目前，常規神經電刺激產品僅提供可預設參數的恒定刺激模式，而新型時變刺激模式是拓展神經電刺激產品臨床應用的重要研究方向之一。為了便于在動物實驗中施行時變的電刺激，本研究設計利用LabVIEW軟件，控制通用的數據采集卡和電刺激器，構建了可輸出各種實時變化的脈沖序列集成刺激系統。它可以產生具有均勻、正態、伽馬和泊松等特定分布的時變脈沖間隔（IPI）脈沖序列，也可以產生其他任意時變IPI脈沖序列。此外，脈沖幅值、脈寬、雙相脈沖相間延時和脈沖序列時長等參數可調。該刺激系統的性能測試結果顯示，其輸出脈沖序列各種參數的誤差均小于1%。利用此系統生成間隔在5~10 ms范圍內隨機時變的脈沖序列，并用于大鼠海馬腦區進行動物實驗。實驗結果顯示，即使平均脈沖頻率同樣為130 Hz左右，隨機變頻刺激對于神經元群體的興奮作用顯著強于恒定頻率刺激。總之，本文設計的刺激系統可為研究和開發新型神經電刺激模式提供有用的工具。
引用本文： 楊剛生, 封洲燕, 鄭呂漂, 王兆祥. 時變參數神經電刺激系統的設計及其應用. 生物醫學工程學雜志, 2021, 38(6): 1144-1153. doi: 10.7507/1001-5515.202102028 復制
引言
深部腦刺激是近年來臨床神經外科領域新發展的重要技術之一[1]，已經在治療帕金森病中取得良好的療效，在治療難治性癲癇、抑郁癥、強迫癥等其他腦神經系統疾病中也展現了良好的應用前景[2]。目前深部腦刺激通常采用窄脈沖序列，其作用取決于脈沖參數的設置。包括脈沖頻率——即脈沖間隔（inter-pulse interval，IPI）的倒數，以及幅值（電流或電壓）、脈寬和刺激時長等。一旦參數設定，刺激期間保持恒定不變。其中，常規深部腦刺激的脈沖頻率為130 Hz左右，也被稱為高頻刺激（high frequency stimulation，HFS）。然而，這種常規的恒頻HFS有時無法獲得理想的療效，也無法滿足深部腦刺激技術推廣應用的需求；因此，亟需開發新型電刺激模式。
刺激新模式的發展方向之一是脈沖序列采用實時變化的IPI[3]。有研究表明，即使平均脈沖頻率一樣，IPI的變化也會改變HFS對于腦神經系統的作用[4-5]。例如，相比于130 Hz的恒頻HFS，某種平均脈沖頻率相同的時變IPI（服從均值為7.7 ms的泊松分布）的變頻刺激，可以更好地抑制大鼠癲癇[6]。而且，優化設計的時變IPI脈沖序列，在其平均脈沖頻率低于恒頻刺激頻率時，也可以達到與恒頻刺激相似的療效，從而減少電能消耗[3]。不過，與恒頻刺激相比，時變IPI刺激的療效有時并不一定更好[7-8]。神經細胞膜對于電刺激具有非線性的響應特性[9]，使得時變IPI的刺激可以產生多樣化的作用。而且，時變IPI的方式可以千變萬化，給開發新型神經刺激模式提供了廣闊的發展空間。然而，時變刺激對于神經系統的調控作用及其機制尚未明確，亟需開展大量實驗研究，來明確不同的時變刺激對于各種不同腦疾病的治療潛能。
雖然目前市場上提供的電刺激器產品有許多種，但通常只能產生恒定的或者規則地周期性變化的IPI，無法提供更多時變IPI序列用于實驗研究。例如，文獻中已報道的隨機分布的時變IPI脈沖序列有泊松、伽馬、正態和均勻分布等[6, 8, 10-11]，它們都無法由現成的電刺激器直接產生。雖然有些實驗室自行開發制作電刺激器，用于滿足各自實驗室的特定需求，但是無法產生任意時變IPI的序列。而且，自行研發硬件設備需要足夠的專業技術支持和較長的開發周期[12-13]。為了滿足時變神經電刺激實驗研究的需求，本文利用通用數據采集卡和圖形化編程軟件LabVIEW 13.0（National Instruments Inc.，美國），設計和實現了能夠產生任意時變信號的電刺激系統，并應用于大鼠海馬腦區電刺激實驗。該刺激系統可以為新型神經電刺激模式的開發和研究提供有用的工具。
1 方法
1.1 刺激系統的設計
如圖1 所示，刺激系統的硬件由個人計算機、數據采集卡（USB-6251, National Instruments Inc.，美國）和刺激器（2200，A-M Systems Inc.，美國）組成。其工作原理是：利用LabVIEW軟件自行設計，產生刺激波形的離散信號，經過數據采集卡的數模轉換后，變成模擬信號，接入刺激器的信號輸入端。該刺激器具備電氣隔離功能，且是模擬型刺激器，可以跟隨輸入的模擬信號，以電流或電壓模式輸出連續的刺激波形，還可選擇數檔不同的放大倍數。LabVIEW軟件同時通過數據采集卡的數字輸出端口之一（P0.0），輸出一路晶體管?晶體管邏輯（transisfor transisfor logic，TTL）電平信號，連接于刺激器的門控端，用于開閉其輸出。
圖1
刺激系統的硬件連接示意圖
Figure1.
