腸道微生物作為人體最龐大的生態系統參與尿酸的合成與代謝，開發和利用腸道細菌降解尿酸或可為高尿酸血癥治療提供新思路。將低尿酸人群糞便樣本處理后接種于濃度為1.5 mmol/L尿酸選擇培養基進行初篩，通過濃度梯度法對初篩出的可能具有降解能力的菌株進行馴化，并通過16S rRNA序列測定方法對篩選出的具備高效尿酸降解率的菌株進行鑒定。結果表明從低尿酸人群糞便中篩選馴化出一株高效尿酸降解菌S3A，尿酸降解率可達到50.2%，經鑒定該菌為大腸桿菌。高效尿酸降解菌株的分離、馴化不僅可以為腸道微生物降解尿酸的機制研究提供科學依據，還可為今后臨床高尿酸血癥和痛風的治療儲備生物菌種資源。
引用本文： 田婷婷, 陳鄔錦, 梁美婷, 瑪依娜·卡哈爾, 李瑞, 孫玉萍. 低尿酸人群腸道尿酸降解功能菌的篩選、馴化及鑒定. 生物醫學工程學雜志, 2022, 39(4): 792-797. doi: 10.7507/1001-5515.202111028 復制
引言
尿酸是嘌呤代謝的終產物，尿酸代謝紊亂可導致高尿酸血癥的發生，是痛風性關節炎和腎功能衰竭的誘因。此外，高尿酸血癥還是糖尿病、非酒精性脂肪肝、心血管疾病、肥胖及高血壓等慢性疾病的危險因素[1-5]。人體每天產生的尿酸2/3通過腎臟排出，余1/3則通過腸道排泄，其中腸道菌群對機體尿酸的代謝不容忽視。腸道菌群作為人體內最大的微生態系統，參與人體的消化、營養吸收以及代謝等過程[6]，與人體的健康和疾病有著密切的關聯。高尿酸血癥患者相較正常人群腸道中乳桿菌屬、鏈球菌屬、梭菌屬及變形桿菌屬等菌屬的分布存在明顯差異[7-10]。在尿酸代謝過程中，部分腸道細菌直接參與尿酸的生成及排泄[11]，但具體作用機制尚未明確。
因此，本研究采用細菌的分離培養和篩選技術，對低尿酸人群糞便中可能具有尿酸降解功能的細菌進行篩選馴化，以期對尿酸降解功能菌的進一步開發和利用提供研究思路。
1 材料方法
1.1 主要試劑及設備
96孔板（廣州賽國生物科技有限公司），尿酸、丙三醇（上海麥克林生化科技有限公司），磷酸氫二鉀（天津市致遠化學試劑有限公司），瓊脂粉、腦心浸液培養基（Brain Heart Infusion Medium，BHI）（青島海博生物科技有限公司），革蘭染液（珠海貝索生物技術有限公司），尿酸測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），細菌基因組DNA快速抽提試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司），超聲震蕩儀F-031SD（深圳福洋科技集團有限公司），生物顯微鏡Ni-U（日本尼康生物），VITEK-2 Compact 30全自動細菌鑒定儀［梅里埃診斷產品（上海）有限公司］，日本三菱MGC厭氧產氣袋。
1.2 糞便標本收集
來源于新疆某高校大一健康男性，年齡18～20歲，按照以下納入標準選擇15名研究對象，收集晨起中段無污染糞便于無菌糞便采樣管中，置于冰盒，2小時內運送到實驗室進行預處理。納入標準：采樣期向前推三個月內無重大疾病且未服用抗生素，健康體檢后血尿酸<190 μmol/L的低水平尿酸者，對本研究均知情同意。
1.3 糞便預處理
無菌離心管稱取糞便樣本0.2～0.3 g，將其加入到備好玻璃珠和無菌水（10 mL）的試管內，振搖5 min，將標本梯度稀釋至10?3～10?5，取上清制備成菌液保存。
1.4 培養基的制備
1.4.1 尿酸溶解
根據尿酸的化學式（C5H4N4O3）及摩爾質量（M=168.110 3 g/mol），稱取尿酸1.681 1 g溶解在1 000 mL溶劑中，制備成濃度10 mmol/L尿酸溶液 ，具體方法見參考文獻[12]。
1.4.2 尿酸選擇培養基的制備
稱取3.85 g BHI置于100 mL容量瓶中，并向容量瓶中加入15 mL配置好的10 mmol/L尿酸溶液，超純水定容至100 mL，配成終濃度為1.5 mmol/L BHI尿酸選擇培養基，平行3個樣，高壓滅菌備用。
1.4.3 尿酸馴化培養基的制備
