人類血漿中的纖維原蛋白（Fg）在止血、修復血管及維持組織完整中發揮關鍵作用。胞外基質或生物材料的表面化學性質通過影響Fg的朝向和分布，改變整合素結合位點的暴露程度，進而影響其對血小板的黏附功能。本文采用原子力顯微鏡（AFM）、流式細胞儀（FCM）及平行平板流動腔系統，檢測親水、疏水及親和素涂層表面吸附Fg的數量、形態、側鏈暴露程度以及血小板在Fg上的滾動行為。本文的研究結果表明，疏水表面導致Fg產生大量交聯和聚集，親水表面則在降低Fg吸附和積聚的同時導致Fg上α鏈的暴露和鋪展并進一步介導血小板的黏附；而通過親和素/生物素固定的Fg不僅能保持單體狀態，避免α鏈的過度暴露和伸展，有效阻止未激活血小板的黏附，且依然能結合經血管性血友病因子A1結構域激活的血小板，具有良好的生物學活性。基于以上研究結果，本研究或可為植入體生物材料表面血液相容性的改善和體外凝血實驗的合理設計提供有益參考。
引用本文： 陳用, 任建芳, 吳建華, 方穎. 材料界面對纖維原蛋白朝向和功能的影響. 生物醫學工程學雜志, 2021, 38(6): 1087-1096. doi: 10.7507/1001-5515.202102018 復制
引言
人類血漿中的纖維原蛋白（fibrinogen，Fg）由肝臟中肝細胞合成，并分泌進入外周血液，在止血過程以及維持、修復血管和組織的完整性中發揮關鍵作用[1-2]。正常生理條件下，血液中Fg的濃度為2～4 g/L，這種可溶性的Fg結合血小板的能力極低[3]。一旦血管或組織受損和感染，血液中的Fg濃度會數倍增加，滲透進入內皮細胞及破損部位的胞外基質[4-6]。在血流環境中，血管性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）或可溶性激動劑通過激活血小板表面的整合素與固定的Fg結合，介導血小板的穩定黏附、聚集和止血栓的形成[7-8]。Fg數量和質量的缺陷均能導致一系列出血性與血栓性疾病，與類風濕性關節炎、腦瘤、結腸炎、肺與腎的纖維化以及阿爾茨海默癥的發生、發展緊密相關[6, 9]。
成熟的Fg是同源二聚體，每個單體包含3條多肽鏈：α鏈（Aα）、β鏈（Bβ）和γ鏈（γ），通過氨基末端的二硫鍵連接而成，分子量為340 kDa[10-12]。2009年解析出來的人源Fg晶體結構證實了基于透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）圖像提出的三節點模型[13-14]：首尾羧基末端大的D區（節點）由Bβ和γ組成，2條Aα鏈的羧基末端比其他鏈的對應端更長，纏繞在一起形成中間小的E區（節點），節點之間通過細長的α螺旋結構相連，如圖1所示。Fg上有若干鈣離子結合位點以及凝血酶結合與催化位點，尤其在D區和E區包含著其主要生理配體——整合素的結合位點：前者是位于γ鏈上的C區第400個至第411個氨基酸（簡稱：C400-411，氨基酸序列：HHLGGAKQAGDV），可與激活態整合素特異性結合，通過由外而內（outside-in）信號通路激活血小板，在血小板的凝止血過程中發揮關鍵作用[15]；后者是位于α鏈第95個至第97個（簡稱：Aα95-97）、第572個至第575個（簡稱：Aα572-575）的兩個精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸（RGD）基序，有報道稱低親和態整合素可與含RGD基序的多肽結合[16]，但其是否與γ鏈上的C400-411協同調控血小板的活化相關，及其在血小板黏附過程中扮演的角色和貢獻至今未明[17-18]。
圖1
Fg結構示意圖
Figure1.
Schematic diagram of Fg structure
由于其特殊的結構，Fg在血漿和基質上表現出不同的活性狀態。Dyr等[19]的研究發現，不同濃度的Fg附著在同種表面會呈現不同的朝向；纖維蛋白肽B（fibrinopeptides B, Fpb）位點（Bβ鏈1-14號殘基）的酶切速度比纖維蛋白肽A（fibrinopeptides A, Fpa）位點（Aα鏈1-16號殘基）快，而酶切效率取決于Fg的表面密度和朝向[20]；另外有研究結果表明，含有羥基（-OH）、羧基（-COOH）等親水性基團的材料表面吸附Fg的數量低于含氨基（-NH2）、烷基（-CH3）等官能團的材料[21]；材料表面的化學性質（主要是疏水性和親水性）不僅能夠影響吸附的Fg的結合能力，而且能調控Fg的朝向變化，增加包括整合素αIIbβ3在內的血小板黏附位點的暴露 [22-23]。先前的研究主要通過檢測Fg吸附數量以及血小板黏附數來表征由材料表面化學性質（諸如電荷、疏水性、pH值等）導致Fg蛋白功能的差異，尚未有直接的研究證據清晰揭示底板的親水、疏水性及包被方式對Fg朝向和功能的影響。基于此，本研究采用原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）、流式細胞儀（flow cytometry，FCM）和平行平板流動腔系統，通過材料的不同親、疏水性質以及直接物理吸附與親和素（avidin）/生物素（biotin）方式固定Fg進行對比，觀察、分析表面材料性質與包被方式對Fg朝向及捕獲、黏附血小板功能的影響，以期為血管支架等內植性醫療器械的材料篩選和體外實驗方案的科學設計提供新的參考。
1 材料與方法
1.1 主要材料
3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Fg和三磷酸腺苷雙磷酸酶（apyrase）購自德國sigma公司；重組抗Fg α鏈抗體EPR2919和重組抗Fg γ鏈抗體EPR3085均購自于英國abcam公司；VWF A1結構域（VWF A1 domain，VWF-A1）蛋白由本實驗室表達純化獲得，其重組質粒獲贈于美國貝勒醫學院Cruz教授[24]；感受態大腸桿菌M15/DH5α購買于北京全式金生物公司。
1.2 AFM掃描Fg蛋白形貌
云母片的預處理如圖2所示：① 取2組云母片清洗后，自然風干待用，標記親水-Fg（hydrophilic-Fg）組；② 取2組云母片清洗后加入5% APTES 液［APTES：磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）= 1∶20（V/V）］，室溫孵育4 h，PBS清洗3次，80 ℃烘干2 h后待用，標記疏水-Fg（hydrophobic-Fg）組[25]；③ 另取2組云母片清洗后加入30 μL濃度為40 μg/mL的avidin，室溫孵育2 h，然后加入500 μL濃度為2%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉30 min后待用，標記avidin/biotin-Fg組。
圖2
云母片預處理
Figure2.
