泡沫穩定性影響泡沫硬化療法的療效及副作用發生率。探究泡沫壓差與泡沫穩定性的關系,能夠為獲得更穩定的泡沫提供思路和依據。實驗選用魚肝油酸鈉泡沫,添加不同濃度的泊洛沙姆188(濃度為0%、4%、8%、12%)實現泡沫壓差的改變。使用自編程序處理泡沫圖片,獲得泡沫壓差以及泡沫的穩定性指標(析水率曲線、半衰期)與泡沫壓差的關系。研究結果顯示,不同時間段內的泡沫壓差先隨濃度增加而增加,再隨濃度增加而減小,在濃度4%時達到峰值。泡沫壓差隨衰變時間的增加不斷減小;添加劑為低濃度時,泡沫平均壓差增加,添加劑濃度過高卻會使泡沫平均壓差減小;泡沫壓差越小,泡沫穩定性越好。本文為泡沫硬化劑穩定性的研究奠定基礎。
引用本文: 白逃萍, 劉繼徹, 蔣文濤, 李亞蘭. 泡沫壓差與泡沫穩定性關系的實驗研究. 生物醫學工程學雜志, 2022, 39(2): 353-358. doi: 10.7507/1001-5515.202104009 復制
引言
下肢靜脈曲張是靜脈系統常見病,發病率約為40%。泡沫硬化療法是靜脈曲張的治療手段之一。該療法將液態硬化劑(如聚多卡醇、魚肝油酸鈉等)按一定體積比與氣體(如空氣、CO2、CO2/O2等)混合形成泡沫,再將泡沫注射入曲張節段,使靜脈血管纖維條索化并堵塞血液,讓曲張靜脈閉塞[1-2]。泡沫硬化療法以操作簡單、微創、炎癥反應低且療效可觀等優點逐漸被患者認可[3-4]。但泡沫硬化療法仍面臨諸多副作用[5],如肺動脈栓塞、深部靜脈血栓、視覺障礙、靜脈炎等[6-7];而泡沫的衰變與這些副作用直接相關[8-10]。因此,泡沫的穩定性一直是泡沫硬化療法重點關注的問題之一[11-14]。
Tessari法是規范化制備泡沫的常用方法之一,由氣體和液體按一定比例,利用注射器垂直相連來回推注混合,形成均勻穩定的泡沫[15-18]。Cameron等[19]研究發現了氣體成分對泡沫結構和穩定性的影響;文獻[20-23]發現了藥物濃度對泡沫穩定性存在影響。諸多學者對制備方式、推注速度、藥物、氣體種類等進行了大量實驗研究,獲得了一些特定的結果[24-28],但均無法統一表征泡沫穩定性。而泡沫的衰變主要由氣體擴散和排液引起,排液主要由重力及表面張力引起,氣體擴散的原動力是泡沫的內外壓差,而壓差主要由泡沫直徑和表面張力獲得,因此壓差是表征泡沫衰變原因的重要指標。為此,本研究擬通過實驗測試,獲得壓差及半衰期規律,并探索兩者之間的關系。
本研究能夠獲取泡沫內部的相關數據和規律,為臨床硬化劑泡沫的穩定性改善提供基礎,并為其他泡沫研究提供數據支撐和相關思路。
1 材料和方法
1.1 實驗材料
魚肝油酸鈉注射液(H31022749,上海信誼金朱藥業有限公司,中國)、泊洛沙姆188(P-188)(9003-11-6,BASF,德國)、5 mL注射器(5 mL,江西洪達醫療器械集團有限公司,中國)、三通閥(FS-3002,廣東百合醫療科技有限公司,中國)、載玻片、蓋玻片。
本文在研究過程中使用了如下的測量儀器和計算分析軟件:
(1)千分之一天平(JA303P,常州市幸運電子設備有限公司,中國);
(2)攝像機(FDR-AX45,索尼,日本);
(3)電子顯微鏡(BX53,奧林巴斯,日本);
(4)表面張力儀(BZY200,上海方瑞儀器有限公司,中國);
(5)統計產品與服務解決方案軟件SPSS(17.0, SPSS Inc., 美國)
1.2 實驗方法及步驟
本實驗由兩部分組成:
第一部分:制備不同濃度的P-188泡沫并研究其泡沫穩定性。魚肝油酸鈉和空氣按照1:4比例用Tessari法制備泡沫。實驗步驟:① 室溫20℃,以千分之一天平稱取質量為0、10、20、30 mg的P-188,分別溶解在5 mL魚肝油酸鈉注射液中,再按每支注射器1 mL的體積分裝到20支5 mL注射器中,獲得P-188濃度分別為0%、4%、8%、12%的魚肝油酸鈉溶液;② 用5 mL注射器抽取4 mL空氣。將魚肝油酸鈉溶液和空氣通過三通閥垂直連接后,由同一實驗人員來回推注20次,得到均勻的魚肝油酸鈉泡沫;③ 記錄制備完成的時間,然后將制備得到的泡沫迅速從注射器取下,豎直放置在桌面上靜置,并用攝像機記錄下泡沫衰變的全部過程;④ 重復此操作直至完成所有實驗及數據記錄;⑤ 整理實驗場地,對所記錄的實驗數據進行整合分析。
采用反復回放攝像機錄制的視頻來讀取相關數據,包括:① 析水率與對應時間,用以描述泡沫析水過程,該過程能夠很好地反映泡沫衰變的整個過程。其中,析水率=析水量/藥品總量。② 析水時間,即泡沫中出現可見液體時間。③ 半衰期,半衰期指泡沫析出液體達到原藥劑50%所用的時間。④ 泡沫半衰期的體積量,即泡沫半衰期時剩余的泡沫量。
第二部分:獲取泡沫壓差的實驗。在電子顯微鏡下觀察其泡沫尺寸分布并計算各濃度下的泡沫壓差。使用表面張力儀測定添加不同濃度P-188后的泡沫硬化劑表面張力,結果如表1所示。具體的實驗步驟:① 制備魚肝油酸鈉泡沫樣品,并用電子顯微鏡對泡沫樣品進行預實驗,確定電子顯微鏡采用的目鏡和物鏡倍數,并確定大致焦距;② 利用Tessari方法制備泡沫;③ 記錄制備完成的時間,迅速取下后擠壓極少量泡沫至載玻片,并迅速將蓋玻片輕柔地蓋至泡沫處,得到單層泡沫樣本;④ 將泡沫樣本置于物鏡下,通過屏幕截圖同時記錄下此時物鏡下泡沫的尺寸分布以及該尺寸分布所對應的時間;⑤ 迅速調整樣本位置,使得屏幕掃描出樣品另一處的泡沫圖像,迅速通過屏幕截圖同時記錄下此時物鏡下泡沫的尺寸分布以及該尺寸分布所對應的時間,重復此步驟直至記錄下該泡沫樣品五處不同位置的尺寸分布圖像和該圖像記錄的相應時間;⑥ 重復此操作直至完成實驗及數據記錄;⑦ 整理實驗場地,對所記錄的實驗數據進行整合分析。

