見圖4a）。所獲得的B-MCs膠束能提高黃芩素在細胞中的累積量和通透性。該研究將DiO/DiI探針對物理包埋入膠束再與過表達MRP2的犬腎細胞（MDCK-MRP2）共孵育，然后采用CLSM成像技術觀察FRET現象（見圖4b），結果如下：在前15 min細胞表現出很低的綠色熒光（DiO信號），MCs膠束主要以完整的形式被細胞攝取，DiO和DiI是在細胞內釋放的，解決了因MRP2在胃腸道和血腦屏障中過度表達而影響藥物高效遞送的難題，且B-MCs膠束在24 h內黃芩素的累計釋放率可達96%。這為研究Pluronic膠束通過細胞的完整性、藥物釋放性能以及逆轉MRP2的機制奠定了基礎。類似的，Chen等[55]將Cy5（受體）通過酰胺反應與雙親性棕櫚酰殼聚糖進行偶聯，并將其形成的膠束用于負載DOX（供體），制備了一種具有pH響應性的FRET-聚合物膠束納米粒子（Cy5-NPCS NPs）。該膠束在中性pH環境下具有高穩定性，酸性條件下易瓦解。進一步將該膠束與HT1080細胞孵育后對藥物在細胞內的釋放及分布情況進行了研究發現：FRET-膠束在30 min～4 h隨著DOX的釋放逐漸瓦解，完成FRET ON到FRET OFF的轉變。該研究工作將Cy5和DOX作為熒光探針對，實現了細胞內膠束結構完整性的實時監測，相對于其他以熒光探針模擬藥物釋放的研究[56-58]，更加直接地對藥物分子的胞內釋放行為及分布情況進行了監測。
圖4
DiO/DiI-MCs膠束體外完整性研究
a. DiO/DiI-MCs膠束克服MPR2機制示意圖；b. DiO/DiI-MCs膠束與MDCK-MRP2共孵育CLSM成像圖及FRET光譜圖[54]
Figure4. In vitro integrity study of DiO/DiI-MCs micellesa. schematic illustration of the mechanism on overcoming MRP2 of DiO/DiI-MCs; b. CLSM images and FRET spectra of the MDCK-MRP2 cells incubated with DiO/DiI-MCs micelles. Reprinted with permission from ref. [54] (Chen et al. 2017). Copyright 2017 American Chemical Society
通過對FRET-膠束完整性及藥物釋放行為的體外研究不難發現，FRET-膠束在解決藥物細胞內遞送難點、增加藥物在細胞中的累積量及通透性等研究領域有著重要的應用價值。
3.2 FRET-膠束體內分布及完整性研究
FRET-聚合物膠束的體內完整性及生物分布研究，能為膠束在血液中的穩定性以及在生物學方面應用的可行性判斷提供重要依據。但由于技術挑戰，大多數研究局限于體外藥物釋放研究，很少能實現關鍵的體內表征[59]，而且因體內、外釋藥行為缺乏統一性，膠束難以在體內顯示出預期的精準靶向治療優勢[60-61]。因此，進一步了解聚合物膠束在體內的穩定性及生物分布情況具有重要研究價值[62]。
Chen等[63]將DiO（供體）/DiI（受體）熒光分子按質量比1/1（聚合物質量的0.5%）物理包埋到甲氧基聚乙二醇-乳酸乙醇酸嵌段共聚物（mPEG-PLGA）中制備了FRET-膠束（DiO/DiI-NPs），并對其體內完整性和藥物的釋放及分布進行了研究。斑馬魚活體成像系統（living imaging system，IVIS）成像實驗表明：膠束在體內孵育1 h后FRET比率為0.84，大多數納米顆粒在體內保持完整結構；孵育1～8 h，FRET比率從0.84下降到0.59，這表明納米粒子在體內逐漸解離，導致DiO和DiI的分離。值得注意的是，在孵育48 h后，FRET信號仍然存在，FRET比率為0.32，這表明在體內仍然有少量的納米顆粒保持完整結構。同時，在整個實驗過程中，經DiO/DiI-NPs處理的斑馬魚沒有表現出明顯的毒性效應，證明該DiO/DiI-NPs具有良好的生物相容性。另外，Morton等[64]也使用含聚乙二醇的兩親性嵌段共聚物PEG-b-PPLG與Cy5.5（供體）和Cy7（受體）制備了FRET-聚合物膠束。該研究將FRET-膠束（大約為臨界膠束濃度的三倍）通過尾靜脈注射入實驗小鼠體內，基于FRET現象利用IVIS對該聚合物膠束在小鼠體內的解離情況進行了實時監測，結果表明：膠束剛注入小鼠體內時FRET效率為96%，其結構非常穩定；比Chen的研究更進一步的是該PEG-b-PPLG膠束注射入體內后，72 h內FRET效率仍保持在50%～85%之間，證明此類膠束具有更高的體內穩定性。
此外，Hsiao等[65]不僅研究了膠束的體內穩定性，還對其生物分布進行了監測。該研究團隊采用聚（環氧乙烷）類聚合物（PEO-PPO-PEO，pluronic F-68），以FITC（供體）及RhB（受體）為FRET探針對，制備了FRET-膠束（PM）。不同的供體/配體比例證明：受體含量相對較多時FRET現象更明顯[66]，選用最高FRET比率0.8（膠束完整度最高）的PM通過CLSM監測其在活體眼角膜中給藥時的穩定性和生物分布：小鼠眼睛局部給藥1 h后，角膜組織中發現不溶性熒光團或親水性質粒DNA與PM共定位，表明給藥1 h后PM在角膜內仍然保持完整性，膠束能夠從角膜上皮向眼睛輸送藥物，證實了PM作為藥物載體的可行性和穩定性。