Schematic diagram of the stimulation system
1.2 LabVIEW軟件的設計
刺激系統的LabVIEW軟件主要由圖形用戶界面（graphical user interface，GUI）和控制程序兩部分組成。控制程序包括：刺激波形生成模塊、時變IPI脈沖序列設計模塊、刺激序列處理和輸出模塊。
1.2.1 刺激脈沖波形的設計和生成方法
常規臨床深部腦刺激采用持續的脈沖序列，為了防止長時間持續刺激可能造成的組織損傷和電極腐蝕，需采用電荷平衡的先負后正雙相脈沖波形，即正相與負相的面積相等[14]。如圖2所示，具有相間延時的雙相脈沖的可調控參數包括負相和正相的幅值和脈寬、兩相之間的相間延時和IPI等，圖2中括號內所示數值僅為示例。本文采用數組存儲的離散數據來編碼脈沖序列，分辨率（即采樣率）可設置。若設為20 kHz，則可實現的最小脈寬為0.05 ms，滿足常用深部腦刺激脈寬大于0.06 ms的需求[15]。利用LabVIEW軟件的“基于持續時間的信號發生器” 虛擬儀器（virtual instrument，VI）分別生成正相和負相脈沖的數組片段，并在2個片段之間填充“0”構成相間延時，形成雙脈沖的編碼數組。重復此雙脈沖數組，并按照所需的IPI補足“0”元素，即獲得整個刺激序列，如圖2脈沖序列的編碼數組所示。本文利用這種數組方式實現下述各種時變IPI的刺激序列。
圖2
脈沖波形的設計方法
Figure2.
Design of pulse waveform
1.2.2 時變IPI脈沖序列的設計
除了常規恒頻脈沖序列之外，本文設計了兩類時變IPI脈沖序列：服從特定分布的隨機變化序列和外部讀入的任意序列。
（1）服從特定分布的隨機時變IPI序列
如圖3所示，隨機時變IPI的分布有4種：均勻、正態、伽馬和泊松分布。其中前3種分布為連續的，用LabVIEW的“連續分布的隨機數”VI生成；而泊松分布為離散的，用LabVIEW的“離散分布的隨機數”VI生成。決定各分布的參數分別為：均勻分布是IPI的最小和最大值；正態分布是均值和標準差；伽馬分布是均值和變異系數；泊松分布是均值。此外，設置默認IPI范圍（1～500 ms），以自動去除過短和過長的IPI。并將此默認范圍設計為用戶可修改。值得注意的是，圖3中除了自身為離散的泊松分布之外，其他分布中呈現的離散點是由如圖2所示數組的分辨率引起。
圖3
四種不同IPI分布及相應的脈沖序列小段示例
Figure3.
Four types of IPI distribution with examples of corresponding pulse episodes
（2）外部任意IPI序列讀取的方法
除了由LabVIEW軟件內部產生IPI序列之外，還設計了讀取事先由其他方法生成的IPI序列的方式。使用“讀取電子表格文件”VI，并在多態實例中選擇“雙精度”，以讀取純文本的單列格式的IPI數據。記事本等軟件工具編輯和生成的IPI序列純文本文檔都可以讀入，使得該刺激系統可以輸出任意IPI序列的脈沖刺激。
1.2.3 刺激波形輸出的設計
該刺激系統使用LabVIEW內置的NI-DAQmx驅動模塊來控制數據采集卡的數模轉換端口的信號輸出。在其中的“DAQmx創建通道”VI中，選擇第一個端口，將其設置為“單通道模擬電壓輸出”模式。在定時VI中選擇“有限采樣”模式，在多態VI選擇器中選擇“采樣時鐘”，并設置采樣率。在“DAQmx寫入”VI中將多態VI選擇器設置為一維雙精度浮點數的模擬信號采樣。將“DAQmx結束前等待”VI中的超時參數設置為“?1”，即無限等待模式。這樣，數據采集卡的數模轉換端口就可以將如圖2所示的刺激波形數組轉換為模擬電壓信號并輸出，再經過刺激器的電氣隔離，用于動物實驗，如圖1所示。
1.3 大鼠動物實驗
成年雄性斯潑累格·多雷(Sprague-Dawley)大鼠（250～400 g），購自浙江大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（浙）2018-0006。動物實驗方案經浙江大學實驗動物福利倫理審查委員會通過。大鼠腹腔注射氨基甲酸乙酯（批號：20200409，國藥集團化學試劑有限公司，中國上海）（劑量為：1.25 g/kg）麻醉之后，固定在腦立體定位儀上。打開左側顱骨，將一根16通道的陣列記錄電極（Poly2，NeuroNexus Technologies Inc.，美國）插入至海馬CA1區，再將一根同芯雙極刺激電極（CBCSG75，FHC Inc.，美國）插入至記錄位點上游的CA1區的輸入軸突Schaffer側支上，如圖4所示。通過刺激電極施加脈沖刺激，激活Schaffer側支，順向傳導并激活下游的神經元群體，就可以在記錄電極上記錄到刺激誘發的群峰電位（population spike，PS），如圖4右圖所示，為單脈沖刺激Schaffer側支誘發的神經元群體發放的PS。有關電極定位、實驗操作、刺激施加和信號記錄等詳見文獻[16]。
圖4
大鼠海馬CA1區電極位置示意圖
Figure4.
