經顱磁聲電刺激（TMAES）作為一種新型的腦神經調控和研究手段，利用超聲和磁場耦合產生的感應電流調節不同腦區的神經電活動。鈣離子作為神經信號第二特使，在神經信號傳遞中起著關鍵作用。為了探究經顱磁聲電刺激對前額葉皮層放電活動的影響，將15只小鼠分為對照組、超聲組和磁聲組，磁聲組接受超聲強度為2.6 W/cm2和磁感應強度為0.3 T的刺激，超聲組僅接受相同強度的超聲刺激，對照組無超聲和磁場，持續刺激一周。通過光纖光度檢測技術實時記錄小鼠刺激過程中前額葉皮層鈣離子濃度，并進行新物體識別實驗，對比各組行為學差異和鈣信號的時頻分布。實驗結果顯示，經顱磁聲組在刺激后10 s內鈣瞬變信號均值（4.84 ± 0.11）%大于超聲組（4.40 ± 0.10）%和對照組（4.22 ± 0.08）%，且鈣瞬變信號波形變緩，提示鈣離子代謝變快；磁聲組主要能量頻帶分布在0～20 Hz，超聲組為0～12 Hz，對照組為0～8 Hz；磁聲組認知指數為0.71，超聲組為0.63，對照組為0.58，表明超聲刺激和磁聲電刺激均能提高小鼠的認知能力，但磁聲組效果優于超聲組。以上結果顯示，經顱磁聲電刺激能夠改變前額葉皮層神經集群的鈣穩態，實現對前額葉神經集群放電活動的調控，對認知功能具有促進效果。研究結果為進一步探索經顱磁聲電刺激的深層神經作用機制提供了數據支撐和參考。
引用本文： 張帥, 武健康, 許家悅, 黨君武, 趙毅航, 侯文濤, 徐桂芝. 經顱磁聲電刺激對前額葉皮層神經集群鈣信號的影響. 生物醫學工程學雜志, 2022, 39(1): 19-27. doi: 10.7507/1001-5515.202107044 復制
引言
內側前額葉皮層（medial prefrontal cortex，mPFC）是被廣泛研究的腦區之一[1]，作為工作記憶的關鍵腦區，其依靠神經元之間的協同作用產生神經信號，形成神經通路來完成認知任務[2]。在神經信號傳遞過程中，鈣離子介導去極化信號的傳遞，并參與突觸活動的調控及生物體內多種功能的調節，從毫秒水平的神經遞質釋放到持續數分鐘乃至數小時的基因轉錄都涉及其中，對神經元的功能至關重要[3-4]。當受到外界刺激時，電壓控制鈣通道的開放程度受到影響[5]，引起細胞質膜內外的濃度變化，如在放電活動過程中鈣離子濃度會達到靜息態的10～100倍，這種變化轉化為細胞反應的信號，改變細胞鈣穩態，進而引起一系列生理反應[6]。鈣穩態對維持各種正常生理活動具有重要作用，穩態失衡與神經集群異常放電息息相關[7-10]，因此研究腦內鈣離子變化是探討神經疾病發病機制的一個潛在方向。
現有神經調控手段包括經顱超聲刺激（transcranial ultrasound stimulation，TUS）[11-12]、深部腦刺激（deep brain stimulation，DBS）[13]、經顱磁刺激（transcranial magnetic stimulation，TMS）[14-16]、經顱直流電刺激（transcranial direct current stimulation，tDCS）[17]和經顱磁聲電刺激（transcranial magneto-acoustic electrical stimulation，TMAES）等[18-19]。其中，TMS作為當前常用的神經調控技術之一，目前應用在某些神經精神類疾病的治療（如帕金森病、癲癇），但仍有不足之處，如顱內磁場分布發散，空間分辨率低[20]。TUS具有較高的空間分辨率和穿透性，但有可能引起血腦屏障損傷、顱內出血等[21]。
經顱磁聲電刺激是一種新型無創腦神經調控技術，和TMS不同，其利用靜態磁場和超聲波的共同作用，可在神經組織產生感應電流進而調節相應腦區的神經活動。2018年，劉志朋團隊[15]通過研究帕金森病模型鼠海馬區黑質神經，發現磁聲電刺激能夠提高其突觸活性及可塑性，從而改變學習與記憶能力。2019年，殷濤團隊[22]對比磁聲電刺激和超聲刺激誘發肌電運動閾值，發現經顱磁聲電刺激具有更有效的運動皮層調控能力。同年，本課題組[23-24]通過仿真實驗以及對大鼠局部場電位功率譜的分析，得出低刺激參數具有更好的調控作用。
以上從突觸活性、肌電信號和局部場電位等多角度證明了經顱磁聲電刺激調控神經的有效性[25-27]，但作用機制尚不明確，亟待從更微觀角度探究經顱磁聲電刺激對神經集群活動狀態的影響。利用光纖光度檢測技術對特異性神經元長期記錄，可檢測300～500 μm[8]范圍內神經元的鈣活動，以指示劑的熒光強度變化表征神經元集群中鈣離子的信號波動，進一步反映神經核團的細胞活動[28-29]。
本文以健康KM小鼠為研究對象，設置對照組、超聲組和磁聲組，基于光纖光度檢測的光學方法，記錄經顱磁聲電刺激下小鼠前額葉皮層集群鈣離子信號，并進行新物體識別實驗，對比各組鈣信號時頻能量和小鼠行為學差異。探討經顱磁聲電刺激對神經集群中信息傳輸的影響，為深入揭示經顱磁聲電刺激的神經作用機制提供數據支撐和參考，為神經解碼和神經調控研究帶來新的突破口。
1 材料和方法
1.1 實驗動物及實驗設計
研究采用雄性成年KM小鼠，15只，6～8周齡，體重（36 ± 3）g，購自北京華阜康生物科技有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2020～0004。飼養環境溫度維持在（25 ± 1）℃，濕度維持在50%～60%，給予充足的食物與水，12小時光照與黑暗環境交替循環。實驗中將小鼠隨機分為3組，即對照組、超聲組和磁聲組，每組5只。光纖植入手術恢復兩周后，進行刺激實驗和行為學實驗。實驗流程如圖1所示。所有動物實驗根據我國相關指南和規定進行，均獲得河北工業大學生物醫學倫理委員會批準（倫理審查編號：HEBUTaCUC2020013），且符合實驗動物倫理學要求和使用規范，本實驗全程受其監督指導。
圖1
實驗設計流程圖
Figure1.
