本研究的目的是構建一種光輻照穩定的光療與化療相結合的可注射凝膠。將光敏劑 IR780 和抗氧化劑白藜蘆醇（Res）引入紫杉醇（PTX）的聚乙二醇（PEG）溶液，制備了具有光療與化療性質的 Res-PTX@IR780 凝膠。結果表明，PTX、PTX@IR780 和 Res-PTX@IR780 能夠形成凝膠，其凝膠具有可注射性。ATR-FTIR 結果既表明了凝膠的組成，又表明了凝膠的形成涉及氫鍵的作用。紫外光譜表明，IR780 溶液不穩定，而 Res-IR780 溶液的光輻照穩定性明顯提高。光熱測試表明，Res-PTX@IR780 比 PTX@IR780 凝膠有更好的光熱轉換效果以及多次輻照光熱穩定性。小鼠體內探索結果顯示，注射了 Res-PTX@IR780 凝膠的部位光輻照后從 35 ℃ 升溫達到 64 ℃，溫差達 30 ℃。由于良好的光熱轉換和光熱循環效果，Res-PTX@IR780 凝膠作為光熱治療與化療結合的材料用于腫瘤的原位治療十分具有潛力。
引用本文： 歐陽耀文, 張奎, 周良芹, 陳元維, 羅祥林. 光輻照穩定的光熱-化療聯合的可注射紫杉醇凝膠. 生物醫學工程學雜志, 2021, 38(5): 979-985. doi: 10.7507/1001-5515.202011087 復制
引言
化療在臨床上被廣泛應用于各種癌癥的治療，但大多數化療藥物存在水溶解性差、生物體內半衰期短、有系統毒副作用等缺點。近年來，基于小分子藥物及其前藥自組裝構建的凝膠開始應用于腫瘤的原位治療[1]。這種局部給藥的方式可以在腫瘤部位長時間地維持較高化療藥物濃度[2]，增強了藥物在治療部位的濃度，減少了對正常組織的毒副作用。臨床中還可以配合手術切除腫瘤主體后將凝膠原位注射到切除的空腔內，防止腫瘤的復發[3]。
紫杉醇（paclitaxel，PTX）作為一個具有抗癌活性的二萜生物堿類化合物[4]，在臨床上已經廣泛用于乳腺癌、卵巢癌、部分頭頸癌和肺癌的治療[5]。研究者已經將 PTX 改性后制備了 PTX 前藥凝膠[6-9]。本課題組[10]通過分析 PTX 的結構以及用微量水性溶劑誘導 PTX 的結晶過程控制結晶程度，形成了真正意義上的可注射的藥物自身凝膠，用于腫瘤的原位治療。然而，在此過程中也發現，單純依靠 PTX 凝膠的化療作用，并不能徹底地殺死腫瘤細胞。
近年來，光動（photodynamic therapy，PDT）-光熱治療（photothermal therapy，PTT）與化療聯合的策略對癌癥的治療展現出優異的效果[11]。光敏劑 IR780 碘化物是一種親脂性陽離子七甲胺染料，吸收近紅外光后可以進行光熱轉化并且釋放活性氧（reactive oxygen species，ROS）[12]，常用于腫瘤的 PDT、PTT 治療和熒光成像研究[13-14]。基于此，我們在研究 PTX 自組裝可注射性凝膠的基礎上[10]，引入光敏劑 IR780 擬構建具有光療與化療聯合作用的可注射凝膠。然而，由于 IR780 這類花菁類染料存在光漂白現象，經近紅外光照射后分子結構中的雙鍵斷裂[15]，不具有多次光照響應性。為此，我們試圖引入一種抗氧化劑來保護 IR780 的分子結構[16-18]，使其凝膠具有多次光照響應性。白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種非黃酮類多酚化合物抗氧化劑，具有良好的抗氧化、抗自由基作用；而且，有研究報道，Res 對腫瘤細胞亦有一定殺傷作用且具有良好的生物相容性[19-21]。因此，在本研究中嘗試摻入 Res 使 IR780 在輻照過程中結構穩定并實現凝膠的多次光照循環性。我們首先研究了 PTX、PTX@IR780 和 Res-PTX@IR780 的成凝膠性及其凝膠的可注射性，然后研究了 Res 對 IR780 溶液的光輻照穩定作用，以及 PTX@IR780 凝膠的穩定性和光熱轉化效率，在此基礎上制備了 Res-PTX@IR780 凝膠，研究了該凝膠的光熱響應性和穩定性，并探究了體內聯合治療的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要儀器、試劑
使用體重為 18～20 g、5～8 周的雌性 BALB/c 小鼠（購自四川大學實驗動物中心）。本研究的動物實驗是根據四川大學動物護理與使用委員會批準的《實驗動物護理與使用指南》進行的。許可證號：SCKX（川）2020-030。
PTX（大連美倫生物有限公司）；IR780 碘化物（Alfa Aesar，美國）；Res（Sigma-Aldrich，美國）；磷酸鹽緩沖液（Hyclone 公司，美國）；其他試劑均購自成都科龍化工試劑公司。臺灣友嘉激光二極管（808 nm，2 W/cm2）；紫外分光光度計 UV-3600（Shimadzu，日本）；全反射紅外光譜儀（attenuated total reflection-Fourier transform infrared spectrometer，ATR-FTIR，美國賽默飛塞爾）；磁力攪拌器 CLJB-01（河北省自動化研究所）；分析天平 TG328A 型（上海天平儀器）。