Schematic diagram of electrodes in the hippocampal CA1 region of rats
利用本文設計的刺激系統產生脈寬為0.1 ms的雙相對稱電流型脈沖序列，脈沖幅值為0.3～0.4 mA。IPI分為兩種：恒定7.5 ms和5～10 ms范圍內均勻隨機變化（平均值為7.5 ms）。兩者的平均脈沖頻率都是133 Hz，下文稱為順向高頻刺激（orthodromic high-frequency stimulation，O-HFS）。這兩種O-HFS的時長均為1 min。
在16通道記錄信號中，選取位于海馬CA1區胞體層的一個記錄通道，用于分析O-HFS期間誘發的PS的個數及幅值[17]。并以O-HFS首個脈沖誘發的PS幅值為基準，計算O-HFS期間PS的歸一化幅值。統計數據均以“均值±標準差”的形式表示。采用t檢驗評判恒定組與時變組之間差異是否具有統計學意義。“n”表示實驗大鼠的數量。
2 結果
2.1 刺激系統的功能實現
如圖5所示是刺激系統的GUI，上方為刺激脈沖序列顯示，下方為操作面板（分成序列生成和序列處理兩大部分）。
圖5
刺激系統的GUI
Figure5.
GUI of the stimulation system
“序列生成”中包括如下參數的設置：正負相脈寬和幅值、相間延時、輸出分辨率（即刺激波形的數模轉換分辨率）。還包括刺激模式選擇：“恒頻”、“隨機變頻”和“序列讀取”。另有“設置”按鈕用于所選刺激模式的參數設定，用彈窗實現。其中，“恒頻”的彈窗內可設定刺激頻率和時長；“隨機變頻”的彈窗內可選擇4種IPI分布之一，并設定相應的參數，如圖6所示為正態分布及其參數；“序列讀取”的彈窗內可選擇預先設計好的IPI序列文件及其路徑。“序列信息”框內顯示脈沖序列的相關信息，包括刺激模式、IPI分布及其參數、刺激時長、平均頻率和IPI的變化范圍等。
圖6
“隨機變頻”模式的參數設置對話窗
Figure6.
Dialog window of parameter setting in “random frequency” mode
“序列處理”中包含“序列保存”和“序列拼接”2個功能按鈕，可保存刺激系統生成的IPI序列，或者拼接已有IPI序列并保存。
最后，“輸出”和“停止”按鈕分別控制刺激波形輸出的啟動和中止。
2.2 脈沖波形和時變IPI序列的測試結果
刺激系統產生的脈沖序列最終由刺激器輸出。將此刺激器的輸出模式分別設置為電壓（1 V/V檔位）和電流（0.1 mA/V檔位），并在GUI中設定脈沖波形參數為：負相、正相的脈寬和幅值分別為0.1 ms、?3 V和0.3 ms、1 V，相間延時為1 ms，如圖5所示。測得刺激器輸出的脈寬（即半高寬）、幅值、上升沿時間和下降沿時間如表1所示。實測的脈沖波形如圖7所示。電流輸出模式時，在刺激器輸出端連接一個電阻（如10 kΩ），將電流波形轉換為電阻兩端的電壓進行測量。如表1所示，刺激系統輸出的脈寬誤差都小于0.3%，幅值誤差都小于0.7%。
表1
脈沖波形參數的測試結果（脈沖個數=5 000）
Table1.
Test results of pulse waveform parameters (number of pulses=5 000)
圖7
實測脈沖波形
Figure7.
Measurements of pulse waveforms
服從4種分布的不同時變IPI序列各5組的測試結果表明，所有60 s時長脈沖序列的IPI測試值與理論值之間的均方根誤差均小于0.001 5 ms。如圖8所示為這些脈沖序列的相對誤差（|測量值—理論值|/理論值）的分布，相對誤差均小于0.6%。箭頭所指為各種序列數據中相對誤差小于0.05%的IPI個數占比，均大于87%。可見，刺激系統輸出脈沖序列的IPI具有足夠高的精度。
圖8
服從4種分布的時變IPI的實測值的相對誤差直方圖
Figure8.
