細胞遷移是指細胞朝著特定的化學濃度梯度發生定向遷移運動，其在胚胎發育、傷口愈合、腫瘤轉移中發揮著至關重要的作用。當前研究手段大多通量低，難以綜合考慮不同濃度梯度條件對細胞遷移行為的影響。針對上述問題，本文首先設計了一款四通道微流控芯片，其特征如下：借助層流和擴散機制在細胞遷移主通道中建立和維持濃度梯度；可在單一顯微鏡視野下同時觀測四組細胞遷移現象；集成了寬度為20 μm的細胞隔離帶，可校準細胞初始位置，保證實驗結果的準確性。隨后，借助Comsol Multiphysics 有限元分析軟件完成了微流控芯片的仿真分析，證明了芯片上設計S型微通道和水平壓力平衡通道有助于在細胞遷移主通道中形成穩定的濃度梯度。最后，采用不同濃度（0、0.2、0.5、1.0 μmol·L?1）與糖尿病及其并發癥密切相關的晚期糖基化終末產物（AGEs）孵育中性粒細胞，研究了其在100 nmol·L?1趨化因子fMLP濃度梯度環境中的遷移行為。結果表明，AGEs抑制了中性粒細胞的遷移能力，證明了四通道微流控芯片的可靠性和實用性。
引用本文： 李慧來, 楊逍, 吳曉松, 李志剛, 洪承剛, 劉勇, 朱靈, 楊柯. 多通道微流控芯片的設計、仿真及細胞遷移應用研究. 生物醫學工程學雜志, 2022, 39(1): 128-138. doi: 10.7507/1001-5515.202105002 復制
引言
細胞趨化性是指細胞朝著特定濃度梯度發生的定向遷移運動。許多細胞具有感知并朝向趨化因子發生遷移運動的能力，如T淋巴細胞、癌細胞、白細胞等。這種現象已被證明在胚胎發育、傷口愈合、腫瘤轉移中發揮著重要作用[1-4]。自20世紀60年代引入趨化性概念以來，細胞趨化性研究技術不斷成熟。目前，最廣泛使用的研究設備為“Boyden小室”或“Transwell小室”，存在如下問題：① 試劑消耗量大，細胞用量多；② 難以形成穩定的濃度梯度，不能同時開展不同梯度環境中的細胞遷移行為研究；③ 難以真實模擬體內微環境；④ 終點計數方法有可能缺失重要的生物學信息。
微流控芯片的微尺寸特征與細胞大小匹配，針對實驗要求可靈活設計微通道結構，并在一定程度上實現集成，非常適合開展細胞遷移行為研究[5-7]。例如，Ge等[8]設計了一種通過表面張力和連續層流機制在微通道表面形成穩定濃度梯度的微流控芯片。Wu等[9]設計了一款微流控芯片來評估中性粒細胞對慢阻肺患者痰樣本的趨化性，發現患者痰液誘導的中性粒細胞趨化性水平與患者的肺活量數據呈負相關。Satti等[10]設計了一種離心式微流控芯片并用于評估人體中性粒細胞的趨化性，但離心操作勢必增加復雜性。上述微流控芯片僅能在單一顯微鏡視野下觀察一個微通道中細胞的遷移運動行為，在觀察多個通道時需要移動顯微鏡或者微流控芯片，操作復雜且不利于實驗數據的獲取。而本團隊[11-13]前期已經開發出三通道微流控芯片，研究了慢性腎病患者血清生物標志物成纖維細胞生長因子對中性粒細胞趨化性的影響。
目前，通過在微流控芯片中設計細胞隔離微結構和微孔結構來約束細胞初始位置已經受到廣泛關注[14-15]。在前期研究基礎上，本文設計了一種用于中性粒細胞趨化遷移分析的四通道微流控芯片，并采用Comsol Multiphysics有限元分析軟件完成了微流控芯片的仿真和結構優化。實驗時，我們采用晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）前處理中性粒細胞，并研究了其在100 nmol·L?1趨化因子N-formylmethionyl-leucyl-phenyl-alanine（fMLP）濃度梯度環境下的遷移行為變化情況，以驗證微流控芯片的可靠性和實用性。
1 實驗部分
1.1 儀器與試劑
中性粒細胞分離試劑盒（17957，STEMCELL，加拿大）；牛血清白蛋白（A1933-25G，Sigma-Aldrich，美國），RPMI 1640（SH30809.01，Hyclone，美國）；熒光素（FD10S-10 kDa-1 mmol·L?1，Sigma-Aldrich，美國）；fMLP（F3506-1 mmol·L?1，Sigma-Aldrich，美國）；纖維連接蛋白（F2006，Sigma-Aldrich，美國）；AGEs（BIV-2221-10，武漢艾美捷科技有限公司，中國）；聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）前體及引發劑（道康寧，美國）；實驗用水為二次蒸餾水；倒置熒光顯微鏡（DMi8，萊卡，德國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 微流控芯片的結構設計
微流控芯片包含四個通道，其中通道1和通道4結構相同且對稱布置，通道2和通道3也結構相同且對稱布置（見圖1a～b）。如圖1c所示，每個通道均設計了趨化因子注入口、培養液注入口、細胞注入口和出口。趨化因子注入口和培養液注入口分別與第一和第二S型微通道連接，兩條S型微通道之間設置有壓力平衡連接通道，用于平衡趨化因子注入口和培養液注入口的壓力差（見圖1c）。第一和第二S型微通道在細胞遷移主通道中匯聚，并通過層流和擴散機制形成濃度梯度場。高流阻S型微通道也有利于控制細胞遷移主通道中的流速，確保細胞遷移免受流速的影響。細胞從細胞注入口注入后，先抵達細胞定位通道，隨后由于受到細胞隔離帶的阻擋，整齊排列在細胞遷移主通道的邊緣（見圖1d）。細胞在感受到趨化因子后，發生極化變形，進而穿過細胞隔離帶，進入細胞遷移主通道。細胞隔離帶的高度為3 μm，寬度為20 μm。細胞定位通道的高度為70 μm，寬度為50 μm。細胞遷移主通道的高度為70 μm，寬度為200 μm。PDMS芯片主體厚度為7 mm（見圖1d）。值得注意的是，為了使微流控芯片的四個細胞遷移主通道能全部在單一顯微鏡視野中呈現，通道1和通道4的S型微通道與細胞遷移主通道的中軸線成90°夾角（見圖1b），通道2和通道3的S型微通道與細胞遷移主通道的中軸線成135°夾角（見圖1b）。
圖1
微流控芯片的結構示意圖
a. 微流控芯片的等軸測視圖；b. 微流控芯片的頂視圖；c. 第一、第二通道的放大視圖；d. 細胞定位通道、細胞隔離帶和細胞遷移主通道的縱向剖面視圖
Figure1. Structure diagram of microfluidic chipa. equiaxonometric view of microfluidic chip; b. top view of microfluidic chip; c. enlarged views of the channel 1 and channel 2; d. a longitudinal profile view of the cell localization channel, cell separation zone and cell migration channel
1.2.2 仿真設置
矩形截面微通道內部流體的運動可以視為不可壓縮流體的運動，其基本的控制方程是連續性方程和Navier-Stokes方程。由于微流體的特殊效應，慣性力相對于流體粘滯力很小，可以忽略，因此微流體在微管道內流動的基本方程組是：
 |
 |
 |
其中，
為流體的密度，
為動態粘度，
為速度場矢量（未知），
為液體自由表面上的壓強（未知），兩個未知數兩個方程，構成一個封閉的方程組。
對流擴散方程表征了流動系統的質量傳遞規律，求解此方程可得出濃度分布。
 |
其中，
為擴散系數，
為質量分數濃度。
式（2）～（3）中含有三個未知量：速度
、濃度
、壓力
，與三個方程組成的方程組是封閉方程組，故可以通過偏微分方程組來求解得到微流體流動中各點的速度、濃度和壓力。