1.2 光熱-化療凝膠制備
1.2.1 PTX@IR780 凝膠制備
取 5 mg IR780 溶于 2 mL 乙醇中制備 IR780 原液。取 40 mg PTX，置于盛有 1 mL PEG400 的螺紋瓶中，密閉瓶口后超聲使 PTX 均勻溶解在其中；緩慢滴加 0.5 mL 的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）誘導 PTX 分子間自組裝，期間向凝膠溶液中添加 20 μL 的 IR780 原液，室溫靜置幾分鐘得到 PTX@IR780 凝膠。與此同時用相機記錄溶膠-凝膠轉變過程。
1.2.2 Res-PTX@IR780 凝膠制備
制備過程完全與 PTX@IR780 凝膠相同，僅需在添加 IR780 的同時添加 40 mg Res，攪拌均勻后再緩慢滴加 PBS。
1.3 ATR-FTIR 測定凝膠組成
測定波數為 4 000～500 cm-1，樣品為凝膠的凍干粉末及 PTX 原藥。
1.4 紫外吸收波譜驗證 Res 穩定 IR780 溶液
將純的 IR780 溶解在含有 1,3-二苯基異苯并呋喃（1,3-diphenylisobenzofuran，DPBF）的 N,N-二甲基甲酰胺（N,N-Dimethylformamide，DMF）中配制成 50 μg/mL 的溶液，使用功率為 2 W/cm2的 808 nm 激光器對 IR780 溶液每次照射 2 min，重復 4 次，并且測量每次照射后溶液的紫外吸收波譜。同理，取相同量的 IR780 溶液并加入 40 mg Res，重復上述操作。
1.5 光熱測試
1.5.1 IR780 溶液光熱測試
分別取適量 IR780 原液滴加到 1 mL 的 PEG400 中制備 IR780 濃度分別為 10～90 μg/mL 的 PEG400 溶液。取 100 μL 上述溶液置于 1.5 mL 的離心管，用功率為 2 W/cm2的紅外激光器輻照，測定 30 s 輻照時間溫度上升的情況。另外制備 50 μg/mL 的 IR780 的 DMF 溶液，測定 0、2、4、6、8、12、24 h 時間點輻照 30 s 溫度上升的情況。
1.5.2 PTX@IR780 及 Res-PTX@IR780 凝膠體外光熱測試
在凝膠化未完成時取 100 μL 凝膠液置于 1.5 mL 的離心管，靜置使其形成凝膠，分別在第 1、3、5、7 天用紅外激光器輻照，測定并記錄溫度。
1.5.3 Res-PTX@IR780 凝膠體內光熱測試
使用 22 號針頭的注射器將 Res-PTX@IR780（40 mg PTX、40 mg Res、50 μg IR780、0.5 mL 0.9% NaCl）凝膠溶液吸入到管腔內，室溫靜止使其形成凝膠。凝膠形成后注射到小鼠皮下，用功率為 2 W/cm2的 808 nm 紅外光照射 1 min，觀察照射部位的變化并記錄小鼠腹部凝膠處溫度變化。
2 結果
2.1 溶膠-凝膠轉變及其凝膠的可注射性
如圖 1 所示，無論是純 PTX-PEG 溶液還是加入了 IR780 或 IR780/Res 的 PTX-PEG 溶液，經適量的 PBS 誘導 PTX 自組裝，都可以形成凝膠，而且這些凝膠都具有可注射性。
圖1
體外溶膠-凝膠轉變及其可注射性
A 和 AG、B 和 BG、C 和 CG 分別顯示的是 PTX、PTX@IR780 以及 Res-PTX@IR780 的溶膠-凝膠轉變；D 和 D’、E 和 E’、F 和 F’分別顯示的是 PTX 凝膠、PTX@IR780 凝膠和 Res-PTX@IR780 凝膠的可注射性，其中凝膠的含量各自為 40 mg PTX、1mL PEG400、0.5 mL PBS、50 μg IR780 以及 40 mg Res
Figure1. Sol-gel transition in vitro and its injectable propertyA and AG, B and BG, C and CG show the sol-gel transition of PTX, PTX@IR780 and Res-PTX@IR780, respectively; D and D', E and E', F and F' show the injectable properties of PTX gel, PTX@IR780 gel and Res-PTX@IR780 gel, respectively. The contents of gels were 40 mg PTX, 1 mL PEG400, 0.5 mL PBS, 50 μg IR780 and 40 mg Res, respectively
2.2 紅外結果