Pretreatment of mica flakes
AFM樣品制備如圖3所示：① 取hydrophilic-Fg組云母片分別滴加30 μL濃度為1 μg/mL的Fg和100 μg/mL的Fg，室溫孵育4 h；② 取hydrophobic-Fg組云母片分別滴加30 μL濃度為1 μg/mL的Fg 、100 μg/mL的Fg，室溫孵育4 h；③ 取avidin/biotin-Fg組云母片分別加入30 μL濃度為1 μg/mL、100 μg/mL的biotin-Fg，室溫孵育4 h。所有樣品均需鋪滿整個云母片。
圖3
AFM樣品制備流程
Figure3.
AFM sample preparation process
所有用于樣品制備的溶液均需用0.22 μm過濾器（MF-MilliporeTM，sigma公司，德國）過濾后使用。待樣品孵育結束后用1 mL的超純水沖洗3次，氮氣（N2）輕輕吹干備用。將云母片置于AFM（CSPM5500，本原納米儀器有限公司，中國）基座上，進行掃描，掃描方式及參數詳同文獻[26]。
1.3 流式微球檢測Fg朝向
微球的預處理：取3滴玻璃微球，PBS清洗后分別進行親水、疏水、孵育avidin處理，處理方法同上述1.2節云母片預處理。將上述微球相應加入500 μL濃度為100 μg/mL的Fg或biotin-Fg，旋轉孵育2 h，分別標記為hydrophilic-Fg、hydrophobic-Fg、avidin/biotin-Fg。對照組設置為未孵育Fg或biotin-Fg的hydrophilic微球、hydrophobic微球和avidin/biotin微球。
FCM檢測分析：將上述預處理微球用PBS洗3次，2% BSA封閉后加入偶聯熒光抗體（重組抗體 EPR3085和重組抗體EPR2919），37 ℃避光孵育30 min，FCM（BD Accuri?C6，BD Biosciences公司，美國）檢測分析。
1.4 平行平板流動腔檢測血小板黏附功能
1.4.1 底板功能化
玻璃底板用去離子水清洗后，按照3∶1比例加入濃硫酸（H2SO4）：過氧化氫（H2O2），靜置30 min后用去離子水清洗；取部分清洗后的玻璃底板干燥后加入100 μg/mL Fg，室溫孵育2 h，標記為hydrophilic-Fg組。另取3組清洗后的玻璃底板干燥后孵育40 μg/mL avidin，用PBS清洗后加入2% BSA，靜置孵育30 min，分別滴加50 μg/mL biotin標記的VWF-A1（biotin-VWF-A1）、100 μg/mL biotin-Fg、50 μg/mL biotin-VWF-A1+100 μg/mL biotin-Fg，依次標記為avidin/biotin-A1組、avidin/biotin-Fg組、avidin/biotin-(A1 + Fg) 組，室溫靜置孵育2 h后加入2% BSA封閉30 min。對照組為未孵育Fg的PBS組、BSA組、avidin/biotin組。
1.4.2 血小板分離與提取
由華南理工大學大學城校區醫院護理人員抽取健康志愿者靜脈血液20 mL于枸櫞酸鈉抗凝管中，150 × g離心5 min，取上層富含血小板的血漿轉移至另一無菌的15 mL離心管中，加入終濃度為5 U/mL的apyrase再進行900 × g離心10 min，去除上清沉淀即為血小板，用含5%血漿的PBS稀釋調整至每毫升溶液中含3 × 106～1 × 107 個血小板[27]。本項研究已得到廣州市第一人民醫院倫理委員會的審查和批準，所有志愿者均簽署了書面知情同意書。
1.4.3 血小板的黏附與滾動
采用平行平板流動腔裝置（腔體規格為20 mm × 2.5 mm × 0.127 mm）對不同底板上Fg進行血小板黏附功能檢測。將1.4.2中懸浮待用的血小板溶液以0.1 Pa流體剪切力條件灌注于平行平板流動腔中，以100幀/s高速攝像儀記錄近壁面血小板的滾動黏附行為。
1.5 統計分析方法
每個條件均進行3次平行實驗，用平均值±標準差表示；三組或三組以上的數據先進行單因素方差分析，再采用邦費羅尼事后檢驗法（Bonferroni post hoc test）進行組間比較，P ≤ 0.05時，差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 avidin/biotin固定方式可抑制的Fg聚集程度對比
AFM是一種高分辨率的顯微鏡，是研究蛋白質樣貌及其與表面相互作用的有效工具[26]。本文通過AFM（CSPM5500，本原納米儀器有限公司，中國）的輕敲模式對Fg的形貌進行觀察。100 μg/mL濃度的Fg掃描結果如圖4所示，hydrophobic-Fg組發生了明顯的聚集現象，Fg交織在一起，形成非常粗大的繩索狀結構；hydrophilic-Fg組和avidin/biotin-Fg組表面則相對細致和均勻。導致這一現象的可能原因有：① 底板電荷性質的差異。Fg等電點（pI）為5.6，當pI < pH（PBS pH = 7.4）時，蛋白整體帶負電荷；而APTES處理后疏水底板表面帶有的-NH2具有較強的吸附Fg能力。② 疏水底板上密集的Fg呈現多種取向狀態，使其有更多的機會通過αC區招募溶液中的Fg，形成多分子的聚集。而1 μg/mL濃度的Fg密度和聚集現象大幅減少；在Fg分子的形貌上，avidin/biotin-Fg組呈現為橢圓型或球型，其它兩組底板上的Fg則大多呈長條形狀，且數目遠高于avidin/biotin-Fg組。
圖4
AFM掃描圖像
Figure4.
