經顱磁刺激作為一種無創的神經調控技術，廣泛地應用于神經和精神類疾病的臨床治療，但其神經調控的作用機制尚不清楚。本文旨在從神經元電生理角度研究不同頻率的磁刺激對離體腦片神經元興奮性和電壓門控型鉀通道的影響。實驗分為刺激組和對照組，刺激組對急性分離的小鼠腦片分別施加同一強度（0.3 T）下不同頻率（20 Hz 和 0.5 Hz）的磁刺激（500 個脈沖）。利用全細胞膜片鉗技術記錄海馬齒狀回顆粒神經元的靜息膜電位、動作電位和電壓門控型鉀通道電流。結果顯示，20 Hz 磁刺激顯著增加了動作電位的發放個數以及單個動作電位的最大斜率，降低了動作電位的閾值、半波寬和達峰時間，提高了海馬神經元的興奮性；降低了鉀通道的電流峰值，瞬時外向鉀通道的失活曲線明顯左移，失活后復活的時間常數明顯增大。0.5 Hz 磁刺激則顯著抑制了神經元興奮性，提高了鉀通道的電流峰值，但通道的動力學特征沒有明顯變化。結果提示，海馬齒狀回顆粒細胞電壓門控鉀通道的動力學特征和神經元的興奮性，可能是磁刺激進行神經調控的潛在機制之一。
引用本文： 尹曉楠, 徐桂芝, 朱海軍, 付蕊, 李洋, 丁沖. 不同頻率磁刺激對離體腦片神經元興奮性及電壓門控型鉀通道影響的研究. 生物醫學工程學雜志, 2021, 38(2): 224-231. doi: 10.7507/1001-5515.202009047 復制
引言
重復經顱磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）是一種非侵入性的神經刺激技術。該技術依據電磁感應原理，利用變化的電流流經線圈時產生變化的磁場[1]，磁場幾乎無衰減地穿透顱骨等高阻抗組織[2]，在大腦中誘導產生刺激電流[3]。目前，經顱磁刺激已廣泛應用于神經與精神性疾病的治療中[4-6]，在阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）、抑郁癥、腦癱等科學研究與臨床治療中取得了顯著成果[7-10]。
研究顯示，rTMS 對大腦的調控作用與神經元興奮性有關。長期施加 1 Hz 的 rTMS 可改變海馬 CA1 區錐體細胞膜上離子通道、靜息膜電位和動作電位閾值，提高神經元的興奮性[11]。rTMS 在提高大腦齒狀回（dentate gyrus，DG）顆粒細胞神經興奮性的同時可改善與年齡相關的認知損傷[12]。長期暴露在高頻 rTMS 下的老年小鼠神經興奮性降低和與年齡相關的認知障礙得到明顯改善，同時電壓門控型鈣通道動力學發生改變[13]。rTMS 對神經調控的作用與頻率有關，低頻 rTMS 可通過降低大腦皮層神經元的興奮性來抑制神經元活動，高頻 rTMS 可通過促進神經元興奮性來改善大腦腦區的功能[14-15]。
已有研究從電生理、分子、行為認知等不同層面對磁刺激的作用進行了探索[16]，但磁刺激的作用效果不盡相同，作用機制仍不明確[17]，對離體腦片施加磁刺激后神經興奮性的變化及其機制的研究鮮有報道。電壓門控型鉀離子通道具有參與調控細胞興奮性和靜息電位的作用[18]，是調節神經元興奮性水平的機制之一[19-20]，主要包括瞬時外向鉀通道電流（transient outward potassium current，IA）和延遲整流鉀通道電流（delayed rectifier potassium current，IK），IA 是膜電位復極化早期外向電流的主要成分，在細胞放電模式、動作電位的產生及放電頻率等方面發揮著很重要的作用[21-22]。IK 的幅值可直接影響動作電位幅度和頻率，對細胞興奮性有至關重要的影響[23-24]。不同頻率的磁刺激是否是通過改變鉀離子通道的動力學特征調節神經元的興奮性還有待驗證。本文旨在探究不同頻率的磁刺激對離體腦片海馬 DG 區顆粒神經元興奮性和電壓門控型鉀離子通道動力學的影響，并提出假設：高頻磁刺激可以提高神經元的興奮性，低頻磁刺激則是抑制其興奮性，磁刺激對離體腦片海馬 DG 區顆粒細胞神經興奮性的調節作用可能是通過對電壓門控鉀離子通道的調控實現的。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及實驗設計
研究采用 4～5 周左右的雌性昆明小鼠共 8 只，購買自北京華阜康生物科技有限公司。在室溫為（25 ± 1）℃、濕度為 60% 左右的環境中飼養小鼠，自由取水和進食，光照與黑暗交替循環。在腦片制備結束之后，將腦片隨機分為實驗組（高頻 20 Hz，低頻 0.5 Hz）與對照組，實驗組在施加磁刺激之后立即進行全細胞腦片膜片鉗電生理實驗，對照組在孵育結束之后直接進行電生理實驗，實驗重復 3 次。所有動物實驗均獲得河北工業大學與華北理工大學倫理委員會批準，且符合實驗動物倫理學要求和使用規范（實驗動物許可證號：SYXK（冀）2015-0038；倫理審查編號：LX201886）。
1.2 磁刺激實施
取孵育之后的腦片置于磁刺激線圈之下，接受特定頻率磁刺激。采用依瑞德 CCY-IA 型號的刺激儀及型號為 Y064 的小動物刺激線圈進行實驗，使用重復磁刺激模式，刺激參數為高頻 20 Hz，低頻 0.5 Hz，刺激強度約為 0.3 T，刺激脈沖個數均為 500 個。
1.3 電生理實驗
1.3.1 溶液配制
人工腦脊液的成分為（mmol/L）：NaCl 124，KCl 3，CaCl2 2，MgCl2 2，NaH2PO4 1.625，NaHCO3 26，glucose 11，HEPES 5，用 NaOH 將 pH 調至 7.4，滲透壓 310～320 mOsm，溫度保持在 30 ℃，通氧（95% O2/5% CO2）使之飽和，在此環境下腦片可存活 8～10 h。
切片液的成分為（mmol/L）：KCl 2.5，CaCl2 1，MgCl2 6，NaH2PO4 1.625，NaHCO3 26，glucose 11，sucrose 220，pH 為 7.4，滲透壓為 300～305 mOsm。
