運動相關創傷性腦損傷（srTBI）是在運動過程中導致的創傷性腦損傷（TBI），可引起認知和運動功能障礙。目前，srTBI 分子機制研究以及相關藥物研發主要依賴單層細胞培養模型和動物模型。但是，這些模型在模擬腦部細胞種群、炎癥反應等方面與人類 srTBI 的病理生理過程存在差異，使得基于以上模型得出的大部分研究成果難以有效地指導臨床治療。新興三維（3D）體外模型作為醫學領域的創新研究工具，彌補了傳統模型在模擬人類 srTBI 病理生理過程的局限，為進一步理解和認知 srTBI 提供新的手段。雖然，已有文獻報道了新興 3D 體外模型在神經系統性疾病中的研究進展，但缺乏上述模型在 srTBI 研究中的系統性梳理和總結。本文綜述了新興 3D 體外模型在 srTBI 中的研究進展，探討了現有模型的優勢和局限，并進一步展望了 srTBI 模型的發展趨勢。本文旨在為組織工程學及運動醫學領域學者研究 srTBI 分子機制和研發神經保護藥物提供新的研究視角。
引用本文： 杜鑫程, 王記波, 趙穩, 陳璞, 歐高志. 運動相關創傷性腦損傷的新興三維體外模型研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2021, 38(4): 797-804. doi: 10.7507/1001-5515.202012050 復制
引言
運動相關創傷性腦損傷（sport-related traumatic brain injury, srTBI）是在運動過程中腦部直接或間接受到外力沖擊，導致認知和運動功能障礙的一種創傷性腦損傷（traumatic brain injury, TBI），并且 srTBI 的發生率分別占 TBI 的 20% 和運動相關損傷的 10%～15%[1-3]。據美國疾病預防和控制中心統計，srTBI 在美國每年有 160～380 萬例，是兒童及青年發生運動相關損傷的主要類型[4-6]。值得注意的是，由于臨床診斷延誤以及醫療設施缺乏等問題，srTBI 患者的實際人數更多，其造成的疾病負擔更重。
srTBI 具有復雜的病理生理特征，如神經元的軸突損傷、骨架破壞、細胞膜通透性增強等原發性神經損傷，以及由神經生化級聯反應導致的繼發性神經損傷。其中，srTBI 導致的原發性神經損傷有 76%～83% 屬于輕度 TBI，難以引起患者的足夠重視[7-8]。若未及時對 srTBI 患者采取有效的醫療干預措施，繼發性神經損傷會進一步加重腦部病變，導致不可逆的認知和運動功能障礙，同時增加罹患阿爾茲海默癥、帕金森等神經退行性疾病的風險[9-10]。因此，深入研究 srTBI 分子機制、研發相關的神經保護藥物以及優化治療手段具有重要意義。
目前，srTBI 分子機制的研究主要依賴經典研究模型（單層細胞培養模型和動物模型）。這些模型能夠模擬人類 srTBI 的部分病理生理特征，增加了人類對 srTBI 的認知。然而，這些模型在研究 srTBI 中存在諸多局限，包括：單層細胞培養模型缺乏與體內三維微環境相似的細胞與細胞間、細胞與細胞外基質（extracellular matrix, ECM）間相互作用；動物模型與人類在生理、病理以及遺傳上存在差異等。因此，急需構建與人類 srTBI 發生和發展過程高度相關的病理生理模型，用于深入研究 srTBI 分子機制，推進 srTBI 轉化研究。
近年來，隨著組織工程學、細胞生物學和發育生物學的迅速發展，新興三維（three-dimensional, 3D）體外模型作為生物醫學研究領域的創新型工具，為研究 srTBI 的發生和發展提供了新的手段。3D 體外模型能夠更加真實地模擬人體組織和器官水平的特異性結構、功能和細胞種群，可以彌補單層細胞培養模型和動物模型間的空缺。因此，3D 體外模型在 srTBI 基礎研究和臨床研究方面展現出了巨大的應用前景。
當前，已有文獻報道了 3D 體外模型在神經系統疾病中的應用[11]。但是，尚無文獻綜述 3D 體外模型在 srTBI 中的應用。因此，本文聚焦于新興 3D 體外模型在 srTBI 的構建以及潛在應用；并進一步總結了現有 3D 體外模型在 srTBI 研究方面的局限，展望了 srTBI 模型的發展趨勢，以期為組織工程學和運動醫學等領域學者在研究 srTBI 的分子機制和藥物篩選方面提供新的視角。
1 新興 3D 體外模型
新興 3D 體外模型是基于細胞生物學、發育生物學、組織工程學和生物材料學等多學科原理和方法，在體外構建的微尺度組織。這些模型可以模擬人體組織特異性的細胞種群、細胞空間排布、功能和微環境（如 ECM、生長因子和機械刺激等）等特征。與經典研究模型相比，3D 體外模型是能夠更真實地模擬人體組織和器官的關鍵結構和功能的創新型研究平臺，并為相關疾病的分子機制研究、藥物篩選、治療手段優化提供了有力支撐。本文重點概述可用于 srTBI 研究的新興 3D 體外模型，并根據構建原理將這些模型分為組織工程學模型和生物學模型。
1.1 組織工程學模型
組織工程學模型基于工程學原理，通過工程化手段將細胞和支架材料進行結合，仿生構建組織中的關鍵結構和功能。如圖1 所示，組織工程學模型按照工程構建手段可進一步分為工程化支架模型和微流控芯片模型。
圖1
用于 srTBI 研究的組織工程學模型示意圖
Figure1.
