為探討低強度振動是否能經由雌激素受體 α（ERα）促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞的骨形成，本研究通過采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）技術檢測骨形成標志物 mRNA 表達量的變化，篩選出促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞骨形成的最佳振動參數（45 Hz × 0.9 g，g 為重力加速度，g = 9.8 m/s2）。隨后，對成骨細胞施加 45 Hz × 0.9 g 的低強度振動，采用免疫印跡（Western blot）實驗檢測骨形成標志物和 ERα 的表達；并用免疫熒光技術檢測 ERα 的表達與分布。最后采用雌激素受體抑制劑 ICI182780，抑制 ERα 的表達，觀察低強度振動下成骨細胞骨形成標志物的變化。結果顯示，低強度振動可促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞骨形成標志物和 ERα 的表達（P < 0.05），并使 ERα 向細胞核內轉移；而當抑制 ERα 的表達后，低強度振動促進成骨細胞骨形成的作用減弱。以上結果說明，低強度振動可通過上調去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞 ERα 的表達和促進 ERα 的胞核轉移的方式，增強去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞的骨形成功能，進而為低強度振動應用于臨床絕經后骨質疏松癥的防治提供理論依據。
引用本文： 朱光光, 俞小琴, 文繼銳, 包明月, 唐敏, 王景閣, 何學令, 李良. 低強度振動經雌激素受體 α 促去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞的骨形成. 生物醫學工程學雜志, 2020, 37(5): 825-833. doi: 10.7507/1001-5515.202006029 復制
引言
隨著世界人口老齡化的加劇，絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）逐漸成為廣泛關注的大眾健康問題。成骨細胞（osteoblast，OB）是骨形成的主要功能細胞，負責骨膠原和骨基質的合成、分泌和礦化，成骨細胞的功能狀態與絕經后骨質疏松癥的發生發展有著極其密切的關系[1]。因此，如何促進成骨細胞的骨形成是防治絕經后骨質疏松癥的研究方向之一。目前用于治療絕經后骨質疏松癥的藥物主要為抑制骨吸收的藥物，并不能從根本上解決患者骨形成能力降低的問題，具有一定局限性。低強度振動（low-magnitude vibration，LMV）以其副作用小、無創性等優點，同時兼具促進骨形成和抑制骨吸收的效應,可降低骨質疏松性骨折的發生率，因而在預防和治療絕經后骨質疏松癥方面已越來越受到臨床醫生和科研人員的關注。低強度振動是指加速度小于 1 g（g 為重力加速度，g = 9.8 m/s2）的振動，研究發現頻率在 20～90 Hz 的低強度振動，能有效促進骨組織的重建，改善成骨細胞的增殖和骨形成活性[2-3]。有報道顯示，雌激素受體 α（estrogen receptor α，ERα）不僅可以與雌激素結合發揮骨保護作用，而且還參與了成骨細胞力學刺激的傳導，引起骨組織對力學刺激的適應以及成骨反應[4-5]。本實驗室前期研究發現，去卵巢骨質疏松癥大鼠雌激素水平下降，ERα 的表達水平也降低，其對外界低強度振動的敏感性也降低；進一步實驗發現，ERα 參與了低強度振動促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞的分化[6]。在成骨細胞中，ERα 是否參與了低強度振動對成骨細胞的作用目前尚不清楚。
因此，本實驗旨在探究低強度振動對成骨細胞骨形成標志物 Runt 家族相關轉錄因子 2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、Ⅰ 型膠原（collagen type I，Col Ⅰ）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和 ERα 的表達以及 ERα 亞細胞定位的影響；隨后抑制 ERα 的表達，檢測低強度振動對成骨細胞骨形成標志物 Runx2、Col Ⅰ 和 OCN 表達的變化，探究低強度振動是否經由 ERα 調控去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞的骨形成，期望為低強度振動預防和治療絕經后骨質疏松癥提供實驗數據。
1 材料和方法
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗試劑
本文所用試劑包括：基礎培養基（minimum essential medium alpha basic，α-MEM）（Gibco 公司，美國）、澳洲胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Gibco 公司，美國）、0.25% 胰蛋白酶［含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）］（Hyclone 公司，美國）、堿性磷酸酶顯色試劑盒（碧云天公司，中國）、堿性磷酸酶檢測試劑盒（碧云天公司，中國）、0.2% 茜素紅染液（索萊寶公司，中國）、ERα 抗體（Proteintech 公司，美國）、Col Ⅰ 抗體（Proteintech 公司，美國）、β-actin 抗體（Proteintech 公司，美國）、Runx2 抗體（Affinity 公司，美國）、OCN 抗體（Affinity 公司，美國）、實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒（TaKaRa 公司，日本）、0.1% 膠原酶 Ⅱ（Sigma 公司，美國）、雌激素受體抑制劑 ICI182780 （MedChemExpress 公司，美國）、細胞裂解液（碧云天公司，中國）、反轉錄試劑盒（TaKaRa 公司，日本）、蛋白上樣緩沖液（5X）（碧云天公司，中國）、偶聯熒光劑的相應二抗（Life technologies 公司，美國）、電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）顯色液（Affinity 公司，美國）、山羊血清（Absin 公司，美國）、羅丹明（索萊寶公司，中國）、4，6-聯脒-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（索萊寶公司，中國）、總 RNA 抽提試劑 TRIZOL 試劑（Invitrogen 公司，美國）、非離子型表面活性劑曲拉通 X-100 （Triton X-100）（Biofroxx 公司，德國）。