稱取3.85 g BHI置于4個100 mL容量瓶中，向容量瓶中分別加入17、19、21、23 mL已溶解好的10 mmol/L尿酸溶液，超純水定容至100 mL。配成終濃度為1.7、1.9、2.1、2.3 mmol/L的尿酸BHI培養基，每個濃度平行3個樣，高壓滅菌備用。
1.5 標準曲線的繪制
本研究根據尿酸測定試劑盒所提供的標準品采用尿酸酶法制定標準曲線。將400 μmol/L尿酸標準品稀釋為7個濃度，分別為100、150、200、250、300、350、400 μmol/L（每個濃度平行3個樣）。取5 μL不同濃度尿酸標準品及稀釋后的待測菌培養濾過液（平行3個樣）加入至96孔板中，在紫外波長510 nm處測定其吸光度值，根據濃度及其所對應的吸光度值建立標準曲線并計算尿酸濃度。
1.6 尿酸降解功能菌的篩選
將預處理后的糞便樣本接種到尿酸濃度為1.5 mmol/L BHI篩選液體培養液中，置于厭氧條件下37 ℃培養24～48 h。采用分區劃線法將具有尿酸降解功能的原始培養液接種于BHI初篩平板中進行分離培養，連續分離純化三次，每次都進行菌落計數和革蘭染色形態鑒定，直到分離純化出純的單個菌落。
1.7 高效尿酸降解菌的馴化及降解效果測定
將分離純化出的細菌制備成1×107 CFU/mL濃度菌液50 μL，采用濃度梯度法把菌液分別接種于1.7、1.9、2.1、2.3 mmol/L BHI培養液中，每組3個平行樣，厭氧條件下37 ℃、220 r/min搖床培養48 h。同時設置相同尿酸濃度不加菌液的BHI培養液進行對照（每個濃度梯度設置3個平行樣）。48 h后取培養液12 000 r/min離心10 min，取上清稀釋20倍，測定培養液中尿酸濃度。
1.8 尿酸降解功能菌的鑒定
1.8.1 形態學觀察
① 菌落形態觀察：挑取純培養物進行稀釋，采用分區劃線法將其接種在1.5 mmol/L BHI平板中，在37 ℃厭氧條件下培養36～48 h后觀察。② 細菌形態學觀察：用滅菌牙簽挑取純化的單個菌落涂于載玻片上并滴加生理鹽水制片，自然干燥1～2 min，用酒精燈進行固定，將固定好的涂片進行革蘭染色。方法參照貝索革蘭染液說明書進行，將染色完成的玻片置油鏡下觀察細菌的排列和形態。
1.8.2 生化反應鑒定
將已分離純化的菌株采用VITEK-2 Compact 全自動細菌鑒定儀進行菌株生化鑒定。
1.8.3 16S rRNA測序
使用Rapid Bacterial Genomic DNA Isolation Kit，按照說明書提取細菌DNA的方法進行操作，使用16S通用引物27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）進行PCR擴增。PCR擴增體系為：PCR mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 21 μL，DNA模板2 μL，總體積為50 μL。擴增條件：94 ℃預變性 5 min，94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，35個循環，72 ℃再延伸10 min，16 ℃保存。將PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，擴增出目的基因條帶的菌株委托給上海生工生物工程股份有限公司進行16S rRNA測序。
1.8.4 序列比對及同源性分析
測序結果在NCBI上進行BLAST比對，對相似度大于97%的菌株序列進行同源性分析，并采用MEGA-X軟件構建系統進化樹。
1.9 統計方法
采用SPSS23.0統計軟件將所得數據進行統計學分析，計量資料以均數 ± 標準差（
）表示，組間比較用配對樣本t檢驗，檢驗水準α = 0.05。
2 結果
2.1 標準曲線的繪制
根據尿酸測定試劑盒所提供的標準品制定標準曲線，由標準曲線可得吸光度A與尿酸濃度相關方程為y = 0.000 174 x + 0.045 589，相關系數R2 = 0.997，符合尿酸濃度測定標準（R2 ≥ 0.995），見圖1。
圖1
不同濃度尿酸標準品標準曲線
Figure1.