Histogram of normalized errors of measured values of time-varying IPI for the four types of distributions
2.3 刺激系統在動物實驗中的應用
為了考察此刺激系統在動物實驗中的應用，分別生成恒定頻率（133 Hz，IPI = 7.5 ms）和隨機時變（平均頻率133 Hz，IPI = 5～10 ms）的1 min時長的脈沖序列，施加于大鼠海馬CA1區的輸入軸突Schaffer側支上，形成2種O-HFS刺激，如圖4所示。在這兩種刺激下，首個脈沖均誘發了幅值相似的PS，且初期的誘發響應相似，如圖9上圖、中圖所示。但恒定IPI的O-HFS期間，PS僅在刺激初期持續了（8.8 ± 2.6）s（n = 7），之后的刺激脈沖不再誘發明顯的PS。這可能是由于高頻脈沖刺激引起軸突阻滯，減弱了刺激對于下游神經元的興奮作用[16, 18]。但是，在平均脈沖頻率同樣為133 Hz的時變IPI的整個1 min的O-HFS期間，幾乎均存在大幅值的PS，有時刺激剛結束時還有PS跟隨。時變IPI刺激誘發的PS持續時間達（60.3 ± 2.4）s（n = 7），大于恒頻刺激，差異具有統計學意義（t-test，P < 0.01），如圖9左下圖所示。時變IPI刺激誘發的PS發放率和PS的歸一化幅值大于恒頻刺激誘發的數值，差異都具有統計學意義（t-test，P < 0.01），如圖9中下圖和右下圖所示。這些結果表明，時變IPI的脈沖刺激對于下游神經元群體具有更強的興奮作用。需要注意的是，圖9中兩個虛線框內的紅色倒三角和虛線指示已去除的刺激偽跡，去偽跡方法詳見文獻[18]。
圖9
神經元群體對恒定IPI和時變IPI的O-HFS的不同響應
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3 討論
本文利用LabVIEW軟件進行設計，控制通用的刺激器，實現了時變參數的刺激，為神經電刺激的實驗研究提供了新工具。而且，應用此刺激系統的大鼠實驗結果表明，恒頻和變頻的脈沖刺激對于海馬腦區的神經元群體具有不同的調控作用。下面分析該刺激系統的特點和神經元響應時變刺激的可能機制。
該刺激系統的首要特點是，可以輸出任意時變IPI的刺激序列，這是市場上的現成刺激器產品不具備的功能。該系統不僅可以產生具有特定分布的隨機時變IPI的脈沖序列，滿足已有報道的刺激模式的實驗需求[6, 8, 10-11]；而且，還具有讀取IPI序列文檔的功能，可以產生任意脈沖序列；此外，還有序列拼接功能，可輸出多種序列組合后的更復雜的刺激序列，便于探索和開發更廣泛的神經電刺激新模式。性能測試結果表明，該系統的輸出具有足夠高的時間精度。之前雖然有利用類似硬件裝置實現的刺激系統，但只能輸出規則變化的刺激序列[19]，不能產生隨機時變刺激。
該刺激系統的另一個特點是，硬件配置簡單，僅需通用的數據采集卡和刺激器，普通實驗室容易配備。而且，系統的GUI簡潔、操作簡單；利用分級彈窗設置參數，靈活且避免了界面繁雜。刺激系統的軟件用LabVIEW開發，非專業編程人員也容易理解這種圖形化編程語言，可以自行進行軟件的二次開發，以擴展功能。
此外，本文利用該刺激系統在大鼠海馬腦區的在體實驗中，比較了恒定IPI與隨機時變IPI的高頻刺激O-HFS的作用。在施加的脈沖數量相同（即平均頻率相同）的情況下，兩種刺激對于神經元群體具有不同的興奮作用。持續的恒定IPI刺激由于引起間歇性軸突阻滯[16, 20]，對于下游神經元的活動具有去同步作用[21-22]；因此，除了O-HFS起始階段之外，后續刺激不再誘發神經元群體同步發放動作電位而形成的PS（如圖9上圖所示）。但是，隨機時變IPI的刺激，即使IPI僅在5～10 ms微小范圍內變化，卻仍然能夠持續誘發神經元同步發放PS（如圖9中圖所示）。只是PS的發放率僅約為（16.6±3.3）個/s（如圖9下中圖所示），遠小于刺激脈沖的頻率133 Hz，這表明時變IPI的持續刺激仍然可能在輸入軸突上產生軸突阻滯而削弱部分脈沖的作用。神經細胞膜對于電刺激的響應具有非線性特性[9]，每個刺激脈沖之后不同長度的時變IPI會導致軸突膜獲得不同程度的恢復[23]；而且，軸突上刺激誘導的興奮傳導至軸突末梢，經突觸傳遞，再經過下游神經元的整合，才能誘發下游神經元發放動作電位。這一系列過程都會導致神經元及其群體發放的改變，其中的機制有待深入研究。之前的研究表明，恒頻和變頻這兩種刺激在抑制癲癇和控制帕金森病等不同疾病時獲得的效果不同[6-8, 24]，本文所示的神經元群體對于這兩種刺激的不同響應提供了線索。
