脂質體由于組分可控，是自然生物膜的良好替代模型。磷脂分子發生水合作用形成規則的膜結構是脂質體形成的先決條件。本文以乙醇分子為模型，考察了小分子醇類對磷脂水合（包括水合過程和水合結果）與脂質體形成的影響，以及醇分子與氯化鈉共存時的影響。實驗發現，磷脂膜水合過程中乙醇與氯化鈉的作用恰好相反。氯化鈉會抑制脂質體形成，而乙醇則在一定濃度范圍內促進脂質體形成。對比不同乙醇及氯化鈉含量時膜上熒光強度和膜連續度的變化，發現當二者同時出現在磷脂膜所處液體環境時，兩者對磷脂水合起疊加作用。本研究結果可為人工生物膜的制備提供參考信息。
引用本文： 蔣麗華, 王瓊, 胡寧, 楊軍. 小分子醇類對磷脂水合和脂質體形成的影響研究. 生物醫學工程學雜志, 2022, 39(1): 112-119. doi: 10.7507/1001-5515.202105060 復制
引言
生物膜在生命體中（除病毒外）廣泛存在，是生命體中至關重要的一種功能結構，與生命活動中能量轉換、物質運送、信息識別與傳遞等重要功能息息相關[1-2]。生物膜的基本形態都是雙分子層片層結構，組成成分主要包括脂質、蛋白質及少量與之相結合的糖類，其中大部分脂質成分為磷脂。然而，生物膜的高度復雜性和動態性使直接針對自然生物膜的相關研究變得極為困難。因此，基于磷脂自組裝形成的人工生物膜結構，包括二維平面磷脂膜和三維脂質體，常被用作模型來研究生物分子在膜上的行為以及它們對膜性質的影響等[3]。由于基于二維平面膜的研究不可避免地會受到來自基底的影響[3]，巨型脂質體成為前景最好、應用最廣的一種選擇[1]。例如，Garten等[2]將β-酪蛋白封裝到巨型單層脂質體（giant unilamellar vesicle，GUV）上，構建了一個穩定、高阻抗的GUV系統。基于該系統，可以利用膜片鉗技術在生理張力下對特定離子通道和轉運體進行電生理研究。這些研究對認識各種生命活動具有重要意義[4]。
脂質體制備是脂質體應用的重要前提。在脂質體相關研究中，往往采用水合法（又稱膨脹法）制備無油脂質體（見圖1）。它主要包括以下三個步驟：① 將磷脂溶解于有機溶劑；② 待有機溶劑揮發后，在固體基底上形成一層干燥磷脂膜；③ 將干燥磷脂暴露于水環境中，磷脂分子自組裝形成規則膜結構。最常用的電形成法便是水合法的一種，它是在溫和水合法基礎上通過施加外部電場來加快脂質體形成的一種方法[5]。大量研究表明當利用水合法制備脂質體時，脂質體的形成效果容易受水環境影響。例如，當水溶液中有離子出現時，脂質體制備（特別是巨型脂質體制備）受到抑制[6-7]。高濃度蔗糖溶液也被發現會抑制脂質體形成[8]。
圖1
水合法（膨脹法）制備脂質體示意圖
Figure1.
The schematic diagram of liposome preparation when using hydration method (or swelling method)
磷脂水合是脂質體形成的必經過程，包括水溶液中磷脂分子重排、磷脂膜膨脹與融合。為了有效制備鹽溶液中的巨型脂質體，我們[9]曾考察了氯化鈉對磷脂水合的過程和結果的影響。結果表明，隨著水溶液中離子出現和離子濃度升高，水合磷脂膜變得越來越穩定。針對這一實驗結果，我們分析氯化鈉之所以抑制巨型脂質體形成，可能是因為增強了磷脂分子所受的疏水作用。強大的疏水排斥下，磷脂膜被牢牢固定于基底。基于此，我們[10]對芯片進行氧等離子處理，使基底變得親水。這一操作促使磷脂膜更易膨脹和脫落，進而促進巨型脂質體形成。
除了離子外，醇分子也常出現在生物膜環境中，并與磷脂分子產生特定相互作用，從而影響生物膜的形成、結構和功能。結構簡單的小型醇分子，如甲醇和乙醇常被用作研究模型[11]。例如，Ma等[12]研究了甲醇與烷基面間的相互作用，發現甲醇會降低兩個烷基面間的疏水黏附。他們猜測甲醇可能破壞了膜附近的水結構，還可能破壞烴分子間的疏水締合。Hwang等[13]分析了甲醇對多肽（BBA5）結構的影響，發現甲醇可以增強肽鏈之間的相互作用，促進二級結構形成。Manca等[14]發現醇分子與磷脂分子結合，會引起雙層膜結構的顯著變化。低濃度時，醇分子參與磷脂自組裝，磷脂分子形成交叉膜結構；高濃度時，醇分子的出現誘導磷脂分子形成非雙層結構。在醇分子與磷脂分子間的具體相互作用上，Feller等[15]認為醇烴基朝向磷脂分子的非極性端，醇羥基與磷酸基團形成氫鍵[16]。除此之外，研究還表明醇分子讓磷脂烴鏈變得無序，降低磷脂膜的相變溫度及雙分子層厚度[17-18]。醇分子對相變溫度的影響與醇烴鏈的長度相關[14]。
相對于甲醇，乙醇作為一種常見的食品成分和有機溶劑，出現在生物膜環境中的機會更多。因此，本文利用微芯片脂質膜研究方法[9]，探討了乙醇對磷脂水合和脂質體形成的影響。除此之外，無論是體外研究還是體內研究，這些分子或離子往往不單獨存在，而是與其他溶質共存于液體環境中[19]。因此，本文還探討了乙醇與氯化鈉共存時對磷脂水合和脂質體形成的影響。由于醇類和磷脂等小分子物質在不同聚集狀態和復雜微環境下的相互作用很難用傳統示蹤及定量分析方法進行檢測分析，因此本文采用顯微熒光技術，通過磷脂水合過程中膜結構的動態變化，間接反映環境分子與磷脂的相互作用及其對磷脂水合和脂質體形成的影響。除此之外，本文半定量地計算了乙醇對膜相對熒光強度和相對連續度的影響，希望從中獲取更多信息。
1 實驗部分
1.1 儀器及試劑
FA 2004B電子天平（上海佑科），ISC10激光打標機（武漢華工激光工程），PDC-GC-M等離子清洗儀（成都維克光譜），BX53生物熒光顯微鏡（日本奧林巴斯），DZF-6050真空干燥箱（上海佑科）。