紅外光譜中（見圖 2），PTX 顯示了 3 500～3 300 cm?1處 NH 和 OH 伸縮振動，1 732、1 704 和 1 645 cm?1處 C=O 伸縮振動，以及 1 071、1 732 cm?1處芳香酸酯的峰紅外特征峰[4,22]。相對于 PTX 原藥，形成的凝膠在 3 500～3 300 cm?1處的峰消失并產生了一塊鼓包，以及 1 645 cm?1處酰胺基團的伸縮振動峰增寬均表明 PTX gel、PTX@IR780 gel 和 Res-PTX@IR780 gel 在形成過程中涉及到 NH 和 OH 與微量的水或 PEG 形成氫鍵。這是因為氫鍵的形成降低了所涉及的化學鍵的鍵力常數，吸收頻率因此會向低頻移動。鍵力常數的變化還會受到氫鍵數量的影響，當氫鍵數量較少時，吸收頻率向低頻移動會有不同程度的縮減，在紅外光譜中表現為光譜峰的展寬。
圖2
PTX 原藥及 PTX、PTX@IR780、Res-PTX@IR780 凝膠凍 干產物的 ATR-FTIR 光譜
Figure2.
ATR-FTIR spectra of PTX naked drug, PTX, PTX@IR780 and Res-PTX@IR780 gel freeze dried products
2.3 IR780 溶液穩定性和光熱轉換
IR780 表現出具有濃度依賴性的光熱轉換效率：用 808 nm 激光器輻照 30 s，10～50 μg/mL 的溶液表現出較明顯的溫度升高；當超過 50 μg/mL 時，升溫幅度不再明顯提高（見圖 3a、3b）。因此，后續實驗選取 50 μg/mL 的 IR780 用于制備凝膠。
圖3
IR780 溶液的光熱穩定性
a.不同濃度的 IR780 溶液輻照 30 s 的溫度-時間變化；b.特定時間點 IR780 的濃度-溫度變化；c. 50 μg/mL 的 IR780 溶液在不同時間點輻照 30 s 的溫度-時間變化；d. 50 μg/mL 的 IR780 溶液在放置過程中的顏色變化
Figure3. Photothermal stability of IR780 solutiona. temperature-time change of IR780 solution with different concentrations irradiated for 30 s; b. the concentration-temperature change of IR780 at a specific time point; c. the temperature-time change of IR780 solution (50 μg/mL) irradiated for 30 s at different time points; d. color change of IR780 solution (50 μg/mL) in the process of storage
然而，IR780-PEG400 溶液穩定性較差，表現為靜置后溶液顏色從最開始的墨綠色逐漸變為黃綠色，最后變為橙黃色（見圖 3d）；帶來的結果是 IR780-PEG400 溶液光熱轉換能力的逐漸減弱（見圖 3c），說明了 IR780 溶液及其光熱轉換能力的不穩定性。
為了分析 IR780 光熱轉換不穩定的原因，在 IR780 溶液中加入 DPBF 作為 ROS 的探針，測定用 808 激光器照射 30 s 后溶液的紫外光譜（見圖 4a）。IR780 在 580～830 nm 有強烈吸收，DPBF 能夠在 400～500 nm 產生明顯的特征峰。激光照射后，隨時間延長，IR780 的最大吸收峰降低并紅移，而 DPBF 在 400～500 nm 的吸收峰下降甚至消失。其原因是在近紅外光照射 IR780 產生光熱轉換的同時會促使 ROS 產生，后者使 IR780 產生光漂白；產生的 ROS 也使得 DPBF 分子斷裂，導致特征峰降低并消失。
圖4
用 808 激光器照射 30 s 后的不同時間段的紫外曲線
a. IR780 溶液；b. Res-IR780 溶液
Figure4. UV curves of different time periods after 30 s irradiation with 808 lasera. IR780 solution; b. Res-IR780 solution
圖 4b 顯示了含有 Res 的 IR780 溶液在相同條件下的紫外光譜。可以看到，DPBF 在 400～500 nm 的吸收峰下降甚至消失，說明有 ROS 產生，但 IR780 特征吸收峰的峰形和強度幾乎沒有變化，說明 Res 確實起到了穩定 IR780 的作用。
2.4 凝膠體外光熱測試
圖 5 顯示了 PTX@IR780 凝膠在第 1、3、5、7 天的光熱轉換情況以及凝膠的顏色變化。可以看到，PTX@IR780 凝膠在一周的時間內仍然保持著 IR780 本身顏色，僅僅是顏色的飽和度有所下降。因此，相比于 IR780 溶液，PTX@IR780 凝膠對 IR780 起到了一定的穩定作用。光熱轉換結果表明，凝膠經一次激光照射均能夠在 30 s 快速升溫到 80 ℃，說明凝膠確實穩定了 IR780。然而，PTX@IR780 凝膠經一次激光照射后，再次響應近紅外照射產生光熱轉換的能力大大下降，這樣并不能滿足在臨床的 PTT 治療時需要在腫瘤部位進行多次照射以提高治療效果的要求。
圖5
PTX@IR780 凝膠在第 1、3、5、7 天的光熱轉換循環能力
Figure5.