選用基于有限元方法的Comsol Multiphysics軟件進行微流控濃度梯度芯片設計仿真。Comsol Multiphysics具有獨特的模擬計算環境，內嵌了物理的基礎理論，整合豐富的算法，計算精度非常高。軟件中基本仿真參數設置如下：趨化因子注入口和細胞培養液注入口的初始濃度分別設置為 
和 
，為100 mol·L?1·m?3和0 mol·L?1·m?3，流體介質密度 
為1×103 kg·m?3，動力粘度 
為1 × 10?3 Pa·s，擴散系數 
為7.5×10?11 m2·s?1 [16]。微流控芯片依靠溶液入口和出口所形成的壓力差推動流體流動，由于PDMS芯片主體高度為7 mm（見圖1d），當趨化因子注入口裝滿試劑時，其壓力可設置為70 Pa。此外，該模型的一個重要假設是出口壓力為0 Pa，即假設出口的直徑無窮大。
1.2.3 微流控芯片前處理
實驗開始之前，首先在微流控芯片各個試劑入口和出口注入纖連蛋白（2.5 μg·mL?1），靜置1 h后再注入0.4%的牛血清白蛋白。實驗時，分別在趨化因子注入口和細胞培養液注入口注入120 μL的100 nmol·L?1 fMLP和0.4%牛血清白蛋白溶液（用RPMI-1640稀釋）。與經典“圣誕樹”型濃度梯度發生器類似[17]，本文設計的微流控芯片可以依靠層流和對流擴散，在細胞遷移主通道形成穩定的濃度梯度。
1.2.4 中性粒細胞分離純化和AGEs前處理
正常人（非糖尿病、腎功能正常）血清AGEs水平約為0.13 μmol·L?1。糖尿病患者AGEs水平升高2倍以上，糖尿病血液透析患者AGEs水平升高8倍左右[18-19]。為了驗證微流控芯片的性能，并探究糖尿病患者體內異常升高的AGEs和中性粒細胞遷移功能表型的關系，我們設計了不同濃度AGEs對中性粒細胞的遷移行為影響的研究實驗。我們首先采用商業化試劑盒分離4 mL人體靜脈血中性粒細胞，分離的細胞被分成4份，并分別重懸浮于含有0、0.2、0.5、1.0 μmol·L?1 AGEs的4份0.4%牛血清白蛋白溶液中進行孵育（體積為1 mL），孵育時間為1 h。實驗時，首先將4份前處理中性粒細胞注入芯片，隨后用100 nmol·L?1 fMLP和0.4%牛血清白蛋白溶液構造濃度梯度，并在顯微鏡下觀察中性粒細胞的遷移情況。
1.2.5 實驗操作及數據分析
采用倒置熒光顯微鏡實時采集細胞趨化遷移運動圖像，采集頻率為6 幀/min，時間為15 min。所獲圖像數據采用ImageJ軟件中的Manual Tracking插件獲取單個細胞的軌跡。每組實驗重復三次，跟蹤細胞數目為30，結果取平均。如圖2所示，細胞的運動能力通過與流速方向的夾角系數（angle index，AI）、細胞平均運動速度（V）、梯度方向遷移位移（S）、總遷移距離（L）來表征。AI、V、L的相互關系見式（5）～（6），其中，T為圖像采集時間間隔。如式（5）所示，如果 
小于90°，表示細胞順著流速方向進行遷移；如果 
大于90°，表示細胞遷移運動未受到流速的影響。
圖2
細胞遷移分析方法
Figure2.
Cell migration analysis method
 |
 |
2 結果與討論
2.1 微流控芯片仿真分析
本文設計的微流控芯片依靠層流和擴散機制在細胞遷移主通道形成穩定的濃度梯度，需考慮以下問題：① 溶液體積以及溶液粘度和通道結構變化可能會導致趨化因子注入口和培養液注入口壓力不平衡，并影響細胞遷移主通道中濃度梯度的創建；② 通道1（通道4）和通道2（通道3）的結構略有差異，是否會導致成像區域內的濃度梯度存在較大差異而造成分析結果不準確；③ 如果梯度通道流速較大，細胞的趨化遷移運動將不可避免地受到流體剪切力的影響，是否會影響結果。
為演示設計原則，我們將不同設計模式的微流控芯片簡化為等效電路模型[20]。如圖3所示，P1和P2分別為趨化因子注入口和細胞培養液注入口的壓力，R為通道流阻，C為通道濃度，Q1和Q2為第一S型微通道和第二S型微通道中的體積流量。特別地，第一S型通道和第二S型通道直接匯聚，隨后流向下游通道的設計方案稱之為直接接觸平衡方式（見圖3a）。第一S型通道和第二S型通道通過水平壓力平衡通道進行隔離稱之為水平接觸平衡方式（見圖3b）。水平壓力平衡通道的長度推薦設計為≥2d，其中d表示S型通道的寬度（見圖3b）。
圖3
微流控芯片的等效模型
a. 直接接觸設計模式；b. 水平通道接觸設計模式
Figure3. The equivalent model of the microfluidic chipa. design model of direct contact; b. design model of horizontal channel contact
首先，我們討論了芯片上設置高流阻的S型通道的必要性。式（7）表達了體積流量與流體通道中的壓力梯度和流體阻力之間的關系。當趨化因子注入口和細胞培養液注入口注入試劑的體積存在差異時，通過增加通道流阻，可以減小體積流量差異。
 |
接著，我們采用3D繪圖軟件分別繪制了通道1和通道2。通道1的仿真結果表明，若入口壓力平衡（P1 = 70 Pa，P2 = 70 Pa），第一S型微通道和第二S型微通道之間設置水平壓力平衡通道時，遷移運動成像區域初始位置梯度曲線更陡，梯度差值為
= 92.5 mol·L?1·m?3，高于直接接觸（64.1 mol·L?1·m?3）（見圖4a、c、e、g）。成像區域的初始位置和終止位置如圖4a～b所示。通道2仿真結果與通道1基本一致，最大梯度差值為 97.5 mol·L?1·m?3，高于直接接觸方式（74.5 mol·L?1·m?3）（見圖4b、d、f、h）。這是因為第一和第二S型微通道的高流阻引起流速減緩，會加快趨化因子和細胞培養液之間的預擴散。水平壓力平衡通道有效緩解了預擴散效應，有利于在細胞遷移主通道產生范圍較寬的濃度梯度。
圖4
入口壓力相同時，通道1和通道2初始位置處濃度梯度仿真結果
a～b. 通道1和通道2的S型微通道處的仿真圖像；c～d. 通道1和通道2細胞遷移主通道處的仿真圖像；e～f. 通道1和通道2細胞遷移主通道中初始位置處的梯度仿真曲線；g～h. 通道1和通道2細胞遷移主通道中初始位置處的梯度最大值和最小值的差值對比結果
Figure4. Simulation results of concentration gradient at the initial position of the channel 1 and 2 when the inlet pressure is the samea-b. simulation images of the S-type microchannels of channel 1 and channel 2; c-d. simulation images of the cell migration main channel of channel 1 and channel 2; e-f. the gradient simulation curve of channel 1 and channel 2 at the initial position of cell migration main channel; g-h. the comparison results of the difference between the maximum and minimum gradients of channel 1 and channel 2 at the initial position of cell migration main channel
