StarD4具有促三陰乳腺癌（TNBC）增殖轉移功能，但臨床價值和分子機制未明。本文發現StarD4在TNBC癌組織高表達，且高表達患者生存預后不良。通過TNBC細胞模型的轉錄組檢測和分析發現：StarD4敲減表達引發膽固醇通路基因的整體下調和TNBC腫瘤通路的顯著富集。進一步分析驗證了StarD4可能通過膽固醇通路交叉調控細胞膜受體ITGA5的蛋白穩定性，發揮促癌的分子機制，為臨床TNBC的診療應用提供了指導。
引用本文： 黃騰, 單蓉, 張敏, 李玲, 黃雋, 劉保安, 周衛兵. 脂質轉運蛋白StarD4促乳腺癌細胞增殖的作用及其機制. 生物醫學工程學雜志, 2021, 38(6): 1118-1125. doi: 10.7507/1001-5515.202105008 復制
引言
乳腺癌是女性首發惡性腫瘤[1]，每年國內乳腺癌新增人數近30萬，年死亡人數近7萬，是威脅婦女健康的主要原因。其中，三陰乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌細胞雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和表皮生長因子受體（HER2）均表達陰性的乳腺癌亞型[2-3]。TNBC年輕女性易發，異質性強，臨床以放化療為主要治療方式，但預后差，致死率高[2-3]。為解決該臨床問題，急需開發TNBC患者新的關鍵靶點基因，研究其詳細機制[4-5]。
脂質膽固醇代謝相關途徑的異常調節與腫瘤發生和人類癌癥的發育有關[6-10]。膽固醇作為細胞膜和血漿中的關鍵物質，其代謝穩態在腫瘤免疫細胞膜的受體調控[11-12]、腫瘤干細胞特性[13]和腫瘤臨床進展[14-15]中具有重要的作用。TNBC臨床樣本的轉錄組測序發現，免疫抑制的患者膽固醇合成途徑顯著上調[15]。而TNBC臨床樣本的人源腫瘤異種移植（patient derived tumor xenograft，PDX）模型的轉錄組測序發現，膽固醇合成途徑是維持乳腺癌腫瘤干性的關鍵[13]。因此，膽固醇合成途徑對TNBC腫瘤干細胞特性的維持具有重要作用。膽固醇代謝穩態具有調控細胞膜受體含量的功能[11-12]，我們推測在TNBC的干細胞特性維持過程中，膽固醇合成途徑可能通過調控TNBC的細胞膜受體蛋白含量的方式，發揮促進TNBC進展的功能。
StarD4是一個包含START ［steroidogenic acute regulatory protein (StAR)-related lipid transfer］結構域的蛋白[16]。我們前期針對StarD4基因在TNBC患者中的臨床相關性和基因功能進行研究，結果發現：① StarD4基因高表達與TNBC患者的生存預后不良顯著相關；② TNBC體外細胞模型中敲減StarD4基因表達，可顯著抑制腫瘤細胞增殖和阻滯腫瘤細胞周期，同時增加腫瘤細胞的凋亡水平；③ TNBC體內皮下裸鼠成瘤模型中敲減StarD4基因表達，可顯著抑制裸鼠皮下成瘤的瘤體大小[17]，這些實驗結果證實StarD4可能是TNBC臨床促癌靶點。但StarD4促進TNBC進展的分子機制仍不清楚。
StarD4蛋白位于細胞核和細胞質中，文獻報道在骨肉瘤的研究中發現StarD4基因表達受脂質調控蛋白SREBP2調控，參與細胞膜和內吞循環小體（endocytic recycling compartment，ERC）之間的膽固醇雙向轉運[18]以及膽固醇穩態調控[19]。StarD4蛋白在乳腺癌細胞中是否通過調控膽固醇代謝穩態促進TNBC進展，需要進一步論證。我們前期研究發現，在TNBC細胞模型中敲減StarD4基因表達能夠抑制乳腺癌干細胞特性基因PAK2和乳腺癌染色質重編程基因H3.3的表達[17]。這些結果表明StarD4與TNBC的干細胞特性相關，而膽固醇代謝穩態亦與TNBC的干細胞特性相關[13]，因此StarD4可能是通過調控TNBC的膽固醇代謝來影響腫瘤干細胞特性從而促進TNBC進展。
文獻報道ITGA5蛋白是TNBC腫瘤干細胞特性的關鍵細胞膜蛋白[20-21]，因此，我們推測TNBC的膽固醇合成途徑可能是通過調控ITGA5蛋白含量的變化，發揮調控TNBC干細胞特性的功能，促進TNBC進展。基于以上分析，本研究采用TNBC細胞系StarD4敲減的細胞模型，進行轉錄組檢測、生物信息學數據挖掘，以及細胞模型的驗證，探討StarD4促進TNBC進展的分子機制，為StarD4在TNBC臨床治療的靶點開發提供重要基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
MDA-MB-231細胞系：由中南大學分子醫學研究中心實驗室留存。
TNBC臨床樣本：收集中南大學湘雅醫院乳腺外科術后病理報告診斷為TNBC的樣本共11例，已排除有其他惡性腫瘤病史，病理報告詳細記錄了患者組織的免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）染色為ER、PR、HER2陰性，分別取癌組織和癌旁組織樣本（癌旁組織定義為離腫瘤大于5 cm的正常乳腺組織）進行入組檢測。這項研究獲得湘雅醫院倫理委員會的批準。
1.2 方法
1.2.1 慢病毒感染TNBC細胞系的增殖檢測