泡沫制備都在相同條件下進行數據處理。首先,因為單張圖片的泡沫數量多,圖片總量大,因此利用泡沫識別自編程序記錄的泡沫尺寸,識別超過95%以上的泡沫,認為值是可信的,如圖1所示藍色標記的泡沫,并根據比例計算得到實際的每個泡沫的尺寸。通過如式(1)所示計算出每組泡沫的壓差值。

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其中,P0為泡沫內部壓強,Px為泡沫外部的液體壓強(本實驗中默認外部壓力為0),σ為氣/液界面張力(通過表面張力儀測得,每個濃度下測量三次取平均值),r為泡沫半徑。最后,通過計算得到每組泡沫內外壓差的均值以及泡沫壓差分布。
2 結果
如圖2所示,從泡沫的析水過程總體曲線可以看出,泡沫在半衰期前的衰變較快,而在60%~70%衰變之后速度則越來越慢。在0%、4%、8%、12%四個不同表面活性劑濃度下的四個析水過程圖像具有相似的變化規律,以4%為例,泡沫衰變到60%所用平均時間為373 s,衰變速度較為迅速,而在析水率到達60%后,由析水率60%到析水率80%所用平均時間為509 s,衰變速度大大減緩。析水率達到0%、20%、40%、60%、80%時,標準誤差分別為6.8 s、9.2 s、13.0 s、21.6 s、28.3 s、97.2 s,隨著析水率的升高,離散度也越來越大。其余各濃度下的泡沫衰變過程都與4%濃度泡沫衰變過程具有類似規律。