然后，我們研究了入口壓力不平衡時（P1 = 50 Pa，P2 = 70 Pa），水平壓力平衡通道平衡設置的必要性。P1 = 50 Pa表示加入試劑的體積未裝滿試劑注入口。通道1仿真結果表明，設置水平壓力平衡通道后，成像區域初始位置的梯度曲線更加陡峭，濃度梯度差值為
= 86.5 mol·L?1·m?3，高于直接接觸方式（59.7 mol·L?1·m?3）（見圖5a、c、e）。通道2仿真結果與通道1基本一致（見圖5b、d、f）。
圖5
入口壓力不相同時，通道1和通道2的初始位置處的濃度梯度仿真結果
a～b. 通道1和通道2的仿真圖像；c～d. 通道1和通道2細胞遷移主通道初始位置處的梯度仿真曲線；e～f. 通道1和通道2細胞遷移主通道初始位置處的梯度最大值和最小值的差值對比結果
Figure5. Simulation results of concentration gradient at the initial position of the channel 1 and 2 when the inlet pressure is not the samea-b. simulation images of channel 1 and channel 2; c-d. the gradient simulation curve of channel 1 and channel 2 at the initial position of the cell migration main channel; e-f. the comparing result of the difference between the maximum and minimum gradients of channel 1 and channel 2 at the initial position of the cell migration main channel
隨后，我們研究了入口壓力不平衡（P1 = 50 Pa，P2 = 70 Pa）時，成像區域不同位置處濃度梯度的差異。通道1仿真結果表明，成像區域初始位置的濃度梯度差值為
= 86.8 mol·L?1·m?3（見圖6a、c），與通道2基本一致（86.6 mol·L?1·m?3）（見圖6b、d）。此外，第一通道終止位置處的最大濃度梯度差值為
= 75.4 mol·L?1·m?3，與通道2基本一致（80.8 mol·L?1·m?3）。初始和終止位置處的差異來源于物質擴散。進一步地，繪制了通道1與通道2成像區域初始位置和終止位置的濃度梯度仿真曲線，發現盡管通道1和通道2的結構存在一定差異，但兩者成像區域相同位置（初始或終止）的濃度梯度分布基本一致（見圖6e、f），這對于同時研究四個通道中的細胞遷移行為至關重要。
圖6
入口壓力不相同時，通道1和通道2的初始位置和終止位置處的濃度梯度仿真結果
a～b. 通道1和通道2的仿真圖像；c～d. 通道1和通道2細胞遷移主通道初始位置和終止位置處的梯度最大值和最小值的差值對比結果；e. 通道1、2、3、4的仿真圖像整合；f. 通道1和通道2初始位置和終止位置處的梯度仿真曲線對比圖
Figure6. Simulation results of concentration gradient at the initial and termination positions of the channel 1 and channel 2 when the inlet pressure is not the samea-b. simulation images of channel 1 and channel 2; c-d. comparison results of the difference between the maximum and minimum gradients at the initial position and the end position of the cell migration main channel of channel 1 and channel 2; e. simulation image of channels 1, 2, 3, and 4; f. comparison chart of gradient simulation curves at the initial and end positions of channel 1 and channel 2
最后，我們研究了細胞遷移主通道中的速度場分布，目的在于分析剪切應力對細胞的影響。如圖7a所示，速度分布在大多數層流情況下呈拋物線。近壁面處，由流體產生的剪切應力被稱為“壁剪切應力”（見圖7b）。仿真結果表明，入口壓力平衡（P1 = 70 Pa，P2 = 70 Pa）時，通道1和通道2在距離基底5 μm處（中性粒細胞直徑約為10 μm）的最大理論流速分別為61.1 μm·s?1和75.8 μm·s?1（分別見圖7c、e、g和圖7d、f、h）。對于矩形通道，h為矩形高度，w為矩形寬度，l為矩形長度，當h<w<<l時，管壁剪應力的計算方法為[21]：
圖7
細胞遷移主通道中的流速仿真結果
a. 層流通道中的流速分布模型；b. 層流通道中的剪切應力分布模型；c～d. 通道1和通道2細胞遷移主通道中的流速仿真圖像；e～f. 通道1和通道2細胞遷移主通道中垂直方向的流速分布；g～h. 通道1和通道2細胞遷移主通道中梯度方向的流速分布
Figure7. Simulation results of flow velocity in main cell migration channela. flow velocity distribution model in laminar flow channel; b. shear stress distribution model in laminar flow channel; c-d. simulation image of flow velocity in the cell migration main channel of channel 1 and channel 2; e-f. the velocity distribution in the vertical direction of the cell migration main channel of channel 1 and channel 2; g-h. the velocity distribution in the gradient direction of the cell migration main channel of channel 1 and channel 2
 |
其中
是流體的粘度，Q為流速，h和w定義如圖所示。粗略計算最大剪切應力為12.73 dyn·cm?2，位于人動脈血管的平均剪應力范圍內（2～20 dyn·cm?2）[22]，細胞在此流速條件下可以實現正常遷移。
2.2 微流控芯片表征
采用雙層光刻技術制備微流控芯片的基本流程如圖8a所示，芯片實物如圖8b所示。試劑注入口的直徑約為5 mm，最多可盛裝約120 μL的試劑。圖8c表明芯片邊緣整齊，結構清晰。圖8d清晰展現了細胞在定位通道、隔離帶邊緣和遷移主通道中的分布情況。
圖8
芯片制作過程及實物示意圖
a. 芯片制備過程；b. 芯片實物圖，c. 單一顯微鏡視野下4個細胞遷移主通道圖像；d. 單一顯微鏡視野下細胞定位通道和細胞遷移主通道中的細胞分布圖像（細胞已經穿過細胞隔離帶）