Standard curve of different concentrations of uric acid standard
2.2 尿酸功能菌的馴化、篩選及尿酸降解率測定
通過強化篩選獲得1株腸道細菌，命名為S3A。馴化后發現S3A菌在不同尿酸濃度馴化培養基中均可生長，在1.7、1.9、2.1、2.3 mmol/L BHI尿酸篩選培養基中的降解率分別為32.2%、37.3%、41.7%、50.2%，且隨著培養基中尿酸濃度的增加，降解率也逐步增加。具體結果見表1。
表1
菌株S3A在馴化BHI培養基中的尿酸降解率
Table1.
Uric acid degradation rate of strain S3A in domesticated BHI medium
2.3 尿酸降解功能菌S3A的鑒定
2.3.1 培養特性及形態學觀察
在BHI平板培養基上可見S3A菌落為灰白色，圓形凸起，邊緣整齊，表面濕潤光滑，見圖2。革蘭染色后顯微鏡下可見革蘭陰性短桿菌，散在排列，見圖3。
圖2
S3A菌落形態
Figure2.
Colonial morphology of strain S3A
圖3
S3A革蘭染色顯微鏡下形態（10 × 100）
Figure3.
Morphology of strain S3A under the microscope after Gram staining (10 × 100)
2.3.2 生化鑒定
菌株S3A生化鑒定結果見表2。通過以上結果，VITEK-2 Compact全自動細菌鑒定儀鑒定出該菌為大腸桿菌。
表2
菌株S3A生化鑒定結果
Table2.
Biochemical identification results of strain S3A
2.3.3 S3A菌株DNA的提取及PCR擴增
提取S3A菌株DNA后進行PCR擴增，擴增產物凝膠電泳顯示在1 500 bp左右存在目的條帶，符合16S rRNA測序要求（見圖4）。
圖4
16S rRNA PCR擴增結果
M. DNA marker；1. PCR產物；2. 陰性對照
Figure4. 16S rRNA PCR amplification resultsM. DNA marker; 1. PCR products; 2. negative control
2.3.4 S3A菌株16S rRNA序列測定、BLAST比對及進化樹建立
16S rRNA序列測定數據經BLAST比對并建立了S3A的系統進化樹（見圖5），菌株S3A與大腸桿菌NBRC 102203同源性為98%，鑒定為大腸桿菌。
圖5
S3A株系統進化樹
Figure5.
System evolution tree of S3A
3 討論與結論
人體中尿酸的形成主要通過飲食等外源性途徑和體內嘌呤代謝等內源性途徑產生[13]，體內尿酸則主要通過腎臟及腸道排泄。由于腸道菌群組成復雜、各菌體間差異較大等客觀因素，關于腸道微生物如何影響尿酸代謝的機制尚未完全被闡明[14-15]。近年來，相關腸道菌群的研究多基于16S rRNA宏基因測序測定和進行不同人群的菌群結構比較，多數研究很難獲得菌株為該領域研究的瓶頸。本研究基于目標表型培養原理[16]，在BHI培養液中加入尿酸制備成濃度梯度選擇馴化培養基，既可以將尿酸作為抑制劑來抑制尿酸不耐受細菌的生長，又可以通過尿酸濃度的不斷升高而篩選出具有高效尿酸降解功能的細菌。本研究針對性地從低尿酸男性青年人群糞便中篩選和馴化得到一株具有高效尿酸降解功能的細菌S3A，其降解效率達到50.2%。隨后采用傳統形態學和16S rRNA序列測定，建立了該菌株的系統進化樹，發現其與大腸桿菌NBRC 102203菌株同源性為98%，最終鑒定為大腸桿菌。
