體外人類肝臟模型常用于藥物篩選，而人原代肝細胞（PHH）是體外人類肝臟模型的金標準。細胞色素P450（CYP450）是PHH進行藥物代謝的關鍵酶，其活性在PHH體外培養過程中迅速下降。本研究通過溫度敏感型培養皿探究小鼠胚胎成纖維細胞3T3-J2形成細胞薄膜的條件，并基于細胞薄膜技術構建3T3-J2細胞薄膜/PHH/膠原凝膠“三明治”式三維（3D）共培養體系。通過蘇木素-伊紅染色和免疫熒光染色觀察模型切面的組織結構和蛋白表達。以非那西丁和安非他酮為反應底物測定CYP450的活性，通過酶聯免疫吸附測定（ELISA）法測定模型中白蛋白和尿素含量。結果顯示，在細胞接種密度為1.5 × 106 個/皿（35 mm培養皿）且低溫孵育時間為60 min的條件下，可以獲得完整的3T3-J2細胞薄膜。通過細胞薄膜疊層，開發了一種體外三維肝臟模型。與二維模型相比，三維模型中的細胞—細胞、細胞—基質間連接緊密，CYP450超家族中的CYP1A2和CYP2B6活性顯著提高，白蛋白和尿素分泌水平提高，均可穩定維持21 d。因此，細胞薄膜疊層有助于提高三維肝臟模型的肝功能水平，該模型有望在臨床前用于預測低清除率藥物的代謝情況，對藥物評估等研究具有重要意義。
引用本文： 關淑文, 高博韜, 肖將尉. 基于細胞薄膜技術構建可長期維持細胞色素P450活性的體外人類三維肝臟模型. 生物醫學工程學雜志, 2022, 39(4): 776-783. doi: 10.7507/1001-5515.202108056 復制
引言
在藥物開發過程中，人體藥代動力學和處方劑量的預測為評估藥物的安全性和有效性提供重要信息。人體內的藥物代謝主要發生在肝臟，研究顯示約70%的市售藥物由肝臟負責代謝[1]。目前利用微粒體、肝細胞懸液等肝臟模型來預測藥物內在清除率的研究已有報道[2-3]。但這些體外肝模型面臨的關鍵問題是藥物代謝酶的活性不足。例如，懸浮的肝細胞在體外只能培養4~6 h，這使得慢代謝藥物難以利用該模型來預測其內在清除率[4]。
細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）是藥物代謝過程中的關鍵酶，其活性變化將直接影響藥物的藥效評價結果[5]。CYP1A2和CYP2B6是CYP450超家族的不同亞型，CYP1A2參與約5%臨床藥物代謝，主要包括芳香族化合物、硝基芳香化合物、雜環胺和霉菌毒素[6]；CYP2B6參與約8%臨床藥物代謝，其中包括抗抑郁藥物安非他酮、抗艾滋病藥物依法韋倫、抗癲癇藥物普羅米那等[7]。近年來，低清除率藥物由于具備使用劑量少、體內暴露量大、半衰期長等優點而得到廣泛重視和發展[8]。但由于低清除率藥物需要更長的藥物代謝時間，這需要能長期維持CYP450活性的體外肝臟模型來對其進行準確評價。目前，用于構建體外肝臟模型的方法主要有“三明治”培養法、共培養法和灌流法等，這些模型都能在維持肝細胞形態和功能方面發揮重要作用，但在長期維持CYP450活性方面尚有不足[9-12]。
細胞薄膜技術是一種無支架的組織工程技術[13]，其核心是溫度敏感型培養皿。溫度敏感型培養皿表面涂有聚（N-異丙基丙烯酰胺）［poly（N-isopropylacrylamide），PIPAAm］，當溫度低于32 ℃時，PIPAAm由疏水性變為親水性，使培養皿上的細胞自行脫落，形成細胞薄膜[14]。細胞薄膜可以完整地保留細胞表面蛋白、基質蛋白和細胞連接，可更好地維持細胞功能并易于堆疊形成三維組織[15-16]。近年來，細胞薄膜技術已用于構建體外肝臟模型，如Kim等[17]將內皮細胞的細胞薄膜覆蓋在大鼠原代肝細胞上，發現肝細胞在28 d內分泌的白蛋白維持在較高水平。
在前期的研究中將人原代肝細胞（primary human hepatocyte，PHH）與小鼠胚胎成纖維細胞3T3-J2置于溫度敏感型培養皿上共培養，進而剝離形成PHH/3T3-J2共培養組織；該組織的CYP450活性較高，但其活性不能長期維持[18]。本研究基于細胞薄膜技術，將3T3-J2細胞薄膜覆蓋在PHH上，發現CYP450的活性可長期保持在較高水平。因此，構建可長期維持CYP450活性的體外肝模型對探究慢代謝藥物內在清除率和鑒定代謝產物具有重要意義。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