Experimental design flow chart
1.2 光纖光度檢測實驗
手術開始前將小鼠置于4%的異氟烷麻醉箱氣體麻醉，檢查并調好實驗裝置后，將小鼠固定在腦立體定位儀上，固定后改為1%濃度的異氟烷維持麻醉，剪開頭皮露出顱骨，去除顱骨表面結締組織。在內側前額葉皮質的前邊緣皮層區（ML：0.3 mm；AP：1.94 mm；DV：? 1.6 mm）上方開一個直徑2 mm的小孔，使用微量注射器通過玻璃微吸管注入（速度：50 nL/min）200 nL鈣熒光蛋白rAAV-CaMKIIa-GCaMp6m-WPRE-hGH-polyA（武漢舒密腦科學技術有限公司，中國）。如圖2a～b所示，在相同位置植入直徑200 μm、長度15 mm的陶瓷插芯光纖頭（千奧公司南京生物科技有限公司，中國），并使用光固化劑（北京永軒科技有限公司，中國）和組織生物膠（Minnesota Mining and Manufacturing，美國）固定創口。手術恢復2周后，進行刺激實驗和信號采集。
圖2
磁聲電刺激系統及鈣信號采集示意圖
a. 腦圖譜；b. 顱骨開口位置；c. TMAES和鈣信號采集示意圖; d～e.分別為對照組和TMAES組所采集的鈣信號；f. 超聲信號調制示意圖
Figure2. TMAES system and calcium signal acquisitiona. brain map location; b. location of skull opening; c. schematic diagram of TMAES and calcium signal acquisition; d–e. calcium transient signals in control group and TMAES group, respectively; f. schematic diagram of ultrasonic signal modulation
1.3 磁聲刺激實驗
磁聲組使用兩個直徑40 mm、厚度10 mm的圓柱形釹鐵硼永磁體提供水平方向0.3 T靜磁場，由任意波形發生器（33500B Series，KEYSIGHT，美國）和射頻功率放大器（Model 150A100C，AR，美國）產生超聲，經超聲換能器（P20FG，汕頭超聲電子有限公司，中國）和準直器（玻璃材質，中國）聚焦到小鼠前額葉皮層。超聲基波頻率（fundamental frequency，FF）為0.5 MHz，脈沖重復頻率（pulse repetition frequency，PRF）為1 kHz，脈沖長度（tone-burst duration，TBD）為0.5 ms，脈沖持續時間（sonication duration，SD）為400 ms，刺激持續時間T1為2 min，脈沖超聲序列參數之間的關系如圖2f所示。小鼠顱內平均脈沖時間強度Isppa計算所得為2.6 W/cm2。超聲組僅使用2.6 W/cm2的刺激強度，對照組在相同環境下去除磁場和超聲。
如圖2c所示，采用配備488 nm激發光二極管（OBIS 488LS，Coherent，美國）和二色鏡（MD498，Thorlabs，美國）的光纖光度檢測系統（南京千奧星科有限公司，中國）進行鈣信號采集，利用多功能數據采集軟件（Thinker Tech，南京生物科學有限公司，中國）記錄GCaMp6m的熒光信號。所得信號經過低通濾波器（40 Hz）后，以500 Hz的頻率采樣，再用MATLAB 2019a（Math Works）軟件進行離線分析。如圖2d～e所示為對照組和磁聲組的采集信號。
實驗中使用呼吸麻醉機（R580S，RWD，中國）對實驗動物進行持續的輕度氣體麻醉[22]。每天早上9:00開始刺激，每天刺激一次，每次刺激持續2 min。連續刺激7天后，從第8天開始鈣信號采集，在暗環境下分別采集各組刺激前100 s、刺激持續過程120 s和刺激后200 s數據，每只小鼠采集10組數據。信號采集過程如圖3所示。
圖3
鈣信號采集過程示意圖
Figure3.