隨著對腸道菌群研究的不斷深入，越來越多的微生物被發現與尿酸降解存在關聯，但研究發現不同種屬的細菌參與尿酸代謝的機制存在較大差異[9, 17]。Schultz等[18]研究發現枯草芽孢桿菌約有超過14個基因編碼參與嘌呤的代謝，其中puc基因決定的pucR蛋白可直接或間接調控pucL和pucLM基因的表達進而影響尿酸酶的活性，該蛋白調控的pucJ和pucK基因則可影響菌體對尿酸的轉運。假單胞菌可將尿酸降解為5-羥基異尿酸及尿囊素等次級代謝產物排出體外[19]。Guzmán等[20]發現hpxO、hpxT、hpxQ和hpxB等基因可調控肺炎克雷伯菌將尿酸作為氮源轉運至胞內并進一步將其分解。Iwadate等[21]發現大腸桿菌在AegA、YgfT（UacF）及FDH-H等蛋白的作用下利用甲酸鹽提供的電子發揮降尿酸作用。還有學者發現大腸桿菌ygfU基因編碼YgfU滲透酶，該酶是一種高容量的尿酸轉運蛋白，可將細胞外尿酸和黃嘌呤轉運至體內，進而將其作為氮源為細胞供能[22-23]。
本研究中菌株S3A能夠適應高濃度尿酸，且具備體外尿酸降解功能，推測可能由于環境中特有物質的刺激或外源性DNA的侵入導致了菌株發生變異，進而激發了其降尿酸功能的產生。而S3A是否存在編碼與YgfU滲透酶相關的基因，是否通過甲酸鹽依賴的尿酸降解途徑為細菌提供氮源，課題組后續將會通過基因工程技術和模式動物驗證等實驗手段進行更深層次的研究。
目前高尿酸血癥藥物治療存在不容忽視的副作用[24]，因此結合現代微生物學技術，尋找無毒無害的微生物制劑用于臨床高尿酸血癥治療是當前研究的前沿領域和熱點領域，也是今后很長一段時間研究者需要攻克的難題。本研究從低尿酸人群獲得的一株人源性高效尿酸降解菌S3A，為今后將該菌株作為無毒無害生物制劑進行降尿酸治療的開發應用提供了一定科學依據。該菌株的安全性評價、降解機制的人群和動物實驗驗證等深層次的研究將是本課題組今后的研究方向和目標。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：田婷婷完成文章的撰寫以及實驗的研究操作和數據整理；孫玉萍是本研究的構思者和負責人，指導論文的寫作與修改；陳鄔錦是本研究的實驗指導老師，指導實驗設計、研究操作及數據分析；梁美婷參與本研究的實驗設計以及實驗操作；瑪依娜·卡哈爾和李瑞參與本研究的數據分析。
倫理聲明：本研究通過了新疆醫科大學倫理委員會的審批（倫理審批號：K202105-09）。
引言
尿酸是嘌呤代謝的終產物，尿酸代謝紊亂可導致高尿酸血癥的發生，是痛風性關節炎和腎功能衰竭的誘因。此外，高尿酸血癥還是糖尿病、非酒精性脂肪肝、心血管疾病、肥胖及高血壓等慢性疾病的危險因素[1-5]。人體每天產生的尿酸2/3通過腎臟排出，余1/3則通過腸道排泄，其中腸道菌群對機體尿酸的代謝不容忽視。腸道菌群作為人體內最大的微生態系統，參與人體的消化、營養吸收以及代謝等過程[6]，與人體的健康和疾病有著密切的關聯。高尿酸血癥患者相較正常人群腸道中乳桿菌屬、鏈球菌屬、梭菌屬及變形桿菌屬等菌屬的分布存在明顯差異[7-10]。在尿酸代謝過程中，部分腸道細菌直接參與尿酸的生成及排泄[11]，但具體作用機制尚未明確。
因此，本研究采用細菌的分離培養和篩選技術，對低尿酸人群糞便中可能具有尿酸降解功能的細菌進行篩選馴化，以期對尿酸降解功能菌的進一步開發和利用提供研究思路。
1 材料方法
1.1 主要試劑及設備
96孔板（廣州賽國生物科技有限公司），尿酸、丙三醇（上海麥克林生化科技有限公司），磷酸氫二鉀（天津市致遠化學試劑有限公司），瓊脂粉、腦心浸液培養基（Brain Heart Infusion Medium，BHI）（青島海博生物科技有限公司），革蘭染液（珠海貝索生物技術有限公司），尿酸測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），細菌基因組DNA快速抽提試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司），超聲震蕩儀F-031SD（深圳福洋科技集團有限公司），生物顯微鏡Ni-U（日本尼康生物），VITEK-2 Compact 30全自動細菌鑒定儀［梅里埃診斷產品（上海）有限公司］，日本三菱MGC厭氧產氣袋。
1.2 糞便標本收集