浙江大學申有青團隊[67]采用高穩定性的PEG-PS聚合物膠束為對照組，對已應用于臨床研究的PEG-PCL[或聚乳酸（polylactic acid，PLA]膠束的穩定性和體內分布情況進行了研究。該研究將疏水熒光探針Cy5-NHS-easter、Cy5.5-NHS-easter通過酰胺反應偶聯在聚合物上形成FRET-膠束（見圖5a），這種膠束只有在解離時才會導致FRET現象消失，排除了因物理包埋而引起的熒光假象，可通過FRET效率計算膠束在體內的完整度并實時追蹤其分布情況。將PEG-PCL（PS）-Cy5.5膠束與Cy5標記的鼠白蛋白（MSA-Cy5）通過尾靜脈注射到小鼠體內，靜脈共聚焦FRET圖像表明：由于血液剪切力的作用，大部分膠束發生解離，1 h內FRET-PEG-PCL膠束在血液中的FRET比率可達0.73，對照組FRET-PEG-PS膠束FRET比率最高為0.52，因此僅有20%左右的膠束保持完整（見圖5b）。采用IVIS分別監測不同時間段FRET-膠束的小鼠體內成像和生物分布情況發現：FRET-PEG-PCL膠束在血液中迅速解離并被轉移至全身，兩小時后在肝臟中占比約36%。之后將正常肝臟與肝臟腫瘤組織分別切開，FRET-PEG-PCL膠束的腫瘤區切片的FRET效率達0.73，膠束完整度為88%（見圖5c），即在血液剪切力的作用下保持完整結構的膠束能夠到達腫瘤組織。該研究工作表明：FRET-PEG-PCL（PLA）類軟核膠束進入血液循環系統后，由于血液剪切力和血漿蛋白的作用，膠束快速解離為聚合物單鏈并被清除，部分未解離的膠束則可到達腫瘤部位。因此，這類生物相容性高的FRET-膠束作為藥物載體的體內完整性及給藥分布研究，是實現體內精準靶向給藥，讓材料從實驗室走向生活的關鍵研究手段。
圖5
FRET-PEG-PCL膠束體內分布及完整性研究
a. FRET-PEG-PCL膠束的制備示意圖；b.小鼠尾靜脈注射FRET-膠束后靜脈CLSM圖像和FRET光譜圖；c. FRET-膠束靜脈注射活體顯像和生物分布[67]
Figure5. In vitro distribution and integrity of FRET-PEG-PCL micellesa. schematic illustration of the preparation of PEG-PCL-FRET micelles; b. CLSM image and FRET spectra of a mouse vein after injection of FRET-micelles via the tail vein; c. the IVIS and biodistribution images of FRET-micelles. Reprinted with permission from ref. [67] (Sun et al. 2018). Copyright 2018 American Chemical Society
4 結論與展望
在膠束中以物理包埋或化學鍵合等方式引入FRET熒光探針對形成FRET-膠束，不僅可實現對油溶性抗癌藥物的包埋，研究藥物釋放動力學和膠束體內/外穩定性，還能實現實時監測膠束體內分布情況和靶向治療效果等目的，拓展聚合物膠束在藥物釋放方面的研究深度，為聚合物膠束作為載體系統的應用研究提供大量理論依據。
然而，大部分研究工作以熒光探針模擬藥物進行膠束的藥物釋放和體內分布研究，極少將藥物與熒光染料結合形成FRET熒光探針對，從真正意義上對藥物釋放動力學、膠束進入體內后的生物分布和靶向治療效果進行研究。因此，將藥物與染料組成FRET熒光探針對，研究膠束的體內藥物釋放動力學和分布情況，是該領域的一個重要發展方向。其次，由于現階段大部分熒光染料存在聚集熒光猝滅效應，無法達到長期的熒光信號成像追蹤效果，因此由唐本忠院士課題組提出的聚集誘導發光新概念的熒光探針因其獨特的抗洗脫、抗光漂白能力強、對活體損傷小、穿透力強等優勢已成為制備FRET-聚合物膠束用于研究膠束穩定性及藥物釋放動力學的發展趨勢。最后，因大部分染料在納米顆粒中，存在組織滲透深度有限、靶向性差和生物相容性差等問題，將FRET技術應用于納米藥物生物活性臨床研究的報道比較有限，因此，由生物發光分子作為熒光供體的生物發光共振能量轉移（bioluminescent resonance energy transfer，BRET）技術因不需要外部激發光源而消除了熒光染料光漂白，在富含血細胞或血紅色素的組織及活體成像中，由于生物體內光吸收、自發熒光的減少，使BRET在信噪比方面具有明顯優勢，被認為是熒光共振能量轉移成像技術的新方向。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：蔣林芮完成文章的撰寫；曾妮、苗青山進行文獻收集工作；蘇紅瑩、陜紹云、吳昌強進行文章指導工作。