總之，本文設計的電刺激系統能夠產生新型的時變刺激模式，用于研究時變刺激和恒定刺激的不同作用，這對于研究腦神經系統的活動機制以及開發電刺激治療腦疾病的新方法都具有重要意義。除了可用于深部腦刺激研究之外，具有各種時變參數的刺激還可用于其他電刺激研究，如神經肌肉電刺激、經皮神經電刺激和脊髓電刺激等[25-26]。時變刺激在這些電刺激技術中的應用和開發，有利于更多神經系統疾病的治療。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
深部腦刺激是近年來臨床神經外科領域新發展的重要技術之一[1]，已經在治療帕金森病中取得良好的療效，在治療難治性癲癇、抑郁癥、強迫癥等其他腦神經系統疾病中也展現了良好的應用前景[2]。目前深部腦刺激通常采用窄脈沖序列，其作用取決于脈沖參數的設置。包括脈沖頻率——即脈沖間隔（inter-pulse interval，IPI）的倒數，以及幅值（電流或電壓）、脈寬和刺激時長等。一旦參數設定，刺激期間保持恒定不變。其中，常規深部腦刺激的脈沖頻率為130 Hz左右，也被稱為高頻刺激（high frequency stimulation，HFS）。然而，這種常規的恒頻HFS有時無法獲得理想的療效，也無法滿足深部腦刺激技術推廣應用的需求；因此，亟需開發新型電刺激模式。
刺激新模式的發展方向之一是脈沖序列采用實時變化的IPI[3]。有研究表明，即使平均脈沖頻率一樣，IPI的變化也會改變HFS對于腦神經系統的作用[4-5]。例如，相比于130 Hz的恒頻HFS，某種平均脈沖頻率相同的時變IPI（服從均值為7.7 ms的泊松分布）的變頻刺激，可以更好地抑制大鼠癲癇[6]。而且，優化設計的時變IPI脈沖序列，在其平均脈沖頻率低于恒頻刺激頻率時，也可以達到與恒頻刺激相似的療效，從而減少電能消耗[3]。不過，與恒頻刺激相比，時變IPI刺激的療效有時并不一定更好[7-8]。神經細胞膜對于電刺激具有非線性的響應特性[9]，使得時變IPI的刺激可以產生多樣化的作用。而且，時變IPI的方式可以千變萬化，給開發新型神經刺激模式提供了廣闊的發展空間。然而，時變刺激對于神經系統的調控作用及其機制尚未明確，亟需開展大量實驗研究，來明確不同的時變刺激對于各種不同腦疾病的治療潛能。
雖然目前市場上提供的電刺激器產品有許多種，但通常只能產生恒定的或者規則地周期性變化的IPI，無法提供更多時變IPI序列用于實驗研究。例如，文獻中已報道的隨機分布的時變IPI脈沖序列有泊松、伽馬、正態和均勻分布等[6, 8, 10-11]，它們都無法由現成的電刺激器直接產生。雖然有些實驗室自行開發制作電刺激器，用于滿足各自實驗室的特定需求，但是無法產生任意時變IPI的序列。而且，自行研發硬件設備需要足夠的專業技術支持和較長的開發周期[12-13]。為了滿足時變神經電刺激實驗研究的需求，本文利用通用數據采集卡和圖形化編程軟件LabVIEW 13.0（National Instruments Inc.，美國），設計和實現了能夠產生任意時變信號的電刺激系統，并應用于大鼠海馬腦區電刺激實驗。該刺激系統可以為新型神經電刺激模式的開發和研究提供有用的工具。
1 方法
1.1 刺激系統的設計
如圖1 所示，刺激系統的硬件由個人計算機、數據采集卡（USB-6251, National Instruments Inc.，美國）和刺激器（2200，A-M Systems Inc.，美國）組成。其工作原理是：利用LabVIEW軟件自行設計，產生刺激波形的離散信號，經過數據采集卡的數模轉換后，變成模擬信號，接入刺激器的信號輸入端。該刺激器具備電氣隔離功能，且是模擬型刺激器，可以跟隨輸入的模擬信號，以電流或電壓模式輸出連續的刺激波形，還可選擇數檔不同的放大倍數。LabVIEW軟件同時通過數據采集卡的數字輸出端口之一（P0.0），輸出一路晶體管?晶體管邏輯（transisfor transisfor logic，TTL）電平信號，連接于刺激器的門控端，用于開閉其輸出。
圖1
刺激系統的硬件連接示意圖
Figure1.