全細胞電流鉗的電極內液成分為（mmol/L）：K-glu 125，NaCl 15，MgCl2 2，CaCl2 1，EGTA 11，HEPES 10，Na-ATP 3，Na-GTP 0.3，調節 pH 為 7.2～7.3，滲透壓為 285～290 mOsm。使用前用 0.22 μm 濾膜進行過濾。
鉀電流記錄細胞外液成分為（mmol/L）：NaCl 130，KCl 5，CaCl2 2，MgCl2 1，glucose 10，HEPES 10，TTX 0.001，CdCl2 0.2，用 NaOH 將 pH 調至 7.4，通氧（95% O2/5% CO2）使之飽和。
鉀電流記錄的電極內液成分為（mmol/L）：KCl 140，MgCl2 2，EGTA 10，HEPES 10，Mg-ATP 2，用 KOH 將 pH 調至 7.2。使用前用 0.22 μm 濾膜進行過濾。
1.3.2 急性分離腦片的制備
小鼠在注射水合氯醛 10 min 之后進入麻醉狀態，迅速斷頭取腦，將大腦浸入冰水混合且通氧的切片液中，1～2 min 之內取出，使用德國徠卡 VT1200S 型號的震動切片機將小鼠腦切成 300 μm 厚的切片，并將切片移入氧飽和的 30 ℃ 恒溫人工腦脊液中孵育 40 min。
1.3.3 全細胞腦片膜片鉗
將接受磁刺激之后的腦片移至德國 HEKA 膜片鉗設備上的腦片記錄槽內，在低倍鏡下找到目標腦區 DG 區，換到高倍水鏡之下找到清晰飽滿、立體感強的顆粒細胞，安裝充灌有電極內液的玻璃微電極，在正置顯微鏡下進行封接破膜，進行全細胞腦片膜片鉗記錄。
采用全細胞電流鉗記錄模式，記錄海馬 DG 區顆粒神經元的靜息膜電位、150 pA 刺激 500 ms 的去極化電流下的動作電位發放個數，以及 150 pA 刺激 30 ms 的去極化電流下的單個誘發動作電位。分析了神經元的靜息膜電位，動作電位的發放個數以及單個動作電位的閾值、半波寬、達峰時間和最大斜率。
采用全細胞電壓鉗記錄模式，記錄細胞的電壓門控型鉀通道電流，包括 IA 和 IK。分析了兩種鉀電流的 I-V 曲線和激活特性，以及 IA 的失活特性和復活特性。
1.4 數據統計分析
數據分析采用 One-way ANOVA 分析方法，每組實驗樣本數量為 6（n = 6），統計結果以均值 ± 標準差的方式呈現，檢驗水準為 0.05。
2 數據分析結果
2.1 不同頻率磁刺激對離體腦片海馬 DG 區神經元放電的影響
為了探究不同頻率的磁刺激對神經元靜息膜電位和誘發動作電位的影響，在進行全細胞電流鉗記錄時，分別給予細胞 0 pA 電流和長時程電流刺激（幅值 150 pA，時長 500 ms），結果顯示在施加 20 Hz 磁刺激腦片的細胞上觀察到自發放電（spontaneous firing），如圖 1a 所示。對靜息膜電位的分析表明，20 Hz 磁刺激組的靜息膜電位明顯高于對照組和 0.5 Hz 磁刺激組，0.5 Hz 磁刺激之后的靜息膜電位明顯低于對照組，統計學結果見圖 1b。記錄到的誘發動作電位示意圖如圖 1c 所示，對放電個數的分析表明，20 Hz 磁刺激顯著增加了動作電位的個數，0.5 Hz 磁刺激與對照組相比，放電個數明顯減少，統計學結果見圖 1d。
圖1
膜電位及動作電位發放個數分析
a. 自發放電；b. 靜息膜電位；c. 誘發動作電位；d. 動作電位個數. *
a. spontaneous firing; b. resting membrane potential; c. evoked firing; d. the number of APs released. *
探究不同頻率的磁刺激對單個動作電位相關電特性指標的影響，給予細胞短時程的電流刺激（幅值 150 pA，時長 30 ms），所用的指標包括：動作電位的閾值、半波寬、達峰時間和最大斜率。統計學分析結果如圖 2 所示。對動作電位閾值的分析表明，20 Hz 磁刺激組動作電位閾值較對照組與 0.5 Hz 磁刺激組均有明顯降低，0.5 Hz 磁刺激組與對照組相比閾值明顯向去極化方向移動，結果如圖 2a 所示。對動作電位半波寬的分析表明，20 Hz 磁刺激組動作電位半波寬較對照組與 0.5 Hz 磁刺激組均有明顯縮短，0.5 Hz 磁刺激組半波寬與對照組相比顯著延長，結果如圖 2b 所示。對動作電位達峰時間的分析表明，20 Hz 磁刺激組動作電位達峰時間較對照組與 0.5 Hz 磁刺激組均有明顯縮短，0.5 Hz 磁刺激組的達峰時間與對照組相比顯著延長，統計學結果見圖 2c。對動作電位最大斜率的分析表明，20 Hz 磁刺激組動作電位最大斜率較對照組與 0.5 Hz 磁刺激組均有明顯增大，0.5 Hz 磁刺激組與對照組相比最大斜率明顯減小，統計學結果見圖 2d。
圖2
動作電位相關電特性數據分析
a. 動作電位閾值；b. 半波寬；c. 達峰時間；d. 最大斜率. *
a. the threshold of AP; b. AP half width; c. time to AP peak amplitude; d. the maximum slope. *
2.2 不同頻率磁刺激對離體海馬 DG 區神經元電壓門控型鉀離子通道的影響
2.2.1 磁刺激對 IA 和IK 電壓和電流（I-V）曲線的影響
為了排除其他電壓門控離子電流對鉀電流的影響，在記錄外液中加入終濃度為 0.001 mmol/L 的 TTX 和 0.2 mmol/L 的 CdCl2 來阻斷電壓門控鈉通道和鈣通道。單獨記錄 IA 和IK 時，外液中還需加入終濃度為 25 mmol/L 的 TEA 阻斷延遲整流鉀電流來記錄 IA，或者加入終濃度為 3 mmol/L 的 4-AP 阻斷瞬時外向鉀電流來記錄 IK。
記錄 IA 的刺激參數為：在 Whole-cell 記錄模式下，將膜電位鉗制在 ? 100 mV，給予 ? 50～+ 90 mV 的去極化階梯電壓，步階為 10 mV，時長為 200 ms，刺激脈沖及電流示意圖見圖3a。
圖3
電流和電壓（I-V）曲線的分析
a.