PHH購自美國賽默飛公司；3T3-J2細胞購自美國Kerafast公司；溫度敏感型培養皿購自日本CellSeed公司；胎牛血清購自美國GE Healthcare公司；胰島素/人轉鐵蛋白/亞硒酸混合液（insulin/human transferrin/selenous acid and linoleic acid，ITS）、膠原蛋白混懸液購自美國Corning公司；E-鈣黏蛋白抗體（產品編號：ab40772）和膠原蛋白Ⅰ抗體（產品編號：ab21286）購自英國Abcam公司；蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒（產品編號：C0105S）、Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG（產品編號：A0423）和Alexa Fluor 555驢抗兔IgG（產品編號：A0453）購自碧云天生物科技有限公司；0.4%臺盼藍、地塞米松、胰高血糖素、非那西丁（phenacetin，PHE）和安非他酮（bupropion，BP）購自美國Sigma Aldrich公司；人白蛋白酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒和人尿素ELISA試劑盒購自美國Bethyl Laboratories公司；低溫培養箱FCI-280HG （As one，日本）；液相色譜-質譜聯用儀UPLC-MS/MS（Waters，美國）；酶標儀Spark 20M（Tecan，瑞士）；色譜柱ZORBAX SB-C18 (Agilent，美國)。
1.2 PHH存活率計算
本研究對凍存的PHH進行解凍和計算，評估PHH的存活率。將0.4%臺盼藍和磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（1 ×）1∶4混合，制備成臺盼藍稀釋液。來回輕搖已解凍的PHH細胞懸液，將臺盼藍稀釋液和PHH細胞懸液1:1混合，靜置1 min，最終臺盼藍稀釋液工作濃度為0.04%。吸取10 μL上述混合液至血細胞計數板上，計算活細胞與死細胞數量。顯微鏡視野中活細胞呈黃色或輪廓清晰，死細胞呈藍色。最后算得PHH存活率在90%以上。將剩余的PHH用于后續的三維（three dimensional，3D）共培養體系和二維（two dimensional，2D）單培養體系構建。
1.3 成纖維細胞的培養和細胞薄膜的收獲
本課題組為成功收獲3T3-J2細胞薄膜，從細胞接種密度和低溫孵育時間兩方面探究3T3-J2細胞形成細胞薄膜的條件。在35 mm溫度敏感型培養皿上接種細胞，接種密度分別為0.5 × 106、1.0 × 106、1.5×106 個/皿。使用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的高糖型杜爾貝科改良伊格爾培養基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）培養3T3-J2細胞，置于37 ℃、5%的CO2培養箱。培養4 d后，將3種不同接種密度的細胞分別置于20 ℃低溫培養箱30 min和60 min，觀察細胞脫壁程度，收集細胞薄膜。
1.4 3D共培養體系的構建
本課題組為構建3D共培養體系，首先將硅膠環附著在35 mm普通細胞培養皿中央，如圖1步驟A所示，構建出一個面積為2 cm2的圓形區域。依據說明書方法配置膠原蛋白混懸液，如圖1步驟B所示，將300 μL混懸液涂抹在硅膠環內圓區域，37 ℃孵育1 h，使膠原蛋白凝膠化。如圖1步驟C所示，隨后在膠原蛋白凝膠上接種PHH，細胞密度為0.2×106 個/皿，加入肝細胞專用培養液，置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養24 h。如圖1步驟D所示，移除硅膠環，在PHH上覆蓋3T3-J2細胞薄膜，形成“三明治”式共培養組織，從下往上分別由膠原蛋白凝膠、PHH和3T3-J2細胞薄膜組成。不加入任何培養基，將該共培養組織置于37 ℃、5% CO2培養箱內孵育30 min，使3T3-J2細胞薄膜黏附在PHH上。如圖1步驟E所示，往培養皿中加入肝細胞專用培養液，形成3T3-J2細胞薄膜/PHH/膠原蛋白凝膠3D共培養體系。所述專用培養液包括DMEM高糖培養基、0.1 μmol/L地塞米松、1% ITS、0.2 μmol/L胰高血糖素、10%胎牛血清和1%青鏈霉素。每2 d換液1次，共培養21 d。
圖1
3D共培養體系的構建
Figure1.