The conversion of PTX@IR780 gel at 1, 3, 5 and 7 d
Res-PTX@IR780 凝膠在一周內經多次輻照的光熱轉換情況如圖 6 所示。結果表明，多次輻照并不會影響 Res-PTX@IR780 凝膠的光熱性能，在光照時間一致時，光熱轉換效率在一周內基本維持不變。因此，Res-PTX@IR780 凝膠滿足了臨床中 PTT 治療的要求，可以用于腫瘤部位原位注射的光-化療聯合治療。
圖6
Res-PTX@IR780 凝膠在第 1、3、5、7 天用 808 激光器輻照 30 s 的光熱響應和循環性
Figure6.
The photothermal response and cycling capacity of Res-PTX@IR780 gel at 1, 3, 5, 7 d
2.5 凝膠體內光熱測試
為了探索 Res-PTX@IR780 凝膠在體內是否具有光熱性能，將其注射到小鼠皮下，經照射后觀察注射部位的升溫情況。如圖 7 所示，注射到小鼠皮下的 Res-PTX@IR780 形成了局部的凝膠塊；光照 1 min，非注射部位皮膚的溫度僅升高 3 ℃，而 Res-PTX@IR780 凝膠部位由于 IR780 的光熱作用，溫度從 35 ℃ 升到 64 ℃，溫升明顯，溫差高達 30 ℃。有文獻報道，當局部溫度達到 55 ℃ 時，腫瘤細胞即會被消融殺傷[23]。因此，可以通過控制光輻照的時間和功率，達到腫瘤細胞消融的目的。Res-PTX@IR780 凝膠有希望用于腫瘤的光療-化療聯合治療。
圖7
Res-PTX@IR780 凝膠的體內光熱響應性
Figure7.
The in vivo photothermal response of Res-PTX@IR780 gel
3 討論
針對單純的 PTX 凝膠用于腫瘤的原位化療不能徹底殺死腫瘤細胞的情況，引入了光敏劑 IR780 和 Res 構建了凝膠（Res-PTX@IR780），用于腫瘤的光療-化療聯合治療。Res-PTX@IR780 以及 PTX@IR780 與 PTX 一樣具有溶膠-凝膠轉變性與可注射性，凝膠的形成原理過程涉及到氫鍵的產生[10]。IR780 穩定性差、易于變質的原因是分子中存在的多個不飽和鍵，它們可以和 ROS 加成形成熱不穩定的含氧雜環結構[24]。Res 具有能夠消除自由基的特性[25]，消耗了 IR780 在光輻照時產生的 ROS，保護了 IR780 分子結構的完整性，減少光漂白，能夠提高 IR780 的穩定性。因此，加入 Res 后的 IR780 溶液在 780 nm 處的最大吸收峰在多次光照后未發生明顯降低。IR780 與 PTX 共同形成凝膠（PTX@IR780），在一定程度上改善了 IR780 的穩定性。其原因可能是，一方面凝膠的網狀結構限制了 IR780 的分子運動，降低了光漂白；另一方面，IR780 可能會和 PTX 之間產生 π-π 堆疊作用，減緩了因光導致的穩定性差的現象。但 PTX@IR780 的多次光熱響應能力仍不夠理想。Res-PTX@IR780 凝膠的光熱循環實驗顯示，多次光照后該凝膠仍能在光照 30 s 達到初次光照下的升溫溫度，證明了 Res-PTX@IR780 凝膠中 RES 確實穩定了 IR780 并減少了其光漂白現象，這表明 Res-PTX@IR780 凝膠同時具有優異的光熱轉換性能和多次光熱響應能力。進一步實驗發現，Res-PTX@IR780 凝膠在小鼠體內也同樣具有光熱響應能力。
4 結論
光敏劑 IR780 和 Res 與 PTX 的 PEG 溶液能夠形成 Res-PTX@IR780 凝膠。該凝膠中 Res 能夠通過消除光輻照時產生的 ROS 保護 IR780 分子結構的完整性，減少光漂白，提高 IR780 的穩定性。Res-PTX@IR780 凝膠具有多次光熱響應能力，在體內也具有光熱轉換性。因而，Res-PTX@IR780 凝膠作為光療和化療結合的材料用于腫瘤的原位治療具有良好的應用前景。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
化療在臨床上被廣泛應用于各種癌癥的治療，但大多數化療藥物存在水溶解性差、生物體內半衰期短、有系統毒副作用等缺點。近年來，基于小分子藥物及其前藥自組裝構建的凝膠開始應用于腫瘤的原位治療[1]。這種局部給藥的方式可以在腫瘤部位長時間地維持較高化療藥物濃度[2]，增強了藥物在治療部位的濃度，減少了對正常組織的毒副作用。臨床中還可以配合手術切除腫瘤主體后將凝膠原位注射到切除的空腔內，防止腫瘤的復發[3]。