Schematic diagram of calcium signal acquisition process
1.4 鈣信號分析與統計學分析
本文應用短時傅里葉變換（short time Fourier transform，STFT）方法[30]對所采集鈣信號進行時頻分析。對于隨時間變化的時域信號
，
是有限能量信號空間，則該信號不同時刻的STFT集合
，如式（1）所示：
 |
其中，
是相對連續信號的角頻率，
表示信號輸入的時刻，t表示信號時間，
是對稱的實窗函數，滿足
，且
= 1。本文采用窗函數為漢明窗，步長設置為128。
對式（1）等號兩邊分別取模的平方即可得到譜圖，如式（2）所示：
 |
其中，
是對應時域信號x(t)的譜圖，它能夠反映信號能量的時頻分布。
檢測小鼠在自由活動時對不同物體的探索行為，認知指數C表示小鼠在新舊物體上停留的時間T1和T2比，即
，值越大，認知能力越強，以此評價小鼠對新物體的自主探究能力。
實驗數據取自刺激實驗第8天，以均值±標準差的形式表示，本文使用Wilcoxon秩和單因素方差檢驗（One-way Analysis of Variance）來對比各組數據之間的差異性，檢驗水準為0.05。所有統計分析由GraphPad Prism軟件包8.4（GraphPad Software Inc.，美國）和SPSS 24（IBM，美國）執行。
2 數據分析結果
2.1 鈣瞬變信號平均幅值響應隨時間的變化
在同一麻醉水平下，選取各組實驗鼠刺激開始前5 s與刺激開始后10 s信號數據。用
表征光纖末端熒光強度的相對變化幅度[31]，如公式（3）所示，下文皆稱為鈣瞬變信號。
 |
其中，
表示記錄到的實時鈣信號。
，表示參考時間內鈣信號的平均值，
表示當前分析鈣信號通道的系統偏置數據，每次實驗前需進行測定。
如圖4所示，用時間相關線圖表示小鼠鈣離子濃度的平均變化趨勢，其中，紅色的實線表示錐體神經元鈣瞬變信號的平均值，灰色陰影表示樣本平均數的標準誤差。圖4a第一行分別為對照組、超聲組和磁聲組刺激開始前5 s和刺激開始后10 s的鈣瞬變信號變化熱度圖，暖色調表示信號變化幅度大，冷色調表示信號變化幅度小。對照組鈣信號分別在t = ? 5～0 s、t = 0～5 s和t = 5～10 s內各有一個冷暖色交替，超聲組在刺激之后鈣瞬變信號熱度圖變亮，磁聲組在刺激之后峰值持續時間變長，暖色帶變長。
圖4
各組刺激前后鈣信號變化分析
a. 各刺激組鈣信號熱度圖和事件線圖；b. 鈣信號變化統計學分析，
a. heat and event graphs of calcium signal in each stimulation group; b. statistic analysis of calcium signal change,
由圖4a第二行可見，對照組鈣瞬變信號變化穩定，在t = 0～10 s內平均鈣瞬變信號會出現波峰和波谷交替變化。超聲組刺激后鈣瞬變信號在0～10 s內先升后降，但刺激后峰谷值（5 ± 0.5）%小于對照組相應值（15 ± 0.5）%。磁聲組鈣瞬變信號△F/F在t = 0～5 s內緩慢上升，t = 5～10 s內呈下降趨勢，但下降幅度較小。鈣瞬變峰值時間基本持續到10 s。對照組、超聲組、磁聲組最大鈣瞬變幅值分別為（12 ± 0.5）%、（11 ± 0.4）%和（11 ± 0.4）%，與對照組相比，超聲組和磁聲組最大鈣瞬變幅值略微下降，超聲組鈣瞬變信號下降趨勢受到抑制，信號波動變小。磁聲組延長了鈣瞬變信號峰值時間，對照組峰值時間為（2 ± 0.4）s，超聲組峰值時間為（3 ± 0.4）s，磁聲組為（10 ± 0.4）s。
將三個實驗組? 5～10 s內鈣瞬變信號均值進行統計學分析，如表1和圖4b所示，對照組與超聲組差異有統計學意義（t = 2.83，P = 0.03），刺激短時間內超聲組小鼠前額葉皮層神經集群的鈣瞬變信號平均瞬時幅值大于對照組，超出（0.18 ± 0.2）%。磁聲組平均鈣瞬變信號在刺激短時間內大于超聲組，超出（0.44 ± 0.2）%（t = 9.74，P = 0.01）。對照組與磁聲組差異有統計學意義（t = 6.92，P = 0.01）。
表1
各組平均△F/F（%）值（
）
Table1.
Average △F/F (%) value of each group (
)
2.2 鈣信號頻率響應隨時間的變化
實驗第8天取對照組、超聲組和磁聲組小鼠鈣信號，通過短時傅里葉變換進行時頻分析。圖5所示為對照組、超聲組和磁聲組鈣信號能量隨時間和頻率的分布情況。各組時頻能量分布范圍集中在0～1 Hz，且頻率小于20 Hz。對照組鈣信號能量主要分布頻帶小于8 Hz；超聲組信號能量分布頻帶比對照組寬，且小于12 Hz；磁聲組信號能量分布頻帶明顯寬于對照組和超聲組，分布在0～20 Hz。
圖5
鈣信號的低頻響應
Figure5.
Low frequency response of calcium signal
圖5右下子圖所示為刺激前60 s和刺激后80 s內對照組、超聲組和磁聲組的鈣信號頻率平均值，時間窗長度為20 s。對照組在刺激前后，鈣信號頻率無明顯變化，主要在0.2～0.3 Hz。超聲組小鼠在刺激之前鈣信號頻率較穩定，集中在0.35 Hz附近，施加超聲刺激后，鈣信號頻率變大，約為0.4 Hz，較對照組鈣信號頻率上升約0.05 Hz，一定程度上促進了鈣信號的發放。磁聲組小鼠鈣信號頻率由刺激前0.4 Hz變為刺激后0.5 Hz，變化范圍大于超聲組，變化頻率近似，但磁聲組的值大于超聲組。隨著刺激時間變長，鈣信號發放頻率加快，這表明細胞膜內外鈣離子交換頻繁，信息傳遞速度變快。
2.3 行為學實驗
在刺激開始第9天，進行小鼠新物體識別實驗[32]，對其探索能力進行評估。實驗系統主要由立體方形箱子、兩個不同形狀的物體和攝像機組成，頂部攝像機能夠記錄小鼠活動。實驗過程分為環境適應期、訓練期和測試期，環境適應期每只小鼠被單獨置于空曠的新物體適應箱，每天在相同時間自由活動20 min，適應期持續3天，如圖6a所示。適應期結束后24 h進入訓練期，將兩個相同圓柱形物體放入箱體底部中，每只小鼠單獨放在箱體中，自由探索10 min。訓練期結束1 h后，開始測試期，將其中一個物體換成一尺寸相當顏色不同的新物體替代。每只小鼠在箱體中自由探索5 min，同時使用攝像機跟蹤記錄。在每個實驗階段開始前后，使用70%酒精擦拭一遍實驗箱體以及物體，避免小鼠遺留氣味對后續實驗造成干擾。
圖6
行為學實驗系統及新物體識別認知指數
a. 行為學實驗箱；b. 各組認知指數（
a. behavioral experiment box; b. cognitive index of each group (
如圖6c所示，用熱度圖表示三個實驗組小鼠在新舊物體上停留的持續時間，小鼠在物體上停留時間越長，對應位置色階值越靠近暖色調。可以發現，對照組小鼠在新、舊兩個物體上的停留時間相當，且其認知指數（0.58）略小于相關研究中[33]的結果（0.6），這可能與實驗小鼠的種類、性別以及光纖植入腦區等有關。超聲組和磁聲組小鼠在新物體上停留時間高于舊物體，對每組數據進行統計分析，結果如表2和圖6b所示。磁聲組小鼠認知指數（C = 0.71）明顯高于超聲組（C = 0.63，t = 7.76，P < 0.001）和對照組（C = 0.58，t = 12.22，P < 0.001）的對應值，測試期認知指數升高表明小鼠在受到刺激后，對新物體的探索興趣加大，與空間記憶相關的認知能力有所提高。以上結果表明，施加經顱磁聲電刺激和經顱超聲刺激均可提高小鼠對新物體的識別能力，但磁聲組效果優于超聲組，這可能是兩種刺激方式對生物組織的作用機制不同所致。
表2
各組認知指數（
）
Table2.