從大豆中粗提取的磷脂酰膽堿（L-α-phosphatidylchoine，PC，14%～23%）以及熒光探針（DiI，1,1'-dihexadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbo-cyanie perchlorate，ex/em：549/564 nm，Molecular Probes）均購自Sigma-Aldrich（美國）；玻璃基片購自珠海凱威（中國）；聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）購自Dow Corning（美國）；聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）購自怡康（中國）；氯化鈉、乙醚、無水乙醇購自東方化玻（中國）。
1.2 芯片及裝置
實驗中采用的微腔室芯片結構由上、下兩層玻璃與中間的PDMS墊片構成（見圖2a）。芯片上有六個半徑為10 mm、高度為1 mm的圓柱形腔室。將頂部玻片封裝于腔室上方后，腔室兩側自然留出狹長的進樣和出樣通道（寬度為2 mm），兩側通道可始終與大氣保持連通。進出樣通道與反應室之間以半徑為2 mm、轉角角度為65o的弧形通道過渡。相比于直角設計，這種結構可以避免進樣時產生氣泡，降低流體運動對膜的擾動。
圖2
實驗設置
a. 包含6個微腔室的實驗芯片；b. 實驗流程示意圖
Figure2. The experimental setupa. the chip used in this study which consists of 6 chambers; b. the experimental processes
芯片設計與加工詳見參考文獻[9]。芯片加工時，先利用激光打標機在PMMA基片上燒蝕芯片模具。將PDMS與固化劑按10∶1的質量比混合并充分攪拌，然后置于真空箱中減壓完全去除氣泡。隨后，將混合好的PDMS澆注到芯片模具上，靜置1 h，再于70 oC下固化2 h。在固化的同時，將1片10 cm × 10 cm的玻璃基片和6片2 cm × 2.5 cm的玻璃蓋片分別用無水乙醇與三蒸水清洗干凈，置于烘箱中完全烘干。待PDMS固化后，將PDMS膠塊從模具上剝離并與玻璃基片一同置于等離子清洗儀中，利用氧等離子清洗30 s。取出PDMS膠塊和玻璃基片通過熱板層壓法鍵合，形成含有6個反應腔室的芯片。
1.3 實驗過程
磷脂水合的實驗過程如圖2b所示，主要包括成膜、封閉、加樣和水合四個步驟。具體地，先將40 mg的PC溶解于10 mL乙醚中，再加入30 μL溶有熒光染料的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液。磷脂與熒光染料的質量比為99.5∶0.5。將40 μL配制好的磷脂溶液滴加到腔室底部，為了避免乙醚揮發時氣流的影響，芯片置于一個較小盒子內，使成膜過程在幾乎密閉的小空間內進行。乙醚揮發后，在基底形成一層干燥的磷脂膜。干燥磷脂膜呈“咖啡環”形態，四周為較厚的環狀膜，中間為相對均勻的平面膜。將成膜后的芯片置于真空干燥箱中室溫過夜，完全去除剩余有機溶劑。水合實驗前，將六塊玻璃蓋片分別固定在六個腔室頂部，形成完整的實驗芯片。然后，將芯片置于熒光顯微鏡的載物臺上，從一側進樣口緩慢加入1 mL乙醇水溶液或乙醇鹽溶液，觀察磷脂水合情況和脂質體形成情況。
1.4 結果處理
充分水合4 h后，快速記錄水合結果的熒光顯微圖像，并利用MATLAB軟件（MathWorks，美國）針對膜相對熒光強度和膜相對連續度兩個參數進行定量分析。具體地，選取同一芯片上相同條件下的6組圖片進行處理，計算膜的相對熒光強度和相對連續度。利用相同方法，多次重復實驗獲得多組數據，進行繪圖分析。由于干燥磷脂膜具有明顯的“咖啡環”效應，每組圖片均包含多張來自腔室中心區域和邊緣區域的圖片。熒光強度和連續度均利用圖片的灰度值計算得到，灰度值閾值的選擇如圖3所示，以覆蓋所有紅色區域為準。其中，熒光強度為f = ∑g/sp，式中，g為大于閾值的灰度值，sp為灰度值大于閾值的像素點之和。熒光強度（f）為一組圖片的平均值。對同一芯片的6組圖片處理完后得到6個平均灰度值。然后，分別除以純水的熒光強度進行歸一化處理，得到相對熒光強度。連續度c = sp/s，其中s為圖片的總像素點之和。同樣地，連續度也是一組圖片的平均值。對同一芯片的6組圖片處理完后得到的6個平均灰度值，分別除以純水的對應值得到相對連續度。
圖3
閾值設定
a. 乙醇水溶液中磷脂水合結果的熒光圖片，圖中標尺為100 μm；b. 根據圖a中白線上的灰度值分布選取合適閾值
Figure3. Setting of the threshold valuea. the experimental fluorescence image, the scale bar is 100 μm; b. setting of the threshold value according to the gray values along the white line in the figure a
2 結果
如圖4所示，隨著氯化鈉濃度增加，磷脂膜變得越來越穩定且牢牢黏附于基底，脂質體形成受到嚴重影響。除此之外，磷脂膜的熒光強度增加，這說明膜中磷脂分子可能包裹得更加緊密。相比而言，單就對磷脂水合的影響，乙醇顯示出相反結果。我們發現隨著乙醇含量增加，水合磷脂膜變得越來越粗糙（見圖4）。為了后續能夠較好地對比乙醇和氯化鈉的影響，本文水合結果圖中的溶質含量均以氯化鈉/水（氯化鈉組）或乙醇/水（乙醇組和乙醇/氯化鈉混合組）的物質的量之比表示，括號內分別為氯化鈉濃度或乙醇體積分數，圖中標尺均為100 μm。
圖4
磷脂在不同含量的氯化鈉溶液和乙醇水溶液中的水合結果
Figure4.