Schematic diagram of the tissue engineering models for srTBI research
1.1.1 工程化支架模型
工程化支架模型是整合種子細胞與生物材料，在體外重構體內微環境的微尺度組織。如圖1 中工程化支架模型所示，根據工程化支架模型中支架材料與細胞結合方式可分為：孔隙型支架模型、包埋型支架模型和復合型支架模型。
孔隙型支架模型是將細胞接種在具有孔隙結構的材料表面（孔隙尺寸一般為百微米級）形成的微組織，可通過孔隙型支架提供的仿生結構，增進細胞遷移和細胞間相互作用。Chen 等[12]利用軟光刻法制作了具有微柱結構的聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane, PDMS）孔隙型支架，并將人多能干細胞（human pluripotent stem cells, hPSCs）接種在支架表面。與單層細胞培養相比，該孔隙型支架促進了 hPSCs 向谷氨酸能神經元的分化以及成熟。隨后，Chen 等[12]對上述支架使用落體打擊構建損傷模型，由落體打擊引起的損傷促進了谷氨酸能神經元釋放谷氨酸，這一結果還原了人腦在損傷過程中的病理生理特征。該研究在損傷前使用神經保護藥物處理神經元，發現上述藥物可有效抑制由損傷導致的谷氨酸升高，阻止繼發性損傷。
包埋型支架模型是將細胞包裹在生物材料中形成的微組織，并通過生物材料為細胞提供仿生微環境[13]。Scimone 等[14]通過對 I 型膠原（collagen I）水凝膠包裹的皮層神經元施加機械沖擊，構建體外輕度損傷模型，并采用治療性低溫處理損傷模型。低溫處理增加了神經細胞內源性神經保護劑鈣蛋白酶抑制蛋白（calpastatin）的表達，抑制了細胞凋亡，減輕了損傷對細胞造成的有害影響。此外，Scimone 等[14]進一步確定了關鍵的治療參數，包括：冷卻溫度、處理時間窗以及治療持續時間，為制定臨床治療方案提供指導。
隨著對損傷研究的深入，研究人員需要構建更加仿生的工程化支架模型以模擬特定的生理結構及功能。復合型支架模型通過將包埋有細胞的凝膠種植在具有孔隙結構的材料表面形成的微組織，為細胞提供高保真的復雜仿生結構和微環境。Tang-Schomer 等[15]利用兩種不同的生物材料（蠶絲素蛋白和膠原）構建了一種復合支架，通過將大鼠皮層神經元接種在該支架上，形成具有皮層結構、神經突觸連接、神經電活動和神經組織力學特性的 3D 神經組織模型，并采用落體打擊構建損傷模型。損傷后的神經元持續釋放谷氨酸，并出現短暫的電活躍現象，這與前期基于小鼠模型的研究結果高度一致。為進一步提高損傷建模的打擊精度和損傷位點的可重復性，Liaudanskaya 等[9]進一步采用控制性皮質撞擊（controlled cortical impact, CCI）構建損傷模型。神經元變性的病理特征首先出現在直接損傷區域，并隨時間推移擴散到其他區域。此外，神經元釋放的乳酸鹽脫氫酶、谷氨酸以及高遷移率族蛋白 B1 的水平與動物實驗和人體試驗相似。Liaudanskaya 等[9]深入研究發現，CCI 可誘導神經網絡結構和功能的退化以及谷氨酸的釋放，并導致神經細胞的程序性壞死生物標志物磷酸化混合系列蛋白激酶樣結構域的高表達。而且損傷還下調了 AKT/mTOR 信號通路中磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和糖原合成酶激-3β。結果表明，上述模型模擬了由損傷引起的神經元程序性壞死和神經退行性反應的病理生理特征，為探索運動導致的皮層損傷和繼發性損傷的分子機制提供了一個可實時監測的平臺。