紫杉醇（paclitaxel，PTX）作為一個具有抗癌活性的二萜生物堿類化合物[4]，在臨床上已經廣泛用于乳腺癌、卵巢癌、部分頭頸癌和肺癌的治療[5]。研究者已經將 PTX 改性后制備了 PTX 前藥凝膠[6-9]。本課題組[10]通過分析 PTX 的結構以及用微量水性溶劑誘導 PTX 的結晶過程控制結晶程度，形成了真正意義上的可注射的藥物自身凝膠，用于腫瘤的原位治療。然而，在此過程中也發現，單純依靠 PTX 凝膠的化療作用，并不能徹底地殺死腫瘤細胞。
近年來，光動（photodynamic therapy，PDT）-光熱治療（photothermal therapy，PTT）與化療聯合的策略對癌癥的治療展現出優異的效果[11]。光敏劑 IR780 碘化物是一種親脂性陽離子七甲胺染料，吸收近紅外光后可以進行光熱轉化并且釋放活性氧（reactive oxygen species，ROS）[12]，常用于腫瘤的 PDT、PTT 治療和熒光成像研究[13-14]。基于此，我們在研究 PTX 自組裝可注射性凝膠的基礎上[10]，引入光敏劑 IR780 擬構建具有光療與化療聯合作用的可注射凝膠。然而，由于 IR780 這類花菁類染料存在光漂白現象，經近紅外光照射后分子結構中的雙鍵斷裂[15]，不具有多次光照響應性。為此，我們試圖引入一種抗氧化劑來保護 IR780 的分子結構[16-18]，使其凝膠具有多次光照響應性。白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種非黃酮類多酚化合物抗氧化劑，具有良好的抗氧化、抗自由基作用；而且，有研究報道，Res 對腫瘤細胞亦有一定殺傷作用且具有良好的生物相容性[19-21]。因此，在本研究中嘗試摻入 Res 使 IR780 在輻照過程中結構穩定并實現凝膠的多次光照循環性。我們首先研究了 PTX、PTX@IR780 和 Res-PTX@IR780 的成凝膠性及其凝膠的可注射性，然后研究了 Res 對 IR780 溶液的光輻照穩定作用，以及 PTX@IR780 凝膠的穩定性和光熱轉化效率，在此基礎上制備了 Res-PTX@IR780 凝膠，研究了該凝膠的光熱響應性和穩定性，并探究了體內聯合治療的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要儀器、試劑
使用體重為 18～20 g、5～8 周的雌性 BALB/c 小鼠（購自四川大學實驗動物中心）。本研究的動物實驗是根據四川大學動物護理與使用委員會批準的《實驗動物護理與使用指南》進行的。許可證號：SCKX（川）2020-030。
PTX（大連美倫生物有限公司）；IR780 碘化物（Alfa Aesar，美國）；Res（Sigma-Aldrich，美國）；磷酸鹽緩沖液（Hyclone 公司，美國）；其他試劑均購自成都科龍化工試劑公司。臺灣友嘉激光二極管（808 nm，2 W/cm2）；紫外分光光度計 UV-3600（Shimadzu，日本）；全反射紅外光譜儀（attenuated total reflection-Fourier transform infrared spectrometer，ATR-FTIR，美國賽默飛塞爾）；磁力攪拌器 CLJB-01（河北省自動化研究所）；分析天平 TG328A 型（上海天平儀器）。
1.2 光熱-化療凝膠制備
1.2.1 PTX@IR780 凝膠制備
取 5 mg IR780 溶于 2 mL 乙醇中制備 IR780 原液。取 40 mg PTX，置于盛有 1 mL PEG400 的螺紋瓶中，密閉瓶口后超聲使 PTX 均勻溶解在其中；緩慢滴加 0.5 mL 的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）誘導 PTX 分子間自組裝，期間向凝膠溶液中添加 20 μL 的 IR780 原液，室溫靜置幾分鐘得到 PTX@IR780 凝膠。與此同時用相機記錄溶膠-凝膠轉變過程。
1.2.2 Res-PTX@IR780 凝膠制備
制備過程完全與 PTX@IR780 凝膠相同，僅需在添加 IR780 的同時添加 40 mg Res，攪拌均勻后再緩慢滴加 PBS。
1.3 ATR-FTIR 測定凝膠組成
測定波數為 4 000～500 cm-1，樣品為凝膠的凍干粉末及 PTX 原藥。
1.4 紫外吸收波譜驗證 Res 穩定 IR780 溶液
