重復經顱磁刺激技術（rTMS）是認知神經科學研究以及臨床神經功能調控領域的重要手段之一，具有無痛和非侵入的特點。本文將成年威斯塔（Wistar）大鼠分為 rTMS 組和空白對照組（control 組），rTMS 組大鼠連續接受頻率為 5 Hz 的 rTMS 刺激 14 d，control 組大鼠不接受磁刺激作用。然后，采集兩組大鼠在進行 T 迷宮工作記憶（WM）任務期間內側前額葉皮層（PFC）的局部場電位信號（LFPs）。最后，通過對比分析兩組大鼠 WM 任務期間的行為學差異、LFPs 的時頻分布和相干性特征，探索 rTMS 對大鼠 WM 的影響。研究結果發現，rTMS 組大鼠執行 WM 任務達到正確率 80% 以上所需時間明顯少于 control 組（P < 0.05）；與 control 組大鼠相比，rTMS 組大鼠 LFPs 信號的 θ（4～12 Hz）和 γ（30～80 Hz）頻段在 T 迷宮選擇點附近能量較高（P < 0.01）；rTMS 組與 control 組 LFPs 信號的電極對之間相干性均隨電極對間距離的增大而減小，而且 rTMS 組大鼠的電極對間相干性均高于 control 組大鼠電極對間的相干性（P < 0.01）。本文結果表明，5 Hz 高頻 rTMS 在一定程度上能夠改善大鼠 PFC 神經元的興奮性以及神經元集群之間的同步性，本文結果或可為進一步研究 rTMS 對 WM 的作用機制提供重要的理論支持。
引用本文： 徐桂芝, 王寧, 郭苗苗, 張天恒, 童禹銘. 高頻重復經顱磁刺激后大鼠工作記憶局部場電位時頻特征與相干性差異分析. 生物醫學工程學雜志, 2020, 37(5): 756-764. doi: 10.7507/1001-5515.201912083 復制
引言
電磁刺激能夠調節神經元的興奮性，目前已逐漸從實驗室研究走向臨床應用。經顱磁刺激（transcranial magnetic stimulation，TMS）是一種無痛、非侵入式的神經調控技術，在認知神經科學以及臨床神經功能調控領域發揮著巨大作用。TMS 能夠利用脈沖電流產生的時變磁場在腦組織內產生感應電場，從而調節神經元興奮性，實現對特定腦功能皮層的刺激，起到改善人或動物認知功能的作用[1-3]。重復經顱磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）是重要的 TMS 刺激模式，不同頻率參數的 rTMS 會產生不同的神經生理效應：低頻刺激（< 1 Hz）會引起短暫的運動皮質抑制[4]，高頻刺激（> 1 Hz）則引起持久的皮質興奮[5]。靳靜娜等[6]通過探討靜息態腦網絡的影響，驗證了 rTMS 聯合運動訓練能改善人的運動神經系統。Kamp 等[7]對精神分裂癥患者實施高頻的 rTMS，并對頭皮腦電圖（electroencephalograph，EEG）數據進行分析，結果表明刺激后前額葉 EEG 信號中的 δ 頻段的活動顯著減少，同時患者面部識別能力增強。Lee 等[8]發現長期的高頻 rTMS 和認知訓練能夠有效改善阿爾茨海默癥患者的工作記憶（working memory，WM）障礙。以上研究表明高頻 rTMS 能夠通過調節神經電活動，進而有針對性的改善神經系統功能。
WM 是認知心理學中的重要概念，對于推理并指導決策和行為十分重要[9]。阿爾茨海默癥、精神分裂癥等神經精神類疾病的主要臨床癥狀表現為 WM 障礙。WM 是較為復雜的認知過程，需要大量神經元協同配合，通過植入式微電極采集并記錄大腦皮層、亞皮層或核團等區域記錄的局部場電位（local field potentials，LFPs），可以反映神經元局部網絡的興奮[10]。與頭皮 EEG 數據相比，LFPs 具有更好的行為特異性和空間分辨率。LFPs 信號頻率特征明顯，不同頻段的神經節律參與了不同類型的生理活動[11]。WM 的主要責任腦區之一為前額葉皮層（prefrontal cortex，PFC），近年來大量研究表明，大鼠 PFC 的損傷會引起認知功能障礙，導致大鼠執行 WM 相關任務時正確率顯著降低[12-13]，同時 PFC 的 θ 頻段（4～12 Hz）和 γ 頻段（30～80 Hz）的神經節律活動與嚙齒類動物 WM 密切相關[14-16]。一些研究者利用多通道技術對 WM 研究結果表明，在 Y 迷宮實驗任務過程中，小鼠 PFC 和海馬區 LFPs 信號的 θ 頻段相干性增強，說明 θ 頻段活動在 WM 任務的執行過程中起到了重要作用[17]。此外還有很多研究表明，γ 頻段的活動也參與了 WM 的編碼[17-18]。
目前 rTMS 被廣泛應用于神經功能調控和精神疾病治療等領域，但其是如何參與調節大腦神經生理機制的尚不清楚。研究表明，高頻 rTMS 能夠對神經節律產生影響，從而改善阿爾茨海默癥患者的 WM 障礙[19-20]。因此研究 rTMS 對大腦神經節律活動的影響，有望為進一步探索高頻 rTMS 調節大腦神經的生理機制提供理論支持，對神經疾病的治療和 TMS 設備的臨床應用具有重要意義。
本文以成年威斯塔（Wistar）大鼠為研究對象，將其隨機分為 rTMS 模型組（rTMS 組）和空白對照組（control 組）。然后，對兩組大鼠的 PFC 區域進行慢性電極植入手術，待恢復良好后進行 T 迷宮 WM 任務訓練，同時采集大鼠在此自由活動狀態下的 LFPs，并記錄其行為學狀態。通過對比分析兩組大鼠行為學和在此期間神經電生理信號的能量和同步性差異，探究 rTMS 對大鼠 WM 的影響，進而為探索 rTMS 調節大腦神經活動的生理機制以及促進 TMS 設備的參數優化起到積極作用，并具有一定的參考價值。
1 材料和方法
1.1 實驗動物