工程化支架模型通過整合生物材料和調控種子細胞命運的物理和化學條件，以促進模型在結構和功能上的仿生。但是，在構建工程化支架模型時，需要綜合考慮材料的生物相容性、可降解性和機械強度等，進而與種子細胞進行有效結合，提高模型的仿真程度。
1.1.2 微流控芯片模型
微流控芯片模型是基于反向工程仿生設計原理，以生物相容性材料為載體，利用微納加工技術在載體材料上加工微納結構，通過在不同時間點向微納結構中選擇性的接種和培養細胞，以模擬人體組織或器官中一些特定功能結構和分區的微平臺，并可再現大腦中多尺度的神經生物學特征，包括：神經突觸連接、血腦屏障、皮層結構等。相較于工程化支架模型，微流控芯片模型能夠精密調控神經微環境，例如：生化因子的時空分布、物理微環境、ECM 和血流動力學。因此，微流控芯片模型廣泛用于模擬和研究神經系統疾病。
微流控芯片可通過微結構引導軸突定向生長，并結合氣動裝置對軸突進行精準損傷，因而可用于構建神經元軸突損傷模型。如圖1 中微流控芯片模型所示，Yap 等[16]利用軟光刻技術，以 PDMS 為材料制作可控制軸突定向生長的微通道，并通過改變氣壓控制氣動微閥的形變程度，引起微閥上的神經元軸突損傷，構建軸突損傷模型。該研究比較了微流控芯片中皮層神經元軸突受到不同程度拉伸損傷的變化，發現了神經元死亡時間與拉伸損傷程度具有一定相關性。此外，有研究還發現，損傷導致軸突中神經絲的變性早于微管的變性，而且神經絲的變化可能是繼發性損傷的觸發因素[17]。研究結果顛覆了超過 10% 形變才會導致神經元軸突損傷的傳統認知，加深了對 srTBI 研究中神經元軸突骨架損傷和變性的理解。
在拳擊、摔跤、足球等同場競技的運動項目中，反復輕度 TBI 發生頻率最高。但由于癥狀不明顯，常常被教練員和運動員所忽視。但已有研究表明，反復損傷引起累積效應會增加腦部損傷的易感性，導致患者行為異常和腦功能的缺陷[18]。Yap 等[19]在前期研究工作[16]的基礎上，進一步研究了單次和反復拉伸損傷對軸突的影響。該團隊通過比較極輕拉伸（0.5% 形變）、輕度拉伸（5% 形變）以及反復極輕拉伸（2×0.5% 形變）對大鼠皮層神經元軸突尖端生長錐的形態和細胞骨架輪廓的影響，發現在極輕和輕度拉伸軸突后，軸突尖端的生長錐面積顯著減少，肌動蛋白和微管共定位異常，尖端回縮。損傷后 72 h，對比反復性極輕損傷與單次極輕損傷的神經元，反復性極輕損傷加重了軸突尖端生長錐結構的塌陷比例，加速了微管的破裂。此外，微管穩定劑埃博霉素 D 處理損傷后的神經元，減少了損傷導致的軸突微管破裂，進而減輕了軸突進一步的損傷。上述研究有助于更好地理解輕度和反復腦部損傷的發病機制，并驗證了微管靶向藥物對神經元遠端的治療效果。
微流控芯片模型因具有較高的保真度以及可重復性，在研究特定條件下 srTBI 的分子機制方面具有巨大潛力。盡管如此，該模型仍存在一些局限性，例如：流體在流動過程中產生的氣泡或剪切力可能會對細胞造成額外地損傷，并且對于生物學家來說，構建基于微機電系統工藝的微流控芯片也是一個巨大的挑戰。此外，模型中任何微小的變化都會對最終損傷造成巨大的影響，如何精準檢測損傷也是亟待解決的問題之一。
1.2 生物學模型
與組織工程學模型不同，生物學模型是基于細胞生物學和發育生物學的原理和方法，在體外依據細胞的分化、增殖和遷移等特征，模擬體內組織生成和器官產生的生理學過程。生物學模型可以高度模擬人腦細胞間復雜的相互聯系，具有與人類組織和器官相似的特異性細胞種群、結構和功能，有利于科研人員在體外構建更加仿生的人腦模型。根據構建方式的不同，生物學模型可分為神經小球（neurosphere）模型和大腦類器官（brain organoid）模型，如圖2 所示。
圖2
用于 srTBI 研究的生物學模型示意圖
Figure2.