Construction of 3D co-culture system
將沒有3T3-J2細胞薄膜覆蓋的PHH/膠原蛋白凝膠2D單培養體系作為對照組，其它培養條件和構建方法與3D共培養體系一致。
1.5 HE染色
在培養21 d后，用4%多聚甲醛固定3D共培養體系和2D單培養體系，室溫固定1 h。隨后分別用石蠟包埋，切成4 μm切片，脫蠟后進行HE染色。最后，封裝干燥并用光學顯微鏡觀察。
1.6 免疫熒光染色
經石蠟切片，3D共培養體系和2D單培養體系的切片組織在脫蠟后分別用一抗孵育，所用一抗有E-鈣黏蛋白抗體和膠原蛋白Ⅰ抗體，稀釋比例為分別為1∶500和1∶250。采用Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG和Alexa Fluor 555驢抗兔IgG作為二抗進行熒光染色，稀釋比例為1∶500。細胞核用4’, 6-二氨基-2-苯吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色。最后將切片固定、干燥，并用熒光顯微鏡觀察。
1.7 CYP450酶活性
在培養的第2、5、7、14、21 d，用PBS和DMEM高糖培養基沖洗3D共培養體系和2D單培養體系。將含100 μmol/L PHE和200 μmol/L BF的DMEM高糖培養基添加到3D共培養體系和2D單培養體系中。PHE和BP分別是CYP1A2和CYP2B6的底物。PHH吸收并代謝PHE和BP后，將其代謝物釋放到培養基中，代謝產物分別是對乙酰氨基酚和羥基安非他酮。37 ℃孵育10 min，收集20 μL上清液。通過液相色譜-質譜聯用儀測定上清液中兩種代謝產物的含量。以代謝產物的生成速率來反映3D共培養體系和2D單培養體系PHH的CYP450代謝活性。
液相色譜-質譜聯用儀在電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）正離子模式下，檢測PHE和BP的生成量。采用色譜柱（3.0 mm × 100 mm，1.8 μm）對上清液進行液相分離，流動相A/B：乙腈（0.1%甲酸）/水（0.1%甲酸）；流速0.3 mL/min；洗脫時間6 min；進樣量5 μL。質譜條件：離子源溫度為500 ℃；噴霧電壓5 500 kV；碰撞氣壓0.082 74 Mpa；氣簾氣壓力0.137 90 Mpa；離子源氣體一0.413 70 Mpa；離子源氣體二0.137 90 Mpa。產物的生成速率計算公式如式(1)所示：
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1.8 白蛋白和尿素含量的測定
分別在培養的第2、5、7、14、21 d收集細胞上清液，用于檢測白蛋白和尿素含量，檢測前置于?30 ℃冰箱儲存。使用人白蛋白ELISA試劑盒和人尿素ELISA試劑盒檢測白蛋白和尿素分泌量，分別進行3次獨立實驗，每組設置3個復孔。實驗操作依據試劑盒說明書進行，反應后通過酶標儀記錄光密度（optical density，OD）值，其中白蛋白吸收波長為450 nm，尿素吸收波長為430 nm。按照說明書計算臨界值，OD值 ≥ 臨界值，判斷為陽性，反之判斷為陰性。
1.9 統計分析
結果以均數±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗（雙側）進行統計學分析，P < 0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 3T3-J2細胞薄膜的制備
根據不同的低溫孵育時間，將培養的3T3-J2細胞分為兩組，組1：低溫孵育30 min；組2：低溫孵育60 min。結果如圖2所示，在組1中，種植密度為0.5 × 106、1.0 × 106、1.5 × 106 個/皿的3T3-J2細胞均不能形成完整的細胞薄膜。在組2中，種植密度為1.5 × 106 個/皿的3T3-J2細胞可以形成完整的細胞薄膜；種植密度為1.0 × 106 個/皿的3T3-J2細胞形成的細胞薄膜有一定破損，韌性差；0.5 × 106 個/皿的3T3-J2細胞不能形成完整的細胞薄膜，極易破碎。因此，確認細胞播種密度為1.5 × 106 個/皿、低溫孵育時間60 min是制作3T3-J2細胞薄膜的最佳條件，并將該方法用于后續實驗，以收獲3T3-J2細胞薄膜構建3D共培養體系模型。
圖2
不同的接種密度和低溫孵育時間對收獲細胞薄膜的影響
Figure2.
Effects of different seeding densities and low-temperature incubation time on cell sheet harvesting
2.2 3D共培養體系的制備
經石蠟包埋、切片、HE染色后，3D共培養體系和2D單培養體系截面的組織形態如圖3所示。3D共培養體系，從下往上分別由膠原蛋白凝膠、PHH和3T3-J2細胞薄膜組成，利用光學顯微鏡觀察發現PHH在膠原蛋白凝膠上形成小的細胞團，并被致密的3T3-J2細胞薄膜覆蓋。2D單培養體系，從下往上分別由膠原蛋白凝膠和PHH組成，PHH在膠原凝膠上同樣形成細胞團。對3D共培養體系和2D單培養體系的E-鈣黏蛋白和膠原蛋白Ⅰ進行免疫熒光標記，其中Alexa Fluor 488標記E-鈣黏蛋白（綠色），Alexa Fluor 555標記膠原蛋白Ⅰ（紅色），DAPI標記細胞核（藍色）。如圖4所示，3D共培養體系顯示出清晰的分層結構，表層富含由3T3-J2細胞產生的膠原蛋白Ⅰ，PHH在膠原蛋白凝膠和3T3-J2細胞薄膜之間形成細胞團；2D單培養體系也清晰地顯示出PHH細胞團；這與HE染色結果一致。此外，E-鈣黏蛋白在PHH細胞團中高表達，表明PHH之間連接緊密。
圖3
3D共培養體系和2D單培養體系截面的組織形態（HE染色）
Figure3.
The cross-sectional tissue morphologies of 3D co-culture system and 2D mono-culture system (HE staining)
圖4
3D共培養體系和2D單培養體系截面的免疫熒光染色
Figure4.