Cognitive index of each group (
)
3 討論
為了更加準確客觀地分析經顱磁聲電刺激對前額葉皮層神經集群的影響，本文設置了對照組、超聲組和磁聲組，考慮到短時弱磁場對生物神經組織作用效果不明顯[34-35]，故未單獨設計磁刺激組。通過分析不同時間段? 5～10 s和? 60～80 s的鈣信號，用鈣瞬變值表征前額葉皮層神經集群放電活動，用新物體值認知指數度量刺激效果。研究的主要發現是：經顱超聲刺激和經顱磁聲電刺激均促進了鈣離子信號發放頻率，隨刺激時間延長，鈣離子濃度變化加快，而經顱磁聲電刺激的促進效果優于超聲刺激。
本研究取各組刺激前5 s和刺激后10 s鈣瞬變信號進行分析，結果顯示超聲組和磁聲組的鈣瞬變信號峰值時間均長于對照組，且磁聲組峰值持續時間明顯長于超聲組（P < 0.01）。鈣瞬變信號峰值時間延長，表明刺激使鈣信號變化加快，離子交換速度增加。此外，磁聲組在刺激前波形明顯區別于對照組和超聲組，一方面，這可能由于在持續一周刺激后，經顱磁聲電刺激對小鼠前額葉皮層的影響效果更大，另一方面由于植入光纖手術和病毒標記物表達均需要時間，磁聲組病毒表達效果可能沒有對照組和超聲組好，這些因素都有可能對結果造成影響，這將在下一步工作中探究論證。圖5所示為各組接受刺激7天后的鈣信號時頻分布，三組鈣信號能量分布頻帶范圍不同（0～8 Hz，0～12 Hz，0～20 Hz），反映出各組鈣離子跨膜運動頻率具有差異性，而帶電離子的跨膜運動會表現為一定的膜電位，鈣離子的變化可能會改變膜電位，影響神經元興奮性。第8天刺激實驗結果顯示，在刺激開始前后，超聲組和磁聲組的鈣信號頻率變化分別為0.05 Hz和0.1 Hz，體現出兩種刺激均具有實時性，且磁聲組變化大于超聲組，即磁聲電刺激下神經集群中鈣穩態更容易被改變。
嚙齒類動物存在對新物體自主探索的天性，新物體識別測試可以得到與空間記憶相關的信息[34]，此類測試被用來研究前額葉皮層在空間和工作記憶水平的功能[36-37]。本文通過對不同刺激方式下小鼠空間探索能力的測試，發現磁聲組認知指數（0.71）顯著高于超聲組（0.63）和對照組（0.58），且三組差異均有統計學意義（P<0.01）。但經顱磁聲電刺激和經顱超聲刺激的作用機制不同。前者基于磁聲電效應產生的感應電流刺激神經細胞，通過感應電流調控鈣離子流動，改變神經集群頻率編碼，從而影響神經元放電活動。而超聲的機械效應能夠打開細胞膜上離子通道[38]，改變細胞內外鈣離子穩態，促進鈣離子膜內外交換。
以上結果表明磁聲電刺激調節了小鼠前額葉皮層神經集群的鈣穩態，進而改變神經興奮性和突觸效率。有研究表明陡升信號與神經細胞去極化導致的快速胞內鈣離子濃度升高相關，下降緩慢與鈣離子緩慢代謝有關[13-14]，鈣瞬變信號峰值時間變長，表明鈣波動信號變化頻率加快，鈣代謝變得頻繁，鈣離子傳輸速率增強。一方面，由于鈣離子參與細胞去極化和復極化過程，鈣瞬變峰時間延長從側面表明細胞膜內外電勢恢復需要的時間更短，細胞電位復極化時間變短，神經元放電頻率加快。另一方面，當動作電位到達神經末梢時，電壓門控型鈣離子通道開放，大量鈣離子由細胞外進入突觸前末梢內，鈣離子作為信使物質，觸發突觸前膜神經遞質釋放，到達突觸后膜，刺激化學與受體門控，鈣離子內流產生電信號[39-40]，實現信息傳遞。神經放電頻率加快，引起突觸效率增高，鈣離子濃度的變化頻率加快，增強了小鼠空間認知能力。
此外，本文僅探討神經元集群對于磁聲電刺激的直接響應，這些響應會沿著神經軸突傳向末梢突觸，作用于突觸后神經元，進而激活下游神經元，產生更為復雜的響應。如果在磁聲電刺激中頻繁改變刺激強度，那么前期刺激是否影響后期刺激作用，神經元集群鈣離子濃度變化是否與刺激時間存在相關性，這些都有待進一步研究，但本文對前額葉皮層神經集群刺激的直接響應是后續開展各項研究的基礎。
4 結論
本文通過光纖光度檢測技術，實時采集不同刺激方式下小鼠前額葉皮層神經集群鈣離子濃度信號，并對比鈣信號頻譜圖和鈣瞬變信號的時間響應。時頻分析結果表明，磁聲組和超聲組小鼠前額葉皮層神經集群鈣信號低頻能量在刺激之后顯著上升，且磁聲組能量分布頻帶范圍大于超聲組。統計結果分析得出，刺激一周后磁聲組小鼠的認知指數大于超聲組和對照組。研究表明：磁聲電刺激能夠明顯改變小鼠前額葉皮層神經集群的鈣離子濃度，促進小鼠認知能力的提升，其部分作用可能是通過感應電流調控膜電位，進而影響鈣離子通道實現的。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：張帥為基金項目負責人，指導實驗設計、數據分析、論文寫作與修改；武健康為本研究實驗設計和實驗研究的執行人，完成數據分析和論文初稿的寫作；黨君武參與論文修改；許家悅參與實驗研究與數據分析；趙毅航和侯文濤負責數據處理和實驗結果分析；徐桂芝對文章知識性內容作批評性審閱與指導，參與論文校對和定稿。