1.1.2 振動裝置
本實驗振動裝置選用廣州美伊豐實驗設備有限公司的 ZD-50T 振動儀，該機器由主控制機、振動平臺組成，該振動裝置可產生正弦波形的垂直振動，通過主控制機可調節振動的頻率（3～500 Hz）和加速度（0～3 g，g 為重力加速度，g = 9.8 m/s2）。
1.1.3 實驗動物
本研究選用 3 月齡雌性未育斯普拉格-道利（Sprague-Dawley，SD）大鼠 30 只，平均體重為（263 ± 12）g，由四川大學動物實驗中心提供。本研究動物實驗，經四川大學華西基礎醫學與法醫學院研究倫理委員會批準；實驗過程中，采用對大鼠痛苦最少的方式進行實驗。
1.2 去卵巢骨質疏松癥大鼠模型的構建
去卵巢骨質疏松癥大鼠模型組（n = 15）：選用 3 月齡雌性 SD 大鼠在手術前 12 h 禁食，次日在無菌條件下施行雙側去卵巢手術，于肋下兩橫指與脊柱下一橫指的交點處做大約 1 cm 切口，分離并切除雙側卵巢。待大鼠生長到 6 月齡時，處死并分離長骨成骨細胞。
正常大鼠組（n = 15）：不施行雙側去卵巢手術，其余與去卵巢骨質疏松癥大鼠模型組作相同處理。
1.3 成骨細胞的分離培養和純化
處死并分離正常大鼠和去卵巢骨質疏松癥大鼠的股骨和脛骨，剪成 0.1 cm × 0.1 cm 大小的骨碎片，加入 2 mL 的 0.25% 胰蛋白酶，于 37℃ 消化 20 min，吸棄 0.25% 胰蛋白酶。加入 3 mL 的 0.1% 膠原酶 Ⅱ 并置于 37℃ 消化 1 h，收集消化液，重復一次；將兩次收集的消化液過濾殘渣后，離心棄上清，重懸細胞于底面積為 25 cm2的培養瓶中培養，48 h 后換液，以后每隔 2 d 換液，待原代成骨細胞融合度達到 80%～90% 時，開始消化傳代。
利用差速貼壁法純化分離原代成骨細胞，至細胞傳至第 3 代時，即可得到純度較高的成骨細胞。
1.4 低強度振動參數的篩選
選用第 3 代去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞，分別加載 45 Hz × 0.3 g、45 Hz × 0.5 g、45 Hz × 0.9 g、90 Hz × 0.3 g、90 Hz × 0.5 g、90 Hz × 0.9 g 的低強度振動，30 min/（次·d），連續振動 5 d。同時選用第 3 代去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞不加載低強度振動，靜置培養 5 d，作為對照，命名為去卵巢（ovariectomized，OVX）組。實驗結束時，分別收集各組成骨細胞提取總 RNA，用 qRT-PCR 技術檢測各組成骨細胞中特異性骨形成標志物 Runx2、ALP、ColⅠ 和 OCN 的 mRNA 表達。選取可有效促進成骨細胞骨形成的最佳低強度振動參數，用于后續實驗。
1.5 細胞實驗的分組
分別將正常大鼠成骨細胞和去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞，以 5 × 104個/孔的細胞密度，接種于六孔板中，共分為 4 組：
（1）對照組（control，CON）：正常大鼠成骨細胞靜置培養 6 d。
（2）去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞靜置組（ovariectomized+static，OVX+S）：去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞靜置培養 6 d。
（3）去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞振動組（ovariectomized+vibration，OVX+V 組）：去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞靜置培養 1 d，然后按照 1.4 小節確定的最佳低強度振動參數加載低強度振動，30 min/次，1 次/d，連續 5 d。
（4）去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞振動+雌激素受體抑制劑組（ovariectomized+vibration+ ICI182780，OVX+V+ICI 組）：去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞在含有 50 ng/mL 雌激素受體抑制劑 ICI182780 和 10% 胎牛血清的 α-MEM 完全培養基中預培養 1 d，然后按照 1.4 小節確定的最佳低強度振動參數加載低強度振動，30 min/次，1 次/d，連續 5 d。
1.6 實驗方法
1.6.1 形態學觀察
在含 10% 胎牛血清的 a-MEM 完全培養基中培養，顯微鏡下觀察每組的細胞形態以及生長情況。
1.6.2 堿性磷酸酶染色
成骨細胞培養 5 d，按照堿性磷酸酶顯色試劑盒說明書進行染色，顯微鏡下觀察并拍照。
1.6.3 茜素紅染色
成骨細胞培養 21 d，用 95% 乙醇固定細胞 10 min，加入 0.2% 茜素紅染色 30 min，用雙蒸水（ddH2O）沖洗細胞 3 次，顯微鏡下觀察與拍照。
1.6.4 堿性磷酸酶活性的檢測
將待檢測的成骨細胞加入細胞裂解液，冰上裂解 30 min，4℃ 下 12 000 r/min，離心 10 min，收集上清液，根據堿性磷酸酶檢測試劑盒說明書，使用 96 孔板分別設置標準品組，空白對照組和樣品組，于 37℃ 孵育 30 min，在 405 nm 波長下檢測各組樣品中堿性磷酸酶的光密度（optical density，OD）值，與各樣品的總蛋白濃度做歸一化處理，并計算各樣品堿性磷酸酶的相對活性。
1.6.5 qRT-PCR 實驗
用 TRIZOL 試劑提取各組成骨細胞的 mRNA。依據 TaKaRa 公司所提供的反轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應，獲得 cDNA。根據 qRT-PCR 試劑盒說明書進行擴增反應，設置參數：95℃、30 s，95℃、5 s，60℃、30 s，總共 40 個循環，并做溶解曲線分析。用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參基因，根據其表達量對目的基因表達量做歸一化處理。各引物序列如表 1 所示。
表1
qRT-PCR 的引物序列
Table1.