Figure8. Fabrication process of microfluidic chip and physical diagrama. fabrication process; b. a physical picture of microfluidic chip; c. images of cell migration channel 1, 2, 3, 4 under a single microscope field; d. cell distribution in the localization channel and main migration channel under a single microscope field (cells have crossed the cell isolation zone)
進一步地，我們將120 μL濃度為5.0 μmol·L?1的熒光素溶液與去離子水分別注入趨化因子注入口和細胞培養液注入口，熒光梯度形成之后，連續采集熒光圖像15 min。圖9a展示了4個細胞遷移主通道中的熒光梯度圖像。圖9b展示了水平壓力平衡通道處的熒光圖像，未發現第一和第二S型微通道發生預擴散。分析4個細胞遷移主通道中的熒光強度曲線，發現通道1和通道4中的熒光梯度曲線與仿真結果基本一致（見圖9c），通道2和通道3中的結果相似（見圖9d）。隨后，我們進一步分析了4個細胞遷移主通道中的熒光梯度曲線隨時間的變化情況。發現0 min時，4個細胞遷移主通道中的梯度曲線形狀一致（見圖9e）；15 min后，熒光梯度曲線基本保持不變（見圖9f）。進一步地，我們將120 μL細胞溶液注入微流控芯片的趨化因子入口和細胞培養液入口，當細胞運動到遷移主通道時，每隔1 s采集細胞在遷移主通道中隨液流的漂移圖像。粗略計算結果表明，液流流速約為60 μm·s?1，與仿真結果基本一致（見圖9g）。
圖9
微流控芯片的性能表征
a. 4個細胞遷移主通道中的熒光圖像；b. 水平壓力平衡通道處的熒光圖像；c. 通道1和通道4的熒光梯度曲線與仿真結果對比；d. 通道2和通道3的熒光梯度曲線與仿真結果對比；e. 0 min時，4個細胞遷移主通道中的熒光梯度曲線圖；f. 15 min時，4個細胞遷移主通道中的熒光梯度曲線圖；g. 細胞遷移主通道的流速計算方法
Figure9. Performance characterization of microfluidic chipa. fluorescent gradient images in cell migration channel 1, 2, 3, 4; b. fluorescence image at the horizontal pressure equilibrium channel; c. comparison of the fluorescent gradient curves between the cell migration channel 1, 4 and the simulation result; d. comparison of the fluorescent gradient curves between the cell migration channel 2, 3 and the simulation result; e. gradient curves in the channel 1, 2, 3, 4 at 0 min; f. gradient curves in the cell migration channel 1, 2, 3, 4 at 15 min; g. velocity calculation in the cell migration channel
2.3 基于微流控芯片研究AGEs對中性粒細胞趨化性的影響
首先，我們將經過0、0.2、0.5、1.0 μmol·L?1 AGEs前處理的中性粒細胞（取懸浮液15 μL）注入微流控芯片，然后將120 μL濃度為100 nmol·L?1的fMLP和0.4%牛血清白蛋白培養基分別注入趨化因子注入口和細胞培養液注入口，隨后觀察中性粒細胞的趨化遷移行為。細胞遷移主通道形成濃度梯度后，位于細胞定位通道中的中性粒細胞將發生極化和形變，并通過細胞隔離帶進入遷移主通道。圖10a和圖10b展示了0 min和15 min時遷移主通道中的細胞分布圖像。0 min時，細胞被細胞隔離帶阻隔。15 min時，細胞遷移進入主通道。由于細胞沿梯度方向的遷移運動過程隨機，并不是徑直朝向梯度方向運動，因此絕大多數細胞并未越過細胞遷移主通道的中軸線（見圖10b）[23]。
圖10
細胞遷移分析
a. 0 min時，細胞分布圖像；b. 15 min時，細胞分布圖像；c. 細胞角度系數分析；d. 細胞平均運動速度分析；e. 梯度位移分析；f. 總遷移距離分析
Figure10. Analysis of cell migration dataa. images of cell distribution at 0 min; b. images of cell distribution at 15 min; c. analysis of the angle index; d. analysis of the mean velocity; e. analysis of the migration distance along the gradient direction; f. analysis of the total migration distance
圖10c給出了細胞的AI分析數據。結果表明，正常組中性粒細胞的AI值為正數，而經過0.2 μmol·L?1 AGEs處理的中性粒細胞的AI值為負數。因此，我們推斷0.2 μmol·L?1 AGEs損傷了中性粒細胞的趨化性，表現為細胞黏附性下降和偏向梯度方向運動。進一步地，發現0.5 μmol·L?1 AGEs組的AI值小于0.2 μmol·L?1 AGEs組，而0.5 μmol·L?1 AGEs組的AI值與1.0 μmol AGEs組基本相同。前人研究發現，AGEs可與中性粒細胞膜上的AGE受體（RAGE）相互作用，導致跨內皮細胞遷移和殺菌能力下降[24]。結合當前的實驗結果可以初步推斷，當RAGE被完全占據之后，持續提高AGEs濃度將不會對中性粒細胞的黏附性產生持續性的抑制。在此基礎上，進一步分析了細胞的V、S和L。圖10d、f結果表明，AGEs處理的中性粒細胞的V和L值均小于對照組，且隨著AGEs用量升高（0.2～1.0 μmol·L?1），V和L值逐漸下降，與AGEs濃度呈負相關關系。圖10e結果表明，0.2 μmol·L?1 AGEs組的S值小于對照組細胞，與0.5 μmol·L?1 AGEs組基本相同，但高于1.0 μmol·L?1 AGEs組。總之，從遷移分析數據可以看出，隨著AGEs濃度的升高，中性粒細胞趨化性受到損害。過往研究已經表明，被AGEs激活時，中性粒細胞內鈣離子信號轉導異常，造成胞內鈣離子增加，從而抑制其趨化性，而通過胰島素治療控制血糖后，功能實現逆轉[25-26]。此外，過往的研究已經表明高血糖將加速AGEs的生成，而AGEs與糖尿病患者免疫功能低下及血管并發癥（動脈粥樣硬化等）的發生發展密切相關[24,27-28]。我們的結果則基于微流控芯片證明AGEs影響了中性粒細胞的遷移行為，為從細胞功能表型角度闡釋AGEs與糖尿病患者免疫功能低下之間的相互關系提供了基本數據參考。
3 結論