Schematic diagram of the biological models for srTBI research
1.2.1 神經小球模型
神經小球模型是神經細胞通過物理或生物相互作用自組織（self-organization）形成的多細胞聚集體，如圖2 中神經小球模型所示。神經小球可通過懸滴板、低黏附板、生物反應器等裝置制備，并且具有天然 ECM 的組成成分。
神經小球可模擬腦部組織的細胞多樣性、電生理、ECM 和機械強度等方面的基本特征，因此可用于體外構建神經疾病模型。Shi 等[20]將由人誘導多能干細胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）來源的神經祖細胞分化成具有皮層神經元和星形膠質細胞的神經小球，進一步結合 3D 打印技術制作的微落重沖擊裝置，構建輕度 TBI 模型。神經小球在單次輕度 TBI 中，僅有微小的病理變化，如少量細胞死亡；而在多次輕度 TBI 中，表現出與人反復輕度 TBI 相似的病理表型，如神經元死亡、反應性星形膠質細胞增生和膠質瘢痕形成。為了進一步研究神經炎癥對于輕度 TBI 的影響，Shi 等[20]在該模型中引入小膠質細胞。結果表明，損傷激活了小膠質細胞，并誘導小膠質細胞持續釋放大量的炎癥因子和趨化因子。該模型具有高重復性，為高通量研究輕度 TBI 的分子機制、靶點識別、藥物篩選以及臨床轉化提供良好平臺。神經小球模型極大提高了體外結果與體內結果的相關度，在研究中樞神經系統的形成、生理、病理生理和修復中具有巨大的應用前景。充分發揮神經小球模型的優勢，將其更好地應用于 srTBI 的研究中，將是未來的重要研究方向。
1.2.2 大腦類器官模型
大腦類器官模型是利用多能干細胞向外胚層和神經譜系分化，產生具有與人類大腦類似結構和功能分區的微尺度大腦[21-22]，如圖2 中大腦類器官模型所示。大腦類器官的形成過程模擬了胚胎發育過程中大腦的生長和發育過程。與神經小球相比，大腦類器官不僅克服了神經小球中缺乏神經干細胞或祖細胞而導致自我更新和分化能力不足的問題，還具有與人類大腦更為相似的組織結構和細胞譜系，如皮層結構及分區等。大腦類器官的構建步驟主要包括：擬胚體形成、神經上皮誘導和神經分化成熟。
大腦類器官模擬了人類大腦細胞中的多細胞亞群以及細胞結構等關鍵方面，具有與人類大腦相似的腦區，能夠產生神經電活動以及功能性突觸[21]，高度還原了胎兒大腦發育過程，并已用于神經發育、神經疾病以及神經毒理方面的研究[23-26]。為了精確模擬腦部受到的外部沖擊，Lai 等[27]通過聲輻射力損傷 hiPSCs 來源的大腦類器官，構建損傷模型。轉錄組學研究表明，損傷上調了糖酵解和蛋白酶抑制劑，再現了神經退行性疾病相關病理特征，包括：磷酸化 Tau 蛋白的升高以及胞漿磷酸化 TDP-43 的聚集。該模型還原了腦損傷疾病的標志性過程以及由腦損傷導致的神經退行性疾病的病理特征，為研究急性和慢性腦損傷的分子機制和潛在治療方案奠定了基礎。然而，目前大腦類器官的成熟度僅相當于胎兒時期。但隨著大腦類器官的發展，構建高成熟度、全功能、多腦區的大腦類器官將為研究成人 srTBI 提供一個高度可靠的方案。
2 總結與展望
本文總結了可用于 srTBI 的新興 3D 體外模型，并根據構建原理的不同，將新興 3D 體外模型分為工程化支架、微流控芯片、神經小球以及大腦類器官模型，并進一步針對以上四種模型的種子細胞類型、尺度大小、模型水平、損傷方式以及相關研究問題等進行了總結，如表1 所示。研究人員需充分明確實際需求，合理選擇不同原理構建的損傷模型。
表1
用于 srTBI 研究的新興 3D 體外模型總結
Table1.