倫理聲明：本研究通過了河北工業大學生物醫學倫理委員會批準（批文編號：HEBUTaCUC2020013）。
引言
內側前額葉皮層（medial prefrontal cortex，mPFC）是被廣泛研究的腦區之一[1]，作為工作記憶的關鍵腦區，其依靠神經元之間的協同作用產生神經信號，形成神經通路來完成認知任務[2]。在神經信號傳遞過程中，鈣離子介導去極化信號的傳遞，并參與突觸活動的調控及生物體內多種功能的調節，從毫秒水平的神經遞質釋放到持續數分鐘乃至數小時的基因轉錄都涉及其中，對神經元的功能至關重要[3-4]。當受到外界刺激時，電壓控制鈣通道的開放程度受到影響[5]，引起細胞質膜內外的濃度變化，如在放電活動過程中鈣離子濃度會達到靜息態的10～100倍，這種變化轉化為細胞反應的信號，改變細胞鈣穩態，進而引起一系列生理反應[6]。鈣穩態對維持各種正常生理活動具有重要作用，穩態失衡與神經集群異常放電息息相關[7-10]，因此研究腦內鈣離子變化是探討神經疾病發病機制的一個潛在方向。
現有神經調控手段包括經顱超聲刺激（transcranial ultrasound stimulation，TUS）[11-12]、深部腦刺激（deep brain stimulation，DBS）[13]、經顱磁刺激（transcranial magnetic stimulation，TMS）[14-16]、經顱直流電刺激（transcranial direct current stimulation，tDCS）[17]和經顱磁聲電刺激（transcranial magneto-acoustic electrical stimulation，TMAES）等[18-19]。其中，TMS作為當前常用的神經調控技術之一，目前應用在某些神經精神類疾病的治療（如帕金森病、癲癇），但仍有不足之處，如顱內磁場分布發散，空間分辨率低[20]。TUS具有較高的空間分辨率和穿透性，但有可能引起血腦屏障損傷、顱內出血等[21]。
經顱磁聲電刺激是一種新型無創腦神經調控技術，和TMS不同，其利用靜態磁場和超聲波的共同作用，可在神經組織產生感應電流進而調節相應腦區的神經活動。2018年，劉志朋團隊[15]通過研究帕金森病模型鼠海馬區黑質神經，發現磁聲電刺激能夠提高其突觸活性及可塑性，從而改變學習與記憶能力。2019年，殷濤團隊[22]對比磁聲電刺激和超聲刺激誘發肌電運動閾值，發現經顱磁聲電刺激具有更有效的運動皮層調控能力。同年，本課題組[23-24]通過仿真實驗以及對大鼠局部場電位功率譜的分析，得出低刺激參數具有更好的調控作用。
以上從突觸活性、肌電信號和局部場電位等多角度證明了經顱磁聲電刺激調控神經的有效性[25-27]，但作用機制尚不明確，亟待從更微觀角度探究經顱磁聲電刺激對神經集群活動狀態的影響。利用光纖光度檢測技術對特異性神經元長期記錄，可檢測300～500 μm[8]范圍內神經元的鈣活動，以指示劑的熒光強度變化表征神經元集群中鈣離子的信號波動，進一步反映神經核團的細胞活動[28-29]。
本文以健康KM小鼠為研究對象，設置對照組、超聲組和磁聲組，基于光纖光度檢測的光學方法，記錄經顱磁聲電刺激下小鼠前額葉皮層集群鈣離子信號，并進行新物體識別實驗，對比各組鈣信號時頻能量和小鼠行為學差異。探討經顱磁聲電刺激對神經集群中信息傳輸的影響，為深入揭示經顱磁聲電刺激的神經作用機制提供數據支撐和參考，為神經解碼和神經調控研究帶來新的突破口。
1 材料和方法
1.1 實驗動物及實驗設計
研究采用雄性成年KM小鼠，15只，6～8周齡，體重（36 ± 3）g，購自北京華阜康生物科技有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2020～0004。飼養環境溫度維持在（25 ± 1）℃，濕度維持在50%～60%，給予充足的食物與水，12小時光照與黑暗環境交替循環。實驗中將小鼠隨機分為3組，即對照組、超聲組和磁聲組，每組5只。光纖植入手術恢復兩周后，進行刺激實驗和行為學實驗。實驗流程如圖1所示。所有動物實驗根據我國相關指南和規定進行，均獲得河北工業大學生物醫學倫理委員會批準（倫理審查編號：HEBUTaCUC2020013），且符合實驗動物倫理學要求和使用規范，本實驗全程受其監督指導。
圖1
實驗設計流程圖
Figure1.