a. stimulation pulse, schematic diagram and
記錄 IK的刺激參數為：在 Whole-cell 記錄模式下，將膜電位鉗制在 ? 50mV，給予 ? 50～+ 90 mV 的去極化階梯電壓，步階為 10 mV，時長為 300 ms，刺激脈沖及電流示意圖見圖3b。
以膜電位為橫坐標，離子電流峰值為縱坐標作IA 和IK 的 I-V 曲線，如圖3 所示。從圖中可以看出，磁刺激對 IA 和 IK 的影響是具有電壓依賴性的，在不同的電壓刺激下，離子電流的峰值反應不同。對IA 的 I-V 曲線分析表明，從 ? 20 mV 開始，實驗組與對照組產生顯著差異，20 Hz 磁刺激明顯抑制了 IA 電流峰值，0.5 Hz 磁刺激則明顯提高了 IA 電流峰值；實驗組之間在 ? 40 mV 開始出現顯著差異。IK 的 I-V 曲線顯示，與對照組相比，20 Hz 磁刺激和 0.5 Hz 磁刺激分別在 + 20 mV 和 + 70 mV 開始出現顯著差異；實驗組之間在 + 20 mV 開始出現顯著差異。可以看出磁刺激對 IA 電流峰值的影響要早于 IK，可能是由于瞬時外向鉀通道的開放要早于延遲整流鉀通道。
2.2.2 磁刺激對 IA 和IK 激活動力學的影響
為了分析磁刺激對兩種鉀電流激活動力學的影響，作出了IA 和IK 的激活曲線。記錄 IA 的刺激參數為：在 Whole-cell 記錄模式下，先將膜電位鉗制在 ? 100 mV，給予時長為 400 ms 的 ? 110 mV 的超極化條件脈沖，之后給予 ? 50～+90 mV、步階為 10 mV、時長為 150 ms 的測試脈沖，刺激脈沖及電流示意圖見圖 4a。記錄 IK 的刺激參數為：在 Whole-cell 記錄模式下，先將膜電位鉗制在 ? 50 mV，給予時長為 400 ms 的 ? 110 mV 的超極化條件脈沖，之后給予 ? 50～+ 90 mV、步階為 10 mV、時長為 150 ms 的測試脈沖，刺激脈沖及電流示意圖見圖 4b。激活曲線是根據不同的測試電壓與其對應下的電導繪制，利用公式G = I/(Vm ? Vrev)將記錄到的電流值轉換成電導值，其中Vm 表示膜電位，Vrev 表示翻轉電位，G表示某一測試電壓下的電導，I表示不同測試電壓下記錄到的電流峰值。以G/Gmax 為縱坐標，不同的膜電位為橫坐標，繪制鉀離子電流的激活曲線，然后用 Boltzmann 方程 G/Gmax = 1/{1 + exp［(Vm ? V1/2)/k］}擬合散點圖得到 V1/2 和k。V1/2 為激活動力學的半數激活電壓，k 為斜率因子。對照組以及不同頻率刺激下的IA 和 IK 的穩態激活曲線如圖 4 所示，經統計學分析得出磁刺激對 IA 和 IK 的激活動力學沒有顯著影響。IA 和 IK 激活曲線的擬合參數見表 1。
圖4
對激活曲線的分析
a.
a. stimulation pulse, schematic diagram and activation curve of
表1
不同頻率的磁刺激對 IA 和IK 激活動力學參數的影響
Table1.