Primer sequences for qRT-PCR
1.6.6 蛋白免疫印跡實驗
振動培養結束后，以 β-actin 作為內參，通過蛋白免疫印跡（Western blot）實驗檢測各蛋白的表達量。首先，將成骨細胞經細胞裂解液裂解并收集蛋白，檢測各組的蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液（5 ×）混勻，煮沸 10 min。隨后進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉后孵育一抗，4℃ 過夜。室溫下孵育二抗 1 h，加入 ECL 顯色液在凝膠成像上顯影。電泳條帶的灰度值用灰度分析軟件 Image Lab 3.0（Bio-Rad，美國）進行分析。
1.6.7 免疫熒光實驗
95% 乙醇固定細胞 10 min，Triton X-100 室溫下破膜 5 min，用山羊血清 4℃ 下封閉 1 h，加入一抗 ERα（1∶100）4℃ 孵育過夜，4℃ 避光孵育偶聯熒光劑的相應二抗（1∶100）2 h，加羅丹明對細胞骨架染色，DAPI 復染細胞核。在激光掃描共聚焦顯微鏡 LSM710（蔡司，德國）下觀察細胞內 ERα 的分布。細胞內 ERα 熒光強度用圖像處理軟件 Image J 1.8.0（National Institutes of Health，美國）軟件進行分析統計。
1.6.8 統計學分析
所有實驗均重復 3 次，所有數據均采用統計軟件 SPSS 21.0（IBM 公司，美國）處理，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行組間差異比較，用紐曼-科伊爾斯檢驗法（Newman-Keuls）進行組間兩兩比較，數據用均數±標準差表示，P < 0.05，表示差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 成骨細胞鑒定
本研究從細胞形態、堿性磷酸酶染色、礦化結節染色和骨形成標志物的方面來鑒定成骨細胞。如圖 1 所示，在光學顯微鏡下，體外分離培養的細胞形態呈三角形、鱗形、多邊形等不規則形狀，有較多突起，胞質豐富，核呈卵圓形，生長旺盛；培養第 5 d，細胞堿性磷酸酶染色陽性，呈藍紫色；培養 21 d，采用茜素紅染色，可見被染成橘紅色的鈣鹽結節，即礦化結節；Western blot 方法檢測到細胞表達特異性的骨形成標志物 Col Ⅰ、Runx2 和 OCN。上述結果提示，本研究體外分離培養的細胞，是成骨細胞。
圖1
成骨細胞的鑒定
Figure1.
Identification of osteoblasts
2.2 篩選促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞骨形成的最佳低強度振動參數
采用 qRT-PCR 實驗比較不同低強度振動參數對成骨細胞骨形成標志物表達的影響，篩選促進成骨細胞骨形成的最佳振動參數。如圖 2 所示，不同低強度振動參數對去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞骨形成的影響不同，與不加載低強度振動，靜置培養 5 d，作為對照的 OVX 組相比較，45 Hz × 0.9 g 組可明顯促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞 Runx2、ALP、OCN 的 mRNA 表達（均有P < 0.01）；不同低強度振動組之間相比較，45 Hz × 0.9 g 組促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞 Runx2、ALP、OCN 的 mRNA 表達均明顯高于其他振動參數組（均有P < 0.05）。因此，本研究將 45 Hz × 0.9 g 作為后續實驗的最佳低強度振動參數。
圖2
不同低強度振動參數對骨形成標志物 mRNA 表達的影響（
，n = 3）
*
，n = 3)
*
2.3 低強度振動促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞的骨形成
2.3.1 低強度振動促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞 Col Ⅰ、OCN 和 Runx2 的表達
利用 Western blot 實驗檢測不同組骨形成標志物蛋白的表達差異。如圖 3 所示，與正常大鼠靜置培養的 CON 組相比較，OVX+S 組骨形成標志物 Col Ⅰ、OCN 和 Runx2 的蛋白表達均明顯降低，分別下降了 2.52、1.34、2.75 倍（均有P < 0.05）。與 OVX+S 組相比較，OVX+V 組骨形成標志物 Col Ⅰ、OCN 和 Runx2 的蛋白表達量均顯著增加，分別增加了 2.30、1.28 和 1.62 倍（均有P < 0.05）。
圖3
不同組骨形成標志物蛋白的表達（
，n = 3）
#
, n = 3)
#
2.3.2 低強度振動促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞堿性磷酸酶的表達
采用堿性磷酸酶定性和定量的檢測，比較不同組成骨細胞堿性磷酸酶的表達差異。如圖 4 所示，與 CON 組相比，OVX+S 組堿性磷酸酶著色范圍較小，陽性細胞數較少，堿性磷酸酶表達量下降了 5.04 倍（P < 0.01）；與 OVX+S 組相比，OVX+V 組的堿性磷酸酶染色程度及面積均明顯增加，堿性磷酸酶表達量增加了 1.22 倍（P < 0.05）。
圖4
不同組堿性磷酸酶的表達（
，n = 3）
#
，n = 3)