Experimental design flow chart
1.2 光纖光度檢測實驗
手術開始前將小鼠置于4%的異氟烷麻醉箱氣體麻醉，檢查并調好實驗裝置后，將小鼠固定在腦立體定位儀上，固定后改為1%濃度的異氟烷維持麻醉，剪開頭皮露出顱骨，去除顱骨表面結締組織。在內側前額葉皮質的前邊緣皮層區（ML：0.3 mm；AP：1.94 mm；DV：? 1.6 mm）上方開一個直徑2 mm的小孔，使用微量注射器通過玻璃微吸管注入（速度：50 nL/min）200 nL鈣熒光蛋白rAAV-CaMKIIa-GCaMp6m-WPRE-hGH-polyA（武漢舒密腦科學技術有限公司，中國）。如圖2a～b所示，在相同位置植入直徑200 μm、長度15 mm的陶瓷插芯光纖頭（千奧公司南京生物科技有限公司，中國），并使用光固化劑（北京永軒科技有限公司，中國）和組織生物膠（Minnesota Mining and Manufacturing，美國）固定創口。手術恢復2周后，進行刺激實驗和信號采集。
圖2
磁聲電刺激系統及鈣信號采集示意圖
a. 腦圖譜；b. 顱骨開口位置；c. TMAES和鈣信號采集示意圖; d～e.分別為對照組和TMAES組所采集的鈣信號；f. 超聲信號調制示意圖
Figure2. TMAES system and calcium signal acquisitiona. brain map location; b. location of skull opening; c. schematic diagram of TMAES and calcium signal acquisition; d–e. calcium transient signals in control group and TMAES group, respectively; f. schematic diagram of ultrasonic signal modulation
1.3 磁聲刺激實驗
磁聲組使用兩個直徑40 mm、厚度10 mm的圓柱形釹鐵硼永磁體提供水平方向0.3 T靜磁場，由任意波形發生器（33500B Series，KEYSIGHT，美國）和射頻功率放大器（Model 150A100C，AR，美國）產生超聲，經超聲換能器（P20FG，汕頭超聲電子有限公司，中國）和準直器（玻璃材質，中國）聚焦到小鼠前額葉皮層。超聲基波頻率（fundamental frequency，FF）為0.5 MHz，脈沖重復頻率（pulse repetition frequency，PRF）為1 kHz，脈沖長度（tone-burst duration，TBD）為0.5 ms，脈沖持續時間（sonication duration，SD）為400 ms，刺激持續時間T1為2 min，脈沖超聲序列參數之間的關系如圖2f所示。小鼠顱內平均脈沖時間強度Isppa計算所得為2.6 W/cm2。超聲組僅使用2.6 W/cm2的刺激強度，對照組在相同環境下去除磁場和超聲。
如圖2c所示，采用配備488 nm激發光二極管（OBIS 488LS，Coherent，美國）和二色鏡（MD498，Thorlabs，美國）的光纖光度檢測系統（南京千奧星科有限公司，中國）進行鈣信號采集，利用多功能數據采集軟件（Thinker Tech，南京生物科學有限公司，中國）記錄GCaMp6m的熒光信號。所得信號經過低通濾波器（40 Hz）后，以500 Hz的頻率采樣，再用MATLAB 2019a（Math Works）軟件進行離線分析。如圖2d～e所示為對照組和磁聲組的采集信號。
實驗中使用呼吸麻醉機（R580S，RWD，中國）對實驗動物進行持續的輕度氣體麻醉[22]。每天早上9:00開始刺激，每天刺激一次，每次刺激持續2 min。連續刺激7天后，從第8天開始鈣信號采集，在暗環境下分別采集各組刺激前100 s、刺激持續過程120 s和刺激后200 s數據，每只小鼠采集10組數據。信號采集過程如圖3所示。
圖3
鈣信號采集過程示意圖
Figure3.
Schematic diagram of calcium signal acquisition process
1.4 鈣信號分析與統計學分析
本文應用短時傅里葉變換（short time Fourier transform，STFT）方法[30]對所采集鈣信號進行時頻分析。對于隨時間變化的時域信號，是有限能量信號空間，則該信號不同時刻的STFT集合，如式（1）所示：
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其中，是相對連續信號的角頻率，表示信號輸入的時刻，t表示信號時間，是對稱的實窗函數，滿足，且 = 1。本文采用窗函數為漢明窗，步長設置為128。
對式（1）等號兩邊分別取模的平方即可得到譜圖，如式（2）所示：
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其中，是對應時域信號x(t)的譜圖，它能夠反映信號能量的時頻分布。
檢測小鼠在自由活動時對不同物體的探索行為，認知指數C表示小鼠在新舊物體上停留的時間T1和T2比，即，值越大，認知能力越強，以此評價小鼠對新物體的自主探究能力。
實驗數據取自刺激實驗第8天，以均值±標準差的形式表示，本文使用Wilcoxon秩和單因素方差檢驗（One-way Analysis of Variance）來對比各組數據之間的差異性，檢驗水準為0.05。所有統計分析由GraphPad Prism軟件包8.4（GraphPad Software Inc.，美國）和SPSS 24（IBM，美國）執行。
2 數據分析結果
2.1 鈣瞬變信號平均幅值響應隨時間的變化
在同一麻醉水平下，選取各組實驗鼠刺激開始前5 s與刺激開始后10 s信號數據。用表征光纖末端熒光強度的相對變化幅度[31]，如公式（3）所示，下文皆稱為鈣瞬變信號。