如圖3所示的五個時間段泡沫顯微圖像,隨著時間的推移,泡沫的含液量逐漸減少,泡沫數量減少,直徑離散度增加,大泡沫數量增多,后期可能出現肉眼可見泡沫。說明隨著時間的推移泡沫直徑發生較大變化,如式(1)所示,泡沫直徑直接影響壓差大小,泡沫在不同時期的穩定性情況可以表征壓差的大小變化。

將所有泡沫直徑分類進行從小到大排序編號后,畫出如圖4所示泡沫分布規律。以直徑40 μm作為分界線,可以獲得不同時期大、小泡沫的數量分布規律。整體而言,小于40 μm的泡沫更多,最大泡沫直徑差異約5倍,最小泡沫約為10 μm,最大泡沫直徑不超過120 μm。四種濃度下,81~90 s時間段的小泡沫數量最少,大泡沫直徑更大,總數量減少。而81~90 s之前的時間段小泡沫數量差異較小,大泡沫有一定差異。濃度為12%時,泡沫總數量減少。

如圖5所示的平均直徑來看,整體增大,特別是4%濃度下,泡沫直徑最小,升高趨勢明顯。而0%濃度下,泡沫直徑變化不顯著。 泡沫平均直徑分布在20~24 μm之間。圖5平均壓差結果是通過泡沫平均直徑結果和表1中的表面張力代入式(1)獲得。整體而言,平均壓差隨著時間逐漸減小,最大幅度約為15 Pa。不同濃度下平均壓差的大小有一定差異,4%濃度時,壓差最大,8%濃度稍小,0%最小。表面活性劑的濃度對泡沫壓差具有一定影響。

實驗內容1獲得的半衰期與實驗內容2獲得的壓差之間的關系如圖6所示。隨著半衰期的增大平均壓差出現先增大后減小的趨勢,特別是在41~50 s的時間段內,泡沫平均壓差增大,半衰期增大。