#
2.4 低強度振動促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞 ERα 的表達
通過 Western blot 和免疫熒光技術分別檢測振動前后 ERα 的表達和亞細胞定位的改變。如圖 5 和圖 6 所示，與 CON 組相比較，OVX+S 組中 ERα 的表達量明顯降低（P < 0.05）。與 OVX+S 組相比較，OVX+V 組的 ERα 表達量明顯增加（P < 0.05）。如圖 6 所示，在免疫熒光實驗中，分別對細胞骨架（紅色）、ERα（綠色）和細胞核（藍色）進行染色，結果顯示，CON 組和 OVX+S 組靜置培養的成骨細胞，ERα 均主要分布于細胞質中，而加載低強度振動后，OVX+V 組成骨細胞中 ERα 的亞細胞定位發生變化，細胞核中的 ERα 增加。
圖5
不同組 ERα 蛋白的表達（
，n = 3）
#
，n = 3)
#
圖6
不同組 ERα 的亞細胞定位和熒光強度
#
#
2.5 低強度振動經 ERα 調節去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞的骨形成
以 Western blot 檢測 ERα 的表達，探討當 ERα 的表達受抑制后，低強度振動在促進成骨細胞骨形成過程中的作用。如圖 7 和圖 8 所示，與 OVX+V 組相比較，OVX+V+ICI 組 ERα 的表達量明顯降低（P < 0.05），同時 Col I 、OCN 和 Runx2 的 mRNA 與蛋白的表達量亦明顯降低（均有P < 0.05）。與 OVX+S 組相比較，OVX+V+ICI 組 ERα 表達量明顯降低（P < 0.05）；Col I 和 Runx2 的蛋白表達量亦明顯降低（均有P < 0.05）。
圖7
抑制 ERα 后，ERα 蛋白的表達（
，n = 3）
##
, n = 3)
##
圖8
抑制 ERα 后，骨形成標志物 mRNA 及蛋白的變化（
，n = 3）
#
, n = 3)
#
3 討論
目前臨床上對于絕經后骨質疏松癥的治療主要依靠各種藥物。藥物治療雖然在一定程度上可以緩解病情，但也由于存在嚴重的副作用、較差的依從性以及低耐受性等缺陷，使患者的選擇十分有限。低強度振動以其高滿意性和較小的副作用等優點，在治療和預防絕經后骨質疏松癥方面，具有重要的臨床應用價值[7]。朱東[8]的研究發現，對去卵巢大鼠施加低載荷機械振動，骨組織的力學性能和微觀結構均明顯提高，骨小梁數量以及面積均明顯改善。成骨細胞是骨組織中負責骨形成的主要功能細胞，因此探究低強度振動促進成骨細胞骨形成的分子機制對于絕經后骨質疏松癥的防治具有重要的意義。
本研究發現不同的低強度振動參數對成骨細胞骨形成的影響不同，其中 45 Hz × 0.9 g 的低強度振動明顯促進成骨細胞骨形成標志物 Runx2、ALP 和 OCN 的 mRNA 的表達，促進成骨細胞的骨形成，因此在后續的實驗中采用 45 Hz × 0.9 g 作為低強度振動參數。進一步的實驗結果顯示，低強度振動可促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞骨形成標志物 Col Ⅰ、OCN、Runx2 的表達，同時增加 ALP 的活性。
雌激素水平的降低是引起絕經后骨質疏松癥的重要原因，雌激素在調節骨的生長和代謝過程中發揮了重要的作用，雌激素的骨保護作用主要由 ERα 介導，包括成骨細胞的增殖和分化；骨基質蛋白的合成，決定骨細胞的壽命，并起到抑制骨吸收的同時促進破骨細胞凋亡的作用[9-11]。ERα 不僅能夠介導雌激素的骨保護效應，同時也能夠參與骨組織的力學響應。
基于以上原因，本研究對低強度振動前后 ERα 的表達以及亞細胞定位的變化做了進一步的探究。ERα 的免疫熒光結果顯示，在靜置條件下，ERα 主要分布于成骨細胞的細胞質中，少部分分布于細胞核，在施加低強度振動后，細胞核中的 ERα 表達明顯增加，出現了細胞質中的 ERα 向細胞核轉移、ERα 的亞細胞定位發生改變的現象。同時本研究對 ERα 的免疫熒光強度和蛋白的表達進行了進一步的分析和檢測，結果顯示去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞在接受低強度振動刺激后，ERα 的表達有顯著升高，表明低強度振動可有效促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞 ERα 的表達。上述結果與之前報道的有關雌激素受體的作用機制相一致：雌激素受體的激活可以不完全依賴與雌激素的結合，力學刺激也可激活雌激素受體，且活化的雌激素受體通過經典的核啟動的類固醇信號傳送通路轉移到細胞核中，與 DNA 上的特定區域結合后促進成骨細胞骨形成標志物的表達，從而增加成骨細胞的骨形成能力[12-13]。然而在采用雌激素受體抑制劑 ICI182780 抑制了 ERα 的表達后，此時低強度振動促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞骨形成的作用明顯降低。
因此本實驗得出結論：45 Hz × 0.9 g 的低強度振動能夠顯著提高去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞的功能活性，且通過增加 ERα 的表達以及改變 ERα 的亞細胞定位的方式，促進成骨細胞的骨形成；但是由于 ERα 主要分布于細胞質中，因此成骨細胞表面如何感知低強度振動刺激，并將外界的力學信號轉化為細胞內的化學信號還有待進一步探究。同時也有研究發現振動可引起紅細胞變形能力降低，周圍毛細血管形態和張力改變以及影響周圍神經的敏感性[14-15]。但也存在一些研究表明振動可抑制紅細胞的免疫黏附，改善血液流變性的異常[16]。因此針對不同的個體、不同的目的應積極探索個性化的振動參數，以便更好地利用振動，并預防其潛在危害。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