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其中，表示記錄到的實時鈣信號。，表示參考時間內鈣信號的平均值，表示當前分析鈣信號通道的系統偏置數據，每次實驗前需進行測定。
如圖4所示，用時間相關線圖表示小鼠鈣離子濃度的平均變化趨勢，其中，紅色的實線表示錐體神經元鈣瞬變信號的平均值，灰色陰影表示樣本平均數的標準誤差。圖4a第一行分別為對照組、超聲組和磁聲組刺激開始前5 s和刺激開始后10 s的鈣瞬變信號變化熱度圖，暖色調表示信號變化幅度大，冷色調表示信號變化幅度小。對照組鈣信號分別在t = ? 5～0 s、t = 0～5 s和t = 5～10 s內各有一個冷暖色交替，超聲組在刺激之后鈣瞬變信號熱度圖變亮，磁聲組在刺激之后峰值持續時間變長，暖色帶變長。
圖4
各組刺激前后鈣信號變化分析
a. 各刺激組鈣信號熱度圖和事件線圖；b. 鈣信號變化統計學分析，
a. heat and event graphs of calcium signal in each stimulation group; b. statistic analysis of calcium signal change,
由圖4a第二行可見，對照組鈣瞬變信號變化穩定，在t = 0～10 s內平均鈣瞬變信號會出現波峰和波谷交替變化。超聲組刺激后鈣瞬變信號在0～10 s內先升后降，但刺激后峰谷值（5 ± 0.5）%小于對照組相應值（15 ± 0.5）%。磁聲組鈣瞬變信號△F/F在t = 0～5 s內緩慢上升，t = 5～10 s內呈下降趨勢，但下降幅度較小。鈣瞬變峰值時間基本持續到10 s。對照組、超聲組、磁聲組最大鈣瞬變幅值分別為（12 ± 0.5）%、（11 ± 0.4）%和（11 ± 0.4）%，與對照組相比，超聲組和磁聲組最大鈣瞬變幅值略微下降，超聲組鈣瞬變信號下降趨勢受到抑制，信號波動變小。磁聲組延長了鈣瞬變信號峰值時間，對照組峰值時間為（2 ± 0.4）s，超聲組峰值時間為（3 ± 0.4）s，磁聲組為（10 ± 0.4）s。
將三個實驗組? 5～10 s內鈣瞬變信號均值進行統計學分析，如表1和圖4b所示，對照組與超聲組差異有統計學意義（t = 2.83，P = 0.03），刺激短時間內超聲組小鼠前額葉皮層神經集群的鈣瞬變信號平均瞬時幅值大于對照組，超出（0.18 ± 0.2）%。磁聲組平均鈣瞬變信號在刺激短時間內大于超聲組，超出（0.44 ± 0.2）%（t = 9.74，P = 0.01）。對照組與磁聲組差異有統計學意義（t = 6.92，P = 0.01）。
表1
各組平均△F/F（%）值（）
Table1.
Average △F/F (%) value of each group ()
2.2 鈣信號頻率響應隨時間的變化
實驗第8天取對照組、超聲組和磁聲組小鼠鈣信號，通過短時傅里葉變換進行時頻分析。圖5所示為對照組、超聲組和磁聲組鈣信號能量隨時間和頻率的分布情況。各組時頻能量分布范圍集中在0～1 Hz，且頻率小于20 Hz。對照組鈣信號能量主要分布頻帶小于8 Hz；超聲組信號能量分布頻帶比對照組寬，且小于12 Hz；磁聲組信號能量分布頻帶明顯寬于對照組和超聲組，分布在0～20 Hz。
圖5
鈣信號的低頻響應
Figure5.
Low frequency response of calcium signal
圖5右下子圖所示為刺激前60 s和刺激后80 s內對照組、超聲組和磁聲組的鈣信號頻率平均值，時間窗長度為20 s。對照組在刺激前后，鈣信號頻率無明顯變化，主要在0.2～0.3 Hz。超聲組小鼠在刺激之前鈣信號頻率較穩定，集中在0.35 Hz附近，施加超聲刺激后，鈣信號頻率變大，約為0.4 Hz，較對照組鈣信號頻率上升約0.05 Hz，一定程度上促進了鈣信號的發放。磁聲組小鼠鈣信號頻率由刺激前0.4 Hz變為刺激后0.5 Hz，變化范圍大于超聲組，變化頻率近似，但磁聲組的值大于超聲組。隨著刺激時間變長，鈣信號發放頻率加快，這表明細胞膜內外鈣離子交換頻繁，信息傳遞速度變快。
2.3 行為學實驗
在刺激開始第9天，進行小鼠新物體識別實驗[32]，對其探索能力進行評估。實驗系統主要由立體方形箱子、兩個不同形狀的物體和攝像機組成，頂部攝像機能夠記錄小鼠活動。實驗過程分為環境適應期、訓練期和測試期，環境適應期每只小鼠被單獨置于空曠的新物體適應箱，每天在相同時間自由活動20 min，適應期持續3天，如圖6a所示。適應期結束后24 h進入訓練期，將兩個相同圓柱形物體放入箱體底部中，每只小鼠單獨放在箱體中，自由探索10 min。訓練期結束1 h后，開始測試期，將其中一個物體換成一尺寸相當顏色不同的新物體替代。每只小鼠在箱體中自由探索5 min，同時使用攝像機跟蹤記錄。在每個實驗階段開始前后，使用70%酒精擦拭一遍實驗箱體以及物體，避免小鼠遺留氣味對后續實驗造成干擾。
圖6
行為學實驗系統及新物體識別認知指數
a. 行為學實驗箱；b. 各組認知指數（
a. behavioral experiment box; b. cognitive index of each group (
如圖6c所示，用熱度圖表示三個實驗組小鼠在新舊物體上停留的持續時間，小鼠在物體上停留時間越長，對應位置色階值越靠近暖色調。可以發現，對照組小鼠在新、舊兩個物體上的停留時間相當，且其認知指數（0.58）略小于相關研究中[33]的結果（0.6），這可能與實驗小鼠的種類、性別以及光纖植入腦區等有關。超聲組和磁聲組小鼠在新物體上停留時間高于舊物體，對每組數據進行統計分析，結果如表2和圖6b所示。磁聲組小鼠認知指數（C = 0.71）明顯高于超聲組（C = 0.63，t = 7.76，P < 0.001）和對照組（C = 0.58，t = 12.22，P < 0.001）的對應值，測試期認知指數升高表明小鼠在受到刺激后，對新物體的探索興趣加大，與空間記憶相關的認知能力有所提高。以上結果表明，施加經顱磁聲電刺激和經顱超聲刺激均可提高小鼠對新物體的識別能力，但磁聲組效果優于超聲組，這可能是兩種刺激方式對生物組織的作用機制不同所致。
表2
各組認知指數（）
Table2.