將純的 IR780 溶解在含有 1,3-二苯基異苯并呋喃（1,3-diphenylisobenzofuran，DPBF）的 N,N-二甲基甲酰胺（N,N-Dimethylformamide，DMF）中配制成 50 μg/mL 的溶液，使用功率為 2 W/cm2的 808 nm 激光器對 IR780 溶液每次照射 2 min，重復 4 次，并且測量每次照射后溶液的紫外吸收波譜。同理，取相同量的 IR780 溶液并加入 40 mg Res，重復上述操作。
1.5 光熱測試
1.5.1 IR780 溶液光熱測試
分別取適量 IR780 原液滴加到 1 mL 的 PEG400 中制備 IR780 濃度分別為 10～90 μg/mL 的 PEG400 溶液。取 100 μL 上述溶液置于 1.5 mL 的離心管，用功率為 2 W/cm2的紅外激光器輻照，測定 30 s 輻照時間溫度上升的情況。另外制備 50 μg/mL 的 IR780 的 DMF 溶液，測定 0、2、4、6、8、12、24 h 時間點輻照 30 s 溫度上升的情況。
1.5.2 PTX@IR780 及 Res-PTX@IR780 凝膠體外光熱測試
在凝膠化未完成時取 100 μL 凝膠液置于 1.5 mL 的離心管，靜置使其形成凝膠，分別在第 1、3、5、7 天用紅外激光器輻照，測定并記錄溫度。
1.5.3 Res-PTX@IR780 凝膠體內光熱測試
使用 22 號針頭的注射器將 Res-PTX@IR780（40 mg PTX、40 mg Res、50 μg IR780、0.5 mL 0.9% NaCl）凝膠溶液吸入到管腔內，室溫靜止使其形成凝膠。凝膠形成后注射到小鼠皮下，用功率為 2 W/cm2的 808 nm 紅外光照射 1 min，觀察照射部位的變化并記錄小鼠腹部凝膠處溫度變化。
2 結果
2.1 溶膠-凝膠轉變及其凝膠的可注射性
如圖 1 所示，無論是純 PTX-PEG 溶液還是加入了 IR780 或 IR780/Res 的 PTX-PEG 溶液，經適量的 PBS 誘導 PTX 自組裝，都可以形成凝膠，而且這些凝膠都具有可注射性。
圖1
體外溶膠-凝膠轉變及其可注射性
A 和 AG、B 和 BG、C 和 CG 分別顯示的是 PTX、PTX@IR780 以及 Res-PTX@IR780 的溶膠-凝膠轉變；D 和 D’、E 和 E’、F 和 F’分別顯示的是 PTX 凝膠、PTX@IR780 凝膠和 Res-PTX@IR780 凝膠的可注射性，其中凝膠的含量各自為 40 mg PTX、1mL PEG400、0.5 mL PBS、50 μg IR780 以及 40 mg Res
Figure1. Sol-gel transition in vitro and its injectable propertyA and AG, B and BG, C and CG show the sol-gel transition of PTX, PTX@IR780 and Res-PTX@IR780, respectively; D and D', E and E', F and F' show the injectable properties of PTX gel, PTX@IR780 gel and Res-PTX@IR780 gel, respectively. The contents of gels were 40 mg PTX, 1 mL PEG400, 0.5 mL PBS, 50 μg IR780 and 40 mg Res, respectively
2.2 紅外結果
紅外光譜中（見圖 2），PTX 顯示了 3 500～3 300 cm?1處 NH 和 OH 伸縮振動，1 732、1 704 和 1 645 cm?1處 C=O 伸縮振動，以及 1 071、1 732 cm?1處芳香酸酯的峰紅外特征峰[4,22]。相對于 PTX 原藥，形成的凝膠在 3 500～3 300 cm?1處的峰消失并產生了一塊鼓包，以及 1 645 cm?1處酰胺基團的伸縮振動峰增寬均表明 PTX gel、PTX@IR780 gel 和 Res-PTX@IR780 gel 在形成過程中涉及到 NH 和 OH 與微量的水或 PEG 形成氫鍵。這是因為氫鍵的形成降低了所涉及的化學鍵的鍵力常數，吸收頻率因此會向低頻移動。鍵力常數的變化還會受到氫鍵數量的影響，當氫鍵數量較少時，吸收頻率向低頻移動會有不同程度的縮減，在紅外光譜中表現為光譜峰的展寬。
圖2
PTX 原藥及 PTX、PTX@IR780、Res-PTX@IR780 凝膠凍 干產物的 ATR-FTIR 光譜
Figure2.