隨著世界人口老齡化的加劇，絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）逐漸成為廣泛關注的大眾健康問題。成骨細胞（osteoblast，OB）是骨形成的主要功能細胞，負責骨膠原和骨基質的合成、分泌和礦化，成骨細胞的功能狀態與絕經后骨質疏松癥的發生發展有著極其密切的關系[1]。因此，如何促進成骨細胞的骨形成是防治絕經后骨質疏松癥的研究方向之一。目前用于治療絕經后骨質疏松癥的藥物主要為抑制骨吸收的藥物，并不能從根本上解決患者骨形成能力降低的問題，具有一定局限性。低強度振動（low-magnitude vibration，LMV）以其副作用小、無創性等優點，同時兼具促進骨形成和抑制骨吸收的效應,可降低骨質疏松性骨折的發生率，因而在預防和治療絕經后骨質疏松癥方面已越來越受到臨床醫生和科研人員的關注。低強度振動是指加速度小于 1 g（g 為重力加速度，g = 9.8 m/s2）的振動，研究發現頻率在 20～90 Hz 的低強度振動，能有效促進骨組織的重建，改善成骨細胞的增殖和骨形成活性[2-3]。有報道顯示，雌激素受體 α（estrogen receptor α，ERα）不僅可以與雌激素結合發揮骨保護作用，而且還參與了成骨細胞力學刺激的傳導，引起骨組織對力學刺激的適應以及成骨反應[4-5]。本實驗室前期研究發現，去卵巢骨質疏松癥大鼠雌激素水平下降，ERα 的表達水平也降低，其對外界低強度振動的敏感性也降低；進一步實驗發現，ERα 參與了低強度振動促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞的分化[6]。在成骨細胞中，ERα 是否參與了低強度振動對成骨細胞的作用目前尚不清楚。
因此，本實驗旨在探究低強度振動對成骨細胞骨形成標志物 Runt 家族相關轉錄因子 2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、Ⅰ 型膠原（collagen type I，Col Ⅰ）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和 ERα 的表達以及 ERα 亞細胞定位的影響；隨后抑制 ERα 的表達，檢測低強度振動對成骨細胞骨形成標志物 Runx2、Col Ⅰ 和 OCN 表達的變化，探究低強度振動是否經由 ERα 調控去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞的骨形成，期望為低強度振動預防和治療絕經后骨質疏松癥提供實驗數據。
1 材料和方法
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗試劑
本文所用試劑包括：基礎培養基（minimum essential medium alpha basic，α-MEM）（Gibco 公司，美國）、澳洲胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Gibco 公司，美國）、0.25% 胰蛋白酶［含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）］（Hyclone 公司，美國）、堿性磷酸酶顯色試劑盒（碧云天公司，中國）、堿性磷酸酶檢測試劑盒（碧云天公司，中國）、0.2% 茜素紅染液（索萊寶公司，中國）、ERα 抗體（Proteintech 公司，美國）、Col Ⅰ 抗體（Proteintech 公司，美國）、β-actin 抗體（Proteintech 公司，美國）、Runx2 抗體（Affinity 公司，美國）、OCN 抗體（Affinity 公司，美國）、實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒（TaKaRa 公司，日本）、0.1% 膠原酶 Ⅱ（Sigma 公司，美國）、雌激素受體抑制劑 ICI182780 （MedChemExpress 公司，美國）、細胞裂解液（碧云天公司，中國）、反轉錄試劑盒（TaKaRa 公司，日本）、蛋白上樣緩沖液（5X）（碧云天公司，中國）、偶聯熒光劑的相應二抗（Life technologies 公司，美國）、電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）顯色液（Affinity 公司，美國）、山羊血清（Absin 公司，美國）、羅丹明（索萊寶公司，中國）、4，6-聯脒-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（索萊寶公司，中國）、總 RNA 抽提試劑 TRIZOL 試劑（Invitrogen 公司，美國）、非離子型表面活性劑曲拉通 X-100 （Triton X-100）（Biofroxx 公司，德國）。
1.1.2 振動裝置
本實驗振動裝置選用廣州美伊豐實驗設備有限公司的 ZD-50T 振動儀，該機器由主控制機、振動平臺組成，該振動裝置可產生正弦波形的垂直振動，通過主控制機可調節振動的頻率（3～500 Hz）和加速度（0～3 g，g 為重力加速度，g = 9.8 m/s2）。
1.1.3 實驗動物
本研究選用 3 月齡雌性未育斯普拉格-道利（Sprague-Dawley，SD）大鼠 30 只，平均體重為（263 ± 12）g，由四川大學動物實驗中心提供。本研究動物實驗，經四川大學華西基礎醫學與法醫學院研究倫理委員會批準；實驗過程中，采用對大鼠痛苦最少的方式進行實驗。
1.2 去卵巢骨質疏松癥大鼠模型的構建