Effects of magnetic stimulation with different frequencies on activation kinetic parameters of IA and IK
2.2.3 磁刺激對 IA 失活動力學的影響
電壓門控鉀電流分為延遲整流鉀電流和瞬時外向鉀電流，延遲整流鉀電流的通道特性為延遲激活且緩慢失活，瞬時外向鉀電流的通道特性是快速激活和快速失活，因此通道的失活特性和復活特性只針對瞬時外向鉀電流而不考慮延遲整流鉀電流。采用的刺激參數為雙脈沖刺激：先將膜電位鉗制在 ? 100 mV，給予 ? 110～+10 mV、步階為 10 mV、時長為 80 ms 的預脈沖刺激，然后給予+50 mV、時長為 80 ms 的測試脈沖刺激，記錄的電流示意圖如圖5a 所示。用各測試電壓下的電流峰值與預脈沖的電壓繪制失活曲線，I/Imax 為縱坐標，預脈沖電壓為橫坐標，用 Boltzmann 方程I/Imax = 1/{1+exp［(Vm ? V1/2)/k］}擬合散點圖得到V1/2 和k。V1/2 為失活動力學的半數失活電壓，k為斜率因子。刺激組和對照組擬合失活散點圖得到的參數如表2 所示，20 Hz 磁刺激之后的IA 失活曲線較對照組發生了明顯的左移，半數失活電壓由（ ? 50.65 ± 0.26）mV 變為（ ? 56.69 ± 0.39）mV，0.5 Hz 磁刺激組的半數失活電壓與對照組之間沒有顯著差異，實驗組與對照組之間的斜率 k 均沒有顯著差異。
圖5
對IA 失活和失活后復活曲線的分析
a. 刺激脈沖、示意圖及失活曲線；b. 刺激脈沖、示意圖及復活曲線
Figure5. Analysis of inactivation and recovery curves of IAa. stimulation pulse, schematic diagram and inactivation curve; b. stimulation pulse, schematic diagram and recovery curve
表2
不同頻率的磁刺激對 IA 失活和復活動力學參數的影響
Table2.
Effects of magnetic stimulation with different freque ncies on inactivation and recovery kinetic parameters of IA
2.2.4 磁刺激對 IA 失活后復活動力學的影響
采用的刺激參數為雙脈沖刺激：將膜電位鉗制在 ? 100 mV，給予細胞一個+50 mV、時長為 80 ms 的預脈沖刺激，間隔 1～256 ms 之后，再給予細胞一個+50 mV、時長為 80 ms 的測試脈沖刺激，記錄的電流示意圖如圖 5b 所示。在不同的時間間隔下，預脈沖刺激得到的電流峰值為I1，測試脈沖得到的電流峰值為I2，I2/I1 作為縱坐標，不同的時間間隔作為橫坐標來繪制IA 的復活曲線。畫出散點圖之后，用單指數方程I2/I1 = A+B exp( ? t/τ) 進行擬合，得到時間常數τ，擬合結果見表 2，統計結果表明 20 Hz 磁刺激較 0.5 Hz 磁刺激與對照組的時間常數明顯延長，而 0.5 Hz 磁刺激組與對照組之間沒有明顯區別。
3 討論
大腦海馬區受損會使學習記憶能力衰退，在老化過程中和一些神經退行性疾病中是易受損傷的區域[25]。DG 區是海馬體的重要組成部分，在情景記憶、空間記憶和對新環境的探索等行為學實驗中起著重要作用。有研究顯示，大腦皮層 DG 通路的功能障礙及神經元損傷與老年人群中最常見的神經退行性疾病 AD 的病理狀態有關[26]。神經元作為一種可興奮細胞，在受到刺激之后產生動作電位的能力稱為神經元的興奮性。神經元的自發放電、靜息膜電位和動作電位的發放頻率是衡量其興奮性的重要指標。
本研究結果顯示，20 Hz 磁刺激組出現自發放電，靜息膜電位向去極化方向移動，動作電位發放個數顯著高于對照組，表明高頻磁刺激可以提高神經元的興奮性，0.5 Hz 磁刺激組則結果相反。對單個動作電位的電特性的分析結果顯示，施加 20 Hz 磁刺激之后的神經元閾值明顯降低，表明神經元興奮性提高。動作電位的半波寬是指峰值一半的時間跨度，代表整個動作電位的時程長短[22]；達峰時間是指從刺激開始到動作電位峰值的時間，時間越短代表離子通道的開放與關閉的速度越快，去極化的過程越快[27]；最大斜率出現在動作電位上升支，代表膜電位去極化的最大速度，這些變化與細胞膜上的電壓門控性鈉通道和鉀通道的開放密切相關[11]，高頻磁刺激后神經元動作電位的半波寬和達峰時間明顯縮短，最大斜率顯著增加，表明電壓門控離子通道特性在一定程度上受到了磁刺激的影響。有研究報道，在施加長期磁刺激之后，大鼠海馬 CA1 區的細胞閾值降低，最大上升斜率增大，神經元的興奮性提高[11]，與本研究中動作電位閾值及其最大斜率的變化結果一致。有研究顯示，神經元興奮性提高的同時，達峰時間明顯增加，動作電位的上升支主要是由于電壓門控鈉通道的開放導致大量鈉離子內流[22]，造成該指標差異的原因可能是外加刺激對電壓門控鈉通道的動力學特征的影響不同，因此，不同頻率的磁刺激對離體腦片海馬 DG 區神經元鈉離子通道的影響是下一步要探究的工作。
鉀離子通道作為人體中種類最多、分布最廣的離子通道，在調節靜息膜電位和形成動作電位的過程中擔任著重要的角色[28]。帶電離子（如 Na+、K+、Cl?、Ca2+等）的跨膜運動會表現為一定的膜電位，磁刺激在穿透腦組織產生磁場的過程中可能會影響離子通道蛋白，導致帶電離子的泄露從而改變細胞內外的離子分布[29]，為帶電離子的跨膜運動提供驅動力，進而改變細胞膜電位。不同頻率的磁刺激誘導的神經元興奮性不同與突觸可塑性和長時程增強效應相關，高頻刺激更易促進與突觸可塑性相關基因的表達[30]。已有研究表明磁刺激可誘導細胞膜去極化并促進神經元突觸谷氨酸受體上的鈣離子內流，增加突觸后膜上谷氨酸受體的數量進而提高神經元的興奮性[29]。目前，關于磁刺激的作用機制的研究尚無明確定論，其臨床治療效果也不統一。因此，繼續探討磁刺激作用的神經機制仍是未來生物電磁方面的研究重點。