Schematic diagram of the stimulation system
1.2 LabVIEW軟件的設計
刺激系統的LabVIEW軟件主要由圖形用戶界面（graphical user interface，GUI）和控制程序兩部分組成。控制程序包括：刺激波形生成模塊、時變IPI脈沖序列設計模塊、刺激序列處理和輸出模塊。
1.2.1 刺激脈沖波形的設計和生成方法
常規臨床深部腦刺激采用持續的脈沖序列，為了防止長時間持續刺激可能造成的組織損傷和電極腐蝕，需采用電荷平衡的先負后正雙相脈沖波形，即正相與負相的面積相等[14]。如圖2所示，具有相間延時的雙相脈沖的可調控參數包括負相和正相的幅值和脈寬、兩相之間的相間延時和IPI等，圖2中括號內所示數值僅為示例。本文采用數組存儲的離散數據來編碼脈沖序列，分辨率（即采樣率）可設置。若設為20 kHz，則可實現的最小脈寬為0.05 ms，滿足常用深部腦刺激脈寬大于0.06 ms的需求[15]。利用LabVIEW軟件的“基于持續時間的信號發生器” 虛擬儀器（virtual instrument，VI）分別生成正相和負相脈沖的數組片段，并在2個片段之間填充“0”構成相間延時，形成雙脈沖的編碼數組。重復此雙脈沖數組，并按照所需的IPI補足“0”元素，即獲得整個刺激序列，如圖2脈沖序列的編碼數組所示。本文利用這種數組方式實現下述各種時變IPI的刺激序列。
圖2
脈沖波形的設計方法
Figure2.
Design of pulse waveform
1.2.2 時變IPI脈沖序列的設計
除了常規恒頻脈沖序列之外，本文設計了兩類時變IPI脈沖序列：服從特定分布的隨機變化序列和外部讀入的任意序列。
（1）服從特定分布的隨機時變IPI序列
如圖3所示，隨機時變IPI的分布有4種：均勻、正態、伽馬和泊松分布。其中前3種分布為連續的，用LabVIEW的“連續分布的隨機數”VI生成；而泊松分布為離散的，用LabVIEW的“離散分布的隨機數”VI生成。決定各分布的參數分別為：均勻分布是IPI的最小和最大值；正態分布是均值和標準差；伽馬分布是均值和變異系數；泊松分布是均值。此外，設置默認IPI范圍（1～500 ms），以自動去除過短和過長的IPI。并將此默認范圍設計為用戶可修改。值得注意的是，圖3中除了自身為離散的泊松分布之外，其他分布中呈現的離散點是由如圖2所示數組的分辨率引起。
圖3
四種不同IPI分布及相應的脈沖序列小段示例
Figure3.
Four types of IPI distribution with examples of corresponding pulse episodes
（2）外部任意IPI序列讀取的方法
除了由LabVIEW軟件內部產生IPI序列之外，還設計了讀取事先由其他方法生成的IPI序列的方式。使用“讀取電子表格文件”VI，并在多態實例中選擇“雙精度”，以讀取純文本的單列格式的IPI數據。記事本等軟件工具編輯和生成的IPI序列純文本文檔都可以讀入，使得該刺激系統可以輸出任意IPI序列的脈沖刺激。
1.2.3 刺激波形輸出的設計
該刺激系統使用LabVIEW內置的NI-DAQmx驅動模塊來控制數據采集卡的數模轉換端口的信號輸出。在其中的“DAQmx創建通道”VI中，選擇第一個端口，將其設置為“單通道模擬電壓輸出”模式。在定時VI中選擇“有限采樣”模式，在多態VI選擇器中選擇“采樣時鐘”，并設置采樣率。在“DAQmx寫入”VI中將多態VI選擇器設置為一維雙精度浮點數的模擬信號采樣。將“DAQmx結束前等待”VI中的超時參數設置為“?1”，即無限等待模式。這樣，數據采集卡的數模轉換端口就可以將如圖2所示的刺激波形數組轉換為模擬電壓信號并輸出，再經過刺激器的電氣隔離，用于動物實驗，如圖1所示。
1.3 大鼠動物實驗
成年雄性斯潑累格·多雷(Sprague-Dawley)大鼠（250～400 g），購自浙江大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（浙）2018-0006。動物實驗方案經浙江大學實驗動物福利倫理審查委員會通過。大鼠腹腔注射氨基甲酸乙酯（批號：20200409，國藥集團化學試劑有限公司，中國上海）（劑量為：1.25 g/kg）麻醉之后，固定在腦立體定位儀上。打開左側顱骨，將一根16通道的陣列記錄電極（Poly2，NeuroNexus Technologies Inc.，美國）插入至海馬CA1區，再將一根同芯雙極刺激電極（CBCSG75，FHC Inc.，美國）插入至記錄位點上游的CA1區的輸入軸突Schaffer側支上，如圖4所示。通過刺激電極施加脈沖刺激，激活Schaffer側支，順向傳導并激活下游的神經元群體，就可以在記錄電極上記錄到刺激誘發的群峰電位（population spike，PS），如圖4右圖所示，為單脈沖刺激Schaffer側支誘發的神經元群體發放的PS。有關電極定位、實驗操作、刺激施加和信號記錄等詳見文獻[16]。
圖4
大鼠海馬CA1區電極位置示意圖
Figure4.