去卵巢骨質疏松癥大鼠模型組（n = 15）：選用 3 月齡雌性 SD 大鼠在手術前 12 h 禁食，次日在無菌條件下施行雙側去卵巢手術，于肋下兩橫指與脊柱下一橫指的交點處做大約 1 cm 切口，分離并切除雙側卵巢。待大鼠生長到 6 月齡時，處死并分離長骨成骨細胞。
正常大鼠組（n = 15）：不施行雙側去卵巢手術，其余與去卵巢骨質疏松癥大鼠模型組作相同處理。
1.3 成骨細胞的分離培養和純化
處死并分離正常大鼠和去卵巢骨質疏松癥大鼠的股骨和脛骨，剪成 0.1 cm × 0.1 cm 大小的骨碎片，加入 2 mL 的 0.25% 胰蛋白酶，于 37℃ 消化 20 min，吸棄 0.25% 胰蛋白酶。加入 3 mL 的 0.1% 膠原酶 Ⅱ 并置于 37℃ 消化 1 h，收集消化液，重復一次；將兩次收集的消化液過濾殘渣后，離心棄上清，重懸細胞于底面積為 25 cm2的培養瓶中培養，48 h 后換液，以后每隔 2 d 換液，待原代成骨細胞融合度達到 80%～90% 時，開始消化傳代。
利用差速貼壁法純化分離原代成骨細胞，至細胞傳至第 3 代時，即可得到純度較高的成骨細胞。
1.4 低強度振動參數的篩選
選用第 3 代去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞，分別加載 45 Hz × 0.3 g、45 Hz × 0.5 g、45 Hz × 0.9 g、90 Hz × 0.3 g、90 Hz × 0.5 g、90 Hz × 0.9 g 的低強度振動，30 min/（次·d），連續振動 5 d。同時選用第 3 代去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞不加載低強度振動，靜置培養 5 d，作為對照，命名為去卵巢（ovariectomized，OVX）組。實驗結束時，分別收集各組成骨細胞提取總 RNA，用 qRT-PCR 技術檢測各組成骨細胞中特異性骨形成標志物 Runx2、ALP、ColⅠ 和 OCN 的 mRNA 表達。選取可有效促進成骨細胞骨形成的最佳低強度振動參數，用于后續實驗。
1.5 細胞實驗的分組
分別將正常大鼠成骨細胞和去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞，以 5 × 104個/孔的細胞密度，接種于六孔板中，共分為 4 組：
（1）對照組（control，CON）：正常大鼠成骨細胞靜置培養 6 d。
（2）去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞靜置組（ovariectomized+static，OVX+S）：去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞靜置培養 6 d。
（3）去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞振動組（ovariectomized+vibration，OVX+V 組）：去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞靜置培養 1 d，然后按照 1.4 小節確定的最佳低強度振動參數加載低強度振動，30 min/次，1 次/d，連續 5 d。
（4）去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞振動+雌激素受體抑制劑組（ovariectomized+vibration+ ICI182780，OVX+V+ICI 組）：去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞在含有 50 ng/mL 雌激素受體抑制劑 ICI182780 和 10% 胎牛血清的 α-MEM 完全培養基中預培養 1 d，然后按照 1.4 小節確定的最佳低強度振動參數加載低強度振動，30 min/次，1 次/d，連續 5 d。
1.6 實驗方法
1.6.1 形態學觀察
在含 10% 胎牛血清的 a-MEM 完全培養基中培養，顯微鏡下觀察每組的細胞形態以及生長情況。
1.6.2 堿性磷酸酶染色
成骨細胞培養 5 d，按照堿性磷酸酶顯色試劑盒說明書進行染色，顯微鏡下觀察并拍照。
1.6.3 茜素紅染色
成骨細胞培養 21 d，用 95% 乙醇固定細胞 10 min，加入 0.2% 茜素紅染色 30 min，用雙蒸水（ddH2O）沖洗細胞 3 次，顯微鏡下觀察與拍照。
1.6.4 堿性磷酸酶活性的檢測
將待檢測的成骨細胞加入細胞裂解液，冰上裂解 30 min，4℃ 下 12 000 r/min，離心 10 min，收集上清液，根據堿性磷酸酶檢測試劑盒說明書，使用 96 孔板分別設置標準品組，空白對照組和樣品組，于 37℃ 孵育 30 min，在 405 nm 波長下檢測各組樣品中堿性磷酸酶的光密度（optical density，OD）值，與各樣品的總蛋白濃度做歸一化處理，并計算各樣品堿性磷酸酶的相對活性。
1.6.5 qRT-PCR 實驗
用 TRIZOL 試劑提取各組成骨細胞的 mRNA。依據 TaKaRa 公司所提供的反轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應，獲得 cDNA。根據 qRT-PCR 試劑盒說明書進行擴增反應，設置參數：95℃、30 s，95℃、5 s，60℃、30 s，總共 40 個循環，并做溶解曲線分析。用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參基因，根據其表達量對目的基因表達量做歸一化處理。各引物序列如表 1 所示。
表1
qRT-PCR 的引物序列
Table1.