3 討論
根據泡沫衰變的理論,氣體擴散和排液是泡沫衰變的主要過程。排液主要分為兩個階段,一是液體受到重力作用而析出,二是泡沫壓差導致氣泡表面的液體流動。此外,泡沫壓差也是氣泡間氣體擴散的主要原因之一,因此泡沫壓差和泡沫的衰變之間有著緊密的聯系。
如圖5所示,在任意濃度下的泡沫壓差隨時間不斷減小。在泡沫衰變的過程中,不斷發生氣體擴散,泡沫壓差的減小說明了泡沫的平均直徑在不斷增加。究其原因,一方面是小氣泡被大氣泡不斷吸收,小氣泡數量減小;另一方面是大氣泡吸收后自身氣泡體積增長。結果部分顯示了添加P-188的泡沫壓差比未添加組的泡沫壓差高,因為添加表面活性劑會改變液體的粘度,從而影響液體的表面張力,根據式(1),氣泡表面張力的提高會引起泡沫壓差的增加。但是,隨著添加P-188濃度的增大,泡沫壓差反而降低,原因可能是粘度的增加導致了液體流動速度的減緩,使得液膜變薄速度減緩,氣體擴散減少,大氣泡吸收小氣泡的速度變慢。如圖6所示,泡沫壓差先隨著半衰期的增長而增長,隨后減小,再增長,差異無統計學意義。可見,泡沫壓差隨時間的增加不斷減小,且在低P-188濃度下,添加劑會使泡沫平均壓差增加,但P-188濃度過高會反過來使得泡沫平均壓差減小。泡沫半衰期較短時,泡沫壓差隨半衰期增加而增加,到達峰值后減小。
泡沫在衰變過程中的氣體擴散會使得小氣泡被大氣泡吸收,小氣泡的數量減少,大氣泡的尺寸增加。泡沫析水會使得氣泡間液體變薄,反過來加速氣體擴散過程。氣體擴散和泡沫析水在導致泡沫平均壓差降低的同時,也會使泡沫壓差分布越來越不均勻。因此,泡沫壓差的分布也能夠作為對泡沫衰變速度快慢的一個衡量指標,這一觀點如圖4所示。
4 結論
泡沫穩定性方面,添加P-188能夠增加泡沫穩定性,并隨著P-188濃度的增加穩定性逐步增強,但增強的速度變緩。對泡沫平均壓差和泡沫穩定性的關系而言,泡沫壓差隨時間不斷減小,低濃度的P-188會使泡沫平均壓差增加,但過高濃度會使得泡沫平均壓差減小。泡沫壓差隨泡沫穩定性的增強出現先增加后減小的趨勢。
重要聲明
利益沖突聲明:本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明:白逃萍、劉繼徹進行實驗設想、實驗操作、數據整理、論文寫作,蔣文濤、李亞蘭進行實驗設想、論文修改等。
引言
下肢靜脈曲張是靜脈系統常見病,發病率約為40%。泡沫硬化療法是靜脈曲張的治療手段之一。該療法將液態硬化劑(如聚多卡醇、魚肝油酸鈉等)按一定體積比與氣體(如空氣、CO2、CO2/O2等)混合形成泡沫,再將泡沫注射入曲張節段,使靜脈血管纖維條索化并堵塞血液,讓曲張靜脈閉塞[1-2]。泡沫硬化療法以操作簡單、微創、炎癥反應低且療效可觀等優點逐漸被患者認可[3-4]。但泡沫硬化療法仍面臨諸多副作用[5],如肺動脈栓塞、深部靜脈血栓、視覺障礙、靜脈炎等[6-7];而泡沫的衰變與這些副作用直接相關[8-10]。因此,泡沫的穩定性一直是泡沫硬化療法重點關注的問題之一[11-14]。
Tessari法是規范化制備泡沫的常用方法之一,由氣體和液體按一定比例,利用注射器垂直相連來回推注混合,形成均勻穩定的泡沫[15-18]。Cameron等[19]研究發現了氣體成分對泡沫結構和穩定性的影響;文獻[20-23]發現了藥物濃度對泡沫穩定性存在影響。諸多學者對制備方式、推注速度、藥物、氣體種類等進行了大量實驗研究,獲得了一些特定的結果[24-28],但均無法統一表征泡沫穩定性。而泡沫的衰變主要由氣體擴散和排液引起,排液主要由重力及表面張力引起,氣體擴散的原動力是泡沫的內外壓差,而壓差主要由泡沫直徑和表面張力獲得,因此壓差是表征泡沫衰變原因的重要指標。為此,本研究擬通過實驗測試,獲得壓差及半衰期規律,并探索兩者之間的關系。
本研究能夠獲取泡沫內部的相關數據和規律,為臨床硬化劑泡沫的穩定性改善提供基礎,并為其他泡沫研究提供數據支撐和相關思路。
1 材料和方法
1.1 實驗材料
魚肝油酸鈉注射液(H31022749,上海信誼金朱藥業有限公司,中國)、泊洛沙姆188(P-188)(9003-11-6,BASF,德國)、5 mL注射器(5 mL,江西洪達醫療器械集團有限公司,中國)、三通閥(FS-3002,廣東百合醫療科技有限公司,中國)、載玻片、蓋玻片。
本文在研究過程中使用了如下的測量儀器和計算分析軟件:
(1)千分之一天平(JA303P,常州市幸運電子設備有限公司,中國);
(2)攝像機(FDR-AX45,索尼,日本);
(3)電子顯微鏡(BX53,奧林巴斯,日本);
(4)表面張力儀(BZY200,上海方瑞儀器有限公司,中國);
(5)統計產品與服務解決方案軟件SPSS(17.0, SPSS Inc., 美國)
1.2 實驗方法及步驟
本實驗由兩部分組成:
第一部分:制備不同濃度的P-188泡沫并研究其泡沫穩定性。魚肝油酸鈉和空氣按照1:4比例用Tessari法制備泡沫。實驗步驟:① 室溫20℃,以千分之一天平稱取質量為0、10、20、30 mg的P-188,分別溶解在5 mL魚肝油酸鈉注射液中,再按每支注射器1 mL的體積分裝到20支5 mL注射器中,獲得P-188濃度分別為0%、4%、8%、12%的魚肝油酸鈉溶液;② 用5 mL注射器抽取4 mL空氣。將魚肝油酸鈉溶液和空氣通過三通閥垂直連接后,由同一實驗人員來回推注20次,得到均勻的魚肝油酸鈉泡沫;③ 記錄制備完成的時間,然后將制備得到的泡沫迅速從注射器取下,豎直放置在桌面上靜置,并用攝像機記錄下泡沫衰變的全部過程;④ 重復此操作直至完成所有實驗及數據記錄;⑤ 整理實驗場地,對所記錄的實驗數據進行整合分析。
采用反復回放攝像機錄制的視頻來讀取相關數據,包括:① 析水率與對應時間,用以描述泡沫析水過程,該過程能夠很好地反映泡沫衰變的整個過程。其中,析水率=析水量/藥品總量。② 析水時間,即泡沫中出現可見液體時間。③ 半衰期,半衰期指泡沫析出液體達到原藥劑50%所用的時間。④ 泡沫半衰期的體積量,即泡沫半衰期時剩余的泡沫量。
第二部分:獲取泡沫壓差的實驗。在電子顯微鏡下觀察其泡沫尺寸分布并計算各濃度下的泡沫壓差。使用表面張力儀測定添加不同濃度P-188后的泡沫硬化劑表面張力,結果如表1所示。具體的實驗步驟:① 制備魚肝油酸鈉泡沫樣品,并用電子顯微鏡對泡沫樣品進行預實驗,確定電子顯微鏡采用的目鏡和物鏡倍數,并確定大致焦距;② 利用Tessari方法制備泡沫;③ 記錄制備完成的時間,迅速取下后擠壓極少量泡沫至載玻片,并迅速將蓋玻片輕柔地蓋至泡沫處,得到單層泡沫樣本;④ 將泡沫樣本置于物鏡下,通過屏幕截圖同時記錄下此時物鏡下泡沫的尺寸分布以及該尺寸分布所對應的時間;⑤ 迅速調整樣本位置,使得屏幕掃描出樣品另一處的泡沫圖像,迅速通過屏幕截圖同時記錄下此時物鏡下泡沫的尺寸分布以及該尺寸分布所對應的時間,重復此步驟直至記錄下該泡沫樣品五處不同位置的尺寸分布圖像和該圖像記錄的相應時間;⑥ 重復此操作直至完成實驗及數據記錄;⑦ 整理實驗場地,對所記錄的實驗數據進行整合分析。