本文設計了一款集成了S型微通道、水平壓力平衡通道等特征的微流控芯片，并借助Comsol Multiphysics有限元分析軟件完成仿真設計。微流控芯片還集成了細胞定位通道和細胞隔離帶，確保細胞從同一起跑線開始遷移。特別地，本文提出的微流控芯片允許同時觀測四種不同梯度環境下細胞的遷移行為，提高了實驗結果分析的準確性和工作效率。使用濃度為0、0.2、0.5、1.0 μmol·L?1的AGEs孵育中性粒細胞，驗證了芯片的可靠性和適用性。實驗結果發現AGEs可抑制中性粒細胞的趨化遷移行為。在后續研究中，通過改變芯片上細胞定位通道和細胞隔離帶的設計尺寸并配合使用其他化學趨引因子，芯片也可適用于癌細胞、T細胞、自然殺傷細胞的趨化遷移行為研究。本研究旨在為基于微流控技術的細胞趨化性研究提供芯片設計思想和方法參考。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：李慧來和楊柯設計實驗和撰寫論文，李慧來和吳曉松進行數據收集和數據分析，楊逍和李志剛進行芯片設計和文中圖片潤色，洪承剛進行芯片制備，劉勇和朱靈指導實驗和修改論文。
倫理聲明：本研究通過了中國科學院合肥物質科學研究院醫學倫理委員會的審批（批文編號：Y-2018-21）。
引言
細胞趨化性是指細胞朝著特定濃度梯度發生的定向遷移運動。許多細胞具有感知并朝向趨化因子發生遷移運動的能力，如T淋巴細胞、癌細胞、白細胞等。這種現象已被證明在胚胎發育、傷口愈合、腫瘤轉移中發揮著重要作用[1-4]。自20世紀60年代引入趨化性概念以來，細胞趨化性研究技術不斷成熟。目前，最廣泛使用的研究設備為“Boyden小室”或“Transwell小室”，存在如下問題：① 試劑消耗量大，細胞用量多；② 難以形成穩定的濃度梯度，不能同時開展不同梯度環境中的細胞遷移行為研究；③ 難以真實模擬體內微環境；④ 終點計數方法有可能缺失重要的生物學信息。
微流控芯片的微尺寸特征與細胞大小匹配，針對實驗要求可靈活設計微通道結構，并在一定程度上實現集成，非常適合開展細胞遷移行為研究[5-7]。例如，Ge等[8]設計了一種通過表面張力和連續層流機制在微通道表面形成穩定濃度梯度的微流控芯片。Wu等[9]設計了一款微流控芯片來評估中性粒細胞對慢阻肺患者痰樣本的趨化性，發現患者痰液誘導的中性粒細胞趨化性水平與患者的肺活量數據呈負相關。Satti等[10]設計了一種離心式微流控芯片并用于評估人體中性粒細胞的趨化性，但離心操作勢必增加復雜性。上述微流控芯片僅能在單一顯微鏡視野下觀察一個微通道中細胞的遷移運動行為，在觀察多個通道時需要移動顯微鏡或者微流控芯片，操作復雜且不利于實驗數據的獲取。而本團隊[11-13]前期已經開發出三通道微流控芯片，研究了慢性腎病患者血清生物標志物成纖維細胞生長因子對中性粒細胞趨化性的影響。
目前，通過在微流控芯片中設計細胞隔離微結構和微孔結構來約束細胞初始位置已經受到廣泛關注[14-15]。在前期研究基礎上，本文設計了一種用于中性粒細胞趨化遷移分析的四通道微流控芯片，并采用Comsol Multiphysics有限元分析軟件完成了微流控芯片的仿真和結構優化。實驗時，我們采用晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）前處理中性粒細胞，并研究了其在100 nmol·L?1趨化因子N-formylmethionyl-leucyl-phenyl-alanine（fMLP）濃度梯度環境下的遷移行為變化情況，以驗證微流控芯片的可靠性和實用性。
1 實驗部分
1.1 儀器與試劑
中性粒細胞分離試劑盒（17957，STEMCELL，加拿大）；牛血清白蛋白（A1933-25G，Sigma-Aldrich，美國），RPMI 1640（SH30809.01，Hyclone，美國）；熒光素（FD10S-10 kDa-1 mmol·L?1，Sigma-Aldrich，美國）；fMLP（F3506-1 mmol·L?1，Sigma-Aldrich，美國）；纖維連接蛋白（F2006，Sigma-Aldrich，美國）；AGEs（BIV-2221-10，武漢艾美捷科技有限公司，中國）；聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）前體及引發劑（道康寧，美國）；實驗用水為二次蒸餾水；倒置熒光顯微鏡（DMi8，萊卡，德國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 微流控芯片的結構設計
微流控芯片包含四個通道，其中通道1和通道4結構相同且對稱布置，通道2和通道3也結構相同且對稱布置（見圖1a～b）。如圖1c所示，每個通道均設計了趨化因子注入口、培養液注入口、細胞注入口和出口。趨化因子注入口和培養液注入口分別與第一和第二S型微通道連接，兩條S型微通道之間設置有壓力平衡連接通道，用于平衡趨化因子注入口和培養液注入口的壓力差（見圖1c）。第一和第二S型微通道在細胞遷移主通道中匯聚，并通過層流和擴散機制形成濃度梯度場。高流阻S型微通道也有利于控制細胞遷移主通道中的流速，確保細胞遷移免受流速的影響。細胞從細胞注入口注入后，先抵達細胞定位通道，隨后由于受到細胞隔離帶的阻擋，整齊排列在細胞遷移主通道的邊緣（見圖1d）。細胞在感受到趨化因子后，發生極化變形，進而穿過細胞隔離帶，進入細胞遷移主通道。細胞隔離帶的高度為3 μm，寬度為20 μm。細胞定位通道的高度為70 μm，寬度為50 μm。細胞遷移主通道的高度為70 μm，寬度為200 μm。PDMS芯片主體厚度為7 mm（見圖1d）。值得注意的是，為了使微流控芯片的四個細胞遷移主通道能全部在單一顯微鏡視野中呈現，通道1和通道4的S型微通道與細胞遷移主通道的中軸線成90°夾角（見圖1b），通道2和通道3的S型微通道與細胞遷移主通道的中軸線成135°夾角（見圖1b）。
圖1
微流控芯片的結構示意圖
a. 微流控芯片的等軸測視圖；b. 微流控芯片的頂視圖；c. 第一、第二通道的放大視圖；d. 細胞定位通道、細胞隔離帶和細胞遷移主通道的縱向剖面視圖
Figure1. Structure diagram of microfluidic chipa. equiaxonometric view of microfluidic chip; b. top view of microfluidic chip; c. enlarged views of the channel 1 and channel 2; d. a longitudinal profile view of the cell localization channel, cell separation zone and cell migration channel
1.2.2 仿真設置
矩形截面微通道內部流體的運動可以視為不可壓縮流體的運動，其基本的控制方程是連續性方程和Navier-Stokes方程。由于微流體的特殊效應，慣性力相對于流體粘滯力很小，可以忽略，因此微流體在微管道內流動的基本方程組是：
|
|
|
其中， 為流體的密度， 為動態粘度， 為速度場矢量（未知）， 為液體自由表面上的壓強（未知），兩個未知數兩個方程，構成一個封閉的方程組。
對流擴散方程表征了流動系統的質量傳遞規律，求解此方程可得出濃度分布。
|
其中， 為擴散系數， 為質量分數濃度。
式（2）～（3）中含有三個未知量：速度、濃度、壓力，與三個方程組成的方程組是封閉方程組，故可以通過偏微分方程組來求解得到微流體流動中各點的速度、濃度和壓力。
選用基于有限元方法的Comsol Multiphysics軟件進行微流控濃度梯度芯片設計仿真。Comsol Multiphysics具有獨特的模擬計算環境，內嵌了物理的基礎理論，整合豐富的算法，計算精度非常高。軟件中基本仿真參數設置如下：趨化因子注入口和細胞培養液注入口的初始濃度分別設置為 和 ，為100 mol·L?1·m?3和0 mol·L?1·m?3，流體介質密度 為1×103 kg·m?3，動力粘度 為1 × 10?3 Pa·s，擴散系數 為7.5×10?11 m2·s?1 [16]。微流控芯片依靠溶液入口和出口所形成的壓力差推動流體流動，由于PDMS芯片主體高度為7 mm（見圖1d），當趨化因子注入口裝滿試劑時，其壓力可設置為70 Pa。此外，該模型的一個重要假設是出口壓力為0 Pa，即假設出口的直徑無窮大。
