不健康的飲食、作息和濫用藥物會引起多種肝臟疾病，包括脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝癌等，嚴重影響人體健康。構筑體外細胞模型在研究肝病及其藥物開發中具有重要意義。目前，國內外研究者已經開發出多種體外肝臟疾病模型。本文概括了體外肝臟病理模型構建的常用策略，并從原料、方法、指標等方面介紹了四種典型肝病相關的體外細胞模型，期望可為肝病模型相關研究人員提供參考。
引用本文： 劉婷, 葛玉卿, 袁敏, 熊巧, 趙建龍. 肝臟疾病的體外細胞模型研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2021, 38(1): 178-184. doi: 10.7507/1001-5515.202004027 復制
引言
肝臟作為維持體內穩態最重要的器官，承擔著人體大部分的代謝功能，在葡萄糖、脂質、氨基酸、異源生物代謝和蛋白質、凝血因子、膽汁生成等方面都起著關鍵性作用[1]。如何有效治療肝臟疾病一直是困擾人類健康的一大難題。通常情況下，肝臟在受到一定的物理與化學損傷后具有可再生修復的能力，但是過度或持續的損傷會打破肝臟組織損傷與修復之間的平衡，使肝臟發生不可逆病變，導致肝纖維化、肝硬化甚至導致肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[2-3]。
在體外研發可以模擬肝臟結構、再生能力以及代謝作用的精確仿生模型對肝病研究非常重要。目前研究中常用的動物模型，由于構造時間相對較長，并且藥物在動物體內發揮作用的機制與人體存在較大差異，不能完全反映藥物或者肝臟疾病在人體內的實際進展狀況，存在局限性[4]。而在體外培養的人源細胞會因缺乏炎癥因子、細胞間的相互作用以及與體內相似微環境，而迅速喪失某些重要的細胞功能，導致體外驗證結果與體內差異較大[5]。因此研究者在體外開發了很多維持細胞穩定性的工程肝臟模型，結合代謝組學、蛋白質組學和轉錄組學等新技術，應用于肝病相關機制和藥物作用等方面的研究。
本文首先根據肝臟具有的生理微環境，概括了目前體外肝臟病理模型構建的常用策略，然后針對酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）、非酒精性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）、藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）和感染性肝病相關模型特點進行總結，最后對體外肝臟病理模型的未來發展趨勢提出總結和展望。
1 構建體外肝臟模型的常用策略
體外肝臟模型是根據細胞生物學、材料學、組織學與工程學的原理，在體外構造出與體內生理環境類似的細胞體外微環境，從而使細胞在體外培養也能獲得與體內細胞相當的生存能力與生理功能，由此來對肝臟的生理與病理進行研究。
1.1 肝臟微環境組成
肝臟具有復雜的微環境，整體上可以分為細胞部分與非細胞部分。肝臟的細胞是由 60%～70% 的肝實質細胞和 30%～40% 非實質細胞（non-parenchymal cell，NPC）構成。肝實質細胞負責肝臟的主要功能，例如血糖代謝、氨的分解和膽汁酸的合成[6]。NPC 則由多種細胞組成，主要由具有大膜孔的肝竇內皮細胞（liver sinusoidal endothelial cells，LSECs）、具有多種免疫作用的庫普夫細胞（kupffer cells，KCs）、能儲存脂質和維生素 A 的星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）以及可與癌細胞病毒和細菌發生反應的自然殺傷細胞（natural killer cells，NKs）組成，它們及其周圍介質共同構成了肝細胞生長的細胞微環境[1]。NPC 主要作用是識別和降解到達肝臟的外來大分子，同時分泌細胞因子、生長因子和激素等促進細胞之間的通信以及肝臟再生[7]。
非細胞部分則是由細胞外基質蛋白、細胞因子以及肝臟特定的生理結構組成。肝臟具有復雜且規律的生理結構，整個肝臟可以看作是兩個相互依賴的器官，具有雙重傳入的血液供應：腸道代謝的所有物質由腸肝循環（門循環）進入肝臟，其他器官和組織的物質則從肝動脈進入肝臟，經過消化代謝后由中央靜脈進入全身。門靜脈與肝動脈有許多分支，分別形成微靜脈和小葉間動脈，伸入肝小葉，最終將血液匯入肝竇。肝臟內部各處組分、壓力、剪切力等因素差異較大，也因此造成不同位置的肝細胞功能存在差異。位于靜脈區的細胞主要參與氧化代謝，而位于中央靜脈區的細胞在厭氧糖酵解、脂肪代謝生酮、脂蛋白和谷氨酰胺合成中更加活躍[1]。除此之外，微環境中的組成成分對肝臟細胞也存在較大影響，細胞微環境遭到破壞后會導致細胞狀態發生改變，例如當細胞外基質蛋白過量時，組織空隙之間的彈性會遭到破壞，血液流動受阻，組織的通透性降低，激活 HSCs，進而誘發肝臟纖維化[8]。
1.2 構建肝臟結構微環境