來源于新疆某高校大一健康男性，年齡18～20歲，按照以下納入標準選擇15名研究對象，收集晨起中段無污染糞便于無菌糞便采樣管中，置于冰盒，2小時內運送到實驗室進行預處理。納入標準：采樣期向前推三個月內無重大疾病且未服用抗生素，健康體檢后血尿酸<190 μmol/L的低水平尿酸者，對本研究均知情同意。
1.3 糞便預處理
無菌離心管稱取糞便樣本0.2～0.3 g，將其加入到備好玻璃珠和無菌水（10 mL）的試管內，振搖5 min，將標本梯度稀釋至10?3～10?5，取上清制備成菌液保存。
1.4 培養基的制備
1.4.1 尿酸溶解
根據尿酸的化學式（C5H4N4O3）及摩爾質量（M=168.110 3 g/mol），稱取尿酸1.681 1 g溶解在1 000 mL溶劑中，制備成濃度10 mmol/L尿酸溶液 ，具體方法見參考文獻[12]。
1.4.2 尿酸選擇培養基的制備
稱取3.85 g BHI置于100 mL容量瓶中，并向容量瓶中加入15 mL配置好的10 mmol/L尿酸溶液，超純水定容至100 mL，配成終濃度為1.5 mmol/L BHI尿酸選擇培養基，平行3個樣，高壓滅菌備用。
1.4.3 尿酸馴化培養基的制備
稱取3.85 g BHI置于4個100 mL容量瓶中，向容量瓶中分別加入17、19、21、23 mL已溶解好的10 mmol/L尿酸溶液，超純水定容至100 mL。配成終濃度為1.7、1.9、2.1、2.3 mmol/L的尿酸BHI培養基，每個濃度平行3個樣，高壓滅菌備用。
1.5 標準曲線的繪制
本研究根據尿酸測定試劑盒所提供的標準品采用尿酸酶法制定標準曲線。將400 μmol/L尿酸標準品稀釋為7個濃度，分別為100、150、200、250、300、350、400 μmol/L（每個濃度平行3個樣）。取5 μL不同濃度尿酸標準品及稀釋后的待測菌培養濾過液（平行3個樣）加入至96孔板中，在紫外波長510 nm處測定其吸光度值，根據濃度及其所對應的吸光度值建立標準曲線并計算尿酸濃度。
1.6 尿酸降解功能菌的篩選
將預處理后的糞便樣本接種到尿酸濃度為1.5 mmol/L BHI篩選液體培養液中，置于厭氧條件下37 ℃培養24～48 h。采用分區劃線法將具有尿酸降解功能的原始培養液接種于BHI初篩平板中進行分離培養，連續分離純化三次，每次都進行菌落計數和革蘭染色形態鑒定，直到分離純化出純的單個菌落。
1.7 高效尿酸降解菌的馴化及降解效果測定
將分離純化出的細菌制備成1×107 CFU/mL濃度菌液50 μL，采用濃度梯度法把菌液分別接種于1.7、1.9、2.1、2.3 mmol/L BHI培養液中，每組3個平行樣，厭氧條件下37 ℃、220 r/min搖床培養48 h。同時設置相同尿酸濃度不加菌液的BHI培養液進行對照（每個濃度梯度設置3個平行樣）。48 h后取培養液12 000 r/min離心10 min，取上清稀釋20倍，測定培養液中尿酸濃度。
1.8 尿酸降解功能菌的鑒定
1.8.1 形態學觀察
① 菌落形態觀察：挑取純培養物進行稀釋，采用分區劃線法將其接種在1.5 mmol/L BHI平板中，在37 ℃厭氧條件下培養36～48 h后觀察。② 細菌形態學觀察：用滅菌牙簽挑取純化的單個菌落涂于載玻片上并滴加生理鹽水制片，自然干燥1～2 min，用酒精燈進行固定，將固定好的涂片進行革蘭染色。方法參照貝索革蘭染液說明書進行，將染色完成的玻片置油鏡下觀察細菌的排列和形態。
1.8.2 生化反應鑒定
將已分離純化的菌株采用VITEK-2 Compact 全自動細菌鑒定儀進行菌株生化鑒定。
1.8.3 16S rRNA測序