1.2.3 微流控芯片前處理
實驗開始之前，首先在微流控芯片各個試劑入口和出口注入纖連蛋白（2.5 μg·mL?1），靜置1 h后再注入0.4%的牛血清白蛋白。實驗時，分別在趨化因子注入口和細胞培養液注入口注入120 μL的100 nmol·L?1 fMLP和0.4%牛血清白蛋白溶液（用RPMI-1640稀釋）。與經典“圣誕樹”型濃度梯度發生器類似[17]，本文設計的微流控芯片可以依靠層流和對流擴散，在細胞遷移主通道形成穩定的濃度梯度。
1.2.4 中性粒細胞分離純化和AGEs前處理
正常人（非糖尿病、腎功能正常）血清AGEs水平約為0.13 μmol·L?1。糖尿病患者AGEs水平升高2倍以上，糖尿病血液透析患者AGEs水平升高8倍左右[18-19]。為了驗證微流控芯片的性能，并探究糖尿病患者體內異常升高的AGEs和中性粒細胞遷移功能表型的關系，我們設計了不同濃度AGEs對中性粒細胞的遷移行為影響的研究實驗。我們首先采用商業化試劑盒分離4 mL人體靜脈血中性粒細胞，分離的細胞被分成4份，并分別重懸浮于含有0、0.2、0.5、1.0 μmol·L?1 AGEs的4份0.4%牛血清白蛋白溶液中進行孵育（體積為1 mL），孵育時間為1 h。實驗時，首先將4份前處理中性粒細胞注入芯片，隨后用100 nmol·L?1 fMLP和0.4%牛血清白蛋白溶液構造濃度梯度，并在顯微鏡下觀察中性粒細胞的遷移情況。
1.2.5 實驗操作及數據分析
采用倒置熒光顯微鏡實時采集細胞趨化遷移運動圖像，采集頻率為6 幀/min，時間為15 min。所獲圖像數據采用ImageJ軟件中的Manual Tracking插件獲取單個細胞的軌跡。每組實驗重復三次，跟蹤細胞數目為30，結果取平均。如圖2所示，細胞的運動能力通過與流速方向的夾角系數（angle index，AI）、細胞平均運動速度（V）、梯度方向遷移位移（S）、總遷移距離（L）來表征。AI、V、L的相互關系見式（5）～（6），其中，T為圖像采集時間間隔。如式（5）所示，如果 小于90°，表示細胞順著流速方向進行遷移；如果 大于90°，表示細胞遷移運動未受到流速的影響。
圖2
細胞遷移分析方法
Figure2.
Cell migration analysis method
|
|
2 結果與討論
2.1 微流控芯片仿真分析
本文設計的微流控芯片依靠層流和擴散機制在細胞遷移主通道形成穩定的濃度梯度，需考慮以下問題：① 溶液體積以及溶液粘度和通道結構變化可能會導致趨化因子注入口和培養液注入口壓力不平衡，并影響細胞遷移主通道中濃度梯度的創建；② 通道1（通道4）和通道2（通道3）的結構略有差異，是否會導致成像區域內的濃度梯度存在較大差異而造成分析結果不準確；③ 如果梯度通道流速較大，細胞的趨化遷移運動將不可避免地受到流體剪切力的影響，是否會影響結果。
為演示設計原則，我們將不同設計模式的微流控芯片簡化為等效電路模型[20]。如圖3所示，P1和P2分別為趨化因子注入口和細胞培養液注入口的壓力，R為通道流阻，C為通道濃度，Q1和Q2為第一S型微通道和第二S型微通道中的體積流量。特別地，第一S型通道和第二S型通道直接匯聚，隨后流向下游通道的設計方案稱之為直接接觸平衡方式（見圖3a）。第一S型通道和第二S型通道通過水平壓力平衡通道進行隔離稱之為水平接觸平衡方式（見圖3b）。水平壓力平衡通道的長度推薦設計為≥2d，其中d表示S型通道的寬度（見圖3b）。
圖3
微流控芯片的等效模型
a. 直接接觸設計模式；b. 水平通道接觸設計模式
Figure3. The equivalent model of the microfluidic chipa. design model of direct contact; b. design model of horizontal channel contact
首先，我們討論了芯片上設置高流阻的S型通道的必要性。式（7）表達了體積流量與流體通道中的壓力梯度和流體阻力之間的關系。當趨化因子注入口和細胞培養液注入口注入試劑的體積存在差異時，通過增加通道流阻，可以減小體積流量差異。
|
接著，我們采用3D繪圖軟件分別繪制了通道1和通道2。通道1的仿真結果表明，若入口壓力平衡（P1 = 70 Pa，P2 = 70 Pa），第一S型微通道和第二S型微通道之間設置水平壓力平衡通道時，遷移運動成像區域初始位置梯度曲線更陡，梯度差值為 = 92.5 mol·L?1·m?3，高于直接接觸（64.1 mol·L?1·m?3）（見圖4a、c、e、g）。成像區域的初始位置和終止位置如圖4a～b所示。通道2仿真結果與通道1基本一致，最大梯度差值為 97.5 mol·L?1·m?3，高于直接接觸方式（74.5 mol·L?1·m?3）（見圖4b、d、f、h）。這是因為第一和第二S型微通道的高流阻引起流速減緩，會加快趨化因子和細胞培養液之間的預擴散。水平壓力平衡通道有效緩解了預擴散效應，有利于在細胞遷移主通道產生范圍較寬的濃度梯度。
圖4
入口壓力相同時，通道1和通道2初始位置處濃度梯度仿真結果
a～b. 通道1和通道2的S型微通道處的仿真圖像；c～d. 通道1和通道2細胞遷移主通道處的仿真圖像；e～f. 通道1和通道2細胞遷移主通道中初始位置處的梯度仿真曲線；g～h. 通道1和通道2細胞遷移主通道中初始位置處的梯度最大值和最小值的差值對比結果
Figure4. Simulation results of concentration gradient at the initial position of the channel 1 and 2 when the inlet pressure is the samea-b. simulation images of the S-type microchannels of channel 1 and channel 2; c-d. simulation images of the cell migration main channel of channel 1 and channel 2; e-f. the gradient simulation curve of channel 1 and channel 2 at the initial position of cell migration main channel; g-h. the comparison results of the difference between the maximum and minimum gradients of channel 1 and channel 2 at the initial position of cell migration main channel
然后，我們研究了入口壓力不平衡時（P1 = 50 Pa，P2 = 70 Pa），水平壓力平衡通道平衡設置的必要性。P1 = 50 Pa表示加入試劑的體積未裝滿試劑注入口。通道1仿真結果表明，設置水平壓力平衡通道后，成像區域初始位置的梯度曲線更加陡峭，濃度梯度差值為 = 86.5 mol·L?1·m?3，高于直接接觸方式（59.7 mol·L?1·m?3）（見圖5a、c、e）。通道2仿真結果與通道1基本一致（見圖5b、d、f）。
圖5
入口壓力不相同時，通道1和通道2的初始位置處的濃度梯度仿真結果
a～b. 通道1和通道2的仿真圖像；c～d. 通道1和通道2細胞遷移主通道初始位置處的梯度仿真曲線；e～f. 通道1和通道2細胞遷移主通道初始位置處的梯度最大值和最小值的差值對比結果