StarD4敲減靶點序列CTATACTGTGGGCTATAAA和對照序列TTCTCCGAACGTGTCACGT，分別構建到shRNA敲減慢病毒載體GV115（上海吉凱公司），并包裝成慢病毒。慢病毒以MOI = 10進行TNBC細胞系MDA-MB-231細胞的感染，感染過夜后換培養基培養3天，使用熒光顯微鏡在明場視野和綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）熒光視野下，觀察慢病毒感染效率達到80%以上，細胞狀態正常。收集感染細胞，一部分進行Real-time PCR檢測，一部分調整起始細胞量到4 000個細胞/孔，連續培養3~5天，熒光顯微鏡下拍照和計數細胞增殖數目變化。
1.2.2 Real-time PCR和Western blot檢測
取6孔板80%細胞密度的細胞樣本或新鮮TNBC凍存組織100 mg加液氮重復研磨，加入1 mL Trizol裂解液，提取總RNA，檢測RNA濃度及純度，取2 μg RNA，按照Promega M-MLV試劑盒進行反轉錄生成cDNA。StarD4（forward primer：GATGCGTTACACTACTGCTGG；reverse primer：AAAAGACTCTGGTTTGGGTTG）、ITGA5（forward primer：GGCTTCAACTTAGACGCGGAG；reverse primer：TGGCTGGTATTAGCCTTGGGT）和內參基因GAPDH（forward primer：TGACTTCAACAGCGACACCCA；reverse primer：CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA）引物，由上海生物工程公司合成提供。
Real-time PCR檢測：采用TransStart Tip Green qPCR SuperMix試劑盒（北京全式金公司）對StarD4、ITGA5和內參基因GAPDH mRNA水平進行Real-time PCR檢測，每個樣本進行3 次重復，使用2?ΔΔCt計算相對表達量。
Western blot檢測：收集細胞樣本，冰上超聲破碎細胞，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，電轉PVDF膜，使用ITGA5抗體（兔單克隆抗體，Abcam批號ab150361，100 μL，適用于Western blot等）進行4 ℃過夜雜交，替換二抗IgG-HRP（羊抗兔單抗，Santa Cruz批號sc-2004，200 μg，適用于Western blot等）孵育1 h后，進行ECL化學發光壓片X曝光檢測。內參用GAPDH抗體（鼠單抗，Abcam批號ab8245，100 μg，適用于Western blot等）和對應二抗IgG-HRP（羊抗鼠單抗，Santa Cruz批號sc-2005，200 μg，適用于Western blot等）進行Western blot檢測。Western blot顯影結果進行灰度分析，比較相對差異。
1.2.3 全轉錄組芯片檢測和數據分析
準備StarD4敲減的細胞樣本和對照細胞樣本，各重復3次，委托上海伯豪公司進行轉錄組芯片（Affymetrix公司，PrimeView）檢測。總體流程：抽提RNA，取5 μL共100 ng總RNA，使用GeneChip 3’ IVT PLUS Kit進行cRNA擴增和Biotin標記，然后和Affymetrix公司的人基因表達譜芯片PrimeView進行孵育雜交，最后進行雜交信號讀取。芯片數據進行原始數據質量評估、數據過濾處理和顯著性差異分析。差異基因進行GeneOntology（GO）和Ingenuity Pathway Analysis（IPA）生物信息學分析。
GO分析：利用GO數據庫（http://geneontology.org/）進行生物學過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組分（cellular Component，CC）的聚類分析。
IPA分析：利用QIAGEN公司的IPA數據庫和軟件進行經典信號通路分析、上游調控分析、疾病功能分析和調控效應的顯著性分析。
1.2.4 TCGA數據庫預后相關性分析
利用TCGA在線分析工具UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）[22]，選用乳腺癌的TNBC人群資料進行TNBC腫瘤組織和正常組織的StarD4表達水平比較分析，以及TNBC患者StarD4高低表達的生存期比較分析。
1.2.5 統計學處理
應用SPSS 19.0 統計學軟件進行數據分析。各組數據之間比較，計量資料采用t 檢驗；相關性檢驗采用Spearman相關性分析；生存分析采用Kaplan-Meier生存分析，并采用Log-rank法進行檢驗。檢驗水準為0.05。
2 結果
2.1 高表達StarD4的TNBC患者預后顯著差于低表達患者