本文實驗動物為雄性 Wistar 大鼠（8～9 周齡，體重 300 g），采購于北京維通利華公司。將實驗 Wistar 大鼠隨機分為兩組：rTMS 組和 control 組，每組 6 只。本實驗所有程序均已由河北工業大學生物醫學倫理委員會審查通過（審查編號：HEBUTaCUC201905）。
1.2 模型制備與手術
磁刺激設備采用重復脈沖磁刺激系統（Rapid2，Magstim，英國），刺激頻率為 0～100 Hz，刺激強度（最大值為 2.2 T）和刺激時間均連續可調，刺激線圈采用中心聚焦性能良好的 8 字型線圈。首先，測量大鼠運動閾值以確定刺激強度，測量結果以 100% 運動閾值作為刺激強度；然后，使用該刺激強度和 5 Hz 刺激頻率對大鼠頭部進行刺激，每天刺激一次，每次 600 個脈沖，每只大鼠刺激 14 d，以此制備 rTMS 組大鼠。在此期間對 control 組進行相同的抓握操作但不接受任何磁刺激。
rTMS 組大鼠制備完畢后，所有大鼠進行 16 通道微電極陣列植入手術。參考大鼠腦立體定位圖譜[21]，使用顱鉆在 PFC 區域上方（以前囟點為原點，向前 2.5～4.5 mm，旁開 0.2～1.0 mm）開一矩形窗，植入微電極陣列，T 迷宮實驗過程中同步記錄大鼠的神經電活動信號。
1.3 T 迷宮實驗
術后恢復 3 d 后，開始對大鼠進行兩天適應性訓練，即讓大鼠在迷宮中自由探索，每天兩次，每次 30 min。適應性訓練完成后開始正式訓練，每天對每只大鼠進行兩組 T 迷宮 WM 任務訓練，每組訓練包含 20 次實驗。每次實驗任務均包括自由選擇和延時交替選擇兩部分。
如圖 1 所示，任務開始前，在 T 迷宮左右兩臂端放置食物；任務開始后，大鼠從起點端出發，首先進行自由選擇，此時大鼠任意進入一個臂端，獲取食物后回到起點，經過 5 s 延遲，重新出發，開始延時交替選擇。圖 1 分別展示了兩種自由選擇情況：① 選擇一：當大鼠在自由選擇階段選擇左臂端，則延時交替選擇階段，應選擇右臂端視為正確執行 WM 任務；② 選擇二：當大鼠在自由選擇階段選擇右臂端，則延時交替階段，應選擇選擇左臂端視為正確執行 WM 任務。一次實驗任務完成以后，大鼠返回到起始區域，準備開始下一次 WM 任務訓練。
圖1
T 迷宮與選擇點示意圖
Figure1.
T-maze and selection point
實驗過程中，記錄行為學數據、LFPs 信號以及經過選擇點的時刻。當大鼠執行 T 迷宮 WM 任務的正確率連續兩天保持在 80% 以上時，認為其“學會”此規則，訓練過程終止。
1.4 數據采集
應用 128 通道神經電生理信號采集系統（OmniPlex，Plexon，美國），設置采樣頻率為 1 kHz，同步采集 rTMS 組和 control 組大鼠在執行 WM 任務時的 16 通道 LFPs 信號的原始數據。所有實驗均在安靜環境下進行。以一只 control 組大鼠為例，16 通道 LFPs 原始數據、θ 頻段（4～12 Hz）和 γ 頻段（30～80 Hz）波形如圖 2 所示。
圖2
16 通道原始數據及各頻段波形示例
Figure2.
Examples of 16-channel raw data and waveform of θ and γ bands
1.5 數據處理與分析
1.5.1 行為學數據
行為學實驗過程中記錄的指標為：每組每天平均正確率和到達“學會”標準的天數。每組每天平均正確率，指的是訓練相同天數時，每組 6 只大鼠的平均正確率；正確率用每天正確的實驗次數和每天實驗的總次數之比表示。達到“學會”的天數，指的是到連續兩天達到 80% 以上正確率的日期距首次訓練日期的天數。
1.5.2 時頻分析
應用短時傅里葉變換（short time fourier transform，STFT）（以符號 STFT 表示）分析實驗所采集到的 LFPs 信號。對于隨時間變化的時域信號 
，
是有限能量信號空間，則該信號不同時刻的 STFT 的集合 
，如式（1）所示：
 |
其中，
是相對連續信號的角頻率，
表示信號輸入的時刻，
表示信號時間，
是對稱的實窗函數，滿足 
，且有 
。
對式（1）等號兩邊分別取模的平方即可得到譜圖，如式（2）所示：
 |
其中，
是對應時域信號 x（t）的譜圖，它能夠反映信號能量的時頻分布。
1.5.3 相干性分析
對于給定的時域信號 
和 
的相干性計算公式，相干性反映出 x 和 y 在頻率上的對應關系，相干值以符號 
表示，如式（3）所示：
 |
其中，f 表示頻率，
和 
分別是 
和 
隨頻率 
變化的功率譜密度函數，
是 x 和 y 隨頻率 f 變化的互譜密度函數，相干值 
大小在 0～1 之間。
1.5.4 統計學分析
本實驗得到的數據均采用 t 檢驗法進行統計學分析，以判斷 rTMS 組和 control 組之間的差異是否具有統計學意義。P < 0.05 時，數據差異具有統計學意義。
2 結果及分析
2.1 大鼠行為學結果
統計兩組大鼠達到“學會”標準的天數，以及所有大鼠每天在 WM 任務實驗中的正確率，數據以均值 ± 標準差表示。連續兩天，rTMS 組大鼠達到“學會”標準的平均正確率分別為：89.17% ± 7.36%、90.00% ± 4.47%；control 組大鼠達到“學會”標準的平均正確率分別為：86.81% ± 6.05%、87.09% ± 4.90%。
如圖 3 所示為兩組大鼠達到“學會”標準的數據對比，rTMS 組平均耗時為（5 ± 1.673）d，control 組大鼠平均耗時為（7.667 ± 2.251）d，t 檢驗結果顯示，rTMS 組大鼠先于 control 組大鼠達到“學會”標準（P < 0.05）。
圖3
兩組大鼠達到“學會”標準的平均天數（*P < 0.05）
Figure3.