Primer sequences for qRT-PCR
1.6.6 蛋白免疫印跡實驗
振動培養結束后，以 β-actin 作為內參，通過蛋白免疫印跡（Western blot）實驗檢測各蛋白的表達量。首先，將成骨細胞經細胞裂解液裂解并收集蛋白，檢測各組的蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液（5 ×）混勻，煮沸 10 min。隨后進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉后孵育一抗，4℃ 過夜。室溫下孵育二抗 1 h，加入 ECL 顯色液在凝膠成像上顯影。電泳條帶的灰度值用灰度分析軟件 Image Lab 3.0（Bio-Rad，美國）進行分析。
1.6.7 免疫熒光實驗
95% 乙醇固定細胞 10 min，Triton X-100 室溫下破膜 5 min，用山羊血清 4℃ 下封閉 1 h，加入一抗 ERα（1∶100）4℃ 孵育過夜，4℃ 避光孵育偶聯熒光劑的相應二抗（1∶100）2 h，加羅丹明對細胞骨架染色，DAPI 復染細胞核。在激光掃描共聚焦顯微鏡 LSM710（蔡司，德國）下觀察細胞內 ERα 的分布。細胞內 ERα 熒光強度用圖像處理軟件 Image J 1.8.0（National Institutes of Health，美國）軟件進行分析統計。
1.6.8 統計學分析
所有實驗均重復 3 次，所有數據均采用統計軟件 SPSS 21.0（IBM 公司，美國）處理，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行組間差異比較，用紐曼-科伊爾斯檢驗法（Newman-Keuls）進行組間兩兩比較，數據用均數±標準差表示，P < 0.05，表示差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 成骨細胞鑒定
本研究從細胞形態、堿性磷酸酶染色、礦化結節染色和骨形成標志物的方面來鑒定成骨細胞。如圖 1 所示，在光學顯微鏡下，體外分離培養的細胞形態呈三角形、鱗形、多邊形等不規則形狀，有較多突起，胞質豐富，核呈卵圓形，生長旺盛；培養第 5 d，細胞堿性磷酸酶染色陽性，呈藍紫色；培養 21 d，采用茜素紅染色，可見被染成橘紅色的鈣鹽結節，即礦化結節；Western blot 方法檢測到細胞表達特異性的骨形成標志物 Col Ⅰ、Runx2 和 OCN。上述結果提示，本研究體外分離培養的細胞，是成骨細胞。
圖1
成骨細胞的鑒定
Figure1.
Identification of osteoblasts
2.2 篩選促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞骨形成的最佳低強度振動參數
采用 qRT-PCR 實驗比較不同低強度振動參數對成骨細胞骨形成標志物表達的影響，篩選促進成骨細胞骨形成的最佳振動參數。如圖 2 所示，不同低強度振動參數對去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞骨形成的影響不同，與不加載低強度振動，靜置培養 5 d，作為對照的 OVX 組相比較，45 Hz × 0.9 g 組可明顯促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞 Runx2、ALP、OCN 的 mRNA 表達（均有P < 0.01）；不同低強度振動組之間相比較，45 Hz × 0.9 g 組促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞 Runx2、ALP、OCN 的 mRNA 表達均明顯高于其他振動參數組（均有P < 0.05）。因此，本研究將 45 Hz × 0.9 g 作為后續實驗的最佳低強度振動參數。
圖2
不同低強度振動參數對骨形成標志物 mRNA 表達的影響（，n = 3）
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，n = 3)
*
2.3 低強度振動促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞的骨形成
2.3.1 低強度振動促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞 Col Ⅰ、OCN 和 Runx2 的表達
利用 Western blot 實驗檢測不同組骨形成標志物蛋白的表達差異。如圖 3 所示，與正常大鼠靜置培養的 CON 組相比較，OVX+S 組骨形成標志物 Col Ⅰ、OCN 和 Runx2 的蛋白表達均明顯降低，分別下降了 2.52、1.34、2.75 倍（均有P < 0.05）。與 OVX+S 組相比較，OVX+V 組骨形成標志物 Col Ⅰ、OCN 和 Runx2 的蛋白表達量均顯著增加，分別增加了 2.30、1.28 和 1.62 倍（均有P < 0.05）。
圖3
不同組骨形成標志物蛋白的表達（，n = 3）
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, n = 3)
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2.3.2 低強度振動促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞堿性磷酸酶的表達
采用堿性磷酸酶定性和定量的檢測，比較不同組成骨細胞堿性磷酸酶的表達差異。如圖 4 所示，與 CON 組相比，OVX+S 組堿性磷酸酶著色范圍較小，陽性細胞數較少，堿性磷酸酶表達量下降了 5.04 倍（P < 0.01）；與 OVX+S 組相比，OVX+V 組的堿性磷酸酶染色程度及面積均明顯增加，堿性磷酸酶表達量增加了 1.22 倍（P < 0.05）。
圖4
不同組堿性磷酸酶的表達（，n = 3）
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，n = 3)