通過對TCGA數據庫116例TNBC的癌組織樣本表達水平和114例正常或癌旁對照樣本進行比較分析，結果發現：TNBC癌組織中的StarD4表達水平顯著高于正常組織樣本，如圖1所示。進一步對TCGA數據庫的116例TNBC患者進行StarD4高低表達分組的預后相關性分析，結果顯示：高表達StarD4的TNBC患者的生存期顯著差于低表達StarD4的TNBC患者（P < 0.01）。在湘雅醫院收集的11例TNBC患者的癌組織和癌旁組織樣本進行qPCR檢測，結果發現相對于癌旁組織，在癌組織表達水平大于1.5倍差異的患者有8例（P4~P11病例），占比72.7%，如圖1所示。
圖1
TNBC患者中StarD4基因表達水平的臨床相關性
a-b. TCGA數據庫中TNBC的表達水平和不同表達水平的生存曲線；c. 湘雅醫院TNBC患者StarD4基因的相對表達水平
Figure1. The clinical correlation of the expression level of StarD4 in TNBC patientsa-b. the relative expression level of StarD4 from TNBC patients and survival curves of them in TCGA database; c. the relative expression level of StarD4 from TNBC patients in Xiangya Hospital
2.2 敲減StarD4表達顯著抑制TNBC細胞增殖
將StarD4 敲減慢病毒感染MDA-MB-231，感染3天后，在明場和熒光顯微鏡下觀察到細胞感染效率達80%，使用Real-time PCR檢測StarD4敲減效率，結果顯示：相比對照組細胞，實驗組細胞的StarD4敲減效率達到90%，如圖2所示。
圖2
慢病毒介導的StarD4敲減對TNBC細胞系MDA-MB-231增殖的影響
a-b. StarD4敲減表達細胞系模型構建；c-d. StarD4敲減表達細胞系的細胞增殖數目差異
Figure2. Inhibiting effect on MDA-MB-231 cells with knocked-down StarD4 expression level by using lentivirus systema-b. MDA-MB-231 cells was used for cell model for StarD4 project; c-d. the cell growth with the knocked-down expression of StarD4 was significantly repressed
將StarD4敲減慢病毒感染MDA-MB-231的細胞組和未感染的對照組，以相同起始量細胞分別鋪板24孔板，密度約50%，連續培養5天后，進行細胞增殖生長量計數。結果顯示：相比于對照組細胞，StarD4敲減組細胞的細胞增殖數量降低了約40%，如圖2所示。
2.3 基于StarD4敲減表達TNBC細胞系的轉錄組學數據進行機制分析
利用MDA-MB-231細胞系StarD4敲減表達組和對照組，進行全轉錄組表達譜芯片檢測，獲得差異倍數（Fold Change，FC）>1.3的差異基因共772個，上調基因350個，下調基因422個，如圖3所示。利用生物信息學IPA數據庫，針對StarD4調控的差異基因，進行疾病和功能的脂質代謝功能富集分析，結果發現：脂質代謝功能的膽固醇合成和代謝調控功能顯著富集，其中膽固醇濃度功能顯著被抑制（Z = ?2.97），如圖3所示。進一步針對StarD4引發的差異基因，進行上游調控子分析，結果發現了膽固醇合成途徑調控的關鍵基因SREBP2，且它們在StarD4敲減組中顯著被抑制，如圖3所示。對IPA經典信號通路之膽固醇合成通路的催化酶基因進行分析，結果發現：膽固醇合成通路的11個催化酶基因的表達被顯著抑制，其中包括進化保守且參與內吞endosome的ERC循環調控基因SC4MOL，如圖3所示，SC4MOL具有調控細胞膜蛋白穩定性的作用。
圖3
StarD4敲減表達MDA-MB-231細胞系轉錄組差異基因膽固醇代謝穩態分析
a-b. 轉錄組差異基因火山圖和熱圖；c-d. 轉錄組差異基因IPA脂質代謝功能分析和上游調控子分析（“
a-b. volcano map and heat map of differential genes from transcriptome between test and control; c-d. IPA analyzed metabolism of lipid and upstream regulator (“
進一步利用差異基因，進行生物信息學GO分析，結果發現：差異基因生物學過程富集于脂質和膽固醇合成；細胞組分富集細胞黏附連接和內質網ER；分子功能富集細胞膜Integrin受體結合蛋白等，如圖4所示。對差異基因利用IPA生物信息學數據庫進行經典信號通路分析，結果發現：StarD4引發的差異基因主要富集于膽固醇信號通路和腫瘤增殖相關的信號通路，如圖4所示。對腫瘤分子機制的相關基因進行分析，結果發現了Integrin家族的細胞膜差異蛋白ITGA5，如圖4所示。最后，通過Real-time PCR和Western blot驗證ITGA5的表達差異，結果發現：相比于對照組，StarD4敲減組細胞ITGA5的mRNA水平和蛋白水平都顯著下調，如圖4所示。
圖4
StarD4敲減MDA-MB-231細胞系轉錄組差異基因生物信息學分析和數據驗證