AFM scanning images
為進一步分析avidin底板與其它兩組吸附方式的差異，將三種不同底板上Fg的體積、長度通過AFM圖像處理軟件gwyddion2.58（GNU General Public License，美國）進行量化分析，如圖5所示。100 μg/mL濃度條件下，hydrophobic-Fg組的蛋白體積高于hydrophilic-Fg組和avidin/biotin-Fg組，表明Fg發生了積聚；100 μg/mL濃度下hydrophobic-Fg組和hydrophilic-Fg組的體積均高于1 μg/mL濃度下相應組的體積，但avidin/biotin-Fg組兩個濃度的數值接近；另外，1 μg/mL濃度下三組的體積差異較小，其中hydrophilic-Fg組和hydrophobic-Fg組的差異不具有統計學意義，并低于avidin/biotin-Fg組，但avidin/biotin-Fg組與hydrophilic-Fg組（或hydrophobic-Fg組）的差異值接近avidin/biotin的體積，意味著三組底板上的Fg體積基本一致，接近按TEM圖像推算的單體Fg的尺度[28]。蛋白長度的數據進一步證實100 μg/mL濃度hydrophilic-Fg組和hydrophobic-Fg組均發生了蛋白的聚集，僅avidin/biotin-Fg組的分子長度沒有受到濃度的影響；1 μg/mL濃度三組Fg的長度盡管差異不具有統計學意義，但hydrophobic-Fg組的離散程度要高于hydrophilic-Fg組，且avidin/biotin-Fg組的離散程度最低。上述結果表明，通過avidin/biotin固定的Fg長度更加均一，即使在高濃度情形下也可有效抑制自身的聚集。
圖5
Fg的體積和長度
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2.2 不同材料表面對Fg側鏈朝向的影響
盡管前面已經探明不同表面處理和固定方式（物理吸附及avidin/biotin結合）對Fg形貌及幾何尺度的影響，但Fg的側鏈朝向及其結合血小板整合素位點的暴露情況是未明的，因此本文在直徑5 μm的玻璃微球上包被100 μg/mL的Fg，利用識別α鏈與γ鏈的熒光抗體EPR2919和EPR3085，通過FCM檢測不同處理表面上Fg的側鏈朝向，以探明不同材料界面對α鏈RGD基序及γ鏈C400-411暴露程度的影響。實驗結果發現，hydrophobic-Fg組微球表面黏附的蛋白含量遠高于hydrophilic-Fg組和avidin/biotin-Fg組，如圖6所示，與上述AFM掃描結果相互應證；同時如圖7所示，hydrophilic-Fg組微球表面吸附的Fg的α鏈位點密度要高于avidin/biotin-Fg組，扣除背景熒光后是后者的3.68倍；而γ鏈C400-411位點密度則低于avidin/biotin-Fg組，扣除背景熒光后是后者的0.25倍。為避免不同微球表面吸附蛋白數量差異對Fg朝向的影響，本文采用α鏈抗體EPR2919和γ鏈抗體EPR3085的平均熒光強度的比值（anti-α/anti-γ）來表征Fg的側鏈傾向程度。hydrophilic-Fg組微球表面Fg上α鏈暴露比率最高，為20.68；hydrophobic-Fg組微球表面這一比率僅為0.87，avidin/biotin-Fg組的微球介于二者之間為1.42。相比于hydrophilic-Fg組微球表面，avidin/biotin-Fg組因avidin/biotin特異固定的Fg的α鏈暴露比率顯著降低。由于α鏈和γ鏈分別包含不同的血小板整合素αIIbβ3的受體識別位點，它們暴露程度的不同可能會導致血小板黏附與滾動行為的差異。
圖6
微球表面的抗體熒光強度
Figure6.
Antibody fluorescence intensity on the surface of microspheres
圖7
不同微球表面抗體熒光強度量化結果及α鏈與γ鏈抗體熒光強度比值
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2.3 流場中avidin/biotin固定的Fg能否介導血小板黏附的考察
為了進一步研究不同材料界面固定的Fg姿態及朝向差異所引起的功能變化，本文通過提取健康志愿者的新鮮血小板，在不同表面處理底板上包被100 μg/mL的Fg，在0.1 Pa流場中觀察血小板在不同底板上的黏附和滾動行為。當流場中近壁面高速漂流的血小板發生明顯減速，且瞬時速度連續5幀低于100 μm/s，可認為細胞與底板的黏附分子之間產生了接觸和相互作用。本文將這類血小板的黏附與滾動行為按接觸時間長短分為瞬間拴縛、滾動與穩定黏附三種類型，如圖8所示，定義如下：瞬間拴縛，細胞發生減速—停留—加速離開，但接觸時間小于0.2 s，產生位移小于3 μm；滾動，細胞發生減速—停留—加速離開，但接觸時間大于0.2 s，產生位移大于3 μm；穩定黏附，細胞減速后停留，或停留后加速離開，但接觸時間至少1 s，且位移小于3 μm。
圖8
血小板不同運動行為示意圖
Figure8.