泡沫制備都在相同條件下進行數據處理。首先,因為單張圖片的泡沫數量多,圖片總量大,因此利用泡沫識別自編程序記錄的泡沫尺寸,識別超過95%以上的泡沫,認為值是可信的,如圖1所示藍色標記的泡沫,并根據比例計算得到實際的每個泡沫的尺寸。通過如式(1)所示計算出每組泡沫的壓差值。

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其中,P0為泡沫內部壓強,Px為泡沫外部的液體壓強(本實驗中默認外部壓力為0),σ為氣/液界面張力(通過表面張力儀測得,每個濃度下測量三次取平均值),r為泡沫半徑。最后,通過計算得到每組泡沫內外壓差的均值以及泡沫壓差分布。
2 結果
如圖2所示,從泡沫的析水過程總體曲線可以看出,泡沫在半衰期前的衰變較快,而在60%~70%衰變之后速度則越來越慢。在0%、4%、8%、12%四個不同表面活性劑濃度下的四個析水過程圖像具有相似的變化規律,以4%為例,泡沫衰變到60%所用平均時間為373 s,衰變速度較為迅速,而在析水率到達60%后,由析水率60%到析水率80%所用平均時間為509 s,衰變速度大大減緩。析水率達到0%、20%、40%、60%、80%時,標準誤差分別為6.8 s、9.2 s、13.0 s、21.6 s、28.3 s、97.2 s,隨著析水率的升高,離散度也越來越大。其余各濃度下的泡沫衰變過程都與4%濃度泡沫衰變過程具有類似規律。

如圖3所示的五個時間段泡沫顯微圖像,隨著時間的推移,泡沫的含液量逐漸減少,泡沫數量減少,直徑離散度增加,大泡沫數量增多,后期可能出現肉眼可見泡沫。說明隨著時間的推移泡沫直徑發生較大變化,如式(1)所示,泡沫直徑直接影響壓差大小,泡沫在不同時期的穩定性情況可以表征壓差的大小變化。