a-b. GO分析和IPA信號通路分析；c. IPA腫瘤機制分子熱圖；d. ITGA5在StarD4敲減組和對照組中的Real-time PCR和Western blot檢測
Figure4. Bioinformatics analysis for transcriptome data of StarD4-knocked down TNBC cell line MDA-MB-231 to verify molecular mechanism of cancera-b. GO analysis and IPA analysis of pathway; c. heat map of cancer mechanism molecular on IPA database; d. detection of expression level of ITGA5 between test and control groups using real-time PCR and Western blot
3 討論
TNBC治療手段有限、預后差、致死率高，是乳腺癌臨床面臨的關鍵問題。臨床發現鑒定TNBC的關鍵靶點、探究其詳細的分子機制是TNBC轉化醫學研究的關鍵。在本研究中，對TCGA數據庫的TNBC臨床樣本進行StarD4表達水平的臨床相關性分析，結果發現：StarD4在TNBC患者的癌組織顯著高表達，且StarD4高表達的TNBC患者生存期顯著低于StarD4低表達患者（如圖1所示）。這些臨床數據結果提示，StarD4是TNBC的重要促癌基因。
前期研究中，我們選擇兩株TNBC細胞系HCC1937和MDA-MB-231細胞，分別進行StarD4的敲減表達，同時進行增殖MTT、凋亡、劃痕轉移相關的細胞學功能實驗以及動物學功能，證明StarD4在乳腺癌中的促癌功能[17]。在本項目中，課題組采用Celligo增殖熒光拍照計數的方法，選用TNBC細胞系MDA-MB-231進行StarD4的敲減，并進行細胞增殖能力變化的評估。結果發現在StarD4敲減的細胞系中，細胞增殖能力降低40%（如圖2所示），該結果與我們前期研究的MTT檢測、周期和凋亡檢測的結果一致[17]。這些實驗表明：StarD4在TNBC中具有促進細胞增殖的重要功能。前期研究中，我們曾嘗試用StarD4低表達的TNBC細胞系進行StarD4過表達操作和功能檢測，但未找到合適的細胞系；另外，我們嘗試對HCC1937細胞和MDA-MB-231細胞進行過表達StarD4遺傳操作，但是因為StarD4本底表達水平比較高，導致過表達效果不明顯。基于這些結果，課題組進一步選用StarD4敲減表達細胞體系，進行StarD4促癌功能的機制研究。
利用TNBC細胞系的StarD4敲減細胞模型進行全轉錄組芯片檢測和數據分析，結果發現StarD4敲減引發的差異基因主要富集于膽固醇信號通路和腫瘤增殖相關的信號通路（如圖4所示）。膽固醇合成途徑是維持TNBC腫瘤干性的關鍵[19]。在腫瘤中，膽固醇代謝穩態受到嚴格調控，其代謝途徑的關鍵蛋白或代謝產物參與對腫瘤的調控[23-25]。StarD4是一個參與膽固醇運輸的載體蛋白，為了進一步分析StarD4可能的調控機制，我們深入分析了StarD4對脂質相關疾病功能和上游調控蛋白的影響，結果發現：在TNBC細胞系MDA-MB-231中，敲減StarD4表達，可顯著抑制膽固醇濃度（如圖3所示），并顯著抑制了膽固醇合成通路上游關鍵調控蛋白SREBP2以及膽固醇合成酶的表達水平（如圖3所示）。膽固醇合成代謝穩態受到胞內脂質水平的影響，其關鍵調控因子SREBP2從內質網向高爾基體轉移，SREBP2在高爾基體內被剪切修飾后釋放入細胞核，最終促進膽固醇合成途徑的基因表達[25]，包括膽固醇合成通路下游關鍵酶SC4MOL的表達（如圖3所示）。膽固醇合成途徑關鍵酶SC4MOL具有促進腫瘤受體的內吞ERC循環、阻止受體降解的作用[24]，與腫瘤進展具有密切關系。這些數據分析表明，StarD4蛋白可能通過調控膽固醇合成代謝穩態通路的SREBP2-SC4MOL調控軸，交叉調控TNBC腫瘤細胞膜受體蛋白的穩定性，從而促進乳腺癌進展（如圖3所示）。
我們利用差異基因進行生物信息學GO分析，發現了StarD4引發的差異基因聚集在Integrin相關蛋白（如圖4所示）。且通過IPA分析StarD4調控的腫瘤相關的信號通路和關鍵蛋白，結果發現Integrin蛋白ITGA5受到調控（如圖4所示）。我們進一步通過TNBC的體外細胞StarD4敲減模型進行驗證，結果發現StarD4抑制ITGA5 的mRNA水平只有30%左右，但是抑制ITGA5蛋白水平高達74%（如圖4所示）。這些結果表明StarD4可能具有調控膜蛋白ITGA5穩定性的功能，而ITGA5是涉及TNBC腫瘤干細胞特性的關鍵明星分子。我們前期研究還發現StarD4敲減能夠抑制PAK2和H3.3蛋白[5]，而PAK2和H3.3是調控乳腺癌干性和腫瘤重編程的關鍵蛋白[26-27]。綜合這些數據表明，StarD4蛋白可能是通過調控ITGA5膜受體來調控TNBC干細胞特性分子，維持TNBC腫瘤干細胞特性，發揮促癌功能[28-29]。
4 總結