Schematic diagram of different movement behavior of platelets
血小板的黏附結果如圖9所示，因為BSA帶負電，因此可以有效阻斷帶負電的細胞與底板的物理黏附。由于疏水底板通過靜電相互作用吸附的Fg分子密度過高，同時相同濃度的BSA并不能阻斷細胞與底板的非特異相互作用（物理黏附），導致大量血小板的穩定黏附（結果未在本文列出）。因此，本文僅比較hydrophilic-Fg組和avidin/biotin-Fg組之間的差異。avidin/biotin-Fg組中由Fg介導的血小板黏附比率極低，BSA組和avidin/biotin-Fg組的差異無統計學意義；而物理吸附Fg上血小板的黏附比率則大大上升，其中大部分為穩定黏附，其次為瞬間拴縛，極少部分為連續滾動。通過對近壁面血小板滾動速度的統計發現：avidin/biotin-Fg組的平均滾動速度為88.36 μm/s（細胞數：12個），而hydrophilic-Fg組的平均滾動速度則大幅下降為25.17 μm/s（細胞數：29個）。這表明親水表面物理吸附的Fg由于暴露較高密度的α鏈RGD，在流體剪切力的作用下，可以通過結合血小板表面的整合素而捕獲隨流的血小板，并介導血小板在底板上的滾動和停留；而avidin/biotin固定的Fg由于暴露的是γ鏈C400-411以及低密度的α鏈RGD，并不能有效結合血小板整合素使血小板拴縛和黏附。
圖9
血小板在不同底板上的黏附比率和滾動速度
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2.4 流場中VWF-A1可誘導血小板整合素的激活，介導血小板的慢速滾動和停留
avidin/biotin固定的Fg不能單獨介導血小板的黏附，可能源于血小板表面的整合素未被激活。為證實這一推斷，本文采用在平行平板流動腔底板單鋪avidin/biotin-A1以及雙鋪avidin/biotin-(A1 + Fg)兩種方式，觀察血小板的黏附滾動行為，并與單鋪Fg組數據進行比較。VWF-A1可特異性結合血小板表面糖蛋白（GPIbα），將循環血小板捕獲于血管受損處，啟動由內而外的信號通路激活整合素，導致血小板的慢速滾動和穩定黏附[29-30]。
本文的實驗結果表明，單鋪avidin/biotin-A1確實可以介導血小板的黏附，如圖10所示，但黏附事件主要為瞬間黏附，占總黏附的49.18%。而avidin/biotin-(A1+Fg)組觀察到大量由滾動到停留的血小板，因此黏附事件主要為穩定黏附，占總黏附的66.11%；與avidin/biotin-A1組相比，血小板穩定黏附的比率提高了2.6倍，而瞬間黏附的比率則為avidin/biotin-A1組的0.37倍；相對而言，滾動黏附比率的差異不具有統計學意義（P>0.05）。通過對滾動黏附類型血小板滾動速度的統計分析，發現avidin/biotin-A1組為15.28 μm/s（細胞數：39個），而avidin/biotin-(A1+Fg)組降低為8.65 μm/s（細胞數：53個），均低于血小板在hydrophilic-Fg組的速度25.17 μm/s，因此推斷avidin/biotin-(A1+Fg)組血小板滾動速度的下降可能源于整合素與γ鏈C400-411的結合。綜上所述，本文的實驗數據證實流場中VWF-A1確實可誘導血小板整合素的快速活化，從而與avidin/biotin固定的Fg相互作用，它們之間較強的親和力導致血小板的慢速滾動乃至停留。
圖10
血小板在單鋪avidin/biotin-A1和雙鋪avidin/biotin-(A1+Fg)底板的黏附比率和滾動速度
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3 討論和展望
材料表面化學性質可以改變蛋白的吸附數量、密度和朝向，而細胞則通過與材料表面蛋白相互作用變化感知材料表面化學性質的差異并引起不同響應。生物材料表面理化性質的差異主要包括界面分子及其官能基團親水性質、疏水性質以及電荷性能等的差異。由于在水環境下APTES發生水解反應，生成Si-OH進與氧化硅表面的Si-OH發生縮水反應，使得另一端的-NH2裸露于表面，親水性下降，接觸角為89.04°，大于60°，表現為疏水性；同時表面的-NH2通過與溶液沖游離H+結合形成-NH3+從而帶有正電荷，有利于對帶負電荷蛋白的吸附并造成蛋白結構的破壞[25]。相比疏水性表面，親水性表面對蛋白結構的破壞較小，其可以通過-OH與αC區域發生反應并將其固定在表面[31]。與上述兩種材料界面對蛋白吸附方式不同，avidin涂層通過avidin/biotin系統的特異性相互作用將biotin-Fg固定在材料表面，避免了由于靜電作用對于蛋白結構的影響。本研究在親水、疏水及avidin涂層底板上通過物理吸附或特異結合等固定方式，系統探索了Fg的表觀形態、側鏈暴露情況以及黏附血小板的能力。盡管疏水處理方式及血小板黏附環境（靜止與流場）不同，本文的實驗結果與Wu等[32]的文獻報道可相互應證：如圖4～圖6所示，親水處理表面可減少溶液中Fg的吸附量，從而減少血小板的黏附。同時，本文的研究表明親水表面吸附的Fg會更大程度地暴露α鏈，其α鏈抗體與γ鏈抗體熒光比值達到20.68；吸附在疏水表面則更多暴露γ鏈（anti-α/anti-γ = 0.87），如圖6、圖7所示，與同等Fg濃度下Sivaraman等[33]研究結果類似。而avidin涂層表面，因為Fg通過氨基端的biotin標記與材料表面的avidin聯接，避免了物理吸附造成的結構鋪展，保證了分子的“站立”姿態，使其在100 μg/mL濃度時依然呈單體狀態，如圖4、圖5所示，其α鏈暴露程度與γ鏈基本相當（anti-α/anti-γ = 1.42）。
Fg分子包含2類整合素的結合位點，分別是位于Aα鏈上的RGD基序和γ鏈C400-411，它們各自與血小板整合素的親和力如何至今未明。1991年Du等[16]實驗數據表明三維溶液中RGD短肽可與未激活的αIIbβ3結合，并誘導該整合素到高活性狀態，從而與可溶性Fg相互作用。而2017年Kononova等[34]采用光鑷和分子動力學模擬方法得到頗為不同的結論：α鏈RGD與γ鏈C400-411對整合素αIIbβ3的親和力并無不同，無論是結合概率還是解離概率。由于整合素是跨膜蛋白，細胞膜對分子胞內及胞外的結構均有影響，因此細胞層面的研究更符合真實的生理或病理過程。在親水底板物理吸附的Fg上，本文中平行平板流動腔實驗結果表明大量α鏈的暴露確實可捕獲流場中的血小板；但遠高于avidin/biotin-A1及avidin/biotin-（A1 + Fg）上的滾動速度意味著α鏈RGD與血小板整合素的親和力應弱于VWF-A1/GPIbα和 γ鏈C400-411/αIIbβ3；單鋪物理吸附Fg組（hydrophilic-Fg組）中大量血小板的穩定黏附可能源于α鏈RGD/αIIbβ3多鍵的形成，或是由于α鏈RGD誘導的血小板整合素的活化，這有待將來的進一步探明。