ATR-FTIR spectra of PTX naked drug, PTX, PTX@IR780 and Res-PTX@IR780 gel freeze dried products
2.3 IR780 溶液穩定性和光熱轉換
IR780 表現出具有濃度依賴性的光熱轉換效率：用 808 nm 激光器輻照 30 s，10～50 μg/mL 的溶液表現出較明顯的溫度升高；當超過 50 μg/mL 時，升溫幅度不再明顯提高（見圖 3a、3b）。因此，后續實驗選取 50 μg/mL 的 IR780 用于制備凝膠。
圖3
IR780 溶液的光熱穩定性
a.不同濃度的 IR780 溶液輻照 30 s 的溫度-時間變化；b.特定時間點 IR780 的濃度-溫度變化；c. 50 μg/mL 的 IR780 溶液在不同時間點輻照 30 s 的溫度-時間變化；d. 50 μg/mL 的 IR780 溶液在放置過程中的顏色變化
Figure3. Photothermal stability of IR780 solutiona. temperature-time change of IR780 solution with different concentrations irradiated for 30 s; b. the concentration-temperature change of IR780 at a specific time point; c. the temperature-time change of IR780 solution (50 μg/mL) irradiated for 30 s at different time points; d. color change of IR780 solution (50 μg/mL) in the process of storage
然而，IR780-PEG400 溶液穩定性較差，表現為靜置后溶液顏色從最開始的墨綠色逐漸變為黃綠色，最后變為橙黃色（見圖 3d）；帶來的結果是 IR780-PEG400 溶液光熱轉換能力的逐漸減弱（見圖 3c），說明了 IR780 溶液及其光熱轉換能力的不穩定性。
為了分析 IR780 光熱轉換不穩定的原因，在 IR780 溶液中加入 DPBF 作為 ROS 的探針，測定用 808 激光器照射 30 s 后溶液的紫外光譜（見圖 4a）。IR780 在 580～830 nm 有強烈吸收，DPBF 能夠在 400～500 nm 產生明顯的特征峰。激光照射后，隨時間延長，IR780 的最大吸收峰降低并紅移，而 DPBF 在 400～500 nm 的吸收峰下降甚至消失。其原因是在近紅外光照射 IR780 產生光熱轉換的同時會促使 ROS 產生，后者使 IR780 產生光漂白；產生的 ROS 也使得 DPBF 分子斷裂，導致特征峰降低并消失。
圖4
用 808 激光器照射 30 s 后的不同時間段的紫外曲線
a. IR780 溶液；b. Res-IR780 溶液
Figure4. UV curves of different time periods after 30 s irradiation with 808 lasera. IR780 solution; b. Res-IR780 solution
圖 4b 顯示了含有 Res 的 IR780 溶液在相同條件下的紫外光譜。可以看到，DPBF 在 400～500 nm 的吸收峰下降甚至消失，說明有 ROS 產生，但 IR780 特征吸收峰的峰形和強度幾乎沒有變化，說明 Res 確實起到了穩定 IR780 的作用。
2.4 凝膠體外光熱測試
圖 5 顯示了 PTX@IR780 凝膠在第 1、3、5、7 天的光熱轉換情況以及凝膠的顏色變化。可以看到，PTX@IR780 凝膠在一周的時間內仍然保持著 IR780 本身顏色，僅僅是顏色的飽和度有所下降。因此，相比于 IR780 溶液，PTX@IR780 凝膠對 IR780 起到了一定的穩定作用。光熱轉換結果表明，凝膠經一次激光照射均能夠在 30 s 快速升溫到 80 ℃，說明凝膠確實穩定了 IR780。然而，PTX@IR780 凝膠經一次激光照射后，再次響應近紅外照射產生光熱轉換的能力大大下降，這樣并不能滿足在臨床的 PTT 治療時需要在腫瘤部位進行多次照射以提高治療效果的要求。
圖5
PTX@IR780 凝膠在第 1、3、5、7 天的光熱轉換循環能力
Figure5.