The average number of days that the two groups of rats reached the standards（*P < 0.05）
2.2 時頻分析
從每只大鼠的數據中選取 30 次 WM 正確的實驗數據，每組共獲取 30 × 6 = 180 段實驗數據，考察單個電極通道的 LFPs 信號并截取選擇點前后各 2 000 ms（共 4 000 ms）的數據譜圖，得到大鼠 LFPs 信號中 θ 頻段和 γ 頻段的時頻分析結果。將每組 180 段 LFPs 時頻分析結果進行疊加平均，得到不同組別的平均時頻能量結果，rTMS 組和 control 組大鼠在執行 WM 任務時的能量如圖 4 所示。
圖4
rTMS 組和 control 組大鼠 θ 頻段和 γ 頻段的能量譜圖
Figure4.
Spectrum of θ and γ bands of rats in rTMS and control groups
如圖 4 所示，橫軸代表時間，縱軸為各頻段的頻率范圍，顏色代表能量高低，時刻 0 s 為記錄時刻選擇點，用三角形以及黑色實線標出。可以看出，大鼠在執行 WM 任務過程中，在選擇點附近其 θ 頻段和 γ 頻段能量會顯著升高，并且無論是 θ 頻段還是 γ 頻段，rTMS 組大鼠的能量都高于 control 組大鼠。
進一步，分別將兩組大鼠在選擇點前后共 4 000 ms 的時間段內 θ 頻段和 γ 頻段的時頻能量進行平均，得到兩組大鼠的平均時頻能量值，并進行對比分析。
如圖 5 所示，rTMS 組與 control 組大鼠的 θ 頻段平均能量值分別是（0.535 ± 0.021）mV2、（0.406 ± 0.033）mV2，γ 頻段平均能量分別是［（7.556 ± 0.114）× 10?3］mV2、［（7.185 ± 0.114）× 10?3］mV2，t 檢驗結果顯示，rTMS 組大鼠 LFPs 信號中 θ 頻段的能量比 control 組能量高（P < 0.01），γ 頻段的能量比 control 組大鼠 γ 頻段能量高（P < 0.01）。
圖5
rTMS 組和 control 組大鼠在選擇點附近時 θ 頻段和 γ 頻段平均能量對比（**P < 0.01）
Figure5.
The comparison of the average energy of θ band and γ band near the selection point of rats in rTMS and control groups（**P < 0.01）
2.3 相干性分析
選取迷宮選擇點前后各 2 000 ms（共 4 000 ms）時間段的數據進行相干性分析。使用時間長度為 800 ms 的矩形窗把數據分為 5 個不重疊的片段，計算每個片段中每兩個通道之間的相干值，將其作為片段中心時刻的各通道對之間的相干性結果，得到 θ 頻段和 γ 頻段電極對間的相干性動態變化，各組大鼠相干性變化基本一致，因此選取 rTMS 組和 control 組中隨機一只大鼠的單次實驗結果作為代表，如圖 6 所示。
圖6
rTMS 組和 control 組大鼠執行 WM 任務期間 θ 頻段和 γ 頻段電極對間的相干性變化
Figure6.
Coherence of θ and γ band on channel pairs during WM tasks of rats in rTMS and control groups
圖 6 中三角標注的位置是大鼠經過迷宮選擇點的時刻（t = 0 s），矩陣橫軸和縱軸均為電極通道的編號，矩陣顏色表示相干值，顏色越接近紅色，表示兩個通道之間的相干值越大，顏色越接近藍色，表示兩個通道之間的相干值越小，對角線為通道自身與自身的相干值，將其設置為 0。可以看出，無論是 θ 頻段還是 γ 頻段，rTMS 組和 control 組大鼠在執行 WM 任務的過程中相干值都有先升高再降低的趨勢，電極對之間的相干值均在 t = 0 s 附近升高明顯，且相鄰電極對的相干值較高，并且 rTMS 組比 control 組大鼠的相干值更高，變化趨勢更明顯。
為進一步對相干性進行分析，本文還將按照電極對的空間距離將電極對分組比較。本文所用的電極陣列中相鄰兩通道的最短空間距離為 300 μm，若將該距離設為單位 1，其他距離設為其倍數，則對于 2 × 8 的陣列，兩個電極絲之間的距離共有 14 種情況：1、
、2、
、3、
、4、
、5、
、6、
、7、
倍。選取每只大鼠 20 次執行 WM 任務時 t = 0 s 的相干性結果，按上述方法分組后，進行統計分析，分別得到 θ 頻段和 γ 頻段電極對之間的相干性隨空間距離的變化圖。
如圖 7 所示，表示 rTMS 組和 control 組兩組大鼠 θ 和 γ 頻段電極對之間的相干值隨電極距離變化的組間差異，僅在 1 × 300 μm 處標記統計學意義，其余標記省略。可以看出，θ 頻段和 γ 頻段的相干值隨著電極對之間空間距離的增加均呈現出降低的趨勢。同時 t 檢驗的結果顯示，在電極對距離相同的情況下，無論是 θ 頻段還是 γ 頻段的相干值，rTMS 組均高于 control 組（P < 0.01）。
圖7
rTMS 組和 control 組大鼠電極對之間 θ 頻段和 γ 頻段相干性對比的統計結果（**P < 0.01）
Figure7.