Summary of emerging 3D in vitro models for srTBI research
目前，3D 體外模型在 srTBI 中的研究尚處于起步階段，主要受限于以下兩方面：① 生理模型的仿生程度有限；② 損傷模式和強度的模擬程度不足。針對 srTBI 模型所存在的局限，本文提出以下展望，在生理模型構建方面：選擇具有高分化潛能人源多能干細胞作為種子細胞，解決模型中種間差異問題，并通過干細胞分化構建多細胞譜系模型；結合組織工程學和發育生物學原理，構建大腦類器官芯片，精確控制大腦類器官生長和發育微環境[28-31]；利用 3D 打印、生物組裝等技術，促進模型形成血管，提高營養物質及代謝產物的交換[32-33]；整合微機電系統，實時原位檢測模型中相關指標和微環境等參數的變化[34]。在損傷造模方面：考慮線性加速度和角速度的疊加、撞擊強度、撞擊次數和損傷間隔等因素對于損傷造模的影響[32]。
綜上所述，新興 3D 體外模型是對現有細胞模型和動物模型的重要補充和發展，是研究人類疾病的分子機制和治療方式的創新型工具，并有望成為生物醫學研究模型的范式和金標準。從生理模型構建和損傷建模對 srTBI 模型進行創新和優化，有助于闡明其損傷機制，制定更加合理的臨床診斷依據，最大程度地減少繼發性腦損傷的影響，從而為受傷運動員提供更加精準的治療方案。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
運動相關創傷性腦損傷（sport-related traumatic brain injury, srTBI）是在運動過程中腦部直接或間接受到外力沖擊，導致認知和運動功能障礙的一種創傷性腦損傷（traumatic brain injury, TBI），并且 srTBI 的發生率分別占 TBI 的 20% 和運動相關損傷的 10%～15%[1-3]。據美國疾病預防和控制中心統計，srTBI 在美國每年有 160～380 萬例，是兒童及青年發生運動相關損傷的主要類型[4-6]。值得注意的是，由于臨床診斷延誤以及醫療設施缺乏等問題，srTBI 患者的實際人數更多，其造成的疾病負擔更重。
srTBI 具有復雜的病理生理特征，如神經元的軸突損傷、骨架破壞、細胞膜通透性增強等原發性神經損傷，以及由神經生化級聯反應導致的繼發性神經損傷。其中，srTBI 導致的原發性神經損傷有 76%～83% 屬于輕度 TBI，難以引起患者的足夠重視[7-8]。若未及時對 srTBI 患者采取有效的醫療干預措施，繼發性神經損傷會進一步加重腦部病變，導致不可逆的認知和運動功能障礙，同時增加罹患阿爾茲海默癥、帕金森等神經退行性疾病的風險[9-10]。因此，深入研究 srTBI 分子機制、研發相關的神經保護藥物以及優化治療手段具有重要意義。
目前，srTBI 分子機制的研究主要依賴經典研究模型（單層細胞培養模型和動物模型）。這些模型能夠模擬人類 srTBI 的部分病理生理特征，增加了人類對 srTBI 的認知。然而，這些模型在研究 srTBI 中存在諸多局限，包括：單層細胞培養模型缺乏與體內三維微環境相似的細胞與細胞間、細胞與細胞外基質（extracellular matrix, ECM）間相互作用；動物模型與人類在生理、病理以及遺傳上存在差異等。因此，急需構建與人類 srTBI 發生和發展過程高度相關的病理生理模型，用于深入研究 srTBI 分子機制，推進 srTBI 轉化研究。
近年來，隨著組織工程學、細胞生物學和發育生物學的迅速發展，新興三維（three-dimensional, 3D）體外模型作為生物醫學研究領域的創新型工具，為研究 srTBI 的發生和發展提供了新的手段。3D 體外模型能夠更加真實地模擬人體組織和器官水平的特異性結構、功能和細胞種群，可以彌補單層細胞培養模型和動物模型間的空缺。因此，3D 體外模型在 srTBI 基礎研究和臨床研究方面展現出了巨大的應用前景。
當前，已有文獻報道了 3D 體外模型在神經系統疾病中的應用[11]。但是，尚無文獻綜述 3D 體外模型在 srTBI 中的應用。因此，本文聚焦于新興 3D 體外模型在 srTBI 的構建以及潛在應用；并進一步總結了現有 3D 體外模型在 srTBI 研究方面的局限，展望了 srTBI 模型的發展趨勢，以期為組織工程學和運動醫學等領域學者在研究 srTBI 的分子機制和藥物篩選方面提供新的視角。
1 新興 3D 體外模型
新興 3D 體外模型是基于細胞生物學、發育生物學、組織工程學和生物材料學等多學科原理和方法，在體外構建的微尺度組織。這些模型可以模擬人體組織特異性的細胞種群、細胞空間排布、功能和微環境（如 ECM、生長因子和機械刺激等）等特征。與經典研究模型相比，3D 體外模型是能夠更真實地模擬人體組織和器官的關鍵結構和功能的創新型研究平臺，并為相關疾病的分子機制研究、藥物篩選、治療手段優化提供了有力支撐。本文重點概述可用于 srTBI 研究的新興 3D 體外模型，并根據構建原理將這些模型分為組織工程學模型和生物學模型。
1.1 組織工程學模型
組織工程學模型基于工程學原理，通過工程化手段將細胞和支架材料進行結合，仿生構建組織中的關鍵結構和功能。如圖1 所示，組織工程學模型按照工程構建手段可進一步分為工程化支架模型和微流控芯片模型。
圖1
用于 srTBI 研究的組織工程學模型示意圖
Figure1.