體外常用的肝實質細胞主要有三種。人原代肝細胞（primary human hepatocytes，PHHs），這是預測體外構造細胞模型的金標準，但新鮮分離的 PHHs 在常規培養中會迅速去分化，丟失重要的代謝酶和藥物轉運蛋白的表達，從而限制了他們在肝生物學、藥物毒性和代謝研究中的作用[9-10]。永生化肝細胞系，雖然不如 PHHs 具有預測性，但具有重復性好、可控性強等優點，廣泛用于體外生理、病理條件構建和肝毒性評估[11]。誘導干細胞衍生肝細胞樣細胞（induced pluripotent stem cell-derived human hepatocytelike cells，iHep）近年來也逐漸發展成為可靠的體外肝細胞來源。將一種或多種 NPC 與肝細胞共培養可以使肝細胞獲得相對應的細胞微環境，從而建立如纖維化模型、免疫模型等不同功能的模型。
在體外，肝臟生理結構通常通過以下方式實現：① 利用膠原蛋白使細胞圖案化，使得細胞在平面上的分布符合一定的規律；② 模型中添加水凝膠、膠原蛋白或者特朗斯韋爾（Transwell）腳手架來增加細胞分布的空間維度，使得細胞在立體空間上有序分布，增加細胞間相互作用；③ 利用旋轉培養法、懸滴法、低吸附表面培養等方法，使細胞形成更為穩定的球體結構；④ 通過生物三維打印技術使細胞與生物材料結合，構建出更復雜的結構。而細胞微環境中物理化學條件的實現可以通過灌注培養替代傳統靜態培養，從而模擬體內液體流動，為細胞提供壓力、剪切力、氧氣和營養物質[12]。肝臟功能的實現依賴于肝臟細胞和肝臟微環境的相互作用，利用這些方式對肝臟微環境進行體外仿生，構筑體外細胞模型，使細胞獲得與體內環境相似的微環境，從而維持細胞長期的穩定性，獲得可靠結果。
2 體外細胞平臺構建病理模型
2.1 酒精性肝病模型
由過度飲酒造成的 ALD 是全球范圍內主要的慢性肝臟疾病。過量飲酒會引發一系列的肝病，包括脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝癌[13]。此外，飲酒還會使患有其他類型肝病（如病毒性肝炎和 NAFLD）的患者加速肝纖維化，加重病情，導致不良結果[14]。
通常通過在培養基中直接添加乙醇誘導體外細胞模型獲得酒精性肝損傷。不同濃度和誘導時間對于肝臟損傷程度不同，由此可以建立可逆損傷和不可逆損傷的 ALD 模型[15]。單層貼壁培養的肝細胞會在較高酒精濃度的誘導下迅速出現酒精肝表型，與體內損傷情況不符，通過增加 NPC 可以更真實地模擬肝病發生過程。Deng 等[16]采用聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）與多孔膜多層累積培養的方式，將肝細胞（HepG2）與 HSCs（LX-2）、人臍靜脈細胞融合細胞（EAhy926）以及 KCs（U937）細胞按照一定的空間結構整合，模擬不同種細胞在肝竇中的分布，并利用蠕動泵以 1 μL/min 的流速持續灌注，重現了酒精誘導肝細胞和 NPC 的損傷過程，分析了 NPC 在 ALD 發生過程的作用。與單一肝細胞模型相比，多種細胞共培養的模型系統會顯示出一些更具有活力的結構，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）組成也相對更復雜，更接近于體內微環境生理情況[17]。與二維模型相比，三維模型具有更高幾率的細胞接觸，有利于促進細胞相互作用，維持更穩定的肝功能和表型，對酒精的刺激響應更貼合于真實的人體肝臟。此外，三維球體模型中的肝細胞對于酒精的耐受度遠遠高于二維平面培養肝細胞。利用大鼠的原代肝細胞與 HSCs 進行球狀共培養，可以在動態培養的條件下，觀察到經過酒精損傷肝組織恢復的過程[15]。
絕大多數體外 ALD 模型研究表明，肝細胞在酒精誘導后，合成代謝能力會逐漸喪失，白蛋白與尿素生成會降低，而氨基轉移酶量會上升。例如，用 600 mmol/L 乙醇處理的 HepG2 上清液中血清丙氨酸氨基轉移酶（serum alanine aminotransferase，ALT）與天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）的量分別增加了 4 倍和 3.8 倍[18]。除此之外，酒精的誘導還會導致 NPC 分泌的炎癥介質例如 α-腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）以及細胞外基質蛋白的分泌量增加[19]。對于這些細胞因子的監控，可以了解和控制細胞的受損情況[20]。盡管迄今為止尚無模型能夠對于 ALD 整個過程進行監控，但它對于研究 ALD 發病機制、測試新藥和開發新的治療策略提供了寶貴的工具。
2.2 非酒精性肝病模型