Statistic of the pairwise coherence of θ-band and γ-band in rTMS group and control group（**P < 0.01）
3 討論
文中大鼠行為學結果表明，相比于未受任何刺激的正常大鼠，經過 5 Hz 高頻 rTMS 刺激的大鼠達到“學會”標準所需的天數更短。進一步對 LFPs 信號中 θ 頻段和 γ 頻段分析，發現 rTMS 組大鼠在迷宮選擇點附近時，θ 頻段和 γ 頻段的能量均高于 control 組大鼠。LFPs 信號能夠反映出神經元核團中各種神經元放電的總和，已有研究表明，θ 頻段對嚙齒動物的 WM 能力有影響，且對海馬區的相關功能有調制作用，并且前額葉神經元 θ 和 γ 頻段的能量都與學習、記憶等認知功能密切相關[22-23]。Liu 等[24]通過 Y 迷宮實驗證實 θ 頻段振蕩是 PFC 和海馬之間交互的基礎，而且這樣的交互過程利于大鼠在任務中做出正確選擇，并且 Liu 等[25]還發現由 Aβ1-42 誘導的 WM 障礙大鼠模型中，PFC 的 γ 頻段能量以及網絡的功能連接強度降低。PFC 的 θ 和 γ 頻段 LFPs 神經節律能反映 WM 過程中的大腦神經元放電特征，并且由于 PFC 的信息整合功能依賴神經元集群 θ 頻段振蕩模式的放電活動[26]，γ 頻段神經振蕩與認知過程中信息的存儲和提取密切相關，因此本文結果中兩組大鼠正確執行 WM 任務時在迷宮選擇點附近的 θ 頻段和 γ 頻段之間的能量差異，一定程度反映出兩組大鼠 WM 能力的差異。
高頻 rTMS 能夠改變大腦皮層的興奮性，增強突觸可塑性，影響腦內代謝和神經電活動，并且對大腦皮層有持續調節作用。Beynel 等[27]發現 5 Hz 高頻 rTMS 能夠增加正常年輕人和老年人完成視覺 WM 任務的正確率。Guo 等[28]發現用 5 Hz 高頻 rTMS 作用于左側背外側 PFC 能夠改善由睡眠剝奪導致的 WM 障礙。同時，國內外研究者的研究結果表明 rTMS 能夠增強嚙齒類動物的空間 WM 能力[29-31]，Bai 等[32]的研究表明 rTMS 可以恢復大鼠由 Aβ1-42 誘導的 γ 振蕩缺失，從而改善 WM 能力。在 WM 任務過程中，rTMS 組大鼠的 θ 和 γ 兩個頻段的能量增強，反映了高頻 rTMS 對大腦皮層的調節作用，高頻 rTMS 通過改變大腦皮層的興奮性，增強了 θ 和 γ 兩個頻段的神經電活動，進而影響了與認知功能相關的神經信息活動，增強了 WM 能力。
相干性通常反映出兩組神經信號之間同步的關系，若 LFPs 信號之間在某頻段內相干值高，則說明不同腦區間或同一腦區之間神經元集群之間的某種協同作用明顯[33]，并且神經信號的相干性被廣泛用于觀察腦疾病患者與正常人的差異[34]。Bygrave 等[35]證實了海馬區和 PFC 的 θ 頻段和 γ 頻段相干性可預測小鼠的 WM 性能并能調節選擇性注意。從相干性分析的結果來看，電極對的相干性隨著它們的空間距離增大而減小，可能是因為同一腦區內短距離的神經元之間有更多的信息交互，遠距離的神經元之間的同步協同作用相對越少。同時，在電極對距離相同的情況下，發現 rTMS 組比 control 組的相干性高，空間距離最遠的兩個電極之間的相干性也表現出相同的差異，說明 rTMS 增加了大鼠 θ 頻段和 γ 頻段相干性，增加了同一腦區相同神經元集群之間的協同作用，進而影響了大鼠的 WM 能力。Sharma 等[33]的實驗結果認為 3.12 mm［相干性 =（0.26 ± 0.03）］以內的電極對有較好的相干性，本文實驗結果均符合該尺度下的相干性結論，但是討論電極通道之間相干性和空間尺度之間關系的文獻較少，未能得出十分明確的結果。
基于以上討論，5 Hz 的 rTMS 的作用可以使得大鼠 PFC 的神經元集群活動增加，能夠正向影響大鼠 WM 能力。由于 rTMS 設備可以在刺激強度、刺激頻率和刺激時長等多參數進行設置，并對大腦的神經元信號產生不同的調節作用，在今后的研究中，可以從多參數優化的角度研究 rTMS 作用對大腦的神經調節機制，進而為神經疾病的有效治療和 TMS 設備的合理應用提供重要的參考價值。
4 結論
本實驗采用在體多通道電生理記錄技術，實時采集經過 5 Hz 高頻 rTMS 刺激大鼠和未經過任何刺激大鼠在 WM 過程中的神經電活動，并對信號進行處理分析。統計分析得出 rTMS 組執行 T 迷宮任務達到“學會”標準所需的天數少于 control 組。時頻分析的結果表明，經過 5 Hz 高頻 rTMS 刺激后的大鼠在選擇點處 θ 頻段和 γ 頻段的能量均高于 control 組大鼠，相干性分析的結果也與時頻分析的結果對應，rTMS 刺激后的大鼠在選擇點處 θ 頻段和 γ 頻段的相干性均高于 control 組大鼠。