The results of hydration of lipid molecules in aqueous solutions with different contents of sodium chloride and ethanol
當乙醇體積分數小于20%（乙醇/水物質的量之比小于7.7%）時，乙醇的出現會促進磷脂膜膨脹和脂質體形成（見圖4）。圖5顯示了直徑大于50 μm的巨型脂質體產量隨乙醇含量的變化。由于磷脂分子間的疏水締合被明顯破壞，乙醇體積分數大于20%后，脂質體產量下降。當乙醇體積分數達到40%時，磷脂膜幾乎完全分散，形成不規則的簇狀結構。與氯化鈉溶液中牢牢黏附于基底的致密膜結構相反[10]，這些不規則簇狀膜結構與基底間的作用不強，在移動芯片時發生明顯晃動。磷脂分子之所以能夠自組裝成規則單層膜或雙層膜，得益于磷脂分子獨特的雙親性。高含量的乙醇溶液中，磷脂分子不再形成規則膜結構說明磷脂分子的雙親性可能遭到破壞。
圖5
巨型脂質體產量隨乙醇體積分數的變化
Figure5.
The dependence of yield of giant lipid vesicles (GLVs) on the ethanol volume ratio after 4 hours
此外，由于生理條件下通常存在大量離子和非電解質，我們還考察了生理離子強度（約為150 mmol/L的氯化鈉溶液）下，不同乙醇含量對磷脂水合和脂質體形成的影響。圖6顯示了將150 mmol/L的氯化鈉溶液（氯化鈉/水的物質的量之比為0.27%）與乙醇按不同比例混合時的磷脂水合結果。與純水類似，隨著乙醇含量增加，磷脂膜的連續性降低。當乙醇體積分數為40%（乙醇/水的物質的量之比為12.34%）時，膜完全分散，磷脂分子以團狀結構出現。相較于乙醇水溶液中的簇狀結構（見圖4），乙醇/氯化鈉混合水溶液中的團狀結構中磷脂分子包裹得更加致密。這說明乙醇/氯化鈉混合水溶液中，氯化鈉保持著對磷脂膜的特異性影響。同樣地，當乙醇體積分數小于20%時，乙醇促進磷脂膜膨脹和脂質體形成；當乙醇體積分數大于20%時，脂質體的產量迅速降低（見圖5和圖6）。
圖6
磷脂在不同含量的乙醇/氯化鈉混合溶液中的水合結果（氯化鈉濃度為150 mmol/L）
Figure6.
The results of hydration of lipid molecules in mixed solutions with different contents of ethanol (the concentration of NaCl is 150 mmol/L)
氯化鈉在水溶液中解離成Na+和Cl?，其中Na+是典型的kosmotropic離子，會壓縮其水化殼內的水分子氫鍵結構。類似于對水施加一個壓力，Na+水化殼內的水分子密度大于純水[20-23]。同樣地，分子動力學相關研究表明Na+離子能夠與磷脂分子的磷酸基團和羰基結合，橋連多個磷脂分子并增加局部的磷脂分子密度[24-26]。磷脂尾鏈間的空隙隨之減小，尾鏈間的范德華力增強，疏水締合作用增強。這可能是膜熒光強度隨氯化鈉濃度增加而增強的原因。因此，為了定量分析乙醇含量對磷脂膜屬性的影響，本文探討了膜相對熒光強度和膜相對連續度隨乙醇含量的變化，二者分別從分子層面和宏觀層面表征磷脂分子間的疏水締合。
如圖7a所示，膜熒光強度隨乙醇含量增加而持續降低。雖然氯化鈉和乙醇對磷脂水合起相反作用，但是氯化鈉的參與并沒有改變乙醇對膜熒光強度的影響趨勢。如圖7b所示，當乙醇體積分數小于20%時，膜的連續度變化不大。在這一范圍內，乙醇可能不影響膜的規則單分子層或雙分子層結構。當乙醇體積分數大于20%時，膜的連續度迅速降低。此時，規則膜結構減少，大量磷脂分子形成簇狀結構。同樣地，氯化鈉的參與并沒有改變乙醇對膜連續度的影響趨勢。除此之外，對比圖4和圖6，我們發現雖然乙醇會降低膜連續性，但是相比于乙醇溶液（見圖4），乙醇/氯化鈉混合溶液中磷脂分子包裹得更加致密（見圖6）。因此，綜上所述，當乙醇和氯化鈉兩種物質同時出現在磷脂的水合環境中時，兩者對磷脂水合的影響可能起疊加作用。
圖7
膜相對熒光強度和膜相對連續度隨乙醇含量的變化
a. 膜相對熒光強度；b. 膜相對連續度
Figure7. The dependence of membrane fluorescence intensity and membrane continuity on the ethanol volumea. membrane fluorescence intensity; b. membrane continuity
3 討論
堿金屬離子與磷脂分子間的相互作用已被廣泛報道，基于現有研究我們猜想乙醇、Na+和Cl?在磷脂分子附近的分布大致如圖8所示[24-25,27]。Na+可以進入到磷脂頭部構成的網絡結構中，與磷酸基團和羰基中的氧原子結合[24-25,27]。Na+作為kosmotropic離子，其電荷密度比水分子大，可以更加緊密地橋連多個磷脂分子[26]，降低磷脂分子的擴散系數[27]；同時也降低磷脂尾鏈間的距離，增大尾鏈間的范德華力。這可能是氯化鈉誘導磷脂分子形成更加致密膜結構的原因。
圖8
Na+、Cl－和乙醇分子與磷脂分子間相互作用示意圖
Figure8.