NAFLD 是全球發展最快的疾病之一[21]。NAFLD 的發展過程與 ALD 類似，肝臟在沒有飲酒、病毒感染或其他特定病因的情況下，從甘油三酸酯的過量累積（肝脂肪變性）到伴有炎癥的脂肪變性，例如非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH），進一步發展為肝纖維化和肝硬化，最終導致 HCC[22]。體外構建的 NAFLD 模型主要有兩種類型：一種是利用來自 NAFLD 或者 NASH 患者的肝組織捕獲基因和表觀遺傳因子，另一種是通過添加一些疾病誘導因子來誘發體外有機組織發生疾病變性[23]。常見的疾病誘導因子，例如葡萄糖、果糖、游離脂肪酸（free fatty acids，FFA）和胰島素均可以在體外將肝臟模型誘變為脂肪變性模型[4]。通過數周的過度營養物的刺激，比如用富含 FFA 的培養基代替常規培養基進行誘導會導致細胞內的甘油三脂（triglyceride，TG）和 ROS 增加，白蛋白分泌減少，從而誘發 NASH[24]。Kostrzewski 等[25]利用膠原蛋白包被在商品化的肝芯片 Liver Chip（MPS-LC12，CN Bio Innovations Inc.，英國）生物反應器壁上，形成三維支架，PHHs 黏附在反應壁上生長，并利用反應器底部的氣泵分別進行高油脂含量與低油脂含量培養基灌注培養，發現高脂肪培養的 PHHs 的脂肪累積量是低脂肪培養的 3 倍，與 NFALD 相關的疾病基因發生上調，但肝細胞代謝活性受損，與之相關的代謝酶細胞色素 P450 超家族（cytochromeP450 proteins，CYP）中 CYP3A4 和 CYP2C9 的活性顯著降低。
多細胞共培養有利于探索不同 NPC 在病變過程中發揮的作用，獲得更多炎癥因子的表達。利用 NPC 所釋放的炎癥因子來評估疾病終點，如通過監測膠原蛋白、TNF-α、白介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）等指標來判斷肝纖維化以及 NASH 的發生[26-27]。此外，NAFLD 模型可以通過微流控芯片結構設計實現微環境的差異性，從而研究 NAFLD 的空間異質性[28]。Bulutoglu 等[29]利用帶有梯度結構的微流控芯片將含有亞油酸的培養基以濃度分配，使同一個培養區的不同位置培養細胞其非酒精性損傷程度不同，以探究 NAFLD 在發病機制上以及肝組織生理結構的異質性；通過對肝臟細胞的脂肪非線性積累情況分析，推測在較高 FFA 濃度時，FFA 的攝入是通過非線性的轉運蛋白介導的，而并非簡單的擴散。這種模型不僅僅適用于分析油脂對于肝臟影響，同樣也適用于分析其他營養物質在肝臟不同部位形成的有差異的影響。
相比動物模型來說，工程化肝臟細胞 NAFLD 模型具有誘導參數可控，結果直觀、高效等優點。目前部分研發產品已成功轉化，如球體組織 3D inSight（MT-02-302-05，InSphero Inc.，瑞士）、PDMS 芯片 Liver Chip（S-1 Chips，Emulate Inc.，美國）以及三維打印組織 exVive3D tissue（Organovo Inc.，美國）均可以直接用于 NAFLD 和 NASH 的研究[30-32]。然而目前 NAFLD 模型的開發大多數停留在脂肪性肝炎以及肝纖維化階段，對于肝硬化以及肝癌相關模型開發還具有一定的挑戰性，需要多學科協同攻關才能推動其發展，發揮其巨大的潛能[33]。
2.3 藥物性肝損傷模型
DILI 是制藥行業關注的重要問題之一，由于藥物的使用會加重肝臟的負擔甚至造成急性肝功能衰竭，這是候選新藥不能進入市場以及多種市售藥物停止使用的主要原因，同時也會給藥企帶來巨大損失[34]。新藥在首次人體試驗之前，需要動物模擬實驗來評估藥物的安全性，盡管動物模型有助于人們了解藥物在全身環境中的分布和作用，但是由于物種差異的局限，臨床前的測試并不完全反映藥物在人體的真實情況，有 38%～51% 化合物肝毒性未能在臨床前檢測到，因此存在巨大的經濟與健康風險[35]。DILI 與其他的肝損傷不同，DILI 發病機制很復雜，涉及復雜的遺傳代謝和免疫應答。舉例來說，部分藥物的肝毒性是劑量依賴型，如常見的對乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）和氨甲喋呤，這類藥物損傷模型可以通過藥物的多次暴露獲得相應的表型[9]；而某些藥物毒性是由于免疫作用而產生，具有特異性，所以評估免疫系統對于藥物的損傷必須包含多種 NPC 并維持長時間的穩定性[36]。三維培養系統中，培養細胞的表型與體內十分類似，具有長期穩定性，有望在人類藥物代謝和毒性研究中取得重大突破，因此這些模型越來越受到學術界和工業界的關注[37-38]。