Cognitive index of each group ()
3 討論
為了更加準確客觀地分析經顱磁聲電刺激對前額葉皮層神經集群的影響，本文設置了對照組、超聲組和磁聲組，考慮到短時弱磁場對生物神經組織作用效果不明顯[34-35]，故未單獨設計磁刺激組。通過分析不同時間段? 5～10 s和? 60～80 s的鈣信號，用鈣瞬變值表征前額葉皮層神經集群放電活動，用新物體值認知指數度量刺激效果。研究的主要發現是：經顱超聲刺激和經顱磁聲電刺激均促進了鈣離子信號發放頻率，隨刺激時間延長，鈣離子濃度變化加快，而經顱磁聲電刺激的促進效果優于超聲刺激。
本研究取各組刺激前5 s和刺激后10 s鈣瞬變信號進行分析，結果顯示超聲組和磁聲組的鈣瞬變信號峰值時間均長于對照組，且磁聲組峰值持續時間明顯長于超聲組（P < 0.01）。鈣瞬變信號峰值時間延長，表明刺激使鈣信號變化加快，離子交換速度增加。此外，磁聲組在刺激前波形明顯區別于對照組和超聲組，一方面，這可能由于在持續一周刺激后，經顱磁聲電刺激對小鼠前額葉皮層的影響效果更大，另一方面由于植入光纖手術和病毒標記物表達均需要時間，磁聲組病毒表達效果可能沒有對照組和超聲組好，這些因素都有可能對結果造成影響，這將在下一步工作中探究論證。圖5所示為各組接受刺激7天后的鈣信號時頻分布，三組鈣信號能量分布頻帶范圍不同（0～8 Hz，0～12 Hz，0～20 Hz），反映出各組鈣離子跨膜運動頻率具有差異性，而帶電離子的跨膜運動會表現為一定的膜電位，鈣離子的變化可能會改變膜電位，影響神經元興奮性。第8天刺激實驗結果顯示，在刺激開始前后，超聲組和磁聲組的鈣信號頻率變化分別為0.05 Hz和0.1 Hz，體現出兩種刺激均具有實時性，且磁聲組變化大于超聲組，即磁聲電刺激下神經集群中鈣穩態更容易被改變。
嚙齒類動物存在對新物體自主探索的天性，新物體識別測試可以得到與空間記憶相關的信息[34]，此類測試被用來研究前額葉皮層在空間和工作記憶水平的功能[36-37]。本文通過對不同刺激方式下小鼠空間探索能力的測試，發現磁聲組認知指數（0.71）顯著高于超聲組（0.63）和對照組（0.58），且三組差異均有統計學意義（P<0.01）。但經顱磁聲電刺激和經顱超聲刺激的作用機制不同。前者基于磁聲電效應產生的感應電流刺激神經細胞，通過感應電流調控鈣離子流動，改變神經集群頻率編碼，從而影響神經元放電活動。而超聲的機械效應能夠打開細胞膜上離子通道[38]，改變細胞內外鈣離子穩態，促進鈣離子膜內外交換。
以上結果表明磁聲電刺激調節了小鼠前額葉皮層神經集群的鈣穩態，進而改變神經興奮性和突觸效率。有研究表明陡升信號與神經細胞去極化導致的快速胞內鈣離子濃度升高相關，下降緩慢與鈣離子緩慢代謝有關[13-14]，鈣瞬變信號峰值時間變長，表明鈣波動信號變化頻率加快，鈣代謝變得頻繁，鈣離子傳輸速率增強。一方面，由于鈣離子參與細胞去極化和復極化過程，鈣瞬變峰時間延長從側面表明細胞膜內外電勢恢復需要的時間更短，細胞電位復極化時間變短，神經元放電頻率加快。另一方面，當動作電位到達神經末梢時，電壓門控型鈣離子通道開放，大量鈣離子由細胞外進入突觸前末梢內，鈣離子作為信使物質，觸發突觸前膜神經遞質釋放，到達突觸后膜，刺激化學與受體門控，鈣離子內流產生電信號[39-40]，實現信息傳遞。神經放電頻率加快，引起突觸效率增高，鈣離子濃度的變化頻率加快，增強了小鼠空間認知能力。
此外，本文僅探討神經元集群對于磁聲電刺激的直接響應，這些響應會沿著神經軸突傳向末梢突觸，作用于突觸后神經元，進而激活下游神經元，產生更為復雜的響應。如果在磁聲電刺激中頻繁改變刺激強度，那么前期刺激是否影響后期刺激作用，神經元集群鈣離子濃度變化是否與刺激時間存在相關性，這些都有待進一步研究，但本文對前額葉皮層神經集群刺激的直接響應是后續開展各項研究的基礎。
4 結論
本文通過光纖光度檢測技術，實時采集不同刺激方式下小鼠前額葉皮層神經集群鈣離子濃度信號，并對比鈣信號頻譜圖和鈣瞬變信號的時間響應。時頻分析結果表明，磁聲組和超聲組小鼠前額葉皮層神經集群鈣信號低頻能量在刺激之后顯著上升，且磁聲組能量分布頻帶范圍大于超聲組。統計結果分析得出，刺激一周后磁聲組小鼠的認知指數大于超聲組和對照組。研究表明：磁聲電刺激能夠明顯改變小鼠前額葉皮層神經集群的鈣離子濃度，促進小鼠認知能力的提升，其部分作用可能是通過感應電流調控膜電位，進而影響鈣離子通道實現的。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：張帥為基金項目負責人，指導實驗設計、數據分析、論文寫作與修改；武健康為本研究實驗設計和實驗研究的執行人，完成數據分析和論文初稿的寫作；黨君武參與論文修改；許家悅參與實驗研究與數據分析；趙毅航和侯文濤負責數據處理和實驗結果分析；徐桂芝對文章知識性內容作批評性審閱與指導，參與論文校對和定稿。
倫理聲明：本研究通過了河北工業大學生物醫學倫理委員會批準（批文編號：HEBUTaCUC2020013）。