Schematic diagram of the interaction of ethanol, Na+ and Cl－ with phosphatidylcholine
對于Cl?，磷脂分子上帶負電荷的磷酸基團和部分負電荷的羰基阻止了Cl?靠近磷脂分子疏水端[24-25]。Perttu等[28]的研究結果也顯示脂質體的滲透性更多取決于陽離子與羰基和磷酸基團間的相互作用。我們的研究也曾發現陰離子對磷脂的宏觀水合無明顯影響（尚未發表）。但是，Sachs等[29-30]的研究顯示大粒徑陰離子與膽堿基團結合使磷脂頭部發生反向，磷脂頭部指向磷脂分子的非極性端。這或許是因為陰離子和膽堿基團均具有較大極化率，兩者在結合時發生相互極化所致。但是，相比于其他鹵素陰離子，Cl?的這種效果并不明顯[30]。因此，總的來說，Na+和Cl?均分布于磷脂分子的極性端，不影響磷脂分子的雙親性。
相比于無機離子Na+和Cl?，有機分子乙醇同時含有疏水乙基和親水羥基。實驗中，我們發現隨著乙醇含量增加，磷脂分子間的疏水締合被不斷瓦解，磷脂水合態從規則膜結構逐漸演變為不規則的簇狀或團狀結構（見圖4和圖6）。基于此，我們猜測乙醇可能改變了磷脂分子的雙親性。如圖8所示，乙基在疏水力驅動下朝向磷脂分子的非極性端，并通過疏水作用和范德華力與磷脂分子的尾鏈結合，降低磷脂分子的疏水性，增加其親水性。除疏水作用外，色散力也常被認為是小分子靠近大分子表面的主要驅動力[31-34]。但是Santos等[35]認為色散力的作用范圍極短，幾乎只對與膠體表面接觸的溶質起作用。Chong等[36]的研究顯示，蛋白質水合程度很低時，醇分子（乙醇和三氟乙醇）只與蛋白質的電荷位點結合；隨著蛋白質水合程度增加，醇分子逐漸與蛋白質的極性位點結合；當蛋白質的水合程度與水溶液中的水合程度相當時，醇分子覆蓋整個蛋白質。這也說明疏水力是驅動醇分子靠近非極性表面的主要作用力。雖然疏水力的來源不清，但實驗和計算機模擬均證實了疏水力的存在[37]。
除疏水乙基，乙醇分子的親水羥基（―OH）也可能影響磷脂水合結果。Hwang等[13]發現相較于水分子，甲醇分子更容易與蛋白質主鏈形成氫鍵。他們認為這是疏水甲基的作用，但是，這與Chong等的實驗結果相反。Chong等[36]的實驗結果顯示即使在低水合程度時，醇分子也能與蛋白質的電荷位點結合。這說明醇羥基與磷脂分子電荷位點間的結合應當是其本身的作用，而非醇烴基的作用。Leekumjorn等[38]的研究結果顯示糖分子能夠優先與磷脂酰膽堿分子的膽堿基團結合；Cacela等[39]的研究結果顯示糖分子也能優先與磷脂酰乙醇胺分子的胺基結合。他們認為這是由于季胺氮的強電負性導致膽堿甲基被酸化所致。因此，類似于糖分子，乙醇羥基也可能與膽堿基團優先結合。只是，同陰離子一樣，乙醇羥基與膽堿的結合可能不影響磷脂分子的宏觀水合情況。由于乙醇的極化率較大，所以醇羥基的作用可能強于Cl?。
因此，綜上分析，溶質與磷脂分子負電荷位點間的親和性可能服從序列：Na+>水>―OH，與磷脂分子正電荷位點間的親和性服從：―OH>Cl?>水。但是，由于靠近磷脂非極性端的極性基團為帶負電的磷酸基團和羰基，所以前者是影響膜宏觀形態的主要因素。氯化鈉主要依靠Na+橋連多個磷脂分子，誘導致密膜結構形成。乙醇主要依靠乙基與磷脂分子非極性端結合，破壞磷脂分子雙親性，進而破壞磷脂分子間的疏水締合。因此，由于主要作用位點的區別，在混合溶液中兩種物質起疊加作用。
4 結論
本文探討了乙醇對磷脂水合和脂質體形成的影響，發現乙醇的影響與Na+剛好相反。Na+的出現可促使磷脂分子形成致密膜結構，抑制脂質體形成；乙醇的出現卻不斷減弱磷脂分子間的疏水締合，在一定濃度范圍內促進脂質體形成。通過考察膜相對熒光強度和膜相對連續度隨乙醇含量的變化，發現混合溶液中氯化鈉和乙醇對磷脂水合起疊加作用。我們分析氯化鈉主要依靠Na+緊密橋連多個磷脂分子，降低磷脂分子間距，增加磷脂分子間的疏水締合；乙醇分子主要依靠乙基與磷脂分子的非極性端結合，改變磷脂分子的雙親性，破壞磷脂分子間的疏水締合。Na+和乙醇分子在磷脂分子上的結合位點不同，可能是混合溶液中兩者對磷脂水合起疊加作用的原因。本研究結果對生物膜形成、脂質體制備等相關研究及應用具有一定參考價值。除此之外，不同氯化鈉濃度時乙醇含量對磷脂水合和脂質體形成的影響以及乙醇羥基的影響還需進一步探討。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：蔣麗華負責實驗操作、論文寫作；王瓊負責實驗設計、論文修改、基金資助；胡寧負責數據收集、基金資助；楊軍負責數據分析、基金資助。
引言