目前，研究者已經研發成功可利用多種方式維持肝細胞功能來進行相應的藥物毒性篩選。最簡單的是利用“三明治”結構，將不同的肝細胞接種在多孔膜或者蛋白凝膠的兩側，既保留了細胞的極性也保證不同細胞之間的相互作用。利用微圖案模式下的共培養，將原代人 LSECs 通過膠原蛋白圖案化與 PHHs 進行共培養，誘導 PHHs 體外分泌白蛋白長達 11 d[39]。利用 Matrigel 基底膠和膠原蛋白混合的支架將大鼠的肝成纖維細胞與膽管上皮細胞進行共培養，可以模擬肝臟發育過程中膽管的形成[40]。細胞球體培養，這種三維培養方式利用細胞間的黏附而非人工底物黏附，解決了藥物被支架吸附的問題[41]。將 HepG2 制成球體培養物可以獲得更為敏感的 DILI 模型，已經用于含有胺碘酮、雙氯芬酸、二甲雙胍、苯乙雙胍和丙戊酸的藥物毒性預測[35]，適用于對慢性暴露肝毒性化合物的研究。三維培養下人肝癌細胞（HepaRG）培養物經過代謝激活后對于對 APAP 和黃曲霉毒素具有更高敏感性。將誘導的多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）分化而獲得的 iHep 與 NPC 進行共培養，可以表達 CYP 家族中的 CYP1A 和 CYP3A，同時與藥物代謝相關 I 期、II 期代謝酶的表達都會比單獨肝細胞系的培養系統有所增強，更接近真實的人體微環境[42-43]。值得注意的是，iHep 可以從罕見的藥物特異性反應患者中產生，為研究特定的反應提供獨特的細胞來源[44]。目前 DILI 的體外模型尚且存在一些問題，對于藥物劑量依賴型的 DILI 來說，不同的模型之間差異較大，缺乏可靠的標準化模型對同一藥物進行準確評估。
2.4 感染性肝病模型
由于部分病原體僅對于人類肝臟細胞具有特異性，很難在小鼠等動物身上進行模擬。因此，具有人源性肝臟細胞的體外模型成為研究肝臟傳染病的重要工具[45]。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是影響人類健康的主要病原體，全球范圍內有將近 3.25 億人長期感染 HBV 和 HCV，而我國現有 HBV 攜帶者也多達 7 000 萬人[46]。對于肝臟傳染病的認識不足是導致疾病多發的主要原因。利用體外細胞模型可以幫助研究者認識肝臟傳染病的發生過程并且可以實行相關的藥物篩選。PHHs 被認為是最合適感染 HBV 的細胞，但很難在體外長期維持穩定。永生化細胞系通常不易被感染，但在補充二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）后的 HepG2 和補充聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）的 HepaRG 可以用于 HBV 感染[47]。除此之外，iHep 也被應用于體外 HBV 的感染，為體外建立病毒感染細胞模型提供基礎[48]。
在體外利用膠原蛋白圖案化將 PHHs 和 iHep 與成纖維細胞（J2-3T3）進行共培養，可以在體外 3 周內維持 HBV 受體鈉牛磺膽酸鹽共轉運多肽（sodium taurocholate cotransporting polypetide，NTCP）的表達能力，進而實現進行 HBV 感染[49]。對于圖案的精確控制有助于實現體外細胞微環境，無需進行任何灌流就可以在體外維持肝功能長達 6 周[50]。但是這種模型無法模擬體內免疫系統對于病毒入侵的反應，細胞種類單一，無法提供相應的免疫應答，并且二維 HBV 系統都需要較高的接種量才能建立，感染效率低。而利用三維球狀結構與灌注相結合，可在體構建具有功能性膽管的肝竇結構，獲得細胞極化作用，使得模型感染能力與臨床 HBV 感染相當[51]。
除了對肝臟特異性感染的病毒外，其他引起全身感染的病毒和微生物，如瘧原蟲等也可以靶向肝并造成嚴重的肝損害。瘧原蟲感染具有高復發性，這是消除瘧疾在東南亞以及非洲地區傳播的主要障礙[52]。研究瘧原蟲對肝臟的影響需要維持模型中細胞的長期穩定性。因為在瘧原蟲感染肝臟后會有休眠狀態，這個狀態可以維持數周至數月，需要長期的細胞活力和肝細胞特性使得瘧原蟲能夠從孢子充分發育。Gural 等[53]利用彈性柱狀 PDMS 在 384 孔板底部對膠原蛋白進行圖案化，建立 PHHs 微球與間日瘧原蟲共培養物，重現了間日瘧原蟲對于肝臟感染的過程，實現長期裂殖體的建立、釋放，同時利用該模型在體外進行藥物的篩選，為開發藥物治療瘧原蟲感染研究提供了有效工具。
除了在體外開發與體內微環境類似的易感模型外，構建病原體的易檢模型也具有重要意義。HBV 的感染通常使用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）對于病毒 DNA，例如共價閉合環狀 DNA（covalently closed circularDNA，cccDNA）和松弛環狀的雙鏈 DNA（relaxed circularDNA，rcDNA）進行分析，而 HCV 和惡性瘧原蟲可以通過實時觀察具有熒光的報告基因來確定感染情況[54-55]。結合特定的問題以及實驗室條件進一步開發能夠概括真實的宿主與病原體之間相互作用的易檢出模型，對于肝臟傳染病的治療以及干預具有重要意義。
3 總結與展望
本文根據不同的疾病誘因，將體外肝臟病理模型分為 ALD、NAFLD、DILI 和感染性肝病等模型，并對以上四種肝臟疾病模型的肝細胞類型、NPC 種類、構造特點、相關評價指標上進行總結，如表 1 所示。不同的模型構造方式可以靈活應用于各種不同的肝臟疾病中，以滿足不同的需求，并結合相應的指標進行評價，有利于研究者開發各種形式的體外模型對肝臟疾病進行模擬。
表1
肝臟疾病體外細胞模型總結
Table1.