The conversion of PTX@IR780 gel at 1, 3, 5 and 7 d
Res-PTX@IR780 凝膠在一周內經多次輻照的光熱轉換情況如圖 6 所示。結果表明，多次輻照并不會影響 Res-PTX@IR780 凝膠的光熱性能，在光照時間一致時，光熱轉換效率在一周內基本維持不變。因此，Res-PTX@IR780 凝膠滿足了臨床中 PTT 治療的要求，可以用于腫瘤部位原位注射的光-化療聯合治療。
圖6
Res-PTX@IR780 凝膠在第 1、3、5、7 天用 808 激光器輻照 30 s 的光熱響應和循環性
Figure6.
The photothermal response and cycling capacity of Res-PTX@IR780 gel at 1, 3, 5, 7 d
2.5 凝膠體內光熱測試
為了探索 Res-PTX@IR780 凝膠在體內是否具有光熱性能，將其注射到小鼠皮下，經照射后觀察注射部位的升溫情況。如圖 7 所示，注射到小鼠皮下的 Res-PTX@IR780 形成了局部的凝膠塊；光照 1 min，非注射部位皮膚的溫度僅升高 3 ℃，而 Res-PTX@IR780 凝膠部位由于 IR780 的光熱作用，溫度從 35 ℃ 升到 64 ℃，溫升明顯，溫差高達 30 ℃。有文獻報道，當局部溫度達到 55 ℃ 時，腫瘤細胞即會被消融殺傷[23]。因此，可以通過控制光輻照的時間和功率，達到腫瘤細胞消融的目的。Res-PTX@IR780 凝膠有希望用于腫瘤的光療-化療聯合治療。
圖7
Res-PTX@IR780 凝膠的體內光熱響應性
Figure7.
The in vivo photothermal response of Res-PTX@IR780 gel
3 討論
針對單純的 PTX 凝膠用于腫瘤的原位化療不能徹底殺死腫瘤細胞的情況，引入了光敏劑 IR780 和 Res 構建了凝膠（Res-PTX@IR780），用于腫瘤的光療-化療聯合治療。Res-PTX@IR780 以及 PTX@IR780 與 PTX 一樣具有溶膠-凝膠轉變性與可注射性，凝膠的形成原理過程涉及到氫鍵的產生[10]。IR780 穩定性差、易于變質的原因是分子中存在的多個不飽和鍵，它們可以和 ROS 加成形成熱不穩定的含氧雜環結構[24]。Res 具有能夠消除自由基的特性[25]，消耗了 IR780 在光輻照時產生的 ROS，保護了 IR780 分子結構的完整性，減少光漂白，能夠提高 IR780 的穩定性。因此，加入 Res 后的 IR780 溶液在 780 nm 處的最大吸收峰在多次光照后未發生明顯降低。IR780 與 PTX 共同形成凝膠（PTX@IR780），在一定程度上改善了 IR780 的穩定性。其原因可能是，一方面凝膠的網狀結構限制了 IR780 的分子運動，降低了光漂白；另一方面，IR780 可能會和 PTX 之間產生 π-π 堆疊作用，減緩了因光導致的穩定性差的現象。但 PTX@IR780 的多次光熱響應能力仍不夠理想。Res-PTX@IR780 凝膠的光熱循環實驗顯示，多次光照后該凝膠仍能在光照 30 s 達到初次光照下的升溫溫度，證明了 Res-PTX@IR780 凝膠中 RES 確實穩定了 IR780 并減少了其光漂白現象，這表明 Res-PTX@IR780 凝膠同時具有優異的光熱轉換性能和多次光熱響應能力。進一步實驗發現，Res-PTX@IR780 凝膠在小鼠體內也同樣具有光熱響應能力。
4 結論
光敏劑 IR780 和 Res 與 PTX 的 PEG 溶液能夠形成 Res-PTX@IR780 凝膠。該凝膠中 Res 能夠通過消除光輻照時產生的 ROS 保護 IR780 分子結構的完整性，減少光漂白，提高 IR780 的穩定性。Res-PTX@IR780 凝膠具有多次光熱響應能力，在體內也具有光熱轉換性。因而，Res-PTX@IR780 凝膠作為光療和化療結合的材料用于腫瘤的原位治療具有良好的應用前景。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