Immunofluorescence staining of cross sections of 3D co-culture system and 2D mono-culture system
2.3 3D共培養體系可增加并長期維持CYP450的活性
為驗證3D共培養體系和2D單培養體系的CYP450活性，本研究通過3次獨立實驗，分別測定兩種體系中CYP1A2 和CYP2B6的活性，其中CYP1A2催化PHE產生對乙酰氨基酚，CYP2B6催化BP產生羥基安非他酮。結果如圖5所示，在2D單培養體系中，隨著時間的推移，對乙酰氨基酚的生成速率緩慢上升，在第21 d達到峰值；羥基安非他酮的生成速率在初期隨時間推移逐漸上升，在第7 d達到峰值，隨后下降。3D共培養體系中對乙酰氨基酚和羥基安非他酮的生成速率趨勢與2D單培養體系相似，但其生成速率顯著高于2D單培養體系。代謝產物的生成速率反映CYP450酶代謝活性，CYP1A2 和CYP2B6在3D共培養體系中活性顯著高于2D單培養體系。此外，在第21 d，3D共培養體系的CYP1A2和CYP2B6活性仍維持在較高水平。
圖5
3D共培養體系和2D單培養體系的肝細胞藥物代謝功能比較
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2.4 3D共培養體系可增加并長期維持白蛋白和尿素水平
為進一步驗證3D共培養體系的優越性，本研究通過人白蛋白ELISA試劑盒和人尿素ELISA試劑盒測定體系中白蛋白和尿素含量。結果如圖6所示，3D共培養體系相對于2D單培養體系可大幅提高白蛋白和尿素產量；在第21 d白蛋白產量是2D單培養體系的3.75倍，尿素產量是2D單培養體系的2.70倍。第21 d發現2D單培養體系的白蛋白與尿素產量下降，而3D共培養體系仍能維持白蛋白與尿素的釋放水平，因此該結果進一步證明3D共培養體系在提高并維持PHH肝功能上的重要性。
圖6
3D共培養體系和2D單培養體系的白蛋白和尿素含量比較
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3 討論
3T3-J2細胞是由小鼠胚胎來源的3T3成纖維細胞經過射線處理之后得到的一種新型細胞，容易獲得且不易被活化。據前人研究發現，3T3-J2細胞可分泌肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子等多種生長因子[19-20]，可在不依賴于肝非實質細胞的情況下穩定肝細胞表型，這其中還可能與N-鈣黏蛋白的介導有關[10]。因此，3T3-J2細胞被證實是構建肝細胞正常模型的關鍵細胞[21]，可為長期研究肝細胞及肝細胞與肝非實質細胞的相互作用提供有利條件[22]。但是，與普通的3T3細胞相比，3T3-J2細胞增殖緩慢，產生細胞外基質較少，不易形成細胞薄膜，且細胞薄膜韌性較差。低溫孵育30 min后對細胞薄膜進行剝離，發現邊緣處仍有部分區域與培養皿緊密貼壁，導致細胞薄膜破裂，據此推測30 min不能使所有細胞徹底脫壁。因此，本研究將孵育時間延長到60 min，發現細胞薄膜剝離較為順利，說明延長低溫孵育時間可使細胞徹底脫壁，從而獲得形態完整的細胞薄膜。
Kim等[17]使用具有明膠涂層的類似于“郵戳”的操縱器來轉移細胞薄膜，將之覆蓋在大鼠原代肝細胞上。但是在本課題組初步的研究中發現，PHH對培養條件的要求比大鼠原代肝細胞更高，細胞薄膜操作器帶來的物理壓力會降低PHH的活性。因此，本研究使用移液管轉移細胞薄膜[23]，以減少細胞薄膜在疊層過程對PHH的損傷。
整體培養體系樣本的肝功能受PHH存活率以及單個PHH的肝功能影響，而PHH體外培養時存活率只會下降，不會提高。依結果來看，3D共培養體系在培養過程中肝功能大幅度提高，其中白蛋白倍增指數（峰值與初始值之比）5.57，尿素倍增指數2.03，CYP1A2倍增指數12.27，CYP2B6倍增指數7.36。因此，肝功能指標大幅度提高說明了3D共培養體系可有效增加單個細胞的肝功能水平。相較于傳統的肝細胞培養模型，基于細胞薄膜的共培養體系具有更為豐富的細胞和細胞外基質。大量的成纖維細胞被壓縮、整合到3D共培養體系中，增加細胞與細胞、細胞與細胞外基質相互作用，可產生高濃度的生長因子。因此本課題組認為這為肝細胞的生存和功能維持提供了有利條件。Kukla等[24]將3T3-J2細胞包裹在PHH外部形成一個三維立體模型，相較于其他類型的包被細胞，3T3-J2細胞包被的PHH也表現出更高的肝功能水平，這與本研究結果相印證。
根據對乙酰氨基酚和羥基安非他酮的生成速率結果可以看出，3D共培養體系顯著提高CYP1A2和CYP2B6的活性，體現了細胞薄膜疊層的重要性。此外，在培養的第21 d，3D共培養體系中的CYP1A2和CYP2B6活性仍維持在較高水平，這對慢代謝藥物的評價具有重要意義。