Summary of cell-based models of human liver disease in vitro
目前研究者已經開發出多種可供使用的三維體外肝臟模型，這些模型是研究肝病發展、促進藥物研究和進行藥物毒性測試的寶貴工具。但是，體外細胞模型仍然處于起步階段，開發具有通用性、標準化的模型進行諸如 ALD、NAFLD 以及病原體感染等疾病的病理學研究具有重要意義。隨著生物材料、細胞體外培養技術、基因組學、蛋白質組學以及電子信息技術地不斷發展，未來將會開發出更加貼近體內生理微環境，并且能在體外長時間維持肝功能的體外模型來進一步研究肝病。通過完善與改進，未來體外肝臟模型的構建將會更注重于實時監控，獲取更加全面的動態信息，有助于了解完整的疾病發生過程。同時，提出具有多種功能的標準化模型來替代傳統的細胞模型，在藥物毒性評估和肝病研究中都具有更為廣闊的應用前景。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
肝臟作為維持體內穩態最重要的器官，承擔著人體大部分的代謝功能，在葡萄糖、脂質、氨基酸、異源生物代謝和蛋白質、凝血因子、膽汁生成等方面都起著關鍵性作用[1]。如何有效治療肝臟疾病一直是困擾人類健康的一大難題。通常情況下，肝臟在受到一定的物理與化學損傷后具有可再生修復的能力，但是過度或持續的損傷會打破肝臟組織損傷與修復之間的平衡，使肝臟發生不可逆病變，導致肝纖維化、肝硬化甚至導致肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[2-3]。
在體外研發可以模擬肝臟結構、再生能力以及代謝作用的精確仿生模型對肝病研究非常重要。目前研究中常用的動物模型，由于構造時間相對較長，并且藥物在動物體內發揮作用的機制與人體存在較大差異，不能完全反映藥物或者肝臟疾病在人體內的實際進展狀況，存在局限性[4]。而在體外培養的人源細胞會因缺乏炎癥因子、細胞間的相互作用以及與體內相似微環境，而迅速喪失某些重要的細胞功能，導致體外驗證結果與體內差異較大[5]。因此研究者在體外開發了很多維持細胞穩定性的工程肝臟模型，結合代謝組學、蛋白質組學和轉錄組學等新技術，應用于肝病相關機制和藥物作用等方面的研究。
本文首先根據肝臟具有的生理微環境，概括了目前體外肝臟病理模型構建的常用策略，然后針對酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）、非酒精性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）、藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）和感染性肝病相關模型特點進行總結，最后對體外肝臟病理模型的未來發展趨勢提出總結和展望。
1 構建體外肝臟模型的常用策略
體外肝臟模型是根據細胞生物學、材料學、組織學與工程學的原理，在體外構造出與體內生理環境類似的細胞體外微環境，從而使細胞在體外培養也能獲得與體內細胞相當的生存能力與生理功能，由此來對肝臟的生理與病理進行研究。
1.1 肝臟微環境組成
肝臟具有復雜的微環境，整體上可以分為細胞部分與非細胞部分。肝臟的細胞是由 60%～70% 的肝實質細胞和 30%～40% 非實質細胞（non-parenchymal cell，NPC）構成。肝實質細胞負責肝臟的主要功能，例如血糖代謝、氨的分解和膽汁酸的合成[6]。NPC 則由多種細胞組成，主要由具有大膜孔的肝竇內皮細胞（liver sinusoidal endothelial cells，LSECs）、具有多種免疫作用的庫普夫細胞（kupffer cells，KCs）、能儲存脂質和維生素 A 的星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）以及可與癌細胞病毒和細菌發生反應的自然殺傷細胞（natural killer cells，NKs）組成，它們及其周圍介質共同構成了肝細胞生長的細胞微環境[1]。NPC 主要作用是識別和降解到達肝臟的外來大分子，同時分泌細胞因子、生長因子和激素等促進細胞之間的通信以及肝臟再生[7]。
非細胞部分則是由細胞外基質蛋白、細胞因子以及肝臟特定的生理結構組成。肝臟具有復雜且規律的生理結構，整個肝臟可以看作是兩個相互依賴的器官，具有雙重傳入的血液供應：腸道代謝的所有物質由腸肝循環（門循環）進入肝臟，其他器官和組織的物質則從肝動脈進入肝臟，經過消化代謝后由中央靜脈進入全身。門靜脈與肝動脈有許多分支，分別形成微靜脈和小葉間動脈，伸入肝小葉，最終將血液匯入肝竇。肝臟內部各處組分、壓力、剪切力等因素差異較大，也因此造成不同位置的肝細胞功能存在差異。位于靜脈區的細胞主要參與氧化代謝，而位于中央靜脈區的細胞在厭氧糖酵解、脂肪代謝生酮、脂蛋白和谷氨酰胺合成中更加活躍[1]。除此之外，微環境中的組成成分對肝臟細胞也存在較大影響，細胞微環境遭到破壞后會導致細胞狀態發生改變，例如當細胞外基質蛋白過量時，組織空隙之間的彈性會遭到破壞，血液流動受阻，組織的通透性降低，激活 HSCs，進而誘發肝臟纖維化[8]。
1.2 構建肝臟結構微環境