Schematic diagram of the tissue engineering models for srTBI research
1.1.1 工程化支架模型
工程化支架模型是整合種子細胞與生物材料，在體外重構體內微環境的微尺度組織。如圖1 中工程化支架模型所示，根據工程化支架模型中支架材料與細胞結合方式可分為：孔隙型支架模型、包埋型支架模型和復合型支架模型。
孔隙型支架模型是將細胞接種在具有孔隙結構的材料表面（孔隙尺寸一般為百微米級）形成的微組織，可通過孔隙型支架提供的仿生結構，增進細胞遷移和細胞間相互作用。Chen 等[12]利用軟光刻法制作了具有微柱結構的聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane, PDMS）孔隙型支架，并將人多能干細胞（human pluripotent stem cells, hPSCs）接種在支架表面。與單層細胞培養相比，該孔隙型支架促進了 hPSCs 向谷氨酸能神經元的分化以及成熟。隨后，Chen 等[12]對上述支架使用落體打擊構建損傷模型，由落體打擊引起的損傷促進了谷氨酸能神經元釋放谷氨酸，這一結果還原了人腦在損傷過程中的病理生理特征。該研究在損傷前使用神經保護藥物處理神經元，發現上述藥物可有效抑制由損傷導致的谷氨酸升高，阻止繼發性損傷。
包埋型支架模型是將細胞包裹在生物材料中形成的微組織，并通過生物材料為細胞提供仿生微環境[13]。Scimone 等[14]通過對 I 型膠原（collagen I）水凝膠包裹的皮層神經元施加機械沖擊，構建體外輕度損傷模型，并采用治療性低溫處理損傷模型。低溫處理增加了神經細胞內源性神經保護劑鈣蛋白酶抑制蛋白（calpastatin）的表達，抑制了細胞凋亡，減輕了損傷對細胞造成的有害影響。此外，Scimone 等[14]進一步確定了關鍵的治療參數，包括：冷卻溫度、處理時間窗以及治療持續時間，為制定臨床治療方案提供指導。
隨著對損傷研究的深入，研究人員需要構建更加仿生的工程化支架模型以模擬特定的生理結構及功能。復合型支架模型通過將包埋有細胞的凝膠種植在具有孔隙結構的材料表面形成的微組織，為細胞提供高保真的復雜仿生結構和微環境。Tang-Schomer 等[15]利用兩種不同的生物材料（蠶絲素蛋白和膠原）構建了一種復合支架，通過將大鼠皮層神經元接種在該支架上，形成具有皮層結構、神經突觸連接、神經電活動和神經組織力學特性的 3D 神經組織模型，并采用落體打擊構建損傷模型。損傷后的神經元持續釋放谷氨酸，并出現短暫的電活躍現象，這與前期基于小鼠模型的研究結果高度一致。為進一步提高損傷建模的打擊精度和損傷位點的可重復性，Liaudanskaya 等[9]進一步采用控制性皮質撞擊（controlled cortical impact, CCI）構建損傷模型。神經元變性的病理特征首先出現在直接損傷區域，并隨時間推移擴散到其他區域。此外，神經元釋放的乳酸鹽脫氫酶、谷氨酸以及高遷移率族蛋白 B1 的水平與動物實驗和人體試驗相似。Liaudanskaya 等[9]深入研究發現，CCI 可誘導神經網絡結構和功能的退化以及谷氨酸的釋放，并導致神經細胞的程序性壞死生物標志物磷酸化混合系列蛋白激酶樣結構域的高表達。而且損傷還下調了 AKT/mTOR 信號通路中磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和糖原合成酶激-3β。結果表明，上述模型模擬了由損傷引起的神經元程序性壞死和神經退行性反應的病理生理特征，為探索運動導致的皮層損傷和繼發性損傷的分子機制提供了一個可實時監測的平臺。