4 結論
本研究建立了一個基于細胞薄膜的3D共培養體系—3T3-J2細胞薄膜/PHH/膠原蛋白凝膠。該3D共培養體系相較于2D單培養體系可顯著提高CYP450酶活性以及白蛋白和尿素的分泌水平，反映出該體系的肝功能指標得到大幅度提高，且可穩定維持21 d。因此，該3D共培養體系有望在未來用于預測慢代謝藥物的內在清除率，對藥物代謝等相關研究具有重要意義。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：高博韜主要負責項目主持、協調溝通、實驗設計以及論文審閱修訂；關淑文主要負責實驗流程、數據記錄與分析以及論文撰寫；肖將尉主要負責實驗指導、數據分析指導。
引言
在藥物開發過程中，人體藥代動力學和處方劑量的預測為評估藥物的安全性和有效性提供重要信息。人體內的藥物代謝主要發生在肝臟，研究顯示約70%的市售藥物由肝臟負責代謝[1]。目前利用微粒體、肝細胞懸液等肝臟模型來預測藥物內在清除率的研究已有報道[2-3]。但這些體外肝模型面臨的關鍵問題是藥物代謝酶的活性不足。例如，懸浮的肝細胞在體外只能培養4~6 h，這使得慢代謝藥物難以利用該模型來預測其內在清除率[4]。
細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）是藥物代謝過程中的關鍵酶，其活性變化將直接影響藥物的藥效評價結果[5]。CYP1A2和CYP2B6是CYP450超家族的不同亞型，CYP1A2參與約5%臨床藥物代謝，主要包括芳香族化合物、硝基芳香化合物、雜環胺和霉菌毒素[6]；CYP2B6參與約8%臨床藥物代謝，其中包括抗抑郁藥物安非他酮、抗艾滋病藥物依法韋倫、抗癲癇藥物普羅米那等[7]。近年來，低清除率藥物由于具備使用劑量少、體內暴露量大、半衰期長等優點而得到廣泛重視和發展[8]。但由于低清除率藥物需要更長的藥物代謝時間，這需要能長期維持CYP450活性的體外肝臟模型來對其進行準確評價。目前，用于構建體外肝臟模型的方法主要有“三明治”培養法、共培養法和灌流法等，這些模型都能在維持肝細胞形態和功能方面發揮重要作用，但在長期維持CYP450活性方面尚有不足[9-12]。
細胞薄膜技術是一種無支架的組織工程技術[13]，其核心是溫度敏感型培養皿。溫度敏感型培養皿表面涂有聚（N-異丙基丙烯酰胺）［poly（N-isopropylacrylamide），PIPAAm］，當溫度低于32 ℃時，PIPAAm由疏水性變為親水性，使培養皿上的細胞自行脫落，形成細胞薄膜[14]。細胞薄膜可以完整地保留細胞表面蛋白、基質蛋白和細胞連接，可更好地維持細胞功能并易于堆疊形成三維組織[15-16]。近年來，細胞薄膜技術已用于構建體外肝臟模型，如Kim等[17]將內皮細胞的細胞薄膜覆蓋在大鼠原代肝細胞上，發現肝細胞在28 d內分泌的白蛋白維持在較高水平。
在前期的研究中將人原代肝細胞（primary human hepatocyte，PHH）與小鼠胚胎成纖維細胞3T3-J2置于溫度敏感型培養皿上共培養，進而剝離形成PHH/3T3-J2共培養組織；該組織的CYP450活性較高，但其活性不能長期維持[18]。本研究基于細胞薄膜技術，將3T3-J2細胞薄膜覆蓋在PHH上，發現CYP450的活性可長期保持在較高水平。因此，構建可長期維持CYP450活性的體外肝模型對探究慢代謝藥物內在清除率和鑒定代謝產物具有重要意義。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
PHH購自美國賽默飛公司；3T3-J2細胞購自美國Kerafast公司；溫度敏感型培養皿購自日本CellSeed公司；胎牛血清購自美國GE Healthcare公司；胰島素/人轉鐵蛋白/亞硒酸混合液（insulin/human transferrin/selenous acid and linoleic acid，ITS）、膠原蛋白混懸液購自美國Corning公司；E-鈣黏蛋白抗體（產品編號：ab40772）和膠原蛋白Ⅰ抗體（產品編號：ab21286）購自英國Abcam公司；蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒（產品編號：C0105S）、Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG（產品編號：A0423）和Alexa Fluor 555驢抗兔IgG（產品編號：A0453）購自碧云天生物科技有限公司；0.4%臺盼藍、地塞米松、胰高血糖素、非那西丁（phenacetin，PHE）和安非他酮（bupropion，BP）購自美國Sigma Aldrich公司；人白蛋白酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒和人尿素ELISA試劑盒購自美國Bethyl Laboratories公司；低溫培養箱FCI-280HG （As one，日本）；液相色譜-質譜聯用儀UPLC-MS/MS（Waters，美國）；酶標儀Spark 20M（Tecan，瑞士）；色譜柱ZORBAX SB-C18 (Agilent，美國)。