體外常用的肝實質細胞主要有三種。人原代肝細胞（primary human hepatocytes，PHHs），這是預測體外構造細胞模型的金標準，但新鮮分離的 PHHs 在常規培養中會迅速去分化，丟失重要的代謝酶和藥物轉運蛋白的表達，從而限制了他們在肝生物學、藥物毒性和代謝研究中的作用[9-10]。永生化肝細胞系，雖然不如 PHHs 具有預測性，但具有重復性好、可控性強等優點，廣泛用于體外生理、病理條件構建和肝毒性評估[11]。誘導干細胞衍生肝細胞樣細胞（induced pluripotent stem cell-derived human hepatocytelike cells，iHep）近年來也逐漸發展成為可靠的體外肝細胞來源。將一種或多種 NPC 與肝細胞共培養可以使肝細胞獲得相對應的細胞微環境，從而建立如纖維化模型、免疫模型等不同功能的模型。
在體外，肝臟生理結構通常通過以下方式實現：① 利用膠原蛋白使細胞圖案化，使得細胞在平面上的分布符合一定的規律；② 模型中添加水凝膠、膠原蛋白或者特朗斯韋爾（Transwell）腳手架來增加細胞分布的空間維度，使得細胞在立體空間上有序分布，增加細胞間相互作用；③ 利用旋轉培養法、懸滴法、低吸附表面培養等方法，使細胞形成更為穩定的球體結構；④ 通過生物三維打印技術使細胞與生物材料結合，構建出更復雜的結構。而細胞微環境中物理化學條件的實現可以通過灌注培養替代傳統靜態培養，從而模擬體內液體流動，為細胞提供壓力、剪切力、氧氣和營養物質[12]。肝臟功能的實現依賴于肝臟細胞和肝臟微環境的相互作用，利用這些方式對肝臟微環境進行體外仿生，構筑體外細胞模型，使細胞獲得與體內環境相似的微環境，從而維持細胞長期的穩定性，獲得可靠結果。
2 體外細胞平臺構建病理模型
2.1 酒精性肝病模型
由過度飲酒造成的 ALD 是全球范圍內主要的慢性肝臟疾病。過量飲酒會引發一系列的肝病，包括脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝癌[13]。此外，飲酒還會使患有其他類型肝病（如病毒性肝炎和 NAFLD）的患者加速肝纖維化，加重病情，導致不良結果[14]。
通常通過在培養基中直接添加乙醇誘導體外細胞模型獲得酒精性肝損傷。不同濃度和誘導時間對于肝臟損傷程度不同，由此可以建立可逆損傷和不可逆損傷的 ALD 模型[15]。單層貼壁培養的肝細胞會在較高酒精濃度的誘導下迅速出現酒精肝表型，與體內損傷情況不符，通過增加 NPC 可以更真實地模擬肝病發生過程。Deng 等[16]采用聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）與多孔膜多層累積培養的方式，將肝細胞（HepG2）與 HSCs（LX-2）、人臍靜脈細胞融合細胞（EAhy926）以及 KCs（U937）細胞按照一定的空間結構整合，模擬不同種細胞在肝竇中的分布，并利用蠕動泵以 1 μL/min 的流速持續灌注，重現了酒精誘導肝細胞和 NPC 的損傷過程，分析了 NPC 在 ALD 發生過程的作用。與單一肝細胞模型相比，多種細胞共培養的模型系統會顯示出一些更具有活力的結構，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）組成也相對更復雜，更接近于體內微環境生理情況[17]。與二維模型相比，三維模型具有更高幾率的細胞接觸，有利于促進細胞相互作用，維持更穩定的肝功能和表型，對酒精的刺激響應更貼合于真實的人體肝臟。此外，三維球體模型中的肝細胞對于酒精的耐受度遠遠高于二維平面培養肝細胞。利用大鼠的原代肝細胞與 HSCs 進行球狀共培養，可以在動態培養的條件下，觀察到經過酒精損傷肝組織恢復的過程[15]。
絕大多數體外 ALD 模型研究表明，肝細胞在酒精誘導后，合成代謝能力會逐漸喪失，白蛋白與尿素生成會降低，而氨基轉移酶量會上升。例如，用 600 mmol/L 乙醇處理的 HepG2 上清液中血清丙氨酸氨基轉移酶（serum alanine aminotransferase，ALT）與天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）的量分別增加了 4 倍和 3.8 倍[18]。除此之外，酒精的誘導還會導致 NPC 分泌的炎癥介質例如 α-腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）以及細胞外基質蛋白的分泌量增加[19]。對于這些細胞因子的監控，可以了解和控制細胞的受損情況[20]。盡管迄今為止尚無模型能夠對于 ALD 整個過程進行監控，但它對于研究 ALD 發病機制、測試新藥和開發新的治療策略提供了寶貴的工具。
2.2 非酒精性肝病模型
NAFLD 是全球發展最快的疾病之一[21]。NAFLD 的發展過程與 ALD 類似，肝臟在沒有飲酒、病毒感染或其他特定病因的情況下，從甘油三酸酯的過量累積（肝脂肪變性）到伴有炎癥的脂肪變性，例如非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH），進一步發展為肝纖維化和肝硬化，最終導致 HCC[22]。體外構建的 NAFLD 模型主要有兩種類型：一種是利用來自 NAFLD 或者 NASH 患者的肝組織捕獲基因和表觀遺傳因子，另一種是通過添加一些疾病誘導因子來誘發體外有機組織發生疾病變性[23]。常見的疾病誘導因子，例如葡萄糖、果糖、游離脂肪酸（free fatty acids，FFA）和胰島素均可以在體外將肝臟模型誘變為脂肪變性模型[4]。