生物膜在生命體中（除病毒外）廣泛存在，是生命體中至關重要的一種功能結構，與生命活動中能量轉換、物質運送、信息識別與傳遞等重要功能息息相關[1-2]。生物膜的基本形態都是雙分子層片層結構，組成成分主要包括脂質、蛋白質及少量與之相結合的糖類，其中大部分脂質成分為磷脂。然而，生物膜的高度復雜性和動態性使直接針對自然生物膜的相關研究變得極為困難。因此，基于磷脂自組裝形成的人工生物膜結構，包括二維平面磷脂膜和三維脂質體，常被用作模型來研究生物分子在膜上的行為以及它們對膜性質的影響等[3]。由于基于二維平面膜的研究不可避免地會受到來自基底的影響[3]，巨型脂質體成為前景最好、應用最廣的一種選擇[1]。例如，Garten等[2]將β-酪蛋白封裝到巨型單層脂質體（giant unilamellar vesicle，GUV）上，構建了一個穩定、高阻抗的GUV系統。基于該系統，可以利用膜片鉗技術在生理張力下對特定離子通道和轉運體進行電生理研究。這些研究對認識各種生命活動具有重要意義[4]。
脂質體制備是脂質體應用的重要前提。在脂質體相關研究中，往往采用水合法（又稱膨脹法）制備無油脂質體（見圖1）。它主要包括以下三個步驟：① 將磷脂溶解于有機溶劑；② 待有機溶劑揮發后，在固體基底上形成一層干燥磷脂膜；③ 將干燥磷脂暴露于水環境中，磷脂分子自組裝形成規則膜結構。最常用的電形成法便是水合法的一種，它是在溫和水合法基礎上通過施加外部電場來加快脂質體形成的一種方法[5]。大量研究表明當利用水合法制備脂質體時，脂質體的形成效果容易受水環境影響。例如，當水溶液中有離子出現時，脂質體制備（特別是巨型脂質體制備）受到抑制[6-7]。高濃度蔗糖溶液也被發現會抑制脂質體形成[8]。
圖1
水合法（膨脹法）制備脂質體示意圖
Figure1.
The schematic diagram of liposome preparation when using hydration method (or swelling method)
磷脂水合是脂質體形成的必經過程，包括水溶液中磷脂分子重排、磷脂膜膨脹與融合。為了有效制備鹽溶液中的巨型脂質體，我們[9]曾考察了氯化鈉對磷脂水合的過程和結果的影響。結果表明，隨著水溶液中離子出現和離子濃度升高，水合磷脂膜變得越來越穩定。針對這一實驗結果，我們分析氯化鈉之所以抑制巨型脂質體形成，可能是因為增強了磷脂分子所受的疏水作用。強大的疏水排斥下，磷脂膜被牢牢固定于基底。基于此，我們[10]對芯片進行氧等離子處理，使基底變得親水。這一操作促使磷脂膜更易膨脹和脫落，進而促進巨型脂質體形成。
除了離子外，醇分子也常出現在生物膜環境中，并與磷脂分子產生特定相互作用，從而影響生物膜的形成、結構和功能。結構簡單的小型醇分子，如甲醇和乙醇常被用作研究模型[11]。例如，Ma等[12]研究了甲醇與烷基面間的相互作用，發現甲醇會降低兩個烷基面間的疏水黏附。他們猜測甲醇可能破壞了膜附近的水結構，還可能破壞烴分子間的疏水締合。Hwang等[13]分析了甲醇對多肽（BBA5）結構的影響，發現甲醇可以增強肽鏈之間的相互作用，促進二級結構形成。Manca等[14]發現醇分子與磷脂分子結合，會引起雙層膜結構的顯著變化。低濃度時，醇分子參與磷脂自組裝，磷脂分子形成交叉膜結構；高濃度時，醇分子的出現誘導磷脂分子形成非雙層結構。在醇分子與磷脂分子間的具體相互作用上，Feller等[15]認為醇烴基朝向磷脂分子的非極性端，醇羥基與磷酸基團形成氫鍵[16]。除此之外，研究還表明醇分子讓磷脂烴鏈變得無序，降低磷脂膜的相變溫度及雙分子層厚度[17-18]。醇分子對相變溫度的影響與醇烴鏈的長度相關[14]。
相對于甲醇，乙醇作為一種常見的食品成分和有機溶劑，出現在生物膜環境中的機會更多。因此，本文利用微芯片脂質膜研究方法[9]，探討了乙醇對磷脂水合和脂質體形成的影響。除此之外，無論是體外研究還是體內研究，這些分子或離子往往不單獨存在，而是與其他溶質共存于液體環境中[19]。因此，本文還探討了乙醇與氯化鈉共存時對磷脂水合和脂質體形成的影響。由于醇類和磷脂等小分子物質在不同聚集狀態和復雜微環境下的相互作用很難用傳統示蹤及定量分析方法進行檢測分析，因此本文采用顯微熒光技術，通過磷脂水合過程中膜結構的動態變化，間接反映環境分子與磷脂的相互作用及其對磷脂水合和脂質體形成的影響。除此之外，本文半定量地計算了乙醇對膜相對熒光強度和相對連續度的影響，希望從中獲取更多信息。
1 實驗部分
1.1 儀器及試劑
FA 2004B電子天平（上海佑科），ISC10激光打標機（武漢華工激光工程），PDC-GC-M等離子清洗儀（成都維克光譜），BX53生物熒光顯微鏡（日本奧林巴斯），DZF-6050真空干燥箱（上海佑科）。
從大豆中粗提取的磷脂酰膽堿（L-α-phosphatidylchoine，PC，14%～23%）以及熒光探針（DiI，1,1'-dihexadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbo-cyanie perchlorate，ex/em：549/564 nm，Molecular Probes）均購自Sigma-Aldrich（美國）；玻璃基片購自珠海凱威（中國）；聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）購自Dow Corning（美國）；聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）購自怡康（中國）；氯化鈉、乙醚、無水乙醇購自東方化玻（中國）。