綜上所述，不同材料上吸附的Fg的數量、朝向決定其黏附血小板的能力[33, 35]。疏水性材料與蛋白電荷性質相反使其具有大量吸附蛋白的能力，有利于促進血小板的黏附和聚集；材料的親水性可降低Fg的吸附，但大量暴露且鋪展的α鏈仍可介導血小板的黏附；材料表面的avidin涂層不僅能減少Fg的附著，而且很大程度上防止了Fg的伸展，從而阻止血液中未激活血小板的黏附。相比親/疏水材料，avidin涂層表面的biotin-Fg具有相對固定的朝向和符合生理環境的分子結構，因而在進行體外模擬實驗中可選擇avidin涂層獲得更加一致且可比較的實驗結果。由于生物材料在血管支架、導尿管、血管假體及血液透析膜上的廣泛應用[36-37]，如何改善材料表面的血液相容性已成為生物醫學工程、生物材料和醫學臨床學共同關注并亟待解決的問題，而本文的研究成果或可提供有益啟發和參考。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
人類血漿中的纖維原蛋白（fibrinogen，Fg）由肝臟中肝細胞合成，并分泌進入外周血液，在止血過程以及維持、修復血管和組織的完整性中發揮關鍵作用[1-2]。正常生理條件下，血液中Fg的濃度為2～4 g/L，這種可溶性的Fg結合血小板的能力極低[3]。一旦血管或組織受損和感染，血液中的Fg濃度會數倍增加，滲透進入內皮細胞及破損部位的胞外基質[4-6]。在血流環境中，血管性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）或可溶性激動劑通過激活血小板表面的整合素與固定的Fg結合，介導血小板的穩定黏附、聚集和止血栓的形成[7-8]。Fg數量和質量的缺陷均能導致一系列出血性與血栓性疾病，與類風濕性關節炎、腦瘤、結腸炎、肺與腎的纖維化以及阿爾茨海默癥的發生、發展緊密相關[6, 9]。
成熟的Fg是同源二聚體，每個單體包含3條多肽鏈：α鏈（Aα）、β鏈（Bβ）和γ鏈（γ），通過氨基末端的二硫鍵連接而成，分子量為340 kDa[10-12]。2009年解析出來的人源Fg晶體結構證實了基于透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）圖像提出的三節點模型[13-14]：首尾羧基末端大的D區（節點）由Bβ和γ組成，2條Aα鏈的羧基末端比其他鏈的對應端更長，纏繞在一起形成中間小的E區（節點），節點之間通過細長的α螺旋結構相連，如圖1所示。Fg上有若干鈣離子結合位點以及凝血酶結合與催化位點，尤其在D區和E區包含著其主要生理配體——整合素的結合位點：前者是位于γ鏈上的C區第400個至第411個氨基酸（簡稱：C400-411，氨基酸序列：HHLGGAKQAGDV），可與激活態整合素特異性結合，通過由外而內（outside-in）信號通路激活血小板，在血小板的凝止血過程中發揮關鍵作用[15]；后者是位于α鏈第95個至第97個（簡稱：Aα95-97）、第572個至第575個（簡稱：Aα572-575）的兩個精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸（RGD）基序，有報道稱低親和態整合素可與含RGD基序的多肽結合[16]，但其是否與γ鏈上的C400-411協同調控血小板的活化相關，及其在血小板黏附過程中扮演的角色和貢獻至今未明[17-18]。
圖1
Fg結構示意圖
Figure1.
Schematic diagram of Fg structure
由于其特殊的結構，Fg在血漿和基質上表現出不同的活性狀態。Dyr等[19]的研究發現，不同濃度的Fg附著在同種表面會呈現不同的朝向；纖維蛋白肽B（fibrinopeptides B, Fpb）位點（Bβ鏈1-14號殘基）的酶切速度比纖維蛋白肽A（fibrinopeptides A, Fpa）位點（Aα鏈1-16號殘基）快，而酶切效率取決于Fg的表面密度和朝向[20]；另外有研究結果表明，含有羥基（-OH）、羧基（-COOH）等親水性基團的材料表面吸附Fg的數量低于含氨基（-NH2）、烷基（-CH3）等官能團的材料[21]；材料表面的化學性質（主要是疏水性和親水性）不僅能夠影響吸附的Fg的結合能力，而且能調控Fg的朝向變化，增加包括整合素αIIbβ3在內的血小板黏附位點的暴露 [22-23]。先前的研究主要通過檢測Fg吸附數量以及血小板黏附數來表征由材料表面化學性質（諸如電荷、疏水性、pH值等）導致Fg蛋白功能的差異，尚未有直接的研究證據清晰揭示底板的親水、疏水性及包被方式對Fg朝向和功能的影響。基于此，本研究采用原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）、流式細胞儀（flow cytometry，FCM）和平行平板流動腔系統，通過材料的不同親、疏水性質以及直接物理吸附與親和素（avidin）/生物素（biotin）方式固定Fg進行對比，觀察、分析表面材料性質與包被方式對Fg朝向及捕獲、黏附血小板功能的影響，以期為血管支架等內植性醫療器械的材料篩選和體外實驗方案的科學設計提供新的參考。
1 材料與方法
1.1 主要材料
3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Fg和三磷酸腺苷雙磷酸酶（apyrase）購自德國sigma公司；重組抗Fg α鏈抗體EPR2919和重組抗Fg γ鏈抗體EPR3085均購自于英國abcam公司；VWF A1結構域（VWF A1 domain，VWF-A1）蛋白由本實驗室表達純化獲得，其重組質粒獲贈于美國貝勒醫學院Cruz教授[24]；感受態大腸桿菌M15/DH5α購買于北京全式金生物公司。
1.2 AFM掃描Fg蛋白形貌
云母片的預處理如圖2所示：① 取2組云母片清洗后，自然風干待用，標記親水-Fg（hydrophilic-Fg）組；② 取2組云母片清洗后加入5% APTES 液［APTES：磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）= 1∶20（V/V）］，室溫孵育4 h，PBS清洗3次，80 ℃烘干2 h后待用，標記疏水-Fg（hydrophobic-Fg）組[25]；③ 另取2組云母片清洗后加入30 μL濃度為40 μg/mL的avidin，室溫孵育2 h，然后加入500 μL濃度為2%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉30 min后待用，標記avidin/biotin-Fg組。
圖2
云母片預處理
Figure2.