通過數周的過度營養物的刺激，比如用富含 FFA 的培養基代替常規培養基進行誘導會導致細胞內的甘油三脂（triglyceride，TG）和 ROS 增加，白蛋白分泌減少，從而誘發 NASH[24]。Kostrzewski 等[25]利用膠原蛋白包被在商品化的肝芯片 Liver Chip（MPS-LC12，CN Bio Innovations Inc.，英國）生物反應器壁上，形成三維支架，PHHs 黏附在反應壁上生長，并利用反應器底部的氣泵分別進行高油脂含量與低油脂含量培養基灌注培養，發現高脂肪培養的 PHHs 的脂肪累積量是低脂肪培養的 3 倍，與 NFALD 相關的疾病基因發生上調，但肝細胞代謝活性受損，與之相關的代謝酶細胞色素 P450 超家族（cytochromeP450 proteins，CYP）中 CYP3A4 和 CYP2C9 的活性顯著降低。
多細胞共培養有利于探索不同 NPC 在病變過程中發揮的作用，獲得更多炎癥因子的表達。利用 NPC 所釋放的炎癥因子來評估疾病終點，如通過監測膠原蛋白、TNF-α、白介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）等指標來判斷肝纖維化以及 NASH 的發生[26-27]。此外，NAFLD 模型可以通過微流控芯片結構設計實現微環境的差異性，從而研究 NAFLD 的空間異質性[28]。Bulutoglu 等[29]利用帶有梯度結構的微流控芯片將含有亞油酸的培養基以濃度分配，使同一個培養區的不同位置培養細胞其非酒精性損傷程度不同，以探究 NAFLD 在發病機制上以及肝組織生理結構的異質性；通過對肝臟細胞的脂肪非線性積累情況分析，推測在較高 FFA 濃度時，FFA 的攝入是通過非線性的轉運蛋白介導的，而并非簡單的擴散。這種模型不僅僅適用于分析油脂對于肝臟影響，同樣也適用于分析其他營養物質在肝臟不同部位形成的有差異的影響。
相比動物模型來說，工程化肝臟細胞 NAFLD 模型具有誘導參數可控，結果直觀、高效等優點。目前部分研發產品已成功轉化，如球體組織 3D inSight（MT-02-302-05，InSphero Inc.，瑞士）、PDMS 芯片 Liver Chip（S-1 Chips，Emulate Inc.，美國）以及三維打印組織 exVive3D tissue（Organovo Inc.，美國）均可以直接用于 NAFLD 和 NASH 的研究[30-32]。然而目前 NAFLD 模型的開發大多數停留在脂肪性肝炎以及肝纖維化階段，對于肝硬化以及肝癌相關模型開發還具有一定的挑戰性，需要多學科協同攻關才能推動其發展，發揮其巨大的潛能[33]。
2.3 藥物性肝損傷模型
DILI 是制藥行業關注的重要問題之一，由于藥物的使用會加重肝臟的負擔甚至造成急性肝功能衰竭，這是候選新藥不能進入市場以及多種市售藥物停止使用的主要原因，同時也會給藥企帶來巨大損失[34]。新藥在首次人體試驗之前，需要動物模擬實驗來評估藥物的安全性，盡管動物模型有助于人們了解藥物在全身環境中的分布和作用，但是由于物種差異的局限，臨床前的測試并不完全反映藥物在人體的真實情況，有 38%～51% 化合物肝毒性未能在臨床前檢測到，因此存在巨大的經濟與健康風險[35]。DILI 與其他的肝損傷不同，DILI 發病機制很復雜，涉及復雜的遺傳代謝和免疫應答。舉例來說，部分藥物的肝毒性是劑量依賴型，如常見的對乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）和氨甲喋呤，這類藥物損傷模型可以通過藥物的多次暴露獲得相應的表型[9]；而某些藥物毒性是由于免疫作用而產生，具有特異性，所以評估免疫系統對于藥物的損傷必須包含多種 NPC 并維持長時間的穩定性[36]。三維培養系統中，培養細胞的表型與體內十分類似，具有長期穩定性，有望在人類藥物代謝和毒性研究中取得重大突破，因此這些模型越來越受到學術界和工業界的關注[37-38]。
目前，研究者已經研發成功可利用多種方式維持肝細胞功能來進行相應的藥物毒性篩選。最簡單的是利用“三明治”結構，將不同的肝細胞接種在多孔膜或者蛋白凝膠的兩側，既保留了細胞的極性也保證不同細胞之間的相互作用。利用微圖案模式下的共培養，將原代人 LSECs 通過膠原蛋白圖案化與 PHHs 進行共培養，誘導 PHHs 體外分泌白蛋白長達 11 d[39]。利用 Matrigel 基底膠和膠原蛋白混合的支架將大鼠的肝成纖維細胞與膽管上皮細胞進行共培養，可以模擬肝臟發育過程中膽管的形成[40]。細胞球體培養，這種三維培養方式利用細胞間的黏附而非人工底物黏附，解決了藥物被支架吸附的問題[41]。將 HepG2 制成球體培養物可以獲得更為敏感的 DILI 模型，已經用于含有胺碘酮、雙氯芬酸、二甲雙胍、苯乙雙胍和丙戊酸的藥物毒性預測[35]，適用于對慢性暴露肝毒性化合物的研究。三維培養下人肝癌細胞（HepaRG）培養物經過代謝激活后對于對 APAP 和黃曲霉毒素具有更高敏感性。將誘導的多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）分化而獲得的 iHep 與 NPC 進行共培養，可以表達 CYP 家族中的 CYP1A 和 CYP3A，同時與藥物代謝相關 I 期、II 期代謝酶的表達都會比單獨肝細胞系的培養系統有所增強，更接近真實的人體微環境[42-43]。值得注意的是，iHep 可以從罕見的藥物特異性反應患者中產生，為研究特定的反應提供獨特的細胞來源[44]。目前 DILI 的體外模型尚且存在一些問題，對于藥物劑量依賴型的 DILI 來說，不同的模型之間差異較大，缺乏可靠的標準化模型對同一藥物進行準確評估。