1.2 PHH存活率計算
本研究對凍存的PHH進行解凍和計算，評估PHH的存活率。將0.4%臺盼藍和磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（1 ×）1∶4混合，制備成臺盼藍稀釋液。來回輕搖已解凍的PHH細胞懸液，將臺盼藍稀釋液和PHH細胞懸液1:1混合，靜置1 min，最終臺盼藍稀釋液工作濃度為0.04%。吸取10 μL上述混合液至血細胞計數板上，計算活細胞與死細胞數量。顯微鏡視野中活細胞呈黃色或輪廓清晰，死細胞呈藍色。最后算得PHH存活率在90%以上。將剩余的PHH用于后續的三維（three dimensional，3D）共培養體系和二維（two dimensional，2D）單培養體系構建。
1.3 成纖維細胞的培養和細胞薄膜的收獲
本課題組為成功收獲3T3-J2細胞薄膜，從細胞接種密度和低溫孵育時間兩方面探究3T3-J2細胞形成細胞薄膜的條件。在35 mm溫度敏感型培養皿上接種細胞，接種密度分別為0.5 × 106、1.0 × 106、1.5×106 個/皿。使用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的高糖型杜爾貝科改良伊格爾培養基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）培養3T3-J2細胞，置于37 ℃、5%的CO2培養箱。培養4 d后，將3種不同接種密度的細胞分別置于20 ℃低溫培養箱30 min和60 min，觀察細胞脫壁程度，收集細胞薄膜。
1.4 3D共培養體系的構建
本課題組為構建3D共培養體系，首先將硅膠環附著在35 mm普通細胞培養皿中央，如圖1步驟A所示，構建出一個面積為2 cm2的圓形區域。依據說明書方法配置膠原蛋白混懸液，如圖1步驟B所示，將300 μL混懸液涂抹在硅膠環內圓區域，37 ℃孵育1 h，使膠原蛋白凝膠化。如圖1步驟C所示，隨后在膠原蛋白凝膠上接種PHH，細胞密度為0.2×106 個/皿，加入肝細胞專用培養液，置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養24 h。如圖1步驟D所示，移除硅膠環，在PHH上覆蓋3T3-J2細胞薄膜，形成“三明治”式共培養組織，從下往上分別由膠原蛋白凝膠、PHH和3T3-J2細胞薄膜組成。不加入任何培養基，將該共培養組織置于37 ℃、5% CO2培養箱內孵育30 min，使3T3-J2細胞薄膜黏附在PHH上。如圖1步驟E所示，往培養皿中加入肝細胞專用培養液，形成3T3-J2細胞薄膜/PHH/膠原蛋白凝膠3D共培養體系。所述專用培養液包括DMEM高糖培養基、0.1 μmol/L地塞米松、1% ITS、0.2 μmol/L胰高血糖素、10%胎牛血清和1%青鏈霉素。每2 d換液1次，共培養21 d。
圖1
3D共培養體系的構建
Figure1.
Construction of 3D co-culture system
將沒有3T3-J2細胞薄膜覆蓋的PHH/膠原蛋白凝膠2D單培養體系作為對照組，其它培養條件和構建方法與3D共培養體系一致。
1.5 HE染色
在培養21 d后，用4%多聚甲醛固定3D共培養體系和2D單培養體系，室溫固定1 h。隨后分別用石蠟包埋，切成4 μm切片，脫蠟后進行HE染色。最后，封裝干燥并用光學顯微鏡觀察。
1.6 免疫熒光染色
經石蠟切片，3D共培養體系和2D單培養體系的切片組織在脫蠟后分別用一抗孵育，所用一抗有E-鈣黏蛋白抗體和膠原蛋白Ⅰ抗體，稀釋比例為分別為1∶500和1∶250。采用Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG和Alexa Fluor 555驢抗兔IgG作為二抗進行熒光染色，稀釋比例為1∶500。細胞核用4’, 6-二氨基-2-苯吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色。最后將切片固定、干燥，并用熒光顯微鏡觀察。
1.7 CYP450酶活性