通過移動窗口的方法對數據進行了相干性分析，得到了不同電極對間的相干性在大鼠 WM 過程中動態變化的結果，發現兩組大鼠在選擇點附近的相干性略有升高，電極對之間的相干性隨電極對的空間距離增大而降低，而且 rTMS 組兩個頻段的相干性值均高于 control 組。綜上所述，5 Hz 的 rTMS 刺激影響了大鼠的神經元放電的同步性，一定程度上提高了正常大鼠的 WM 能力。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
電磁刺激能夠調節神經元的興奮性，目前已逐漸從實驗室研究走向臨床應用。經顱磁刺激（transcranial magnetic stimulation，TMS）是一種無痛、非侵入式的神經調控技術，在認知神經科學以及臨床神經功能調控領域發揮著巨大作用。TMS 能夠利用脈沖電流產生的時變磁場在腦組織內產生感應電場，從而調節神經元興奮性，實現對特定腦功能皮層的刺激，起到改善人或動物認知功能的作用[1-3]。重復經顱磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）是重要的 TMS 刺激模式，不同頻率參數的 rTMS 會產生不同的神經生理效應：低頻刺激（< 1 Hz）會引起短暫的運動皮質抑制[4]，高頻刺激（> 1 Hz）則引起持久的皮質興奮[5]。靳靜娜等[6]通過探討靜息態腦網絡的影響，驗證了 rTMS 聯合運動訓練能改善人的運動神經系統。Kamp 等[7]對精神分裂癥患者實施高頻的 rTMS，并對頭皮腦電圖（electroencephalograph，EEG）數據進行分析，結果表明刺激后前額葉 EEG 信號中的 δ 頻段的活動顯著減少，同時患者面部識別能力增強。Lee 等[8]發現長期的高頻 rTMS 和認知訓練能夠有效改善阿爾茨海默癥患者的工作記憶（working memory，WM）障礙。以上研究表明高頻 rTMS 能夠通過調節神經電活動，進而有針對性的改善神經系統功能。
WM 是認知心理學中的重要概念，對于推理并指導決策和行為十分重要[9]。阿爾茨海默癥、精神分裂癥等神經精神類疾病的主要臨床癥狀表現為 WM 障礙。WM 是較為復雜的認知過程，需要大量神經元協同配合，通過植入式微電極采集并記錄大腦皮層、亞皮層或核團等區域記錄的局部場電位（local field potentials，LFPs），可以反映神經元局部網絡的興奮[10]。與頭皮 EEG 數據相比，LFPs 具有更好的行為特異性和空間分辨率。LFPs 信號頻率特征明顯，不同頻段的神經節律參與了不同類型的生理活動[11]。WM 的主要責任腦區之一為前額葉皮層（prefrontal cortex，PFC），近年來大量研究表明，大鼠 PFC 的損傷會引起認知功能障礙，導致大鼠執行 WM 相關任務時正確率顯著降低[12-13]，同時 PFC 的 θ 頻段（4～12 Hz）和 γ 頻段（30～80 Hz）的神經節律活動與嚙齒類動物 WM 密切相關[14-16]。一些研究者利用多通道技術對 WM 研究結果表明，在 Y 迷宮實驗任務過程中，小鼠 PFC 和海馬區 LFPs 信號的 θ 頻段相干性增強，說明 θ 頻段活動在 WM 任務的執行過程中起到了重要作用[17]。此外還有很多研究表明，γ 頻段的活動也參與了 WM 的編碼[17-18]。
目前 rTMS 被廣泛應用于神經功能調控和精神疾病治療等領域，但其是如何參與調節大腦神經生理機制的尚不清楚。研究表明，高頻 rTMS 能夠對神經節律產生影響，從而改善阿爾茨海默癥患者的 WM 障礙[19-20]。因此研究 rTMS 對大腦神經節律活動的影響，有望為進一步探索高頻 rTMS 調節大腦神經的生理機制提供理論支持，對神經疾病的治療和 TMS 設備的臨床應用具有重要意義。
本文以成年威斯塔（Wistar）大鼠為研究對象，將其隨機分為 rTMS 模型組（rTMS 組）和空白對照組（control 組）。然后，對兩組大鼠的 PFC 區域進行慢性電極植入手術，待恢復良好后進行 T 迷宮 WM 任務訓練，同時采集大鼠在此自由活動狀態下的 LFPs，并記錄其行為學狀態。通過對比分析兩組大鼠行為學和在此期間神經電生理信號的能量和同步性差異，探究 rTMS 對大鼠 WM 的影響，進而為探索 rTMS 調節大腦神經活動的生理機制以及促進 TMS 設備的參數優化起到積極作用，并具有一定的參考價值。
1 材料和方法
1.1 實驗動物
本文實驗動物為雄性 Wistar 大鼠（8～9 周齡，體重 300 g），采購于北京維通利華公司。將實驗 Wistar 大鼠隨機分為兩組：rTMS 組和 control 組，每組 6 只。本實驗所有程序均已由河北工業大學生物醫學倫理委員會審查通過（審查編號：HEBUTaCUC201905）。
1.2 模型制備與手術
磁刺激設備采用重復脈沖磁刺激系統（Rapid2，Magstim，英國），刺激頻率為 0～100 Hz，刺激強度（最大值為 2.2 T）和刺激時間均連續可調，刺激線圈采用中心聚焦性能良好的 8 字型線圈。首先，測量大鼠運動閾值以確定刺激強度，測量結果以 100% 運動閾值作為刺激強度；然后，使用該刺激強度和 5 Hz 刺激頻率對大鼠頭部進行刺激，每天刺激一次，每次 600 個脈沖，每只大鼠刺激 14 d，以此制備 rTMS 組大鼠。在此期間對 control 組進行相同的抓握操作但不接受任何磁刺激。