4 結論
20 Hz 磁刺激明顯改變了急性分離的腦片海馬 DC 神經元的靜息膜電位和動作電位及其自身電特性，提高了其神經興奮性，以電壓依賴的方式抑制了兩種電壓門控鉀離子通道的電流幅值，明顯將 A 型鉀通道的失活曲線向左移動，即半數失活電壓向超極化方向移動，復活時間延長。0.5 Hz 磁刺激對鉀離子通道動力學無明顯影響，但改變了細胞的靜息膜電位及其他電特性，并明顯提高了鉀通道的電流峰值。根據以上結果，我們得出：高頻磁刺激可顯著促進離體腦片海馬 DG 區顆粒細胞的興奮性，低頻磁刺激則抑制神經元的興奮性，其部分作用可能是通過改變電壓門控鉀離子通道的動力學特征來實現的。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
重復經顱磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）是一種非侵入性的神經刺激技術。該技術依據電磁感應原理，利用變化的電流流經線圈時產生變化的磁場[1]，磁場幾乎無衰減地穿透顱骨等高阻抗組織[2]，在大腦中誘導產生刺激電流[3]。目前，經顱磁刺激已廣泛應用于神經與精神性疾病的治療中[4-6]，在阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）、抑郁癥、腦癱等科學研究與臨床治療中取得了顯著成果[7-10]。
研究顯示，rTMS 對大腦的調控作用與神經元興奮性有關。長期施加 1 Hz 的 rTMS 可改變海馬 CA1 區錐體細胞膜上離子通道、靜息膜電位和動作電位閾值，提高神經元的興奮性[11]。rTMS 在提高大腦齒狀回（dentate gyrus，DG）顆粒細胞神經興奮性的同時可改善與年齡相關的認知損傷[12]。長期暴露在高頻 rTMS 下的老年小鼠神經興奮性降低和與年齡相關的認知障礙得到明顯改善，同時電壓門控型鈣通道動力學發生改變[13]。rTMS 對神經調控的作用與頻率有關，低頻 rTMS 可通過降低大腦皮層神經元的興奮性來抑制神經元活動，高頻 rTMS 可通過促進神經元興奮性來改善大腦腦區的功能[14-15]。
已有研究從電生理、分子、行為認知等不同層面對磁刺激的作用進行了探索[16]，但磁刺激的作用效果不盡相同，作用機制仍不明確[17]，對離體腦片施加磁刺激后神經興奮性的變化及其機制的研究鮮有報道。電壓門控型鉀離子通道具有參與調控細胞興奮性和靜息電位的作用[18]，是調節神經元興奮性水平的機制之一[19-20]，主要包括瞬時外向鉀通道電流（transient outward potassium current，IA）和延遲整流鉀通道電流（delayed rectifier potassium current，IK），IA 是膜電位復極化早期外向電流的主要成分，在細胞放電模式、動作電位的產生及放電頻率等方面發揮著很重要的作用[21-22]。IK 的幅值可直接影響動作電位幅度和頻率，對細胞興奮性有至關重要的影響[23-24]。不同頻率的磁刺激是否是通過改變鉀離子通道的動力學特征調節神經元的興奮性還有待驗證。本文旨在探究不同頻率的磁刺激對離體腦片海馬 DG 區顆粒神經元興奮性和電壓門控型鉀離子通道動力學的影響，并提出假設：高頻磁刺激可以提高神經元的興奮性，低頻磁刺激則是抑制其興奮性，磁刺激對離體腦片海馬 DG 區顆粒細胞神經興奮性的調節作用可能是通過對電壓門控鉀離子通道的調控實現的。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及實驗設計
研究采用 4～5 周左右的雌性昆明小鼠共 8 只，購買自北京華阜康生物科技有限公司。在室溫為（25 ± 1）℃、濕度為 60% 左右的環境中飼養小鼠，自由取水和進食，光照與黑暗交替循環。在腦片制備結束之后，將腦片隨機分為實驗組（高頻 20 Hz，低頻 0.5 Hz）與對照組，實驗組在施加磁刺激之后立即進行全細胞腦片膜片鉗電生理實驗，對照組在孵育結束之后直接進行電生理實驗，實驗重復 3 次。所有動物實驗均獲得河北工業大學與華北理工大學倫理委員會批準，且符合實驗動物倫理學要求和使用規范（實驗動物許可證號：SYXK（冀）2015-0038；倫理審查編號：LX201886）。
1.2 磁刺激實施
取孵育之后的腦片置于磁刺激線圈之下，接受特定頻率磁刺激。采用依瑞德 CCY-IA 型號的刺激儀及型號為 Y064 的小動物刺激線圈進行實驗，使用重復磁刺激模式，刺激參數為高頻 20 Hz，低頻 0.5 Hz，刺激強度約為 0.3 T，刺激脈沖個數均為 500 個。
1.3 電生理實驗
1.3.1 溶液配制
人工腦脊液的成分為（mmol/L）：NaCl 124，KCl 3，CaCl2 2，MgCl2 2，NaH2PO4 1.625，NaHCO3 26，glucose 11，HEPES 5，用 NaOH 將 pH 調至 7.4，滲透壓 310～320 mOsm，溫度保持在 30 ℃，通氧（95% O2/5% CO2）使之飽和，在此環境下腦片可存活 8～10 h。
切片液的成分為（mmol/L）：KCl 2.5，CaCl2 1，MgCl2 6，NaH2PO4 1.625，NaHCO3 26，glucose 11，sucrose 220，pH 為 7.4，滲透壓為 300～305 mOsm。
全細胞電流鉗的電極內液成分為（mmol/L）：K-glu 125，NaCl 15，MgCl2 2，CaCl2 1，EGTA 11，HEPES 10，Na-ATP 3，Na-GTP 0.3，調節 pH 為 7.2～7.3，滲透壓為 285～290 mOsm。使用前用 0.22 μm 濾膜進行過濾。