TNBC生存期相關基因StarD4可能通過調控膽固醇代謝穩態的SREBP2-SC4MOL調控軸，參與細胞膜ITGA5受體蛋白的穩定性調控，從而促進TNBC的進展。該研究為進一步深入研究StarD家族基因膽固醇運輸蛋白StarD4作為TNBC生存期的關鍵候選藥靶，以及StarD4調控乳腺癌細胞膜受體和干細胞特性的機制打下基礎，為深層次理解TNBC預后與膽固醇代謝穩態的關系以及轉化醫學提供理論依據。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
乳腺癌是女性首發惡性腫瘤[1]，每年國內乳腺癌新增人數近30萬，年死亡人數近7萬，是威脅婦女健康的主要原因。其中，三陰乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌細胞雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和表皮生長因子受體（HER2）均表達陰性的乳腺癌亞型[2-3]。TNBC年輕女性易發，異質性強，臨床以放化療為主要治療方式，但預后差，致死率高[2-3]。為解決該臨床問題，急需開發TNBC患者新的關鍵靶點基因，研究其詳細機制[4-5]。
脂質膽固醇代謝相關途徑的異常調節與腫瘤發生和人類癌癥的發育有關[6-10]。膽固醇作為細胞膜和血漿中的關鍵物質，其代謝穩態在腫瘤免疫細胞膜的受體調控[11-12]、腫瘤干細胞特性[13]和腫瘤臨床進展[14-15]中具有重要的作用。TNBC臨床樣本的轉錄組測序發現，免疫抑制的患者膽固醇合成途徑顯著上調[15]。而TNBC臨床樣本的人源腫瘤異種移植（patient derived tumor xenograft，PDX）模型的轉錄組測序發現，膽固醇合成途徑是維持乳腺癌腫瘤干性的關鍵[13]。因此，膽固醇合成途徑對TNBC腫瘤干細胞特性的維持具有重要作用。膽固醇代謝穩態具有調控細胞膜受體含量的功能[11-12]，我們推測在TNBC的干細胞特性維持過程中，膽固醇合成途徑可能通過調控TNBC的細胞膜受體蛋白含量的方式，發揮促進TNBC進展的功能。
StarD4是一個包含START ［steroidogenic acute regulatory protein (StAR)-related lipid transfer］結構域的蛋白[16]。我們前期針對StarD4基因在TNBC患者中的臨床相關性和基因功能進行研究，結果發現：① StarD4基因高表達與TNBC患者的生存預后不良顯著相關；② TNBC體外細胞模型中敲減StarD4基因表達，可顯著抑制腫瘤細胞增殖和阻滯腫瘤細胞周期，同時增加腫瘤細胞的凋亡水平；③ TNBC體內皮下裸鼠成瘤模型中敲減StarD4基因表達，可顯著抑制裸鼠皮下成瘤的瘤體大小[17]，這些實驗結果證實StarD4可能是TNBC臨床促癌靶點。但StarD4促進TNBC進展的分子機制仍不清楚。
StarD4蛋白位于細胞核和細胞質中，文獻報道在骨肉瘤的研究中發現StarD4基因表達受脂質調控蛋白SREBP2調控，參與細胞膜和內吞循環小體（endocytic recycling compartment，ERC）之間的膽固醇雙向轉運[18]以及膽固醇穩態調控[19]。StarD4蛋白在乳腺癌細胞中是否通過調控膽固醇代謝穩態促進TNBC進展，需要進一步論證。我們前期研究發現，在TNBC細胞模型中敲減StarD4基因表達能夠抑制乳腺癌干細胞特性基因PAK2和乳腺癌染色質重編程基因H3.3的表達[17]。這些結果表明StarD4與TNBC的干細胞特性相關，而膽固醇代謝穩態亦與TNBC的干細胞特性相關[13]，因此StarD4可能是通過調控TNBC的膽固醇代謝來影響腫瘤干細胞特性從而促進TNBC進展。
文獻報道ITGA5蛋白是TNBC腫瘤干細胞特性的關鍵細胞膜蛋白[20-21]，因此，我們推測TNBC的膽固醇合成途徑可能是通過調控ITGA5蛋白含量的變化，發揮調控TNBC干細胞特性的功能，促進TNBC進展。基于以上分析，本研究采用TNBC細胞系StarD4敲減的細胞模型，進行轉錄組檢測、生物信息學數據挖掘，以及細胞模型的驗證，探討StarD4促進TNBC進展的分子機制，為StarD4在TNBC臨床治療的靶點開發提供重要基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
MDA-MB-231細胞系：由中南大學分子醫學研究中心實驗室留存。
TNBC臨床樣本：收集中南大學湘雅醫院乳腺外科術后病理報告診斷為TNBC的樣本共11例，已排除有其他惡性腫瘤病史，病理報告詳細記錄了患者組織的免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）染色為ER、PR、HER2陰性，分別取癌組織和癌旁組織樣本（癌旁組織定義為離腫瘤大于5 cm的正常乳腺組織）進行入組檢測。這項研究獲得湘雅醫院倫理委員會的批準。
1.2 方法
1.2.1 慢病毒感染TNBC細胞系的增殖檢測
StarD4敲減靶點序列CTATACTGTGGGCTATAAA和對照序列TTCTCCGAACGTGTCACGT，分別構建到shRNA敲減慢病毒載體GV115（上海吉凱公司），并包裝成慢病毒。慢病毒以MOI = 10進行TNBC細胞系MDA-MB-231細胞的感染，感染過夜后換培養基培養3天，使用熒光顯微鏡在明場視野和綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）熒光視野下，觀察慢病毒感染效率達到80%以上，細胞狀態正常。收集感染細胞，一部分進行Real-time PCR檢測，一部分調整起始細胞量到4 000個細胞/孔，連續培養3~5天，熒光顯微鏡下拍照和計數細胞增殖數目變化。