Pretreatment of mica flakes
AFM樣品制備如圖3所示：① 取hydrophilic-Fg組云母片分別滴加30 μL濃度為1 μg/mL的Fg和100 μg/mL的Fg，室溫孵育4 h；② 取hydrophobic-Fg組云母片分別滴加30 μL濃度為1 μg/mL的Fg 、100 μg/mL的Fg，室溫孵育4 h；③ 取avidin/biotin-Fg組云母片分別加入30 μL濃度為1 μg/mL、100 μg/mL的biotin-Fg，室溫孵育4 h。所有樣品均需鋪滿整個云母片。
圖3
AFM樣品制備流程
Figure3.
AFM sample preparation process
所有用于樣品制備的溶液均需用0.22 μm過濾器（MF-MilliporeTM，sigma公司，德國）過濾后使用。待樣品孵育結束后用1 mL的超純水沖洗3次，氮氣（N2）輕輕吹干備用。將云母片置于AFM（CSPM5500，本原納米儀器有限公司，中國）基座上，進行掃描，掃描方式及參數詳同文獻[26]。
1.3 流式微球檢測Fg朝向
微球的預處理：取3滴玻璃微球，PBS清洗后分別進行親水、疏水、孵育avidin處理，處理方法同上述1.2節云母片預處理。將上述微球相應加入500 μL濃度為100 μg/mL的Fg或biotin-Fg，旋轉孵育2 h，分別標記為hydrophilic-Fg、hydrophobic-Fg、avidin/biotin-Fg。對照組設置為未孵育Fg或biotin-Fg的hydrophilic微球、hydrophobic微球和avidin/biotin微球。
FCM檢測分析：將上述預處理微球用PBS洗3次，2% BSA封閉后加入偶聯熒光抗體（重組抗體 EPR3085和重組抗體EPR2919），37 ℃避光孵育30 min，FCM（BD Accuri?C6，BD Biosciences公司，美國）檢測分析。
1.4 平行平板流動腔檢測血小板黏附功能
1.4.1 底板功能化
玻璃底板用去離子水清洗后，按照3∶1比例加入濃硫酸（H2SO4）：過氧化氫（H2O2），靜置30 min后用去離子水清洗；取部分清洗后的玻璃底板干燥后加入100 μg/mL Fg，室溫孵育2 h，標記為hydrophilic-Fg組。另取3組清洗后的玻璃底板干燥后孵育40 μg/mL avidin，用PBS清洗后加入2% BSA，靜置孵育30 min，分別滴加50 μg/mL biotin標記的VWF-A1（biotin-VWF-A1）、100 μg/mL biotin-Fg、50 μg/mL biotin-VWF-A1+100 μg/mL biotin-Fg，依次標記為avidin/biotin-A1組、avidin/biotin-Fg組、avidin/biotin-(A1 + Fg) 組，室溫靜置孵育2 h后加入2% BSA封閉30 min。對照組為未孵育Fg的PBS組、BSA組、avidin/biotin組。
1.4.2 血小板分離與提取
由華南理工大學大學城校區醫院護理人員抽取健康志愿者靜脈血液20 mL于枸櫞酸鈉抗凝管中，150 × g離心5 min，取上層富含血小板的血漿轉移至另一無菌的15 mL離心管中，加入終濃度為5 U/mL的apyrase再進行900 × g離心10 min，去除上清沉淀即為血小板，用含5%血漿的PBS稀釋調整至每毫升溶液中含3 × 106～1 × 107 個血小板[27]。本項研究已得到廣州市第一人民醫院倫理委員會的審查和批準，所有志愿者均簽署了書面知情同意書。
1.4.3 血小板的黏附與滾動
采用平行平板流動腔裝置（腔體規格為20 mm × 2.5 mm × 0.127 mm）對不同底板上Fg進行血小板黏附功能檢測。將1.4.2中懸浮待用的血小板溶液以0.1 Pa流體剪切力條件灌注于平行平板流動腔中，以100幀/s高速攝像儀記錄近壁面血小板的滾動黏附行為。
1.5 統計分析方法
每個條件均進行3次平行實驗，用平均值±標準差表示；三組或三組以上的數據先進行單因素方差分析，再采用邦費羅尼事后檢驗法（Bonferroni post hoc test）進行組間比較，P ≤ 0.05時，差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 avidin/biotin固定方式可抑制的Fg聚集程度對比
AFM是一種高分辨率的顯微鏡，是研究蛋白質樣貌及其與表面相互作用的有效工具[26]。本文通過AFM（CSPM5500，本原納米儀器有限公司，中國）的輕敲模式對Fg的形貌進行觀察。100 μg/mL濃度的Fg掃描結果如圖4所示，hydrophobic-Fg組發生了明顯的聚集現象，Fg交織在一起，形成非常粗大的繩索狀結構；hydrophilic-Fg組和avidin/biotin-Fg組表面則相對細致和均勻。導致這一現象的可能原因有：① 底板電荷性質的差異。Fg等電點（pI）為5.6，當pI < pH（PBS pH = 7.4）時，蛋白整體帶負電荷；而APTES處理后疏水底板表面帶有的-NH2具有較強的吸附Fg能力。② 疏水底板上密集的Fg呈現多種取向狀態，使其有更多的機會通過αC區招募溶液中的Fg，形成多分子的聚集。而1 μg/mL濃度的Fg密度和聚集現象大幅減少；在Fg分子的形貌上，avidin/biotin-Fg組呈現為橢圓型或球型，其它兩組底板上的Fg則大多呈長條形狀，且數目遠高于avidin/biotin-Fg組。
圖4
AFM掃描圖像
Figure4.