使用Rapid Bacterial Genomic DNA Isolation Kit，按照說明書提取細菌DNA的方法進行操作，使用16S通用引物27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）進行PCR擴增。PCR擴增體系為：PCR mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 21 μL，DNA模板2 μL，總體積為50 μL。擴增條件：94 ℃預變性 5 min，94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，35個循環，72 ℃再延伸10 min，16 ℃保存。將PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，擴增出目的基因條帶的菌株委托給上海生工生物工程股份有限公司進行16S rRNA測序。
1.8.4 序列比對及同源性分析
測序結果在NCBI上進行BLAST比對，對相似度大于97%的菌株序列進行同源性分析，并采用MEGA-X軟件構建系統進化樹。
1.9 統計方法
采用SPSS23.0統計軟件將所得數據進行統計學分析，計量資料以均數 ± 標準差（）表示，組間比較用配對樣本t檢驗，檢驗水準α = 0.05。
2 結果
2.1 標準曲線的繪制
根據尿酸測定試劑盒所提供的標準品制定標準曲線，由標準曲線可得吸光度A與尿酸濃度相關方程為y = 0.000 174 x + 0.045 589，相關系數R2 = 0.997，符合尿酸濃度測定標準（R2 ≥ 0.995），見圖1。
圖1
不同濃度尿酸標準品標準曲線
Figure1.
Standard curve of different concentrations of uric acid standard
2.2 尿酸功能菌的馴化、篩選及尿酸降解率測定
通過強化篩選獲得1株腸道細菌，命名為S3A。馴化后發現S3A菌在不同尿酸濃度馴化培養基中均可生長，在1.7、1.9、2.1、2.3 mmol/L BHI尿酸篩選培養基中的降解率分別為32.2%、37.3%、41.7%、50.2%，且隨著培養基中尿酸濃度的增加，降解率也逐步增加。具體結果見表1。
表1
菌株S3A在馴化BHI培養基中的尿酸降解率
Table1.
Uric acid degradation rate of strain S3A in domesticated BHI medium
2.3 尿酸降解功能菌S3A的鑒定
2.3.1 培養特性及形態學觀察
在BHI平板培養基上可見S3A菌落為灰白色，圓形凸起，邊緣整齊，表面濕潤光滑，見圖2。革蘭染色后顯微鏡下可見革蘭陰性短桿菌，散在排列，見圖3。
圖2
S3A菌落形態
Figure2.
Colonial morphology of strain S3A
圖3
S3A革蘭染色顯微鏡下形態（10 × 100）
Figure3.
Morphology of strain S3A under the microscope after Gram staining (10 × 100)
2.3.2 生化鑒定
菌株S3A生化鑒定結果見表2。通過以上結果，VITEK-2 Compact全自動細菌鑒定儀鑒定出該菌為大腸桿菌。
表2
菌株S3A生化鑒定結果
Table2.
Biochemical identification results of strain S3A
2.3.3 S3A菌株DNA的提取及PCR擴增
提取S3A菌株DNA后進行PCR擴增，擴增產物凝膠電泳顯示在1 500 bp左右存在目的條帶，符合16S rRNA測序要求（見圖4）。
圖4
16S rRNA PCR擴增結果
M. DNA marker；1. PCR產物；2. 陰性對照
Figure4. 16S rRNA PCR amplification resultsM. DNA marker; 1. PCR products; 2. negative control
2.3.4 S3A菌株16S rRNA序列測定、BLAST比對及進化樹建立
16S rRNA序列測定數據經BLAST比對并建立了S3A的系統進化樹（見圖5），菌株S3A與大腸桿菌NBRC 102203同源性為98%，鑒定為大腸桿菌。
圖5
S3A株系統進化樹
Figure5.