1.2.2 Real-time PCR和Western blot檢測
取6孔板80%細胞密度的細胞樣本或新鮮TNBC凍存組織100 mg加液氮重復研磨，加入1 mL Trizol裂解液，提取總RNA，檢測RNA濃度及純度，取2 μg RNA，按照Promega M-MLV試劑盒進行反轉錄生成cDNA。StarD4（forward primer：GATGCGTTACACTACTGCTGG；reverse primer：AAAAGACTCTGGTTTGGGTTG）、ITGA5（forward primer：GGCTTCAACTTAGACGCGGAG；reverse primer：TGGCTGGTATTAGCCTTGGGT）和內參基因GAPDH（forward primer：TGACTTCAACAGCGACACCCA；reverse primer：CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA）引物，由上海生物工程公司合成提供。
Real-time PCR檢測：采用TransStart Tip Green qPCR SuperMix試劑盒（北京全式金公司）對StarD4、ITGA5和內參基因GAPDH mRNA水平進行Real-time PCR檢測，每個樣本進行3 次重復，使用2?ΔΔCt計算相對表達量。
Western blot檢測：收集細胞樣本，冰上超聲破碎細胞，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，電轉PVDF膜，使用ITGA5抗體（兔單克隆抗體，Abcam批號ab150361，100 μL，適用于Western blot等）進行4 ℃過夜雜交，替換二抗IgG-HRP（羊抗兔單抗，Santa Cruz批號sc-2004，200 μg，適用于Western blot等）孵育1 h后，進行ECL化學發光壓片X曝光檢測。內參用GAPDH抗體（鼠單抗，Abcam批號ab8245，100 μg，適用于Western blot等）和對應二抗IgG-HRP（羊抗鼠單抗，Santa Cruz批號sc-2005，200 μg，適用于Western blot等）進行Western blot檢測。Western blot顯影結果進行灰度分析，比較相對差異。
1.2.3 全轉錄組芯片檢測和數據分析
準備StarD4敲減的細胞樣本和對照細胞樣本，各重復3次，委托上海伯豪公司進行轉錄組芯片（Affymetrix公司，PrimeView）檢測。總體流程：抽提RNA，取5 μL共100 ng總RNA，使用GeneChip 3’ IVT PLUS Kit進行cRNA擴增和Biotin標記，然后和Affymetrix公司的人基因表達譜芯片PrimeView進行孵育雜交，最后進行雜交信號讀取。芯片數據進行原始數據質量評估、數據過濾處理和顯著性差異分析。差異基因進行GeneOntology（GO）和Ingenuity Pathway Analysis（IPA）生物信息學分析。
GO分析：利用GO數據庫（http://geneontology.org/）進行生物學過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組分（cellular Component，CC）的聚類分析。
IPA分析：利用QIAGEN公司的IPA數據庫和軟件進行經典信號通路分析、上游調控分析、疾病功能分析和調控效應的顯著性分析。
1.2.4 TCGA數據庫預后相關性分析
利用TCGA在線分析工具UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）[22]，選用乳腺癌的TNBC人群資料進行TNBC腫瘤組織和正常組織的StarD4表達水平比較分析，以及TNBC患者StarD4高低表達的生存期比較分析。
1.2.5 統計學處理
應用SPSS 19.0 統計學軟件進行數據分析。各組數據之間比較，計量資料采用t 檢驗；相關性檢驗采用Spearman相關性分析；生存分析采用Kaplan-Meier生存分析，并采用Log-rank法進行檢驗。檢驗水準為0.05。
2 結果
2.1 高表達StarD4的TNBC患者預后顯著差于低表達患者
通過對TCGA數據庫116例TNBC的癌組織樣本表達水平和114例正常或癌旁對照樣本進行比較分析，結果發現：TNBC癌組織中的StarD4表達水平顯著高于正常組織樣本，如圖1所示。進一步對TCGA數據庫的116例TNBC患者進行StarD4高低表達分組的預后相關性分析，結果顯示：高表達StarD4的TNBC患者的生存期顯著差于低表達StarD4的TNBC患者（P < 0.01）。在湘雅醫院收集的11例TNBC患者的癌組織和癌旁組織樣本進行qPCR檢測，結果發現相對于癌旁組織，在癌組織表達水平大于1.5倍差異的患者有8例（P4~P11病例），占比72.7%，如圖1所示。
圖1
TNBC患者中StarD4基因表達水平的臨床相關性