rTMS 組大鼠制備完畢后，所有大鼠進行 16 通道微電極陣列植入手術。參考大鼠腦立體定位圖譜[21]，使用顱鉆在 PFC 區域上方（以前囟點為原點，向前 2.5～4.5 mm，旁開 0.2～1.0 mm）開一矩形窗，植入微電極陣列，T 迷宮實驗過程中同步記錄大鼠的神經電活動信號。
1.3 T 迷宮實驗
術后恢復 3 d 后，開始對大鼠進行兩天適應性訓練，即讓大鼠在迷宮中自由探索，每天兩次，每次 30 min。適應性訓練完成后開始正式訓練，每天對每只大鼠進行兩組 T 迷宮 WM 任務訓練，每組訓練包含 20 次實驗。每次實驗任務均包括自由選擇和延時交替選擇兩部分。
如圖 1 所示，任務開始前，在 T 迷宮左右兩臂端放置食物；任務開始后，大鼠從起點端出發，首先進行自由選擇，此時大鼠任意進入一個臂端，獲取食物后回到起點，經過 5 s 延遲，重新出發，開始延時交替選擇。圖 1 分別展示了兩種自由選擇情況：① 選擇一：當大鼠在自由選擇階段選擇左臂端，則延時交替選擇階段，應選擇右臂端視為正確執行 WM 任務；② 選擇二：當大鼠在自由選擇階段選擇右臂端，則延時交替階段，應選擇選擇左臂端視為正確執行 WM 任務。一次實驗任務完成以后，大鼠返回到起始區域，準備開始下一次 WM 任務訓練。
圖1
T 迷宮與選擇點示意圖
Figure1.
T-maze and selection point
實驗過程中，記錄行為學數據、LFPs 信號以及經過選擇點的時刻。當大鼠執行 T 迷宮 WM 任務的正確率連續兩天保持在 80% 以上時，認為其“學會”此規則，訓練過程終止。
1.4 數據采集
應用 128 通道神經電生理信號采集系統（OmniPlex，Plexon，美國），設置采樣頻率為 1 kHz，同步采集 rTMS 組和 control 組大鼠在執行 WM 任務時的 16 通道 LFPs 信號的原始數據。所有實驗均在安靜環境下進行。以一只 control 組大鼠為例，16 通道 LFPs 原始數據、θ 頻段（4～12 Hz）和 γ 頻段（30～80 Hz）波形如圖 2 所示。
圖2
16 通道原始數據及各頻段波形示例
Figure2.
Examples of 16-channel raw data and waveform of θ and γ bands
1.5 數據處理與分析
1.5.1 行為學數據
行為學實驗過程中記錄的指標為：每組每天平均正確率和到達“學會”標準的天數。每組每天平均正確率，指的是訓練相同天數時，每組 6 只大鼠的平均正確率；正確率用每天正確的實驗次數和每天實驗的總次數之比表示。達到“學會”的天數，指的是到連續兩天達到 80% 以上正確率的日期距首次訓練日期的天數。
1.5.2 時頻分析
應用短時傅里葉變換（short time fourier transform，STFT）（以符號 STFT 表示）分析實驗所采集到的 LFPs 信號。對于隨時間變化的時域信號 ，是有限能量信號空間，則該信號不同時刻的 STFT 的集合 ，如式（1）所示：
|
其中， 是相對連續信號的角頻率， 表示信號輸入的時刻， 表示信號時間，是對稱的實窗函數，滿足 ，且有 。
對式（1）等號兩邊分別取模的平方即可得到譜圖，如式（2）所示：
|
其中，是對應時域信號 x（t）的譜圖，它能夠反映信號能量的時頻分布。
1.5.3 相干性分析
對于給定的時域信號 和 的相干性計算公式，相干性反映出 x 和 y 在頻率上的對應關系，相干值以符號 表示，如式（3）所示：
|
其中，f 表示頻率，和 分別是 和 隨頻率 變化的功率譜密度函數，是 x 和 y 隨頻率 f 變化的互譜密度函數，相干值 大小在 0～1 之間。
1.5.4 統計學分析
本實驗得到的數據均采用 t 檢驗法進行統計學分析，以判斷 rTMS 組和 control 組之間的差異是否具有統計學意義。P < 0.05 時，數據差異具有統計學意義。
2 結果及分析
2.1 大鼠行為學結果
統計兩組大鼠達到“學會”標準的天數，以及所有大鼠每天在 WM 任務實驗中的正確率，數據以均值 ± 標準差表示。連續兩天，rTMS 組大鼠達到“學會”標準的平均正確率分別為：89.17% ± 7.36%、90.00% ± 4.47%；control 組大鼠達到“學會”標準的平均正確率分別為：86.81% ± 6.05%、87.09% ± 4.90%。
如圖 3 所示為兩組大鼠達到“學會”標準的數據對比，rTMS 組平均耗時為（5 ± 1.673）d，control 組大鼠平均耗時為（7.667 ± 2.251）d，t 檢驗結果顯示，rTMS 組大鼠先于 control 組大鼠達到“學會”標準（P < 0.05）。
圖3
兩組大鼠達到“學會”標準的平均天數（*P < 0.05）
Figure3.