System evolution tree of S3A
3 討論與結論
人體中尿酸的形成主要通過飲食等外源性途徑和體內嘌呤代謝等內源性途徑產生[13]，體內尿酸則主要通過腎臟及腸道排泄。由于腸道菌群組成復雜、各菌體間差異較大等客觀因素，關于腸道微生物如何影響尿酸代謝的機制尚未完全被闡明[14-15]。近年來，相關腸道菌群的研究多基于16S rRNA宏基因測序測定和進行不同人群的菌群結構比較，多數研究很難獲得菌株為該領域研究的瓶頸。本研究基于目標表型培養原理[16]，在BHI培養液中加入尿酸制備成濃度梯度選擇馴化培養基，既可以將尿酸作為抑制劑來抑制尿酸不耐受細菌的生長，又可以通過尿酸濃度的不斷升高而篩選出具有高效尿酸降解功能的細菌。本研究針對性地從低尿酸男性青年人群糞便中篩選和馴化得到一株具有高效尿酸降解功能的細菌S3A，其降解效率達到50.2%。隨后采用傳統形態學和16S rRNA序列測定，建立了該菌株的系統進化樹，發現其與大腸桿菌NBRC 102203菌株同源性為98%，最終鑒定為大腸桿菌。
隨著對腸道菌群研究的不斷深入，越來越多的微生物被發現與尿酸降解存在關聯，但研究發現不同種屬的細菌參與尿酸代謝的機制存在較大差異[9, 17]。Schultz等[18]研究發現枯草芽孢桿菌約有超過14個基因編碼參與嘌呤的代謝，其中puc基因決定的pucR蛋白可直接或間接調控pucL和pucLM基因的表達進而影響尿酸酶的活性，該蛋白調控的pucJ和pucK基因則可影響菌體對尿酸的轉運。假單胞菌可將尿酸降解為5-羥基異尿酸及尿囊素等次級代謝產物排出體外[19]。Guzmán等[20]發現hpxO、hpxT、hpxQ和hpxB等基因可調控肺炎克雷伯菌將尿酸作為氮源轉運至胞內并進一步將其分解。Iwadate等[21]發現大腸桿菌在AegA、YgfT（UacF）及FDH-H等蛋白的作用下利用甲酸鹽提供的電子發揮降尿酸作用。還有學者發現大腸桿菌ygfU基因編碼YgfU滲透酶，該酶是一種高容量的尿酸轉運蛋白，可將細胞外尿酸和黃嘌呤轉運至體內，進而將其作為氮源為細胞供能[22-23]。
本研究中菌株S3A能夠適應高濃度尿酸，且具備體外尿酸降解功能，推測可能由于環境中特有物質的刺激或外源性DNA的侵入導致了菌株發生變異，進而激發了其降尿酸功能的產生。而S3A是否存在編碼與YgfU滲透酶相關的基因，是否通過甲酸鹽依賴的尿酸降解途徑為細菌提供氮源，課題組后續將會通過基因工程技術和模式動物驗證等實驗手段進行更深層次的研究。
目前高尿酸血癥藥物治療存在不容忽視的副作用[24]，因此結合現代微生物學技術，尋找無毒無害的微生物制劑用于臨床高尿酸血癥治療是當前研究的前沿領域和熱點領域，也是今后很長一段時間研究者需要攻克的難題。本研究從低尿酸人群獲得的一株人源性高效尿酸降解菌S3A，為今后將該菌株作為無毒無害生物制劑進行降尿酸治療的開發應用提供了一定科學依據。該菌株的安全性評價、降解機制的人群和動物實驗驗證等深層次的研究將是本課題組今后的研究方向和目標。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：田婷婷完成文章的撰寫以及實驗的研究操作和數據整理；孫玉萍是本研究的構思者和負責人，指導論文的寫作與修改；陳鄔錦是本研究的實驗指導老師，指導實驗設計、研究操作及數據分析；梁美婷參與本研究的實驗設計以及實驗操作；瑪依娜·卡哈爾和李瑞參與本研究的數據分析。
倫理聲明：本研究通過了新疆醫科大學倫理委員會的審批（倫理審批號：K202105-09）。