Figure5. Simulation results of concentration gradient at the initial position of the channel 1 and 2 when the inlet pressure is not the samea-b. simulation images of channel 1 and channel 2; c-d. the gradient simulation curve of channel 1 and channel 2 at the initial position of the cell migration main channel; e-f. the comparing result of the difference between the maximum and minimum gradients of channel 1 and channel 2 at the initial position of the cell migration main channel
隨后，我們研究了入口壓力不平衡（P1 = 50 Pa，P2 = 70 Pa）時，成像區域不同位置處濃度梯度的差異。通道1仿真結果表明，成像區域初始位置的濃度梯度差值為 = 86.8 mol·L?1·m?3（見圖6a、c），與通道2基本一致（86.6 mol·L?1·m?3）（見圖6b、d）。此外，第一通道終止位置處的最大濃度梯度差值為 = 75.4 mol·L?1·m?3，與通道2基本一致（80.8 mol·L?1·m?3）。初始和終止位置處的差異來源于物質擴散。進一步地，繪制了通道1與通道2成像區域初始位置和終止位置的濃度梯度仿真曲線，發現盡管通道1和通道2的結構存在一定差異，但兩者成像區域相同位置（初始或終止）的濃度梯度分布基本一致（見圖6e、f），這對于同時研究四個通道中的細胞遷移行為至關重要。
圖6
入口壓力不相同時，通道1和通道2的初始位置和終止位置處的濃度梯度仿真結果
a～b. 通道1和通道2的仿真圖像；c～d. 通道1和通道2細胞遷移主通道初始位置和終止位置處的梯度最大值和最小值的差值對比結果；e. 通道1、2、3、4的仿真圖像整合；f. 通道1和通道2初始位置和終止位置處的梯度仿真曲線對比圖
Figure6. Simulation results of concentration gradient at the initial and termination positions of the channel 1 and channel 2 when the inlet pressure is not the samea-b. simulation images of channel 1 and channel 2; c-d. comparison results of the difference between the maximum and minimum gradients at the initial position and the end position of the cell migration main channel of channel 1 and channel 2; e. simulation image of channels 1, 2, 3, and 4; f. comparison chart of gradient simulation curves at the initial and end positions of channel 1 and channel 2
最后，我們研究了細胞遷移主通道中的速度場分布，目的在于分析剪切應力對細胞的影響。如圖7a所示，速度分布在大多數層流情況下呈拋物線。近壁面處，由流體產生的剪切應力被稱為“壁剪切應力”（見圖7b）。仿真結果表明，入口壓力平衡（P1 = 70 Pa，P2 = 70 Pa）時，通道1和通道2在距離基底5 μm處（中性粒細胞直徑約為10 μm）的最大理論流速分別為61.1 μm·s?1和75.8 μm·s?1（分別見圖7c、e、g和圖7d、f、h）。對于矩形通道，h為矩形高度，w為矩形寬度，l為矩形長度，當h<w<<l時，管壁剪應力的計算方法為[21]：
圖7
細胞遷移主通道中的流速仿真結果
a. 層流通道中的流速分布模型；b. 層流通道中的剪切應力分布模型；c～d. 通道1和通道2細胞遷移主通道中的流速仿真圖像；e～f. 通道1和通道2細胞遷移主通道中垂直方向的流速分布；g～h. 通道1和通道2細胞遷移主通道中梯度方向的流速分布
Figure7. Simulation results of flow velocity in main cell migration channela. flow velocity distribution model in laminar flow channel; b. shear stress distribution model in laminar flow channel; c-d. simulation image of flow velocity in the cell migration main channel of channel 1 and channel 2; e-f. the velocity distribution in the vertical direction of the cell migration main channel of channel 1 and channel 2; g-h. the velocity distribution in the gradient direction of the cell migration main channel of channel 1 and channel 2
|
其中是流體的粘度，Q為流速，h和w定義如圖所示。粗略計算最大剪切應力為12.73 dyn·cm?2，位于人動脈血管的平均剪應力范圍內（2～20 dyn·cm?2）[22]，細胞在此流速條件下可以實現正常遷移。
2.2 微流控芯片表征
采用雙層光刻技術制備微流控芯片的基本流程如圖8a所示，芯片實物如圖8b所示。試劑注入口的直徑約為5 mm，最多可盛裝約120 μL的試劑。圖8c表明芯片邊緣整齊，結構清晰。圖8d清晰展現了細胞在定位通道、隔離帶邊緣和遷移主通道中的分布情況。
圖8
芯片制作過程及實物示意圖
a. 芯片制備過程；b. 芯片實物圖，c. 單一顯微鏡視野下4個細胞遷移主通道圖像；d. 單一顯微鏡視野下細胞定位通道和細胞遷移主通道中的細胞分布圖像（細胞已經穿過細胞隔離帶）
Figure8. Fabrication process of microfluidic chip and physical diagrama. fabrication process; b. a physical picture of microfluidic chip; c. images of cell migration channel 1, 2, 3, 4 under a single microscope field; d. cell distribution in the localization channel and main migration channel under a single microscope field (cells have crossed the cell isolation zone)