鉀電流記錄細胞外液成分為（mmol/L）：NaCl 130，KCl 5，CaCl2 2，MgCl2 1，glucose 10，HEPES 10，TTX 0.001，CdCl2 0.2，用 NaOH 將 pH 調至 7.4，通氧（95% O2/5% CO2）使之飽和。
鉀電流記錄的電極內液成分為（mmol/L）：KCl 140，MgCl2 2，EGTA 10，HEPES 10，Mg-ATP 2，用 KOH 將 pH 調至 7.2。使用前用 0.22 μm 濾膜進行過濾。
1.3.2 急性分離腦片的制備
小鼠在注射水合氯醛 10 min 之后進入麻醉狀態，迅速斷頭取腦，將大腦浸入冰水混合且通氧的切片液中，1～2 min 之內取出，使用德國徠卡 VT1200S 型號的震動切片機將小鼠腦切成 300 μm 厚的切片，并將切片移入氧飽和的 30 ℃ 恒溫人工腦脊液中孵育 40 min。
1.3.3 全細胞腦片膜片鉗
將接受磁刺激之后的腦片移至德國 HEKA 膜片鉗設備上的腦片記錄槽內，在低倍鏡下找到目標腦區 DG 區，換到高倍水鏡之下找到清晰飽滿、立體感強的顆粒細胞，安裝充灌有電極內液的玻璃微電極，在正置顯微鏡下進行封接破膜，進行全細胞腦片膜片鉗記錄。
采用全細胞電流鉗記錄模式，記錄海馬 DG 區顆粒神經元的靜息膜電位、150 pA 刺激 500 ms 的去極化電流下的動作電位發放個數，以及 150 pA 刺激 30 ms 的去極化電流下的單個誘發動作電位。分析了神經元的靜息膜電位，動作電位的發放個數以及單個動作電位的閾值、半波寬、達峰時間和最大斜率。
采用全細胞電壓鉗記錄模式，記錄細胞的電壓門控型鉀通道電流，包括 IA 和 IK。分析了兩種鉀電流的 I-V 曲線和激活特性，以及 IA 的失活特性和復活特性。
1.4 數據統計分析
數據分析采用 One-way ANOVA 分析方法，每組實驗樣本數量為 6（n = 6），統計結果以均值 ± 標準差的方式呈現，檢驗水準為 0.05。
2 數據分析結果
2.1 不同頻率磁刺激對離體腦片海馬 DG 區神經元放電的影響
為了探究不同頻率的磁刺激對神經元靜息膜電位和誘發動作電位的影響，在進行全細胞電流鉗記錄時，分別給予細胞 0 pA 電流和長時程電流刺激（幅值 150 pA，時長 500 ms），結果顯示在施加 20 Hz 磁刺激腦片的細胞上觀察到自發放電（spontaneous firing），如圖 1a 所示。對靜息膜電位的分析表明，20 Hz 磁刺激組的靜息膜電位明顯高于對照組和 0.5 Hz 磁刺激組，0.5 Hz 磁刺激之后的靜息膜電位明顯低于對照組，統計學結果見圖 1b。記錄到的誘發動作電位示意圖如圖 1c 所示，對放電個數的分析表明，20 Hz 磁刺激顯著增加了動作電位的個數，0.5 Hz 磁刺激與對照組相比，放電個數明顯減少，統計學結果見圖 1d。
圖1
膜電位及動作電位發放個數分析
a. 自發放電；b. 靜息膜電位；c. 誘發動作電位；d. 動作電位個數. *
a. spontaneous firing; b. resting membrane potential; c. evoked firing; d. the number of APs released. *
探究不同頻率的磁刺激對單個動作電位相關電特性指標的影響，給予細胞短時程的電流刺激（幅值 150 pA，時長 30 ms），所用的指標包括：動作電位的閾值、半波寬、達峰時間和最大斜率。統計學分析結果如圖 2 所示。對動作電位閾值的分析表明，20 Hz 磁刺激組動作電位閾值較對照組與 0.5 Hz 磁刺激組均有明顯降低，0.5 Hz 磁刺激組與對照組相比閾值明顯向去極化方向移動，結果如圖 2a 所示。對動作電位半波寬的分析表明，20 Hz 磁刺激組動作電位半波寬較對照組與 0.5 Hz 磁刺激組均有明顯縮短，0.5 Hz 磁刺激組半波寬與對照組相比顯著延長，結果如圖 2b 所示。對動作電位達峰時間的分析表明，20 Hz 磁刺激組動作電位達峰時間較對照組與 0.5 Hz 磁刺激組均有明顯縮短，0.5 Hz 磁刺激組的達峰時間與對照組相比顯著延長，統計學結果見圖 2c。對動作電位最大斜率的分析表明，20 Hz 磁刺激組動作電位最大斜率較對照組與 0.5 Hz 磁刺激組均有明顯增大，0.5 Hz 磁刺激組與對照組相比最大斜率明顯減小，統計學結果見圖 2d。
圖2
動作電位相關電特性數據分析
a. 動作電位閾值；b. 半波寬；c. 達峰時間；d. 最大斜率. *
a. the threshold of AP; b. AP half width; c. time to AP peak amplitude; d. the maximum slope. *
2.2 不同頻率磁刺激對離體海馬 DG 區神經元電壓門控型鉀離子通道的影響
2.2.1 磁刺激對 IA 和IK 電壓和電流（I-V）曲線的影響
為了排除其他電壓門控離子電流對鉀電流的影響，在記錄外液中加入終濃度為 0.001 mmol/L 的 TTX 和 0.2 mmol/L 的 CdCl2 來阻斷電壓門控鈉通道和鈣通道。單獨記錄 IA 和IK 時，外液中還需加入終濃度為 25 mmol/L 的 TEA 阻斷延遲整流鉀電流來記錄 IA，或者加入終濃度為 3 mmol/L 的 4-AP 阻斷瞬時外向鉀電流來記錄 IK。
記錄 IA 的刺激參數為：在 Whole-cell 記錄模式下，將膜電位鉗制在 ? 100 mV，給予 ? 50～+ 90 mV 的去極化階梯電壓，步階為 10 mV，時長為 200 ms，刺激脈沖及電流示意圖見圖3a。
圖3
電流和電壓（I-V）曲線的分析
a.