a-b. TCGA數據庫中TNBC的表達水平和不同表達水平的生存曲線；c. 湘雅醫院TNBC患者StarD4基因的相對表達水平
Figure1. The clinical correlation of the expression level of StarD4 in TNBC patientsa-b. the relative expression level of StarD4 from TNBC patients and survival curves of them in TCGA database; c. the relative expression level of StarD4 from TNBC patients in Xiangya Hospital
2.2 敲減StarD4表達顯著抑制TNBC細胞增殖
將StarD4 敲減慢病毒感染MDA-MB-231，感染3天后，在明場和熒光顯微鏡下觀察到細胞感染效率達80%，使用Real-time PCR檢測StarD4敲減效率，結果顯示：相比對照組細胞，實驗組細胞的StarD4敲減效率達到90%，如圖2所示。
圖2
慢病毒介導的StarD4敲減對TNBC細胞系MDA-MB-231增殖的影響
a-b. StarD4敲減表達細胞系模型構建；c-d. StarD4敲減表達細胞系的細胞增殖數目差異
Figure2. Inhibiting effect on MDA-MB-231 cells with knocked-down StarD4 expression level by using lentivirus systema-b. MDA-MB-231 cells was used for cell model for StarD4 project; c-d. the cell growth with the knocked-down expression of StarD4 was significantly repressed
將StarD4敲減慢病毒感染MDA-MB-231的細胞組和未感染的對照組，以相同起始量細胞分別鋪板24孔板，密度約50%，連續培養5天后，進行細胞增殖生長量計數。結果顯示：相比于對照組細胞，StarD4敲減組細胞的細胞增殖數量降低了約40%，如圖2所示。
2.3 基于StarD4敲減表達TNBC細胞系的轉錄組學數據進行機制分析
利用MDA-MB-231細胞系StarD4敲減表達組和對照組，進行全轉錄組表達譜芯片檢測，獲得差異倍數（Fold Change，FC）>1.3的差異基因共772個，上調基因350個，下調基因422個，如圖3所示。利用生物信息學IPA數據庫，針對StarD4調控的差異基因，進行疾病和功能的脂質代謝功能富集分析，結果發現：脂質代謝功能的膽固醇合成和代謝調控功能顯著富集，其中膽固醇濃度功能顯著被抑制（Z = ?2.97），如圖3所示。進一步針對StarD4引發的差異基因，進行上游調控子分析，結果發現了膽固醇合成途徑調控的關鍵基因SREBP2，且它們在StarD4敲減組中顯著被抑制，如圖3所示。對IPA經典信號通路之膽固醇合成通路的催化酶基因進行分析，結果發現：膽固醇合成通路的11個催化酶基因的表達被顯著抑制，其中包括進化保守且參與內吞endosome的ERC循環調控基因SC4MOL，如圖3所示，SC4MOL具有調控細胞膜蛋白穩定性的作用。
圖3
StarD4敲減表達MDA-MB-231細胞系轉錄組差異基因膽固醇代謝穩態分析
a-b. 轉錄組差異基因火山圖和熱圖；c-d. 轉錄組差異基因IPA脂質代謝功能分析和上游調控子分析（“
a-b. volcano map and heat map of differential genes from transcriptome between test and control; c-d. IPA analyzed metabolism of lipid and upstream regulator (“
進一步利用差異基因，進行生物信息學GO分析，結果發現：差異基因生物學過程富集于脂質和膽固醇合成；細胞組分富集細胞黏附連接和內質網ER；分子功能富集細胞膜Integrin受體結合蛋白等，如圖4所示。對差異基因利用IPA生物信息學數據庫進行經典信號通路分析，結果發現：StarD4引發的差異基因主要富集于膽固醇信號通路和腫瘤增殖相關的信號通路，如圖4所示。對腫瘤分子機制的相關基因進行分析，結果發現了Integrin家族的細胞膜差異蛋白ITGA5，如圖4所示。最后，通過Real-time PCR和Western blot驗證ITGA5的表達差異，結果發現：相比于對照組，StarD4敲減組細胞ITGA5的mRNA水平和蛋白水平都顯著下調，如圖4所示。
圖4
StarD4敲減MDA-MB-231細胞系轉錄組差異基因生物信息學分析和數據驗證
a-b. GO分析和IPA信號通路分析；c. IPA腫瘤機制分子熱圖；d. ITGA5在StarD4敲減組和對照組中的Real-time PCR和Western blot檢測