進一步地，我們將120 μL濃度為5.0 μmol·L?1的熒光素溶液與去離子水分別注入趨化因子注入口和細胞培養液注入口，熒光梯度形成之后，連續采集熒光圖像15 min。圖9a展示了4個細胞遷移主通道中的熒光梯度圖像。圖9b展示了水平壓力平衡通道處的熒光圖像，未發現第一和第二S型微通道發生預擴散。分析4個細胞遷移主通道中的熒光強度曲線，發現通道1和通道4中的熒光梯度曲線與仿真結果基本一致（見圖9c），通道2和通道3中的結果相似（見圖9d）。隨后，我們進一步分析了4個細胞遷移主通道中的熒光梯度曲線隨時間的變化情況。發現0 min時，4個細胞遷移主通道中的梯度曲線形狀一致（見圖9e）；15 min后，熒光梯度曲線基本保持不變（見圖9f）。進一步地，我們將120 μL細胞溶液注入微流控芯片的趨化因子入口和細胞培養液入口，當細胞運動到遷移主通道時，每隔1 s采集細胞在遷移主通道中隨液流的漂移圖像。粗略計算結果表明，液流流速約為60 μm·s?1，與仿真結果基本一致（見圖9g）。
圖9
微流控芯片的性能表征
a. 4個細胞遷移主通道中的熒光圖像；b. 水平壓力平衡通道處的熒光圖像；c. 通道1和通道4的熒光梯度曲線與仿真結果對比；d. 通道2和通道3的熒光梯度曲線與仿真結果對比；e. 0 min時，4個細胞遷移主通道中的熒光梯度曲線圖；f. 15 min時，4個細胞遷移主通道中的熒光梯度曲線圖；g. 細胞遷移主通道的流速計算方法
Figure9. Performance characterization of microfluidic chipa. fluorescent gradient images in cell migration channel 1, 2, 3, 4; b. fluorescence image at the horizontal pressure equilibrium channel; c. comparison of the fluorescent gradient curves between the cell migration channel 1, 4 and the simulation result; d. comparison of the fluorescent gradient curves between the cell migration channel 2, 3 and the simulation result; e. gradient curves in the channel 1, 2, 3, 4 at 0 min; f. gradient curves in the cell migration channel 1, 2, 3, 4 at 15 min; g. velocity calculation in the cell migration channel
2.3 基于微流控芯片研究AGEs對中性粒細胞趨化性的影響
首先，我們將經過0、0.2、0.5、1.0 μmol·L?1 AGEs前處理的中性粒細胞（取懸浮液15 μL）注入微流控芯片，然后將120 μL濃度為100 nmol·L?1的fMLP和0.4%牛血清白蛋白培養基分別注入趨化因子注入口和細胞培養液注入口，隨后觀察中性粒細胞的趨化遷移行為。細胞遷移主通道形成濃度梯度后，位于細胞定位通道中的中性粒細胞將發生極化和形變，并通過細胞隔離帶進入遷移主通道。圖10a和圖10b展示了0 min和15 min時遷移主通道中的細胞分布圖像。0 min時，細胞被細胞隔離帶阻隔。15 min時，細胞遷移進入主通道。由于細胞沿梯度方向的遷移運動過程隨機，并不是徑直朝向梯度方向運動，因此絕大多數細胞并未越過細胞遷移主通道的中軸線（見圖10b）[23]。
圖10
細胞遷移分析
a. 0 min時，細胞分布圖像；b. 15 min時，細胞分布圖像；c. 細胞角度系數分析；d. 細胞平均運動速度分析；e. 梯度位移分析；f. 總遷移距離分析
Figure10. Analysis of cell migration dataa. images of cell distribution at 0 min; b. images of cell distribution at 15 min; c. analysis of the angle index; d. analysis of the mean velocity; e. analysis of the migration distance along the gradient direction; f. analysis of the total migration distance
圖10c給出了細胞的AI分析數據。結果表明，正常組中性粒細胞的AI值為正數，而經過0.2 μmol·L?1 AGEs處理的中性粒細胞的AI值為負數。因此，我們推斷0.2 μmol·L?1 AGEs損傷了中性粒細胞的趨化性，表現為細胞黏附性下降和偏向梯度方向運動。進一步地，發現0.5 μmol·L?1 AGEs組的AI值小于0.2 μmol·L?1 AGEs組，而0.5 μmol·L?1 AGEs組的AI值與1.0 μmol AGEs組基本相同。前人研究發現，AGEs可與中性粒細胞膜上的AGE受體（RAGE）相互作用，導致跨內皮細胞遷移和殺菌能力下降[24]。結合當前的實驗結果可以初步推斷，當RAGE被完全占據之后，持續提高AGEs濃度將不會對中性粒細胞的黏附性產生持續性的抑制。在此基礎上，進一步分析了細胞的V、S和L。圖10d、f結果表明，AGEs處理的中性粒細胞的V和L值均小于對照組，且隨著AGEs用量升高（0.2～1.0 μmol·L?1），V和L值逐漸下降，與AGEs濃度呈負相關關系。圖10e結果表明，0.2 μmol·L?1 AGEs組的S值小于對照組細胞，與0.5 μmol·L?1 AGEs組基本相同，但高于1.0 μmol·L?1 AGEs組。總之，從遷移分析數據可以看出，隨著AGEs濃度的升高，中性粒細胞趨化性受到損害。過往研究已經表明，被AGEs激活時，中性粒細胞內鈣離子信號轉導異常，造成胞內鈣離子增加，從而抑制其趨化性，而通過胰島素治療控制血糖后，功能實現逆轉[25-26]。此外，過往的研究已經表明高血糖將加速AGEs的生成，而AGEs與糖尿病患者免疫功能低下及血管并發癥（動脈粥樣硬化等）的發生發展密切相關[24,27-28]。我們的結果則基于微流控芯片證明AGEs影響了中性粒細胞的遷移行為，為從細胞功能表型角度闡釋AGEs與糖尿病患者免疫功能低下之間的相互關系提供了基本數據參考。
3 結論
本文設計了一款集成了S型微通道、水平壓力平衡通道等特征的微流控芯片，并借助Comsol Multiphysics有限元分析軟件完成仿真設計。微流控芯片還集成了細胞定位通道和細胞隔離帶，確保細胞從同一起跑線開始遷移。特別地，本文提出的微流控芯片允許同時觀測四種不同梯度環境下細胞的遷移行為，提高了實驗結果分析的準確性和工作效率。使用濃度為0、0.2、0.5、1.0 μmol·L?1的AGEs孵育中性粒細胞，驗證了芯片的可靠性和適用性。實驗結果發現AGEs可抑制中性粒細胞的趨化遷移行為。在后續研究中，通過改變芯片上細胞定位通道和細胞隔離帶的設計尺寸并配合使用其他化學趨引因子，芯片也可適用于癌細胞、T細胞、自然殺傷細胞的趨化遷移行為研究。本研究旨在為基于微流控技術的細胞趨化性研究提供芯片設計思想和方法參考。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：李慧來和楊柯設計實驗和撰寫論文，李慧來和吳曉松進行數據收集和數據分析，楊逍和李志剛進行芯片設計和文中圖片潤色，洪承剛進行芯片制備，劉勇和朱靈指導實驗和修改論文。
倫理聲明：本研究通過了中國科學院合肥物質科學研究院醫學倫理委員會的審批（批文編號：Y-2018-21）。