#
2.4 低強度振動促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞 ERα 的表達
通過 Western blot 和免疫熒光技術分別檢測振動前后 ERα 的表達和亞細胞定位的改變。如圖 5 和圖 6 所示，與 CON 組相比較，OVX+S 組中 ERα 的表達量明顯降低（P < 0.05）。與 OVX+S 組相比較，OVX+V 組的 ERα 表達量明顯增加（P < 0.05）。如圖 6 所示，在免疫熒光實驗中，分別對細胞骨架（紅色）、ERα（綠色）和細胞核（藍色）進行染色，結果顯示，CON 組和 OVX+S 組靜置培養的成骨細胞，ERα 均主要分布于細胞質中，而加載低強度振動后，OVX+V 組成骨細胞中 ERα 的亞細胞定位發生變化，細胞核中的 ERα 增加。
圖5
不同組 ERα 蛋白的表達（，n = 3）
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，n = 3)
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圖6
不同組 ERα 的亞細胞定位和熒光強度
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2.5 低強度振動經 ERα 調節去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞的骨形成
以 Western blot 檢測 ERα 的表達，探討當 ERα 的表達受抑制后，低強度振動在促進成骨細胞骨形成過程中的作用。如圖 7 和圖 8 所示，與 OVX+V 組相比較，OVX+V+ICI 組 ERα 的表達量明顯降低（P < 0.05），同時 Col I 、OCN 和 Runx2 的 mRNA 與蛋白的表達量亦明顯降低（均有P < 0.05）。與 OVX+S 組相比較，OVX+V+ICI 組 ERα 表達量明顯降低（P < 0.05）；Col I 和 Runx2 的蛋白表達量亦明顯降低（均有P < 0.05）。
圖7
抑制 ERα 后，ERα 蛋白的表達（，n = 3）
##
, n = 3)
##
圖8
抑制 ERα 后，骨形成標志物 mRNA 及蛋白的變化（，n = 3）
#
, n = 3)
#
3 討論
目前臨床上對于絕經后骨質疏松癥的治療主要依靠各種藥物。藥物治療雖然在一定程度上可以緩解病情，但也由于存在嚴重的副作用、較差的依從性以及低耐受性等缺陷，使患者的選擇十分有限。低強度振動以其高滿意性和較小的副作用等優點，在治療和預防絕經后骨質疏松癥方面，具有重要的臨床應用價值[7]。朱東[8]的研究發現，對去卵巢大鼠施加低載荷機械振動，骨組織的力學性能和微觀結構均明顯提高，骨小梁數量以及面積均明顯改善。成骨細胞是骨組織中負責骨形成的主要功能細胞，因此探究低強度振動促進成骨細胞骨形成的分子機制對于絕經后骨質疏松癥的防治具有重要的意義。
本研究發現不同的低強度振動參數對成骨細胞骨形成的影響不同，其中 45 Hz × 0.9 g 的低強度振動明顯促進成骨細胞骨形成標志物 Runx2、ALP 和 OCN 的 mRNA 的表達，促進成骨細胞的骨形成，因此在后續的實驗中采用 45 Hz × 0.9 g 作為低強度振動參數。進一步的實驗結果顯示，低強度振動可促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞骨形成標志物 Col Ⅰ、OCN、Runx2 的表達，同時增加 ALP 的活性。
雌激素水平的降低是引起絕經后骨質疏松癥的重要原因，雌激素在調節骨的生長和代謝過程中發揮了重要的作用，雌激素的骨保護作用主要由 ERα 介導，包括成骨細胞的增殖和分化；骨基質蛋白的合成，決定骨細胞的壽命，并起到抑制骨吸收的同時促進破骨細胞凋亡的作用[9-11]。ERα 不僅能夠介導雌激素的骨保護效應，同時也能夠參與骨組織的力學響應。
基于以上原因，本研究對低強度振動前后 ERα 的表達以及亞細胞定位的變化做了進一步的探究。ERα 的免疫熒光結果顯示，在靜置條件下，ERα 主要分布于成骨細胞的細胞質中，少部分分布于細胞核，在施加低強度振動后，細胞核中的 ERα 表達明顯增加，出現了細胞質中的 ERα 向細胞核轉移、ERα 的亞細胞定位發生改變的現象。同時本研究對 ERα 的免疫熒光強度和蛋白的表達進行了進一步的分析和檢測，結果顯示去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞在接受低強度振動刺激后，ERα 的表達有顯著升高，表明低強度振動可有效促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞 ERα 的表達。上述結果與之前報道的有關雌激素受體的作用機制相一致：雌激素受體的激活可以不完全依賴與雌激素的結合，力學刺激也可激活雌激素受體，且活化的雌激素受體通過經典的核啟動的類固醇信號傳送通路轉移到細胞核中，與 DNA 上的特定區域結合后促進成骨細胞骨形成標志物的表達，從而增加成骨細胞的骨形成能力[12-13]。然而在采用雌激素受體抑制劑 ICI182780 抑制了 ERα 的表達后，此時低強度振動促進去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞骨形成的作用明顯降低。
因此本實驗得出結論：45 Hz × 0.9 g 的低強度振動能夠顯著提高去卵巢骨質疏松癥大鼠成骨細胞的功能活性，且通過增加 ERα 的表達以及改變 ERα 的亞細胞定位的方式，促進成骨細胞的骨形成；但是由于 ERα 主要分布于細胞質中，因此成骨細胞表面如何感知低強度振動刺激，并將外界的力學信號轉化為細胞內的化學信號還有待進一步探究。同時也有研究發現振動可引起紅細胞變形能力降低，周圍毛細血管形態和張力改變以及影響周圍神經的敏感性[14-15]。但也存在一些研究表明振動可抑制紅細胞的免疫黏附，改善血液流變性的異常[16]。因此針對不同的個體、不同的目的應積極探索個性化的振動參數，以便更好地利用振動，并預防其潛在危害。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