Figure4. Bioinformatics analysis for transcriptome data of StarD4-knocked down TNBC cell line MDA-MB-231 to verify molecular mechanism of cancera-b. GO analysis and IPA analysis of pathway; c. heat map of cancer mechanism molecular on IPA database; d. detection of expression level of ITGA5 between test and control groups using real-time PCR and Western blot
3 討論
TNBC治療手段有限、預后差、致死率高，是乳腺癌臨床面臨的關鍵問題。臨床發現鑒定TNBC的關鍵靶點、探究其詳細的分子機制是TNBC轉化醫學研究的關鍵。在本研究中，對TCGA數據庫的TNBC臨床樣本進行StarD4表達水平的臨床相關性分析，結果發現：StarD4在TNBC患者的癌組織顯著高表達，且StarD4高表達的TNBC患者生存期顯著低于StarD4低表達患者（如圖1所示）。這些臨床數據結果提示，StarD4是TNBC的重要促癌基因。
前期研究中，我們選擇兩株TNBC細胞系HCC1937和MDA-MB-231細胞，分別進行StarD4的敲減表達，同時進行增殖MTT、凋亡、劃痕轉移相關的細胞學功能實驗以及動物學功能，證明StarD4在乳腺癌中的促癌功能[17]。在本項目中，課題組采用Celligo增殖熒光拍照計數的方法，選用TNBC細胞系MDA-MB-231進行StarD4的敲減，并進行細胞增殖能力變化的評估。結果發現在StarD4敲減的細胞系中，細胞增殖能力降低40%（如圖2所示），該結果與我們前期研究的MTT檢測、周期和凋亡檢測的結果一致[17]。這些實驗表明：StarD4在TNBC中具有促進細胞增殖的重要功能。前期研究中，我們曾嘗試用StarD4低表達的TNBC細胞系進行StarD4過表達操作和功能檢測，但未找到合適的細胞系；另外，我們嘗試對HCC1937細胞和MDA-MB-231細胞進行過表達StarD4遺傳操作，但是因為StarD4本底表達水平比較高，導致過表達效果不明顯。基于這些結果，課題組進一步選用StarD4敲減表達細胞體系，進行StarD4促癌功能的機制研究。
利用TNBC細胞系的StarD4敲減細胞模型進行全轉錄組芯片檢測和數據分析，結果發現StarD4敲減引發的差異基因主要富集于膽固醇信號通路和腫瘤增殖相關的信號通路（如圖4所示）。膽固醇合成途徑是維持TNBC腫瘤干性的關鍵[19]。在腫瘤中，膽固醇代謝穩態受到嚴格調控，其代謝途徑的關鍵蛋白或代謝產物參與對腫瘤的調控[23-25]。StarD4是一個參與膽固醇運輸的載體蛋白，為了進一步分析StarD4可能的調控機制，我們深入分析了StarD4對脂質相關疾病功能和上游調控蛋白的影響，結果發現：在TNBC細胞系MDA-MB-231中，敲減StarD4表達，可顯著抑制膽固醇濃度（如圖3所示），并顯著抑制了膽固醇合成通路上游關鍵調控蛋白SREBP2以及膽固醇合成酶的表達水平（如圖3所示）。膽固醇合成代謝穩態受到胞內脂質水平的影響，其關鍵調控因子SREBP2從內質網向高爾基體轉移，SREBP2在高爾基體內被剪切修飾后釋放入細胞核，最終促進膽固醇合成途徑的基因表達[25]，包括膽固醇合成通路下游關鍵酶SC4MOL的表達（如圖3所示）。膽固醇合成途徑關鍵酶SC4MOL具有促進腫瘤受體的內吞ERC循環、阻止受體降解的作用[24]，與腫瘤進展具有密切關系。這些數據分析表明，StarD4蛋白可能通過調控膽固醇合成代謝穩態通路的SREBP2-SC4MOL調控軸，交叉調控TNBC腫瘤細胞膜受體蛋白的穩定性，從而促進乳腺癌進展（如圖3所示）。
我們利用差異基因進行生物信息學GO分析，發現了StarD4引發的差異基因聚集在Integrin相關蛋白（如圖4所示）。且通過IPA分析StarD4調控的腫瘤相關的信號通路和關鍵蛋白，結果發現Integrin蛋白ITGA5受到調控（如圖4所示）。我們進一步通過TNBC的體外細胞StarD4敲減模型進行驗證，結果發現StarD4抑制ITGA5 的mRNA水平只有30%左右，但是抑制ITGA5蛋白水平高達74%（如圖4所示）。這些結果表明StarD4可能具有調控膜蛋白ITGA5穩定性的功能，而ITGA5是涉及TNBC腫瘤干細胞特性的關鍵明星分子。我們前期研究還發現StarD4敲減能夠抑制PAK2和H3.3蛋白[5]，而PAK2和H3.3是調控乳腺癌干性和腫瘤重編程的關鍵蛋白[26-27]。綜合這些數據表明，StarD4蛋白可能是通過調控ITGA5膜受體來調控TNBC干細胞特性分子，維持TNBC腫瘤干細胞特性，發揮促癌功能[28-29]。
4 總結
TNBC生存期相關基因StarD4可能通過調控膽固醇代謝穩態的SREBP2-SC4MOL調控軸，參與細胞膜ITGA5受體蛋白的穩定性調控，從而促進TNBC的進展。該研究為進一步深入研究StarD家族基因膽固醇運輸蛋白StarD4作為TNBC生存期的關鍵候選藥靶，以及StarD4調控乳腺癌細胞膜受體和干細胞特性的機制打下基礎，為深層次理解TNBC預后與膽固醇代謝穩態的關系以及轉化醫學提供理論依據。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