工程化支架模型通過整合生物材料和調控種子細胞命運的物理和化學條件，以促進模型在結構和功能上的仿生。但是，在構建工程化支架模型時，需要綜合考慮材料的生物相容性、可降解性和機械強度等，進而與種子細胞進行有效結合，提高模型的仿真程度。
1.1.2 微流控芯片模型
微流控芯片模型是基于反向工程仿生設計原理，以生物相容性材料為載體，利用微納加工技術在載體材料上加工微納結構，通過在不同時間點向微納結構中選擇性的接種和培養細胞，以模擬人體組織或器官中一些特定功能結構和分區的微平臺，并可再現大腦中多尺度的神經生物學特征，包括：神經突觸連接、血腦屏障、皮層結構等。相較于工程化支架模型，微流控芯片模型能夠精密調控神經微環境，例如：生化因子的時空分布、物理微環境、ECM 和血流動力學。因此，微流控芯片模型廣泛用于模擬和研究神經系統疾病。
微流控芯片可通過微結構引導軸突定向生長，并結合氣動裝置對軸突進行精準損傷，因而可用于構建神經元軸突損傷模型。如圖1 中微流控芯片模型所示，Yap 等[16]利用軟光刻技術，以 PDMS 為材料制作可控制軸突定向生長的微通道，并通過改變氣壓控制氣動微閥的形變程度，引起微閥上的神經元軸突損傷，構建軸突損傷模型。該研究比較了微流控芯片中皮層神經元軸突受到不同程度拉伸損傷的變化，發現了神經元死亡時間與拉伸損傷程度具有一定相關性。此外，有研究還發現，損傷導致軸突中神經絲的變性早于微管的變性，而且神經絲的變化可能是繼發性損傷的觸發因素[17]。研究結果顛覆了超過 10% 形變才會導致神經元軸突損傷的傳統認知，加深了對 srTBI 研究中神經元軸突骨架損傷和變性的理解。
在拳擊、摔跤、足球等同場競技的運動項目中，反復輕度 TBI 發生頻率最高。但由于癥狀不明顯，常常被教練員和運動員所忽視。但已有研究表明，反復損傷引起累積效應會增加腦部損傷的易感性，導致患者行為異常和腦功能的缺陷[18]。Yap 等[19]在前期研究工作[16]的基礎上，進一步研究了單次和反復拉伸損傷對軸突的影響。該團隊通過比較極輕拉伸（0.5% 形變）、輕度拉伸（5% 形變）以及反復極輕拉伸（2×0.5% 形變）對大鼠皮層神經元軸突尖端生長錐的形態和細胞骨架輪廓的影響，發現在極輕和輕度拉伸軸突后，軸突尖端的生長錐面積顯著減少，肌動蛋白和微管共定位異常，尖端回縮。損傷后 72 h，對比反復性極輕損傷與單次極輕損傷的神經元，反復性極輕損傷加重了軸突尖端生長錐結構的塌陷比例，加速了微管的破裂。此外，微管穩定劑埃博霉素 D 處理損傷后的神經元，減少了損傷導致的軸突微管破裂，進而減輕了軸突進一步的損傷。上述研究有助于更好地理解輕度和反復腦部損傷的發病機制，并驗證了微管靶向藥物對神經元遠端的治療效果。
微流控芯片模型因具有較高的保真度以及可重復性，在研究特定條件下 srTBI 的分子機制方面具有巨大潛力。盡管如此，該模型仍存在一些局限性，例如：流體在流動過程中產生的氣泡或剪切力可能會對細胞造成額外地損傷，并且對于生物學家來說，構建基于微機電系統工藝的微流控芯片也是一個巨大的挑戰。此外，模型中任何微小的變化都會對最終損傷造成巨大的影響，如何精準檢測損傷也是亟待解決的問題之一。
1.2 生物學模型
與組織工程學模型不同，生物學模型是基于細胞生物學和發育生物學的原理和方法，在體外依據細胞的分化、增殖和遷移等特征，模擬體內組織生成和器官產生的生理學過程。生物學模型可以高度模擬人腦細胞間復雜的相互聯系，具有與人類組織和器官相似的特異性細胞種群、結構和功能，有利于科研人員在體外構建更加仿生的人腦模型。根據構建方式的不同，生物學模型可分為神經小球（neurosphere）模型和大腦類器官（brain organoid）模型，如圖2 所示。
圖2
用于 srTBI 研究的生物學模型示意圖
Figure2.