1.2 芯片及裝置
實驗中采用的微腔室芯片結構由上、下兩層玻璃與中間的PDMS墊片構成（見圖2a）。芯片上有六個半徑為10 mm、高度為1 mm的圓柱形腔室。將頂部玻片封裝于腔室上方后，腔室兩側自然留出狹長的進樣和出樣通道（寬度為2 mm），兩側通道可始終與大氣保持連通。進出樣通道與反應室之間以半徑為2 mm、轉角角度為65o的弧形通道過渡。相比于直角設計，這種結構可以避免進樣時產生氣泡，降低流體運動對膜的擾動。
圖2
實驗設置
a. 包含6個微腔室的實驗芯片；b. 實驗流程示意圖
Figure2. The experimental setupa. the chip used in this study which consists of 6 chambers; b. the experimental processes
芯片設計與加工詳見參考文獻[9]。芯片加工時，先利用激光打標機在PMMA基片上燒蝕芯片模具。將PDMS與固化劑按10∶1的質量比混合并充分攪拌，然后置于真空箱中減壓完全去除氣泡。隨后，將混合好的PDMS澆注到芯片模具上，靜置1 h，再于70 oC下固化2 h。在固化的同時，將1片10 cm × 10 cm的玻璃基片和6片2 cm × 2.5 cm的玻璃蓋片分別用無水乙醇與三蒸水清洗干凈，置于烘箱中完全烘干。待PDMS固化后，將PDMS膠塊從模具上剝離并與玻璃基片一同置于等離子清洗儀中，利用氧等離子清洗30 s。取出PDMS膠塊和玻璃基片通過熱板層壓法鍵合，形成含有6個反應腔室的芯片。
1.3 實驗過程
磷脂水合的實驗過程如圖2b所示，主要包括成膜、封閉、加樣和水合四個步驟。具體地，先將40 mg的PC溶解于10 mL乙醚中，再加入30 μL溶有熒光染料的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液。磷脂與熒光染料的質量比為99.5∶0.5。將40 μL配制好的磷脂溶液滴加到腔室底部，為了避免乙醚揮發時氣流的影響，芯片置于一個較小盒子內，使成膜過程在幾乎密閉的小空間內進行。乙醚揮發后，在基底形成一層干燥的磷脂膜。干燥磷脂膜呈“咖啡環”形態，四周為較厚的環狀膜，中間為相對均勻的平面膜。將成膜后的芯片置于真空干燥箱中室溫過夜，完全去除剩余有機溶劑。水合實驗前，將六塊玻璃蓋片分別固定在六個腔室頂部，形成完整的實驗芯片。然后，將芯片置于熒光顯微鏡的載物臺上，從一側進樣口緩慢加入1 mL乙醇水溶液或乙醇鹽溶液，觀察磷脂水合情況和脂質體形成情況。
1.4 結果處理
充分水合4 h后，快速記錄水合結果的熒光顯微圖像，并利用MATLAB軟件（MathWorks，美國）針對膜相對熒光強度和膜相對連續度兩個參數進行定量分析。具體地，選取同一芯片上相同條件下的6組圖片進行處理，計算膜的相對熒光強度和相對連續度。利用相同方法，多次重復實驗獲得多組數據，進行繪圖分析。由于干燥磷脂膜具有明顯的“咖啡環”效應，每組圖片均包含多張來自腔室中心區域和邊緣區域的圖片。熒光強度和連續度均利用圖片的灰度值計算得到，灰度值閾值的選擇如圖3所示，以覆蓋所有紅色區域為準。其中，熒光強度為f = ∑g/sp，式中，g為大于閾值的灰度值，sp為灰度值大于閾值的像素點之和。熒光強度（f）為一組圖片的平均值。對同一芯片的6組圖片處理完后得到6個平均灰度值。然后，分別除以純水的熒光強度進行歸一化處理，得到相對熒光強度。連續度c = sp/s，其中s為圖片的總像素點之和。同樣地，連續度也是一組圖片的平均值。對同一芯片的6組圖片處理完后得到的6個平均灰度值，分別除以純水的對應值得到相對連續度。
圖3
閾值設定
a. 乙醇水溶液中磷脂水合結果的熒光圖片，圖中標尺為100 μm；b. 根據圖a中白線上的灰度值分布選取合適閾值
Figure3. Setting of the threshold valuea. the experimental fluorescence image, the scale bar is 100 μm; b. setting of the threshold value according to the gray values along the white line in the figure a
2 結果
如圖4所示，隨著氯化鈉濃度增加，磷脂膜變得越來越穩定且牢牢黏附于基底，脂質體形成受到嚴重影響。除此之外，磷脂膜的熒光強度增加，這說明膜中磷脂分子可能包裹得更加緊密。相比而言，單就對磷脂水合的影響，乙醇顯示出相反結果。我們發現隨著乙醇含量增加，水合磷脂膜變得越來越粗糙（見圖4）。為了后續能夠較好地對比乙醇和氯化鈉的影響，本文水合結果圖中的溶質含量均以氯化鈉/水（氯化鈉組）或乙醇/水（乙醇組和乙醇/氯化鈉混合組）的物質的量之比表示，括號內分別為氯化鈉濃度或乙醇體積分數，圖中標尺均為100 μm。
圖4
磷脂在不同含量的氯化鈉溶液和乙醇水溶液中的水合結果
Figure4.