AFM scanning images
為進一步分析avidin底板與其它兩組吸附方式的差異，將三種不同底板上Fg的體積、長度通過AFM圖像處理軟件gwyddion2.58（GNU General Public License，美國）進行量化分析，如圖5所示。100 μg/mL濃度條件下，hydrophobic-Fg組的蛋白體積高于hydrophilic-Fg組和avidin/biotin-Fg組，表明Fg發生了積聚；100 μg/mL濃度下hydrophobic-Fg組和hydrophilic-Fg組的體積均高于1 μg/mL濃度下相應組的體積，但avidin/biotin-Fg組兩個濃度的數值接近；另外，1 μg/mL濃度下三組的體積差異較小，其中hydrophilic-Fg組和hydrophobic-Fg組的差異不具有統計學意義，并低于avidin/biotin-Fg組，但avidin/biotin-Fg組與hydrophilic-Fg組（或hydrophobic-Fg組）的差異值接近avidin/biotin的體積，意味著三組底板上的Fg體積基本一致，接近按TEM圖像推算的單體Fg的尺度[28]。蛋白長度的數據進一步證實100 μg/mL濃度hydrophilic-Fg組和hydrophobic-Fg組均發生了蛋白的聚集，僅avidin/biotin-Fg組的分子長度沒有受到濃度的影響；1 μg/mL濃度三組Fg的長度盡管差異不具有統計學意義，但hydrophobic-Fg組的離散程度要高于hydrophilic-Fg組，且avidin/biotin-Fg組的離散程度最低。上述結果表明，通過avidin/biotin固定的Fg長度更加均一，即使在高濃度情形下也可有效抑制自身的聚集。
圖5
Fg的體積和長度
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2.2 不同材料表面對Fg側鏈朝向的影響
盡管前面已經探明不同表面處理和固定方式（物理吸附及avidin/biotin結合）對Fg形貌及幾何尺度的影響，但Fg的側鏈朝向及其結合血小板整合素位點的暴露情況是未明的，因此本文在直徑5 μm的玻璃微球上包被100 μg/mL的Fg，利用識別α鏈與γ鏈的熒光抗體EPR2919和EPR3085，通過FCM檢測不同處理表面上Fg的側鏈朝向，以探明不同材料界面對α鏈RGD基序及γ鏈C400-411暴露程度的影響。實驗結果發現，hydrophobic-Fg組微球表面黏附的蛋白含量遠高于hydrophilic-Fg組和avidin/biotin-Fg組，如圖6所示，與上述AFM掃描結果相互應證；同時如圖7所示，hydrophilic-Fg組微球表面吸附的Fg的α鏈位點密度要高于avidin/biotin-Fg組，扣除背景熒光后是后者的3.68倍；而γ鏈C400-411位點密度則低于avidin/biotin-Fg組，扣除背景熒光后是后者的0.25倍。為避免不同微球表面吸附蛋白數量差異對Fg朝向的影響，本文采用α鏈抗體EPR2919和γ鏈抗體EPR3085的平均熒光強度的比值（anti-α/anti-γ）來表征Fg的側鏈傾向程度。hydrophilic-Fg組微球表面Fg上α鏈暴露比率最高，為20.68；hydrophobic-Fg組微球表面這一比率僅為0.87，avidin/biotin-Fg組的微球介于二者之間為1.42。相比于hydrophilic-Fg組微球表面，avidin/biotin-Fg組因avidin/biotin特異固定的Fg的α鏈暴露比率顯著降低。由于α鏈和γ鏈分別包含不同的血小板整合素αIIbβ3的受體識別位點，它們暴露程度的不同可能會導致血小板黏附與滾動行為的差異。
圖6
微球表面的抗體熒光強度
Figure6.
Antibody fluorescence intensity on the surface of microspheres
圖7
不同微球表面抗體熒光強度量化結果及α鏈與γ鏈抗體熒光強度比值
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2.3 流場中avidin/biotin固定的Fg能否介導血小板黏附的考察
為了進一步研究不同材料界面固定的Fg姿態及朝向差異所引起的功能變化，本文通過提取健康志愿者的新鮮血小板，在不同表面處理底板上包被100 μg/mL的Fg，在0.1 Pa流場中觀察血小板在不同底板上的黏附和滾動行為。當流場中近壁面高速漂流的血小板發生明顯減速，且瞬時速度連續5幀低于100 μm/s，可認為細胞與底板的黏附分子之間產生了接觸和相互作用。本文將這類血小板的黏附與滾動行為按接觸時間長短分為瞬間拴縛、滾動與穩定黏附三種類型，如圖8所示，定義如下：瞬間拴縛，細胞發生減速—停留—加速離開，但接觸時間小于0.2 s，產生位移小于3 μm；滾動，細胞發生減速—停留—加速離開，但接觸時間大于0.2 s，產生位移大于3 μm；穩定黏附，細胞減速后停留，或停留后加速離開，但接觸時間至少1 s，且位移小于3 μm。
圖8
血小板不同運動行為示意圖
Figure8.
Schematic diagram of different movement behavior of platelets
血小板的黏附結果如圖9所示，因為BSA帶負電，因此可以有效阻斷帶負電的細胞與底板的物理黏附。由于疏水底板通過靜電相互作用吸附的Fg分子密度過高，同時相同濃度的BSA并不能阻斷細胞與底板的非特異相互作用（物理黏附），導致大量血小板的穩定黏附（結果未在本文列出）。因此，本文僅比較hydrophilic-Fg組和avidin/biotin-Fg組之間的差異。avidin/biotin-Fg組中由Fg介導的血小板黏附比率極低，BSA組和avidin/biotin-Fg組的差異無統計學意義；而物理吸附Fg上血小板的黏附比率則大大上升，其中大部分為穩定黏附，其次為瞬間拴縛，極少部分為連續滾動。通過對近壁面血小板滾動速度的統計發現：avidin/biotin-Fg組的平均滾動速度為88.36 μm/s（細胞數：12個），而hydrophilic-Fg組的平均滾動速度則大幅下降為25.17 μm/s（細胞數：29個）。這表明親水表面物理吸附的Fg由于暴露較高密度的α鏈RGD，在流體剪切力的作用下，可以通過結合血小板表面的整合素而捕獲隨流的血小板，并介導血小板在底板上的滾動和停留；而avidin/biotin固定的Fg由于暴露的是γ鏈C400-411以及低密度的α鏈RGD，并不能有效結合血小板整合素使血小板拴縛和黏附。