Schematic diagram of the biological models for srTBI research
1.2.1 神經小球模型
神經小球模型是神經細胞通過物理或生物相互作用自組織（self-organization）形成的多細胞聚集體，如圖2 中神經小球模型所示。神經小球可通過懸滴板、低黏附板、生物反應器等裝置制備，并且具有天然 ECM 的組成成分。
神經小球可模擬腦部組織的細胞多樣性、電生理、ECM 和機械強度等方面的基本特征，因此可用于體外構建神經疾病模型。Shi 等[20]將由人誘導多能干細胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）來源的神經祖細胞分化成具有皮層神經元和星形膠質細胞的神經小球，進一步結合 3D 打印技術制作的微落重沖擊裝置，構建輕度 TBI 模型。神經小球在單次輕度 TBI 中，僅有微小的病理變化，如少量細胞死亡；而在多次輕度 TBI 中，表現出與人反復輕度 TBI 相似的病理表型，如神經元死亡、反應性星形膠質細胞增生和膠質瘢痕形成。為了進一步研究神經炎癥對于輕度 TBI 的影響，Shi 等[20]在該模型中引入小膠質細胞。結果表明，損傷激活了小膠質細胞，并誘導小膠質細胞持續釋放大量的炎癥因子和趨化因子。該模型具有高重復性，為高通量研究輕度 TBI 的分子機制、靶點識別、藥物篩選以及臨床轉化提供良好平臺。神經小球模型極大提高了體外結果與體內結果的相關度，在研究中樞神經系統的形成、生理、病理生理和修復中具有巨大的應用前景。充分發揮神經小球模型的優勢，將其更好地應用于 srTBI 的研究中，將是未來的重要研究方向。
1.2.2 大腦類器官模型
大腦類器官模型是利用多能干細胞向外胚層和神經譜系分化，產生具有與人類大腦類似結構和功能分區的微尺度大腦[21-22]，如圖2 中大腦類器官模型所示。大腦類器官的形成過程模擬了胚胎發育過程中大腦的生長和發育過程。與神經小球相比，大腦類器官不僅克服了神經小球中缺乏神經干細胞或祖細胞而導致自我更新和分化能力不足的問題，還具有與人類大腦更為相似的組織結構和細胞譜系，如皮層結構及分區等。大腦類器官的構建步驟主要包括：擬胚體形成、神經上皮誘導和神經分化成熟。
大腦類器官模擬了人類大腦細胞中的多細胞亞群以及細胞結構等關鍵方面，具有與人類大腦相似的腦區，能夠產生神經電活動以及功能性突觸[21]，高度還原了胎兒大腦發育過程，并已用于神經發育、神經疾病以及神經毒理方面的研究[23-26]。為了精確模擬腦部受到的外部沖擊，Lai 等[27]通過聲輻射力損傷 hiPSCs 來源的大腦類器官，構建損傷模型。轉錄組學研究表明，損傷上調了糖酵解和蛋白酶抑制劑，再現了神經退行性疾病相關病理特征，包括：磷酸化 Tau 蛋白的升高以及胞漿磷酸化 TDP-43 的聚集。該模型還原了腦損傷疾病的標志性過程以及由腦損傷導致的神經退行性疾病的病理特征，為研究急性和慢性腦損傷的分子機制和潛在治療方案奠定了基礎。然而，目前大腦類器官的成熟度僅相當于胎兒時期。但隨著大腦類器官的發展，構建高成熟度、全功能、多腦區的大腦類器官將為研究成人 srTBI 提供一個高度可靠的方案。
2 總結與展望
本文總結了可用于 srTBI 的新興 3D 體外模型，并根據構建原理的不同，將新興 3D 體外模型分為工程化支架、微流控芯片、神經小球以及大腦類器官模型，并進一步針對以上四種模型的種子細胞類型、尺度大小、模型水平、損傷方式以及相關研究問題等進行了總結，如表1 所示。研究人員需充分明確實際需求，合理選擇不同原理構建的損傷模型。
表1
用于 srTBI 研究的新興 3D 體外模型總結
Table1.
Summary of emerging 3D in vitro models for srTBI research
目前，3D 體外模型在 srTBI 中的研究尚處于起步階段，主要受限于以下兩方面：① 生理模型的仿生程度有限；② 損傷模式和強度的模擬程度不足。針對 srTBI 模型所存在的局限，本文提出以下展望，在生理模型構建方面：選擇具有高分化潛能人源多能干細胞作為種子細胞，解決模型中種間差異問題，并通過干細胞分化構建多細胞譜系模型；結合組織工程學和發育生物學原理，構建大腦類器官芯片，精確控制大腦類器官生長和發育微環境[28-31]；利用 3D 打印、生物組裝等技術，促進模型形成血管，提高營養物質及代謝產物的交換[32-33]；整合微機電系統，實時原位檢測模型中相關指標和微環境等參數的變化[34]。在損傷造模方面：考慮線性加速度和角速度的疊加、撞擊強度、撞擊次數和損傷間隔等因素對于損傷造模的影響[32]。
綜上所述，新興 3D 體外模型是對現有細胞模型和動物模型的重要補充和發展，是研究人類疾病的分子機制和治療方式的創新型工具，并有望成為生物醫學研究模型的范式和金標準。從生理模型構建和損傷建模對 srTBI 模型進行創新和優化，有助于闡明其損傷機制，制定更加合理的臨床診斷依據，最大程度地減少繼發性腦損傷的影響，從而為受傷運動員提供更加精準的治療方案。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