a. stimulation pulse, schematic diagram and
記錄 IK的刺激參數為：在 Whole-cell 記錄模式下，將膜電位鉗制在 ? 50mV，給予 ? 50～+ 90 mV 的去極化階梯電壓，步階為 10 mV，時長為 300 ms，刺激脈沖及電流示意圖見圖3b。
以膜電位為橫坐標，離子電流峰值為縱坐標作IA 和IK 的 I-V 曲線，如圖3 所示。從圖中可以看出，磁刺激對 IA 和 IK 的影響是具有電壓依賴性的，在不同的電壓刺激下，離子電流的峰值反應不同。對IA 的 I-V 曲線分析表明，從 ? 20 mV 開始，實驗組與對照組產生顯著差異，20 Hz 磁刺激明顯抑制了 IA 電流峰值，0.5 Hz 磁刺激則明顯提高了 IA 電流峰值；實驗組之間在 ? 40 mV 開始出現顯著差異。IK 的 I-V 曲線顯示，與對照組相比，20 Hz 磁刺激和 0.5 Hz 磁刺激分別在 + 20 mV 和 + 70 mV 開始出現顯著差異；實驗組之間在 + 20 mV 開始出現顯著差異。可以看出磁刺激對 IA 電流峰值的影響要早于 IK，可能是由于瞬時外向鉀通道的開放要早于延遲整流鉀通道。
2.2.2 磁刺激對 IA 和IK 激活動力學的影響
為了分析磁刺激對兩種鉀電流激活動力學的影響，作出了IA 和IK 的激活曲線。記錄 IA 的刺激參數為：在 Whole-cell 記錄模式下，先將膜電位鉗制在 ? 100 mV，給予時長為 400 ms 的 ? 110 mV 的超極化條件脈沖，之后給予 ? 50～+90 mV、步階為 10 mV、時長為 150 ms 的測試脈沖，刺激脈沖及電流示意圖見圖 4a。記錄 IK 的刺激參數為：在 Whole-cell 記錄模式下，先將膜電位鉗制在 ? 50 mV，給予時長為 400 ms 的 ? 110 mV 的超極化條件脈沖，之后給予 ? 50～+ 90 mV、步階為 10 mV、時長為 150 ms 的測試脈沖，刺激脈沖及電流示意圖見圖 4b。激活曲線是根據不同的測試電壓與其對應下的電導繪制，利用公式G = I/(Vm ? Vrev)將記錄到的電流值轉換成電導值，其中Vm 表示膜電位，Vrev 表示翻轉電位，G表示某一測試電壓下的電導，I表示不同測試電壓下記錄到的電流峰值。以G/Gmax 為縱坐標，不同的膜電位為橫坐標，繪制鉀離子電流的激活曲線，然后用 Boltzmann 方程 G/Gmax = 1/{1 + exp［(Vm ? V1/2)/k］}擬合散點圖得到 V1/2 和k。V1/2 為激活動力學的半數激活電壓，k 為斜率因子。對照組以及不同頻率刺激下的IA 和 IK 的穩態激活曲線如圖 4 所示，經統計學分析得出磁刺激對 IA 和 IK 的激活動力學沒有顯著影響。IA 和 IK 激活曲線的擬合參數見表 1。
圖4
對激活曲線的分析
a.
a. stimulation pulse, schematic diagram and activation curve of
表1
不同頻率的磁刺激對 IA 和IK 激活動力學參數的影響
Table1.
Effects of magnetic stimulation with different frequencies on activation kinetic parameters of IA and IK
2.2.3 磁刺激對 IA 失活動力學的影響
電壓門控鉀電流分為延遲整流鉀電流和瞬時外向鉀電流，延遲整流鉀電流的通道特性為延遲激活且緩慢失活，瞬時外向鉀電流的通道特性是快速激活和快速失活，因此通道的失活特性和復活特性只針對瞬時外向鉀電流而不考慮延遲整流鉀電流。采用的刺激參數為雙脈沖刺激：先將膜電位鉗制在 ? 100 mV，給予 ? 110～+10 mV、步階為 10 mV、時長為 80 ms 的預脈沖刺激，然后給予+50 mV、時長為 80 ms 的測試脈沖刺激，記錄的電流示意圖如圖5a 所示。用各測試電壓下的電流峰值與預脈沖的電壓繪制失活曲線，I/Imax 為縱坐標，預脈沖電壓為橫坐標，用 Boltzmann 方程I/Imax = 1/{1+exp［(Vm ? V1/2)/k］}擬合散點圖得到V1/2 和k。V1/2 為失活動力學的半數失活電壓，k為斜率因子。刺激組和對照組擬合失活散點圖得到的參數如表2 所示，20 Hz 磁刺激之后的IA 失活曲線較對照組發生了明顯的左移，半數失活電壓由（ ? 50.65 ± 0.26）mV 變為（ ? 56.69 ± 0.39）mV，0.5 Hz 磁刺激組的半數失活電壓與對照組之間沒有顯著差異，實驗組與對照組之間的斜率 k 均沒有顯著差異。
圖5
對IA 失活和失活后復活曲線的分析
a. 刺激脈沖、示意圖及失活曲線；b. 刺激脈沖、示意圖及復活曲線
Figure5. Analysis of inactivation and recovery curves of IAa. stimulation pulse, schematic diagram and inactivation curve; b. stimulation pulse, schematic diagram and recovery curve
表2
不同頻率的磁刺激對 IA 失活和復活動力學參數的影響
Table2.