Schematic diagram of electrodes in the hippocampal CA1 region of rats
利用本文設計的刺激系統產生脈寬為0.1 ms的雙相對稱電流型脈沖序列，脈沖幅值為0.3～0.4 mA。IPI分為兩種：恒定7.5 ms和5～10 ms范圍內均勻隨機變化（平均值為7.5 ms）。兩者的平均脈沖頻率都是133 Hz，下文稱為順向高頻刺激（orthodromic high-frequency stimulation，O-HFS）。這兩種O-HFS的時長均為1 min。
在16通道記錄信號中，選取位于海馬CA1區胞體層的一個記錄通道，用于分析O-HFS期間誘發的PS的個數及幅值[17]。并以O-HFS首個脈沖誘發的PS幅值為基準，計算O-HFS期間PS的歸一化幅值。統計數據均以“均值±標準差”的形式表示。采用t檢驗評判恒定組與時變組之間差異是否具有統計學意義。“n”表示實驗大鼠的數量。
2 結果
2.1 刺激系統的功能實現
如圖5所示是刺激系統的GUI，上方為刺激脈沖序列顯示，下方為操作面板（分成序列生成和序列處理兩大部分）。
圖5
刺激系統的GUI
Figure5.
GUI of the stimulation system
“序列生成”中包括如下參數的設置：正負相脈寬和幅值、相間延時、輸出分辨率（即刺激波形的數模轉換分辨率）。還包括刺激模式選擇：“恒頻”、“隨機變頻”和“序列讀取”。另有“設置”按鈕用于所選刺激模式的參數設定，用彈窗實現。其中，“恒頻”的彈窗內可設定刺激頻率和時長；“隨機變頻”的彈窗內可選擇4種IPI分布之一，并設定相應的參數，如圖6所示為正態分布及其參數；“序列讀取”的彈窗內可選擇預先設計好的IPI序列文件及其路徑。“序列信息”框內顯示脈沖序列的相關信息，包括刺激模式、IPI分布及其參數、刺激時長、平均頻率和IPI的變化范圍等。
圖6
“隨機變頻”模式的參數設置對話窗
Figure6.
Dialog window of parameter setting in “random frequency” mode
“序列處理”中包含“序列保存”和“序列拼接”2個功能按鈕，可保存刺激系統生成的IPI序列，或者拼接已有IPI序列并保存。
最后，“輸出”和“停止”按鈕分別控制刺激波形輸出的啟動和中止。
2.2 脈沖波形和時變IPI序列的測試結果
刺激系統產生的脈沖序列最終由刺激器輸出。將此刺激器的輸出模式分別設置為電壓（1 V/V檔位）和電流（0.1 mA/V檔位），并在GUI中設定脈沖波形參數為：負相、正相的脈寬和幅值分別為0.1 ms、?3 V和0.3 ms、1 V，相間延時為1 ms，如圖5所示。測得刺激器輸出的脈寬（即半高寬）、幅值、上升沿時間和下降沿時間如表1所示。實測的脈沖波形如圖7所示。電流輸出模式時，在刺激器輸出端連接一個電阻（如10 kΩ），將電流波形轉換為電阻兩端的電壓進行測量。如表1所示，刺激系統輸出的脈寬誤差都小于0.3%，幅值誤差都小于0.7%。
表1
脈沖波形參數的測試結果（脈沖個數=5 000）
Table1.
Test results of pulse waveform parameters (number of pulses=5 000)
圖7
實測脈沖波形
Figure7.
Measurements of pulse waveforms
服從4種分布的不同時變IPI序列各5組的測試結果表明，所有60 s時長脈沖序列的IPI測試值與理論值之間的均方根誤差均小于0.001 5 ms。如圖8所示為這些脈沖序列的相對誤差（|測量值—理論值|/理論值）的分布，相對誤差均小于0.6%。箭頭所指為各種序列數據中相對誤差小于0.05%的IPI個數占比，均大于87%。可見，刺激系統輸出脈沖序列的IPI具有足夠高的精度。
圖8
服從4種分布的時變IPI的實測值的相對誤差直方圖
Figure8.