在培養的第2、5、7、14、21 d，用PBS和DMEM高糖培養基沖洗3D共培養體系和2D單培養體系。將含100 μmol/L PHE和200 μmol/L BF的DMEM高糖培養基添加到3D共培養體系和2D單培養體系中。PHE和BP分別是CYP1A2和CYP2B6的底物。PHH吸收并代謝PHE和BP后，將其代謝物釋放到培養基中，代謝產物分別是對乙酰氨基酚和羥基安非他酮。37 ℃孵育10 min，收集20 μL上清液。通過液相色譜-質譜聯用儀測定上清液中兩種代謝產物的含量。以代謝產物的生成速率來反映3D共培養體系和2D單培養體系PHH的CYP450代謝活性。
液相色譜-質譜聯用儀在電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）正離子模式下，檢測PHE和BP的生成量。采用色譜柱（3.0 mm × 100 mm，1.8 μm）對上清液進行液相分離，流動相A/B：乙腈（0.1%甲酸）/水（0.1%甲酸）；流速0.3 mL/min；洗脫時間6 min；進樣量5 μL。質譜條件：離子源溫度為500 ℃；噴霧電壓5 500 kV；碰撞氣壓0.082 74 Mpa；氣簾氣壓力0.137 90 Mpa；離子源氣體一0.413 70 Mpa；離子源氣體二0.137 90 Mpa。產物的生成速率計算公式如式(1)所示：
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1.8 白蛋白和尿素含量的測定
分別在培養的第2、5、7、14、21 d收集細胞上清液，用于檢測白蛋白和尿素含量，檢測前置于?30 ℃冰箱儲存。使用人白蛋白ELISA試劑盒和人尿素ELISA試劑盒檢測白蛋白和尿素分泌量，分別進行3次獨立實驗，每組設置3個復孔。實驗操作依據試劑盒說明書進行，反應后通過酶標儀記錄光密度（optical density，OD）值，其中白蛋白吸收波長為450 nm，尿素吸收波長為430 nm。按照說明書計算臨界值，OD值 ≥ 臨界值，判斷為陽性，反之判斷為陰性。
1.9 統計分析
結果以均數±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗（雙側）進行統計學分析，P < 0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 3T3-J2細胞薄膜的制備
根據不同的低溫孵育時間，將培養的3T3-J2細胞分為兩組，組1：低溫孵育30 min；組2：低溫孵育60 min。結果如圖2所示，在組1中，種植密度為0.5 × 106、1.0 × 106、1.5 × 106 個/皿的3T3-J2細胞均不能形成完整的細胞薄膜。在組2中，種植密度為1.5 × 106 個/皿的3T3-J2細胞可以形成完整的細胞薄膜；種植密度為1.0 × 106 個/皿的3T3-J2細胞形成的細胞薄膜有一定破損，韌性差；0.5 × 106 個/皿的3T3-J2細胞不能形成完整的細胞薄膜，極易破碎。因此，確認細胞播種密度為1.5 × 106 個/皿、低溫孵育時間60 min是制作3T3-J2細胞薄膜的最佳條件，并將該方法用于后續實驗，以收獲3T3-J2細胞薄膜構建3D共培養體系模型。
圖2
不同的接種密度和低溫孵育時間對收獲細胞薄膜的影響
Figure2.
Effects of different seeding densities and low-temperature incubation time on cell sheet harvesting
2.2 3D共培養體系的制備
經石蠟包埋、切片、HE染色后，3D共培養體系和2D單培養體系截面的組織形態如圖3所示。3D共培養體系，從下往上分別由膠原蛋白凝膠、PHH和3T3-J2細胞薄膜組成，利用光學顯微鏡觀察發現PHH在膠原蛋白凝膠上形成小的細胞團，并被致密的3T3-J2細胞薄膜覆蓋。2D單培養體系，從下往上分別由膠原蛋白凝膠和PHH組成，PHH在膠原凝膠上同樣形成細胞團。對3D共培養體系和2D單培養體系的E-鈣黏蛋白和膠原蛋白Ⅰ進行免疫熒光標記，其中Alexa Fluor 488標記E-鈣黏蛋白（綠色），Alexa Fluor 555標記膠原蛋白Ⅰ（紅色），DAPI標記細胞核（藍色）。如圖4所示，3D共培養體系顯示出清晰的分層結構，表層富含由3T3-J2細胞產生的膠原蛋白Ⅰ，PHH在膠原蛋白凝膠和3T3-J2細胞薄膜之間形成細胞團；2D單培養體系也清晰地顯示出PHH細胞團；這與HE染色結果一致。此外，E-鈣黏蛋白在PHH細胞團中高表達，表明PHH之間連接緊密。
圖3
3D共培養體系和2D單培養體系截面的組織形態（HE染色）
Figure3.
The cross-sectional tissue morphologies of 3D co-culture system and 2D mono-culture system (HE staining)
圖4
3D共培養體系和2D單培養體系截面的免疫熒光染色
Figure4.