Effects of magnetic stimulation with different freque ncies on inactivation and recovery kinetic parameters of IA
2.2.4 磁刺激對 IA 失活后復活動力學的影響
采用的刺激參數為雙脈沖刺激：將膜電位鉗制在 ? 100 mV，給予細胞一個+50 mV、時長為 80 ms 的預脈沖刺激，間隔 1～256 ms 之后，再給予細胞一個+50 mV、時長為 80 ms 的測試脈沖刺激，記錄的電流示意圖如圖 5b 所示。在不同的時間間隔下，預脈沖刺激得到的電流峰值為I1，測試脈沖得到的電流峰值為I2，I2/I1 作為縱坐標，不同的時間間隔作為橫坐標來繪制IA 的復活曲線。畫出散點圖之后，用單指數方程I2/I1 = A+B exp( ? t/τ) 進行擬合，得到時間常數τ，擬合結果見表 2，統計結果表明 20 Hz 磁刺激較 0.5 Hz 磁刺激與對照組的時間常數明顯延長，而 0.5 Hz 磁刺激組與對照組之間沒有明顯區別。
3 討論
大腦海馬區受損會使學習記憶能力衰退，在老化過程中和一些神經退行性疾病中是易受損傷的區域[25]。DG 區是海馬體的重要組成部分，在情景記憶、空間記憶和對新環境的探索等行為學實驗中起著重要作用。有研究顯示，大腦皮層 DG 通路的功能障礙及神經元損傷與老年人群中最常見的神經退行性疾病 AD 的病理狀態有關[26]。神經元作為一種可興奮細胞，在受到刺激之后產生動作電位的能力稱為神經元的興奮性。神經元的自發放電、靜息膜電位和動作電位的發放頻率是衡量其興奮性的重要指標。
本研究結果顯示，20 Hz 磁刺激組出現自發放電，靜息膜電位向去極化方向移動，動作電位發放個數顯著高于對照組，表明高頻磁刺激可以提高神經元的興奮性，0.5 Hz 磁刺激組則結果相反。對單個動作電位的電特性的分析結果顯示，施加 20 Hz 磁刺激之后的神經元閾值明顯降低，表明神經元興奮性提高。動作電位的半波寬是指峰值一半的時間跨度，代表整個動作電位的時程長短[22]；達峰時間是指從刺激開始到動作電位峰值的時間，時間越短代表離子通道的開放與關閉的速度越快，去極化的過程越快[27]；最大斜率出現在動作電位上升支，代表膜電位去極化的最大速度，這些變化與細胞膜上的電壓門控性鈉通道和鉀通道的開放密切相關[11]，高頻磁刺激后神經元動作電位的半波寬和達峰時間明顯縮短，最大斜率顯著增加，表明電壓門控離子通道特性在一定程度上受到了磁刺激的影響。有研究報道，在施加長期磁刺激之后，大鼠海馬 CA1 區的細胞閾值降低，最大上升斜率增大，神經元的興奮性提高[11]，與本研究中動作電位閾值及其最大斜率的變化結果一致。有研究顯示，神經元興奮性提高的同時，達峰時間明顯增加，動作電位的上升支主要是由于電壓門控鈉通道的開放導致大量鈉離子內流[22]，造成該指標差異的原因可能是外加刺激對電壓門控鈉通道的動力學特征的影響不同，因此，不同頻率的磁刺激對離體腦片海馬 DG 區神經元鈉離子通道的影響是下一步要探究的工作。
鉀離子通道作為人體中種類最多、分布最廣的離子通道，在調節靜息膜電位和形成動作電位的過程中擔任著重要的角色[28]。帶電離子（如 Na+、K+、Cl?、Ca2+等）的跨膜運動會表現為一定的膜電位，磁刺激在穿透腦組織產生磁場的過程中可能會影響離子通道蛋白，導致帶電離子的泄露從而改變細胞內外的離子分布[29]，為帶電離子的跨膜運動提供驅動力，進而改變細胞膜電位。不同頻率的磁刺激誘導的神經元興奮性不同與突觸可塑性和長時程增強效應相關，高頻刺激更易促進與突觸可塑性相關基因的表達[30]。已有研究表明磁刺激可誘導細胞膜去極化并促進神經元突觸谷氨酸受體上的鈣離子內流，增加突觸后膜上谷氨酸受體的數量進而提高神經元的興奮性[29]。目前，關于磁刺激的作用機制的研究尚無明確定論，其臨床治療效果也不統一。因此，繼續探討磁刺激作用的神經機制仍是未來生物電磁方面的研究重點。
4 結論
20 Hz 磁刺激明顯改變了急性分離的腦片海馬 DC 神經元的靜息膜電位和動作電位及其自身電特性，提高了其神經興奮性，以電壓依賴的方式抑制了兩種電壓門控鉀離子通道的電流幅值，明顯將 A 型鉀通道的失活曲線向左移動，即半數失活電壓向超極化方向移動，復活時間延長。0.5 Hz 磁刺激對鉀離子通道動力學無明顯影響，但改變了細胞的靜息膜電位及其他電特性，并明顯提高了鉀通道的電流峰值。根據以上結果，我們得出：高頻磁刺激可顯著促進離體腦片海馬 DG 區顆粒細胞的興奮性，低頻磁刺激則抑制神經元的興奮性，其部分作用可能是通過改變電壓門控鉀離子通道的動力學特征來實現的。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