Histogram of normalized errors of measured values of time-varying IPI for the four types of distributions
2.3 刺激系統在動物實驗中的應用
為了考察此刺激系統在動物實驗中的應用，分別生成恒定頻率（133 Hz，IPI = 7.5 ms）和隨機時變（平均頻率133 Hz，IPI = 5～10 ms）的1 min時長的脈沖序列，施加于大鼠海馬CA1區的輸入軸突Schaffer側支上，形成2種O-HFS刺激，如圖4所示。在這兩種刺激下，首個脈沖均誘發了幅值相似的PS，且初期的誘發響應相似，如圖9上圖、中圖所示。但恒定IPI的O-HFS期間，PS僅在刺激初期持續了（8.8 ± 2.6）s（n = 7），之后的刺激脈沖不再誘發明顯的PS。這可能是由于高頻脈沖刺激引起軸突阻滯，減弱了刺激對于下游神經元的興奮作用[16, 18]。但是，在平均脈沖頻率同樣為133 Hz的時變IPI的整個1 min的O-HFS期間，幾乎均存在大幅值的PS，有時刺激剛結束時還有PS跟隨。時變IPI刺激誘發的PS持續時間達（60.3 ± 2.4）s（n = 7），大于恒頻刺激，差異具有統計學意義（t-test，P < 0.01），如圖9左下圖所示。時變IPI刺激誘發的PS發放率和PS的歸一化幅值大于恒頻刺激誘發的數值，差異都具有統計學意義（t-test，P < 0.01），如圖9中下圖和右下圖所示。這些結果表明，時變IPI的脈沖刺激對于下游神經元群體具有更強的興奮作用。需要注意的是，圖9中兩個虛線框內的紅色倒三角和虛線指示已去除的刺激偽跡，去偽跡方法詳見文獻[18]。
圖9
神經元群體對恒定IPI和時變IPI的O-HFS的不同響應
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3 討論
本文利用LabVIEW軟件進行設計，控制通用的刺激器，實現了時變參數的刺激，為神經電刺激的實驗研究提供了新工具。而且，應用此刺激系統的大鼠實驗結果表明，恒頻和變頻的脈沖刺激對于海馬腦區的神經元群體具有不同的調控作用。下面分析該刺激系統的特點和神經元響應時變刺激的可能機制。
該刺激系統的首要特點是，可以輸出任意時變IPI的刺激序列，這是市場上的現成刺激器產品不具備的功能。該系統不僅可以產生具有特定分布的隨機時變IPI的脈沖序列，滿足已有報道的刺激模式的實驗需求[6, 8, 10-11]；而且，還具有讀取IPI序列文檔的功能，可以產生任意脈沖序列；此外，還有序列拼接功能，可輸出多種序列組合后的更復雜的刺激序列，便于探索和開發更廣泛的神經電刺激新模式。性能測試結果表明，該系統的輸出具有足夠高的時間精度。之前雖然有利用類似硬件裝置實現的刺激系統，但只能輸出規則變化的刺激序列[19]，不能產生隨機時變刺激。
該刺激系統的另一個特點是，硬件配置簡單，僅需通用的數據采集卡和刺激器，普通實驗室容易配備。而且，系統的GUI簡潔、操作簡單；利用分級彈窗設置參數，靈活且避免了界面繁雜。刺激系統的軟件用LabVIEW開發，非專業編程人員也容易理解這種圖形化編程語言，可以自行進行軟件的二次開發，以擴展功能。
此外，本文利用該刺激系統在大鼠海馬腦區的在體實驗中，比較了恒定IPI與隨機時變IPI的高頻刺激O-HFS的作用。在施加的脈沖數量相同（即平均頻率相同）的情況下，兩種刺激對于神經元群體具有不同的興奮作用。持續的恒定IPI刺激由于引起間歇性軸突阻滯[16, 20]，對于下游神經元的活動具有去同步作用[21-22]；因此，除了O-HFS起始階段之外，后續刺激不再誘發神經元群體同步發放動作電位而形成的PS（如圖9上圖所示）。但是，隨機時變IPI的刺激，即使IPI僅在5～10 ms微小范圍內變化，卻仍然能夠持續誘發神經元同步發放PS（如圖9中圖所示）。只是PS的發放率僅約為（16.6±3.3）個/s（如圖9下中圖所示），遠小于刺激脈沖的頻率133 Hz，這表明時變IPI的持續刺激仍然可能在輸入軸突上產生軸突阻滯而削弱部分脈沖的作用。神經細胞膜對于電刺激的響應具有非線性特性[9]，每個刺激脈沖之后不同長度的時變IPI會導致軸突膜獲得不同程度的恢復[23]；而且，軸突上刺激誘導的興奮傳導至軸突末梢，經突觸傳遞，再經過下游神經元的整合，才能誘發下游神經元發放動作電位。這一系列過程都會導致神經元及其群體發放的改變，其中的機制有待深入研究。之前的研究表明，恒頻和變頻這兩種刺激在抑制癲癇和控制帕金森病等不同疾病時獲得的效果不同[6-8, 24]，本文所示的神經元群體對于這兩種刺激的不同響應提供了線索。
總之，本文設計的電刺激系統能夠產生新型的時變刺激模式，用于研究時變刺激和恒定刺激的不同作用，這對于研究腦神經系統的活動機制以及開發電刺激治療腦疾病的新方法都具有重要意義。除了可用于深部腦刺激研究之外，具有各種時變參數的刺激還可用于其他電刺激研究，如神經肌肉電刺激、經皮神經電刺激和脊髓電刺激等[25-26]。時變刺激在這些電刺激技術中的應用和開發，有利于更多神經系統疾病的治療。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