將所有泡沫直徑分類進行從小到大排序編號后,畫出如圖4所示泡沫分布規律。以直徑40 μm作為分界線,可以獲得不同時期大、小泡沫的數量分布規律。整體而言,小于40 μm的泡沫更多,最大泡沫直徑差異約5倍,最小泡沫約為10 μm,最大泡沫直徑不超過120 μm。四種濃度下,81~90 s時間段的小泡沫數量最少,大泡沫直徑更大,總數量減少。而81~90 s之前的時間段小泡沫數量差異較小,大泡沫有一定差異。濃度為12%時,泡沫總數量減少。

如圖5所示的平均直徑來看,整體增大,特別是4%濃度下,泡沫直徑最小,升高趨勢明顯。而0%濃度下,泡沫直徑變化不顯著。 泡沫平均直徑分布在20~24 μm之間。圖5平均壓差結果是通過泡沫平均直徑結果和表1中的表面張力代入式(1)獲得。整體而言,平均壓差隨著時間逐漸減小,最大幅度約為15 Pa。不同濃度下平均壓差的大小有一定差異,4%濃度時,壓差最大,8%濃度稍小,0%最小。表面活性劑的濃度對泡沫壓差具有一定影響。

實驗內容1獲得的半衰期與實驗內容2獲得的壓差之間的關系如圖6所示。隨著半衰期的增大平均壓差出現先增大后減小的趨勢,特別是在41~50 s的時間段內,泡沫平均壓差增大,半衰期增大。

3 討論
根據泡沫衰變的理論,氣體擴散和排液是泡沫衰變的主要過程。排液主要分為兩個階段,一是液體受到重力作用而析出,二是泡沫壓差導致氣泡表面的液體流動。此外,泡沫壓差也是氣泡間氣體擴散的主要原因之一,因此泡沫壓差和泡沫的衰變之間有著緊密的聯系。
如圖5所示,在任意濃度下的泡沫壓差隨時間不斷減小。在泡沫衰變的過程中,不斷發生氣體擴散,泡沫壓差的減小說明了泡沫的平均直徑在不斷增加。究其原因,一方面是小氣泡被大氣泡不斷吸收,小氣泡數量減小;另一方面是大氣泡吸收后自身氣泡體積增長。結果部分顯示了添加P-188的泡沫壓差比未添加組的泡沫壓差高,因為添加表面活性劑會改變液體的粘度,從而影響液體的表面張力,根據式(1),氣泡表面張力的提高會引起泡沫壓差的增加。但是,隨著添加P-188濃度的增大,泡沫壓差反而降低,原因可能是粘度的增加導致了液體流動速度的減緩,使得液膜變薄速度減緩,氣體擴散減少,大氣泡吸收小氣泡的速度變慢。如圖6所示,泡沫壓差先隨著半衰期的增長而增長,隨后減小,再增長,差異無統計學意義。可見,泡沫壓差隨時間的增加不斷減小,且在低P-188濃度下,添加劑會使泡沫平均壓差增加,但P-188濃度過高會反過來使得泡沫平均壓差減小。泡沫半衰期較短時,泡沫壓差隨半衰期增加而增加,到達峰值后減小。
泡沫在衰變過程中的氣體擴散會使得小氣泡被大氣泡吸收,小氣泡的數量減少,大氣泡的尺寸增加。泡沫析水會使得氣泡間液體變薄,反過來加速氣體擴散過程。氣體擴散和泡沫析水在導致泡沫平均壓差降低的同時,也會使泡沫壓差分布越來越不均勻。因此,泡沫壓差的分布也能夠作為對泡沫衰變速度快慢的一個衡量指標,這一觀點如圖4所示。
4 結論
泡沫穩定性方面,添加P-188能夠增加泡沫穩定性,并隨著P-188濃度的增加穩定性逐步增強,但增強的速度變緩。對泡沫平均壓差和泡沫穩定性的關系而言,泡沫壓差隨時間不斷減小,低濃度的P-188會使泡沫平均壓差增加,但過高濃度會使得泡沫平均壓差減小。泡沫壓差隨泡沫穩定性的增強出現先增加后減小的趨勢。
重要聲明
利益沖突聲明:本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明:白逃萍、劉繼徹進行實驗設想、實驗操作、數據整理、論文寫作,蔣文濤、李亞蘭進行實驗設想、論文修改等。