圖9
血小板在不同底板上的黏附比率和滾動速度
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2.4 流場中VWF-A1可誘導血小板整合素的激活，介導血小板的慢速滾動和停留
avidin/biotin固定的Fg不能單獨介導血小板的黏附，可能源于血小板表面的整合素未被激活。為證實這一推斷，本文采用在平行平板流動腔底板單鋪avidin/biotin-A1以及雙鋪avidin/biotin-(A1 + Fg)兩種方式，觀察血小板的黏附滾動行為，并與單鋪Fg組數據進行比較。VWF-A1可特異性結合血小板表面糖蛋白（GPIbα），將循環血小板捕獲于血管受損處，啟動由內而外的信號通路激活整合素，導致血小板的慢速滾動和穩定黏附[29-30]。
本文的實驗結果表明，單鋪avidin/biotin-A1確實可以介導血小板的黏附，如圖10所示，但黏附事件主要為瞬間黏附，占總黏附的49.18%。而avidin/biotin-(A1+Fg)組觀察到大量由滾動到停留的血小板，因此黏附事件主要為穩定黏附，占總黏附的66.11%；與avidin/biotin-A1組相比，血小板穩定黏附的比率提高了2.6倍，而瞬間黏附的比率則為avidin/biotin-A1組的0.37倍；相對而言，滾動黏附比率的差異不具有統計學意義（P>0.05）。通過對滾動黏附類型血小板滾動速度的統計分析，發現avidin/biotin-A1組為15.28 μm/s（細胞數：39個），而avidin/biotin-(A1+Fg)組降低為8.65 μm/s（細胞數：53個），均低于血小板在hydrophilic-Fg組的速度25.17 μm/s，因此推斷avidin/biotin-(A1+Fg)組血小板滾動速度的下降可能源于整合素與γ鏈C400-411的結合。綜上所述，本文的實驗數據證實流場中VWF-A1確實可誘導血小板整合素的快速活化，從而與avidin/biotin固定的Fg相互作用，它們之間較強的親和力導致血小板的慢速滾動乃至停留。
圖10
血小板在單鋪avidin/biotin-A1和雙鋪avidin/biotin-(A1+Fg)底板的黏附比率和滾動速度
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3 討論和展望
材料表面化學性質可以改變蛋白的吸附數量、密度和朝向，而細胞則通過與材料表面蛋白相互作用變化感知材料表面化學性質的差異并引起不同響應。生物材料表面理化性質的差異主要包括界面分子及其官能基團親水性質、疏水性質以及電荷性能等的差異。由于在水環境下APTES發生水解反應，生成Si-OH進與氧化硅表面的Si-OH發生縮水反應，使得另一端的-NH2裸露于表面，親水性下降，接觸角為89.04°，大于60°，表現為疏水性；同時表面的-NH2通過與溶液沖游離H+結合形成-NH3+從而帶有正電荷，有利于對帶負電荷蛋白的吸附并造成蛋白結構的破壞[25]。相比疏水性表面，親水性表面對蛋白結構的破壞較小，其可以通過-OH與αC區域發生反應并將其固定在表面[31]。與上述兩種材料界面對蛋白吸附方式不同，avidin涂層通過avidin/biotin系統的特異性相互作用將biotin-Fg固定在材料表面，避免了由于靜電作用對于蛋白結構的影響。本研究在親水、疏水及avidin涂層底板上通過物理吸附或特異結合等固定方式，系統探索了Fg的表觀形態、側鏈暴露情況以及黏附血小板的能力。盡管疏水處理方式及血小板黏附環境（靜止與流場）不同，本文的實驗結果與Wu等[32]的文獻報道可相互應證：如圖4～圖6所示，親水處理表面可減少溶液中Fg的吸附量，從而減少血小板的黏附。同時，本文的研究表明親水表面吸附的Fg會更大程度地暴露α鏈，其α鏈抗體與γ鏈抗體熒光比值達到20.68；吸附在疏水表面則更多暴露γ鏈（anti-α/anti-γ = 0.87），如圖6、圖7所示，與同等Fg濃度下Sivaraman等[33]研究結果類似。而avidin涂層表面，因為Fg通過氨基端的biotin標記與材料表面的avidin聯接，避免了物理吸附造成的結構鋪展，保證了分子的“站立”姿態，使其在100 μg/mL濃度時依然呈單體狀態，如圖4、圖5所示，其α鏈暴露程度與γ鏈基本相當（anti-α/anti-γ = 1.42）。
Fg分子包含2類整合素的結合位點，分別是位于Aα鏈上的RGD基序和γ鏈C400-411，它們各自與血小板整合素的親和力如何至今未明。1991年Du等[16]實驗數據表明三維溶液中RGD短肽可與未激活的αIIbβ3結合，并誘導該整合素到高活性狀態，從而與可溶性Fg相互作用。而2017年Kononova等[34]采用光鑷和分子動力學模擬方法得到頗為不同的結論：α鏈RGD與γ鏈C400-411對整合素αIIbβ3的親和力并無不同，無論是結合概率還是解離概率。由于整合素是跨膜蛋白，細胞膜對分子胞內及胞外的結構均有影響，因此細胞層面的研究更符合真實的生理或病理過程。在親水底板物理吸附的Fg上，本文中平行平板流動腔實驗結果表明大量α鏈的暴露確實可捕獲流場中的血小板；但遠高于avidin/biotin-A1及avidin/biotin-（A1 + Fg）上的滾動速度意味著α鏈RGD與血小板整合素的親和力應弱于VWF-A1/GPIbα和 γ鏈C400-411/αIIbβ3；單鋪物理吸附Fg組（hydrophilic-Fg組）中大量血小板的穩定黏附可能源于α鏈RGD/αIIbβ3多鍵的形成，或是由于α鏈RGD誘導的血小板整合素的活化，這有待將來的進一步探明。
綜上所述，不同材料上吸附的Fg的數量、朝向決定其黏附血小板的能力[33, 35]。疏水性材料與蛋白電荷性質相反使其具有大量吸附蛋白的能力，有利于促進血小板的黏附和聚集；材料的親水性可降低Fg的吸附，但大量暴露且鋪展的α鏈仍可介導血小板的黏附；材料表面的avidin涂層不僅能減少Fg的附著，而且很大程度上防止了Fg的伸展，從而阻止血液中未激活血小板的黏附。相比親/疏水材料，avidin涂層表面的biotin-Fg具有相對固定的朝向和符合生理環境的分子結構，因而在進行體外模擬實驗中可選擇avidin涂層獲得更加一致且可比較的實驗結果。由于生物材料在血管支架、導尿管、血管假體及血液透析膜上的廣泛應用[36-37]，如何改善材料表面的血液相容性已成為生物醫學工程、生物材料和醫學臨床學共同關注并亟待解決的問題，而本文的研究成果或可提供有益啟發和參考。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