The results of hydration of lipid molecules in aqueous solutions with different contents of sodium chloride and ethanol
當乙醇體積分數小于20%（乙醇/水物質的量之比小于7.7%）時，乙醇的出現會促進磷脂膜膨脹和脂質體形成（見圖4）。圖5顯示了直徑大于50 μm的巨型脂質體產量隨乙醇含量的變化。由于磷脂分子間的疏水締合被明顯破壞，乙醇體積分數大于20%后，脂質體產量下降。當乙醇體積分數達到40%時，磷脂膜幾乎完全分散，形成不規則的簇狀結構。與氯化鈉溶液中牢牢黏附于基底的致密膜結構相反[10]，這些不規則簇狀膜結構與基底間的作用不強，在移動芯片時發生明顯晃動。磷脂分子之所以能夠自組裝成規則單層膜或雙層膜，得益于磷脂分子獨特的雙親性。高含量的乙醇溶液中，磷脂分子不再形成規則膜結構說明磷脂分子的雙親性可能遭到破壞。
圖5
巨型脂質體產量隨乙醇體積分數的變化
Figure5.
The dependence of yield of giant lipid vesicles (GLVs) on the ethanol volume ratio after 4 hours
此外，由于生理條件下通常存在大量離子和非電解質，我們還考察了生理離子強度（約為150 mmol/L的氯化鈉溶液）下，不同乙醇含量對磷脂水合和脂質體形成的影響。圖6顯示了將150 mmol/L的氯化鈉溶液（氯化鈉/水的物質的量之比為0.27%）與乙醇按不同比例混合時的磷脂水合結果。與純水類似，隨著乙醇含量增加，磷脂膜的連續性降低。當乙醇體積分數為40%（乙醇/水的物質的量之比為12.34%）時，膜完全分散，磷脂分子以團狀結構出現。相較于乙醇水溶液中的簇狀結構（見圖4），乙醇/氯化鈉混合水溶液中的團狀結構中磷脂分子包裹得更加致密。這說明乙醇/氯化鈉混合水溶液中，氯化鈉保持著對磷脂膜的特異性影響。同樣地，當乙醇體積分數小于20%時，乙醇促進磷脂膜膨脹和脂質體形成；當乙醇體積分數大于20%時，脂質體的產量迅速降低（見圖5和圖6）。
圖6
磷脂在不同含量的乙醇/氯化鈉混合溶液中的水合結果（氯化鈉濃度為150 mmol/L）
Figure6.
The results of hydration of lipid molecules in mixed solutions with different contents of ethanol (the concentration of NaCl is 150 mmol/L)
氯化鈉在水溶液中解離成Na+和Cl?，其中Na+是典型的kosmotropic離子，會壓縮其水化殼內的水分子氫鍵結構。類似于對水施加一個壓力，Na+水化殼內的水分子密度大于純水[20-23]。同樣地，分子動力學相關研究表明Na+離子能夠與磷脂分子的磷酸基團和羰基結合，橋連多個磷脂分子并增加局部的磷脂分子密度[24-26]。磷脂尾鏈間的空隙隨之減小，尾鏈間的范德華力增強，疏水締合作用增強。這可能是膜熒光強度隨氯化鈉濃度增加而增強的原因。因此，為了定量分析乙醇含量對磷脂膜屬性的影響，本文探討了膜相對熒光強度和膜相對連續度隨乙醇含量的變化，二者分別從分子層面和宏觀層面表征磷脂分子間的疏水締合。
如圖7a所示，膜熒光強度隨乙醇含量增加而持續降低。雖然氯化鈉和乙醇對磷脂水合起相反作用，但是氯化鈉的參與并沒有改變乙醇對膜熒光強度的影響趨勢。如圖7b所示，當乙醇體積分數小于20%時，膜的連續度變化不大。在這一范圍內，乙醇可能不影響膜的規則單分子層或雙分子層結構。當乙醇體積分數大于20%時，膜的連續度迅速降低。此時，規則膜結構減少，大量磷脂分子形成簇狀結構。同樣地，氯化鈉的參與并沒有改變乙醇對膜連續度的影響趨勢。除此之外，對比圖4和圖6，我們發現雖然乙醇會降低膜連續性，但是相比于乙醇溶液（見圖4），乙醇/氯化鈉混合溶液中磷脂分子包裹得更加致密（見圖6）。因此，綜上所述，當乙醇和氯化鈉兩種物質同時出現在磷脂的水合環境中時，兩者對磷脂水合的影響可能起疊加作用。
圖7
膜相對熒光強度和膜相對連續度隨乙醇含量的變化
a. 膜相對熒光強度；b. 膜相對連續度
Figure7. The dependence of membrane fluorescence intensity and membrane continuity on the ethanol volumea. membrane fluorescence intensity; b. membrane continuity
3 討論
堿金屬離子與磷脂分子間的相互作用已被廣泛報道，基于現有研究我們猜想乙醇、Na+和Cl?在磷脂分子附近的分布大致如圖8所示[24-25,27]。Na+可以進入到磷脂頭部構成的網絡結構中，與磷酸基團和羰基中的氧原子結合[24-25,27]。Na+作為kosmotropic離子，其電荷密度比水分子大，可以更加緊密地橋連多個磷脂分子[26]，降低磷脂分子的擴散系數[27]；同時也降低磷脂尾鏈間的距離，增大尾鏈間的范德華力。這可能是氯化鈉誘導磷脂分子形成更加致密膜結構的原因。
圖8
Na+、Cl－和乙醇分子與磷脂分子間相互作用示意圖
Figure8.