The average number of days that the two groups of rats reached the standards（*P < 0.05）
2.2 時頻分析
從每只大鼠的數據中選取 30 次 WM 正確的實驗數據，每組共獲取 30 × 6 = 180 段實驗數據，考察單個電極通道的 LFPs 信號并截取選擇點前后各 2 000 ms（共 4 000 ms）的數據譜圖，得到大鼠 LFPs 信號中 θ 頻段和 γ 頻段的時頻分析結果。將每組 180 段 LFPs 時頻分析結果進行疊加平均，得到不同組別的平均時頻能量結果，rTMS 組和 control 組大鼠在執行 WM 任務時的能量如圖 4 所示。
圖4
rTMS 組和 control 組大鼠 θ 頻段和 γ 頻段的能量譜圖
Figure4.
Spectrum of θ and γ bands of rats in rTMS and control groups
如圖 4 所示，橫軸代表時間，縱軸為各頻段的頻率范圍，顏色代表能量高低，時刻 0 s 為記錄時刻選擇點，用三角形以及黑色實線標出。可以看出，大鼠在執行 WM 任務過程中，在選擇點附近其 θ 頻段和 γ 頻段能量會顯著升高，并且無論是 θ 頻段還是 γ 頻段，rTMS 組大鼠的能量都高于 control 組大鼠。
進一步，分別將兩組大鼠在選擇點前后共 4 000 ms 的時間段內 θ 頻段和 γ 頻段的時頻能量進行平均，得到兩組大鼠的平均時頻能量值，并進行對比分析。
如圖 5 所示，rTMS 組與 control 組大鼠的 θ 頻段平均能量值分別是（0.535 ± 0.021）mV2、（0.406 ± 0.033）mV2，γ 頻段平均能量分別是［（7.556 ± 0.114）× 10?3］mV2、［（7.185 ± 0.114）× 10?3］mV2，t 檢驗結果顯示，rTMS 組大鼠 LFPs 信號中 θ 頻段的能量比 control 組能量高（P < 0.01），γ 頻段的能量比 control 組大鼠 γ 頻段能量高（P < 0.01）。
圖5
rTMS 組和 control 組大鼠在選擇點附近時 θ 頻段和 γ 頻段平均能量對比（**P < 0.01）
Figure5.
The comparison of the average energy of θ band and γ band near the selection point of rats in rTMS and control groups（**P < 0.01）
2.3 相干性分析
選取迷宮選擇點前后各 2 000 ms（共 4 000 ms）時間段的數據進行相干性分析。使用時間長度為 800 ms 的矩形窗把數據分為 5 個不重疊的片段，計算每個片段中每兩個通道之間的相干值，將其作為片段中心時刻的各通道對之間的相干性結果，得到 θ 頻段和 γ 頻段電極對間的相干性動態變化，各組大鼠相干性變化基本一致，因此選取 rTMS 組和 control 組中隨機一只大鼠的單次實驗結果作為代表，如圖 6 所示。
圖6
rTMS 組和 control 組大鼠執行 WM 任務期間 θ 頻段和 γ 頻段電極對間的相干性變化
Figure6.
Coherence of θ and γ band on channel pairs during WM tasks of rats in rTMS and control groups
圖 6 中三角標注的位置是大鼠經過迷宮選擇點的時刻（t = 0 s），矩陣橫軸和縱軸均為電極通道的編號，矩陣顏色表示相干值，顏色越接近紅色，表示兩個通道之間的相干值越大，顏色越接近藍色，表示兩個通道之間的相干值越小，對角線為通道自身與自身的相干值，將其設置為 0。可以看出，無論是 θ 頻段還是 γ 頻段，rTMS 組和 control 組大鼠在執行 WM 任務的過程中相干值都有先升高再降低的趨勢，電極對之間的相干值均在 t = 0 s 附近升高明顯，且相鄰電極對的相干值較高，并且 rTMS 組比 control 組大鼠的相干值更高，變化趨勢更明顯。
為進一步對相干性進行分析，本文還將按照電極對的空間距離將電極對分組比較。本文所用的電極陣列中相鄰兩通道的最短空間距離為 300 μm，若將該距離設為單位 1，其他距離設為其倍數，則對于 2 × 8 的陣列，兩個電極絲之間的距離共有 14 種情況：1、、2、、3、、4、、5、、6、、7、倍。選取每只大鼠 20 次執行 WM 任務時 t = 0 s 的相干性結果，按上述方法分組后，進行統計分析，分別得到 θ 頻段和 γ 頻段電極對之間的相干性隨空間距離的變化圖。
如圖 7 所示，表示 rTMS 組和 control 組兩組大鼠 θ 和 γ 頻段電極對之間的相干值隨電極距離變化的組間差異，僅在 1 × 300 μm 處標記統計學意義，其余標記省略。可以看出，θ 頻段和 γ 頻段的相干值隨著電極對之間空間距離的增加均呈現出降低的趨勢。同時 t 檢驗的結果顯示，在電極對距離相同的情況下，無論是 θ 頻段還是 γ 頻段的相干值，rTMS 組均高于 control 組（P < 0.01）。
圖7
rTMS 組和 control 組大鼠電極對之間 θ 頻段和 γ 頻段相干性對比的統計結果（**P < 0.01）
Figure7.