2.4 感染性肝病模型
由于部分病原體僅對于人類肝臟細胞具有特異性，很難在小鼠等動物身上進行模擬。因此，具有人源性肝臟細胞的體外模型成為研究肝臟傳染病的重要工具[45]。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是影響人類健康的主要病原體，全球范圍內有將近 3.25 億人長期感染 HBV 和 HCV，而我國現有 HBV 攜帶者也多達 7 000 萬人[46]。對于肝臟傳染病的認識不足是導致疾病多發的主要原因。利用體外細胞模型可以幫助研究者認識肝臟傳染病的發生過程并且可以實行相關的藥物篩選。PHHs 被認為是最合適感染 HBV 的細胞，但很難在體外長期維持穩定。永生化細胞系通常不易被感染，但在補充二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）后的 HepG2 和補充聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）的 HepaRG 可以用于 HBV 感染[47]。除此之外，iHep 也被應用于體外 HBV 的感染，為體外建立病毒感染細胞模型提供基礎[48]。
在體外利用膠原蛋白圖案化將 PHHs 和 iHep 與成纖維細胞（J2-3T3）進行共培養，可以在體外 3 周內維持 HBV 受體鈉牛磺膽酸鹽共轉運多肽（sodium taurocholate cotransporting polypetide，NTCP）的表達能力，進而實現進行 HBV 感染[49]。對于圖案的精確控制有助于實現體外細胞微環境，無需進行任何灌流就可以在體外維持肝功能長達 6 周[50]。但是這種模型無法模擬體內免疫系統對于病毒入侵的反應，細胞種類單一，無法提供相應的免疫應答，并且二維 HBV 系統都需要較高的接種量才能建立，感染效率低。而利用三維球狀結構與灌注相結合，可在體構建具有功能性膽管的肝竇結構，獲得細胞極化作用，使得模型感染能力與臨床 HBV 感染相當[51]。
除了對肝臟特異性感染的病毒外，其他引起全身感染的病毒和微生物，如瘧原蟲等也可以靶向肝并造成嚴重的肝損害。瘧原蟲感染具有高復發性，這是消除瘧疾在東南亞以及非洲地區傳播的主要障礙[52]。研究瘧原蟲對肝臟的影響需要維持模型中細胞的長期穩定性。因為在瘧原蟲感染肝臟后會有休眠狀態，這個狀態可以維持數周至數月，需要長期的細胞活力和肝細胞特性使得瘧原蟲能夠從孢子充分發育。Gural 等[53]利用彈性柱狀 PDMS 在 384 孔板底部對膠原蛋白進行圖案化，建立 PHHs 微球與間日瘧原蟲共培養物，重現了間日瘧原蟲對于肝臟感染的過程，實現長期裂殖體的建立、釋放，同時利用該模型在體外進行藥物的篩選，為開發藥物治療瘧原蟲感染研究提供了有效工具。
除了在體外開發與體內微環境類似的易感模型外，構建病原體的易檢模型也具有重要意義。HBV 的感染通常使用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）對于病毒 DNA，例如共價閉合環狀 DNA（covalently closed circularDNA，cccDNA）和松弛環狀的雙鏈 DNA（relaxed circularDNA，rcDNA）進行分析，而 HCV 和惡性瘧原蟲可以通過實時觀察具有熒光的報告基因來確定感染情況[54-55]。結合特定的問題以及實驗室條件進一步開發能夠概括真實的宿主與病原體之間相互作用的易檢出模型，對于肝臟傳染病的治療以及干預具有重要意義。
3 總結與展望
本文根據不同的疾病誘因，將體外肝臟病理模型分為 ALD、NAFLD、DILI 和感染性肝病等模型，并對以上四種肝臟疾病模型的肝細胞類型、NPC 種類、構造特點、相關評價指標上進行總結，如表 1 所示。不同的模型構造方式可以靈活應用于各種不同的肝臟疾病中，以滿足不同的需求，并結合相應的指標進行評價，有利于研究者開發各種形式的體外模型對肝臟疾病進行模擬。
表1
肝臟疾病體外細胞模型總結
Table1.
Summary of cell-based models of human liver disease in vitro
目前研究者已經開發出多種可供使用的三維體外肝臟模型，這些模型是研究肝病發展、促進藥物研究和進行藥物毒性測試的寶貴工具。但是，體外細胞模型仍然處于起步階段，開發具有通用性、標準化的模型進行諸如 ALD、NAFLD 以及病原體感染等疾病的病理學研究具有重要意義。隨著生物材料、細胞體外培養技術、基因組學、蛋白質組學以及電子信息技術地不斷發展，未來將會開發出更加貼近體內生理微環境，并且能在體外長時間維持肝功能的體外模型來進一步研究肝病。通過完善與改進，未來體外肝臟模型的構建將會更注重于實時監控，獲取更加全面的動態信息，有助于了解完整的疾病發生過程。同時，提出具有多種功能的標準化模型來替代傳統的細胞模型，在藥物毒性評估和肝病研究中都具有更為廣闊的應用前景。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