Schematic diagram of the interaction of ethanol, Na+ and Cl－ with phosphatidylcholine
對于Cl?，磷脂分子上帶負電荷的磷酸基團和部分負電荷的羰基阻止了Cl?靠近磷脂分子疏水端[24-25]。Perttu等[28]的研究結果也顯示脂質體的滲透性更多取決于陽離子與羰基和磷酸基團間的相互作用。我們的研究也曾發現陰離子對磷脂的宏觀水合無明顯影響（尚未發表）。但是，Sachs等[29-30]的研究顯示大粒徑陰離子與膽堿基團結合使磷脂頭部發生反向，磷脂頭部指向磷脂分子的非極性端。這或許是因為陰離子和膽堿基團均具有較大極化率，兩者在結合時發生相互極化所致。但是，相比于其他鹵素陰離子，Cl?的這種效果并不明顯[30]。因此，總的來說，Na+和Cl?均分布于磷脂分子的極性端，不影響磷脂分子的雙親性。
相比于無機離子Na+和Cl?，有機分子乙醇同時含有疏水乙基和親水羥基。實驗中，我們發現隨著乙醇含量增加，磷脂分子間的疏水締合被不斷瓦解，磷脂水合態從規則膜結構逐漸演變為不規則的簇狀或團狀結構（見圖4和圖6）。基于此，我們猜測乙醇可能改變了磷脂分子的雙親性。如圖8所示，乙基在疏水力驅動下朝向磷脂分子的非極性端，并通過疏水作用和范德華力與磷脂分子的尾鏈結合，降低磷脂分子的疏水性，增加其親水性。除疏水作用外，色散力也常被認為是小分子靠近大分子表面的主要驅動力[31-34]。但是Santos等[35]認為色散力的作用范圍極短，幾乎只對與膠體表面接觸的溶質起作用。Chong等[36]的研究顯示，蛋白質水合程度很低時，醇分子（乙醇和三氟乙醇）只與蛋白質的電荷位點結合；隨著蛋白質水合程度增加，醇分子逐漸與蛋白質的極性位點結合；當蛋白質的水合程度與水溶液中的水合程度相當時，醇分子覆蓋整個蛋白質。這也說明疏水力是驅動醇分子靠近非極性表面的主要作用力。雖然疏水力的來源不清，但實驗和計算機模擬均證實了疏水力的存在[37]。
除疏水乙基，乙醇分子的親水羥基（―OH）也可能影響磷脂水合結果。Hwang等[13]發現相較于水分子，甲醇分子更容易與蛋白質主鏈形成氫鍵。他們認為這是疏水甲基的作用，但是，這與Chong等的實驗結果相反。Chong等[36]的實驗結果顯示即使在低水合程度時，醇分子也能與蛋白質的電荷位點結合。這說明醇羥基與磷脂分子電荷位點間的結合應當是其本身的作用，而非醇烴基的作用。Leekumjorn等[38]的研究結果顯示糖分子能夠優先與磷脂酰膽堿分子的膽堿基團結合；Cacela等[39]的研究結果顯示糖分子也能優先與磷脂酰乙醇胺分子的胺基結合。他們認為這是由于季胺氮的強電負性導致膽堿甲基被酸化所致。因此，類似于糖分子，乙醇羥基也可能與膽堿基團優先結合。只是，同陰離子一樣，乙醇羥基與膽堿的結合可能不影響磷脂分子的宏觀水合情況。由于乙醇的極化率較大，所以醇羥基的作用可能強于Cl?。
因此，綜上分析，溶質與磷脂分子負電荷位點間的親和性可能服從序列：Na+>水>―OH，與磷脂分子正電荷位點間的親和性服從：―OH>Cl?>水。但是，由于靠近磷脂非極性端的極性基團為帶負電的磷酸基團和羰基，所以前者是影響膜宏觀形態的主要因素。氯化鈉主要依靠Na+橋連多個磷脂分子，誘導致密膜結構形成。乙醇主要依靠乙基與磷脂分子非極性端結合，破壞磷脂分子雙親性，進而破壞磷脂分子間的疏水締合。因此，由于主要作用位點的區別，在混合溶液中兩種物質起疊加作用。
4 結論
本文探討了乙醇對磷脂水合和脂質體形成的影響，發現乙醇的影響與Na+剛好相反。Na+的出現可促使磷脂分子形成致密膜結構，抑制脂質體形成；乙醇的出現卻不斷減弱磷脂分子間的疏水締合，在一定濃度范圍內促進脂質體形成。通過考察膜相對熒光強度和膜相對連續度隨乙醇含量的變化，發現混合溶液中氯化鈉和乙醇對磷脂水合起疊加作用。我們分析氯化鈉主要依靠Na+緊密橋連多個磷脂分子，降低磷脂分子間距，增加磷脂分子間的疏水締合；乙醇分子主要依靠乙基與磷脂分子的非極性端結合，改變磷脂分子的雙親性，破壞磷脂分子間的疏水締合。Na+和乙醇分子在磷脂分子上的結合位點不同，可能是混合溶液中兩者對磷脂水合起疊加作用的原因。本研究結果對生物膜形成、脂質體制備等相關研究及應用具有一定參考價值。除此之外，不同氯化鈉濃度時乙醇含量對磷脂水合和脂質體形成的影響以及乙醇羥基的影響還需進一步探討。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：蔣麗華負責實驗操作、論文寫作；王瓊負責實驗設計、論文修改、基金資助；胡寧負責數據收集、基金資助；楊軍負責數據分析、基金資助。