Statistic of the pairwise coherence of θ-band and γ-band in rTMS group and control group（**P < 0.01）
3 討論
文中大鼠行為學結果表明，相比于未受任何刺激的正常大鼠，經過 5 Hz 高頻 rTMS 刺激的大鼠達到“學會”標準所需的天數更短。進一步對 LFPs 信號中 θ 頻段和 γ 頻段分析，發現 rTMS 組大鼠在迷宮選擇點附近時，θ 頻段和 γ 頻段的能量均高于 control 組大鼠。LFPs 信號能夠反映出神經元核團中各種神經元放電的總和，已有研究表明，θ 頻段對嚙齒動物的 WM 能力有影響，且對海馬區的相關功能有調制作用，并且前額葉神經元 θ 和 γ 頻段的能量都與學習、記憶等認知功能密切相關[22-23]。Liu 等[24]通過 Y 迷宮實驗證實 θ 頻段振蕩是 PFC 和海馬之間交互的基礎，而且這樣的交互過程利于大鼠在任務中做出正確選擇，并且 Liu 等[25]還發現由 Aβ1-42 誘導的 WM 障礙大鼠模型中，PFC 的 γ 頻段能量以及網絡的功能連接強度降低。PFC 的 θ 和 γ 頻段 LFPs 神經節律能反映 WM 過程中的大腦神經元放電特征，并且由于 PFC 的信息整合功能依賴神經元集群 θ 頻段振蕩模式的放電活動[26]，γ 頻段神經振蕩與認知過程中信息的存儲和提取密切相關，因此本文結果中兩組大鼠正確執行 WM 任務時在迷宮選擇點附近的 θ 頻段和 γ 頻段之間的能量差異，一定程度反映出兩組大鼠 WM 能力的差異。
高頻 rTMS 能夠改變大腦皮層的興奮性，增強突觸可塑性，影響腦內代謝和神經電活動，并且對大腦皮層有持續調節作用。Beynel 等[27]發現 5 Hz 高頻 rTMS 能夠增加正常年輕人和老年人完成視覺 WM 任務的正確率。Guo 等[28]發現用 5 Hz 高頻 rTMS 作用于左側背外側 PFC 能夠改善由睡眠剝奪導致的 WM 障礙。同時，國內外研究者的研究結果表明 rTMS 能夠增強嚙齒類動物的空間 WM 能力[29-31]，Bai 等[32]的研究表明 rTMS 可以恢復大鼠由 Aβ1-42 誘導的 γ 振蕩缺失，從而改善 WM 能力。在 WM 任務過程中，rTMS 組大鼠的 θ 和 γ 兩個頻段的能量增強，反映了高頻 rTMS 對大腦皮層的調節作用，高頻 rTMS 通過改變大腦皮層的興奮性，增強了 θ 和 γ 兩個頻段的神經電活動，進而影響了與認知功能相關的神經信息活動，增強了 WM 能力。
相干性通常反映出兩組神經信號之間同步的關系，若 LFPs 信號之間在某頻段內相干值高，則說明不同腦區間或同一腦區之間神經元集群之間的某種協同作用明顯[33]，并且神經信號的相干性被廣泛用于觀察腦疾病患者與正常人的差異[34]。Bygrave 等[35]證實了海馬區和 PFC 的 θ 頻段和 γ 頻段相干性可預測小鼠的 WM 性能并能調節選擇性注意。從相干性分析的結果來看，電極對的相干性隨著它們的空間距離增大而減小，可能是因為同一腦區內短距離的神經元之間有更多的信息交互，遠距離的神經元之間的同步協同作用相對越少。同時，在電極對距離相同的情況下，發現 rTMS 組比 control 組的相干性高，空間距離最遠的兩個電極之間的相干性也表現出相同的差異，說明 rTMS 增加了大鼠 θ 頻段和 γ 頻段相干性，增加了同一腦區相同神經元集群之間的協同作用，進而影響了大鼠的 WM 能力。Sharma 等[33]的實驗結果認為 3.12 mm［相干性 =（0.26 ± 0.03）］以內的電極對有較好的相干性，本文實驗結果均符合該尺度下的相干性結論，但是討論電極通道之間相干性和空間尺度之間關系的文獻較少，未能得出十分明確的結果。
基于以上討論，5 Hz 的 rTMS 的作用可以使得大鼠 PFC 的神經元集群活動增加，能夠正向影響大鼠 WM 能力。由于 rTMS 設備可以在刺激強度、刺激頻率和刺激時長等多參數進行設置，并對大腦的神經元信號產生不同的調節作用，在今后的研究中，可以從多參數優化的角度研究 rTMS 作用對大腦的神經調節機制，進而為神經疾病的有效治療和 TMS 設備的合理應用提供重要的參考價值。
4 結論
本實驗采用在體多通道電生理記錄技術，實時采集經過 5 Hz 高頻 rTMS 刺激大鼠和未經過任何刺激大鼠在 WM 過程中的神經電活動，并對信號進行處理分析。統計分析得出 rTMS 組執行 T 迷宮任務達到“學會”標準所需的天數少于 control 組。時頻分析的結果表明，經過 5 Hz 高頻 rTMS 刺激后的大鼠在選擇點處 θ 頻段和 γ 頻段的能量均高于 control 組大鼠，相干性分析的結果也與時頻分析的結果對應，rTMS 刺激后的大鼠在選擇點處 θ 頻段和 γ 頻段的相干性均高于 control 組大鼠。
通過移動窗口的方法對數據進行了相干性分析，得到了不同電極對間的相干性在大鼠 WM 過程中動態變化的結果，發現兩組大鼠在選擇點附近的相干性略有升高，電極對之間的相干性隨電極對的空間距離增大而降低，而且 rTMS 組兩個頻段的相干性值均高于 control 組。綜上所述，5 Hz 的 rTMS 刺激影響了大鼠的神經元放電的同步性，一定程度上提高了正常大鼠的 WM 能力。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