Immunofluorescence staining of cross sections of 3D co-culture system and 2D mono-culture system
2.3 3D共培養體系可增加并長期維持CYP450的活性
為驗證3D共培養體系和2D單培養體系的CYP450活性，本研究通過3次獨立實驗，分別測定兩種體系中CYP1A2 和CYP2B6的活性，其中CYP1A2催化PHE產生對乙酰氨基酚，CYP2B6催化BP產生羥基安非他酮。結果如圖5所示，在2D單培養體系中，隨著時間的推移，對乙酰氨基酚的生成速率緩慢上升，在第21 d達到峰值；羥基安非他酮的生成速率在初期隨時間推移逐漸上升，在第7 d達到峰值，隨后下降。3D共培養體系中對乙酰氨基酚和羥基安非他酮的生成速率趨勢與2D單培養體系相似，但其生成速率顯著高于2D單培養體系。代謝產物的生成速率反映CYP450酶代謝活性，CYP1A2 和CYP2B6在3D共培養體系中活性顯著高于2D單培養體系。此外，在第21 d，3D共培養體系的CYP1A2和CYP2B6活性仍維持在較高水平。
圖5
3D共培養體系和2D單培養體系的肝細胞藥物代謝功能比較
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2.4 3D共培養體系可增加并長期維持白蛋白和尿素水平
為進一步驗證3D共培養體系的優越性，本研究通過人白蛋白ELISA試劑盒和人尿素ELISA試劑盒測定體系中白蛋白和尿素含量。結果如圖6所示，3D共培養體系相對于2D單培養體系可大幅提高白蛋白和尿素產量；在第21 d白蛋白產量是2D單培養體系的3.75倍，尿素產量是2D單培養體系的2.70倍。第21 d發現2D單培養體系的白蛋白與尿素產量下降，而3D共培養體系仍能維持白蛋白與尿素的釋放水平，因此該結果進一步證明3D共培養體系在提高并維持PHH肝功能上的重要性。
圖6
3D共培養體系和2D單培養體系的白蛋白和尿素含量比較
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3 討論
3T3-J2細胞是由小鼠胚胎來源的3T3成纖維細胞經過射線處理之后得到的一種新型細胞，容易獲得且不易被活化。據前人研究發現，3T3-J2細胞可分泌肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子等多種生長因子[19-20]，可在不依賴于肝非實質細胞的情況下穩定肝細胞表型，這其中還可能與N-鈣黏蛋白的介導有關[10]。因此，3T3-J2細胞被證實是構建肝細胞正常模型的關鍵細胞[21]，可為長期研究肝細胞及肝細胞與肝非實質細胞的相互作用提供有利條件[22]。但是，與普通的3T3細胞相比，3T3-J2細胞增殖緩慢，產生細胞外基質較少，不易形成細胞薄膜，且細胞薄膜韌性較差。低溫孵育30 min后對細胞薄膜進行剝離，發現邊緣處仍有部分區域與培養皿緊密貼壁，導致細胞薄膜破裂，據此推測30 min不能使所有細胞徹底脫壁。因此，本研究將孵育時間延長到60 min，發現細胞薄膜剝離較為順利，說明延長低溫孵育時間可使細胞徹底脫壁，從而獲得形態完整的細胞薄膜。
Kim等[17]使用具有明膠涂層的類似于“郵戳”的操縱器來轉移細胞薄膜，將之覆蓋在大鼠原代肝細胞上。但是在本課題組初步的研究中發現，PHH對培養條件的要求比大鼠原代肝細胞更高，細胞薄膜操作器帶來的物理壓力會降低PHH的活性。因此，本研究使用移液管轉移細胞薄膜[23]，以減少細胞薄膜在疊層過程對PHH的損傷。
整體培養體系樣本的肝功能受PHH存活率以及單個PHH的肝功能影響，而PHH體外培養時存活率只會下降，不會提高。依結果來看，3D共培養體系在培養過程中肝功能大幅度提高，其中白蛋白倍增指數（峰值與初始值之比）5.57，尿素倍增指數2.03，CYP1A2倍增指數12.27，CYP2B6倍增指數7.36。因此，肝功能指標大幅度提高說明了3D共培養體系可有效增加單個細胞的肝功能水平。相較于傳統的肝細胞培養模型，基于細胞薄膜的共培養體系具有更為豐富的細胞和細胞外基質。大量的成纖維細胞被壓縮、整合到3D共培養體系中，增加細胞與細胞、細胞與細胞外基質相互作用，可產生高濃度的生長因子。因此本課題組認為這為肝細胞的生存和功能維持提供了有利條件。Kukla等[24]將3T3-J2細胞包裹在PHH外部形成一個三維立體模型，相較于其他類型的包被細胞，3T3-J2細胞包被的PHH也表現出更高的肝功能水平，這與本研究結果相印證。
根據對乙酰氨基酚和羥基安非他酮的生成速率結果可以看出，3D共培養體系顯著提高CYP1A2和CYP2B6的活性，體現了細胞薄膜疊層的重要性。此外，在培養的第21 d，3D共培養體系中的CYP1A2和CYP2B6活性仍維持在較高水平，這對慢代謝藥物的評價具有重要意義。
4 結論
本研究建立了一個基于細胞薄膜的3D共培養體系—3T3-J2細胞薄膜/PHH/膠原蛋白凝膠。該3D共培養體系相較于2D單培養體系可顯著提高CYP450酶活性以及白蛋白和尿素的分泌水平，反映出該體系的肝功能指標得到大幅度提高，且可穩定維持21 d。因此，該3D共培養體系有望在未來用于預測慢代謝藥物的內在清除率，對藥物代謝等相關研究具有重要意義。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：高博韜主要負責項目主持、協調溝通、實驗設計以及論文審閱修訂；關淑文主要負責實驗流程、數據記錄與分析以及論文撰寫；肖將尉主要負責實驗指導、數據分析指導。
