為探討方格星蟲水提物（SNE）促進小鼠皮膚創傷愈合的活性及其機制，測定 SNE 的止血作用，建立小鼠全皮層創傷模型，觀察傷口愈合形態并測定愈合率；采用蘇木素-伊紅（HE）、馬森（Masson）染色、透射電鏡（TEM）觀察創面的組織結構；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測細胞因子及其相關蛋白的表達水平。結果顯示，SNE 具有止血作用，能明顯提高小鼠創傷愈合率并縮短掉痂時間（P < 0.05）。研究中，SNE 組小鼠表皮生長完全、創面毛細血管和膠原纖維增生明顯優于空白（NT）組；第 7 d，SNE 明顯降低白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和轉化生長因子-β1（TGF-β1）的表達水平（P < 0.05）；第 28 d，相比于 NT 組，SNE 組的 Smad7 表達水平上調，TGF-β II 型受體（TGF-βRII）、I 型膠原蛋白（COL1A1）和 α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達水平下調，差異具有統計學意義（P < 0.05），而與云南白藥組（PC 組）的差異無統計學意義（P > 0.05）。結果表明，SNE 具有促進傷口愈合活性和抑制增生性瘢痕生成作用，其作用機制與止血、調節炎癥因子、促進膠原纖維重塑以及調控 TGF-β/Smads 信號通路傳導有密切關聯。SNE 作為皮膚創傷修復和抑制瘢痕制劑，具有潛在的臨床應用價值。
引用本文： 鄭志鴻, 章超樺, 林海生, 曾少葵, 秦小明, 曹文紅, 陳海源. 方格星蟲水提物促小鼠皮膚創傷愈合及作用機制的研究. 生物醫學工程學雜志, 2020, 37(3): 460-468, 479. doi: 10.7507/1001-5515.201908008 復制
引言
皮膚是人體最大的器官，其主要功能是隔絕機體與外界環境，形成一層對人體的保護屏障[1]。如果受損的皮膚不能及時修復，創面很容易受到感染，嚴重的創傷甚至危及生命。瘢痕（Scar）是機體創傷愈合的必然產物，但如果瘢痕增生過度，則引起外形及功能異常而產生增生性瘢痕（hyperplasia scar，HS），給患者的身心健康帶來嚴重的影響。因而，不斷探索新型創傷修復活性物質受到創傷修復領域的廣泛關注。創傷愈合主要包含止血凝血期、炎癥期、增殖期和組織重塑期四個時期[2]。在機體遭受創傷后，血小板激活，分泌相關細胞因子促使血液凝集止血，同時刺激機體產生炎癥反應[3]。進入炎癥期，炎癥細胞吞噬清除機體中的污染物，分泌各種細胞因子刺激成纖維細胞（fibroblast，FB）分裂、合成膠原[4]。增殖期，FB 產生膠原蛋白、纖維連接蛋白（fibronectin，FN）等細胞外基質（extracellular matrix，ECM）成分，合成肉芽組織，同時分化為肌成纖維細胞（myofibroblast，MFB），再上皮化和傷口收縮，而內皮細胞則完成創面的血管再生[2, 4]。組織重塑期，在免疫細胞、神經細胞及多種生長因子的共同調節下，基質蛋白和結締組織不斷進行合成和分解，最后完成組織重建、傷口收縮、瘢痕形成及功能恢復等過程[4-5]。在皮膚創傷愈合整個過程中，各類因子與 ECM 協同發揮修復功能，包括促炎因子白細胞介素-β（interleukin-β，IL-β）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、轉化生長因子-β（transforming growth factor alpha，TGF-β）、TGF-α 等[4]。其中，TGF-β1 是纖維化疾病的重要影響因子，通過 TGF-β/Smads 信號通路轉導，主導創傷早期炎性反應、創面愈合及后期病理性瘢痕的形成。該途徑受多種因子調控，如 TGF-β II 型受體（type II TGF-β receptors，TGF-βRII）、Smads 家族蛋白等。因而，研究 TGF-β/Smads 信號轉導，可為臨床創傷愈合及病理性瘢痕的防治奠定理論基礎[6]。
目前，市面上促傷口愈合的藥物和保健品主要根據傷口愈合的四個時期來設計的，如止血藥、抗菌藥、抗炎藥或者促進膠原蛋白合成藥等。按來源分，主要有中草藥、化學藥品、基因工程藥品及海洋藥物等，其中中草藥居多，而海洋來源藥物和保健品占很小一部分。因此，開發能促進創傷愈合和預防病理性瘢痕形成的海洋活性物質成為創傷領域關注的焦點[4]。
方格星蟲（Sipunculus nudus）是一種經濟底棲生物，其營養豐富，半必需氨基酸精氨酸含量極高[7]，而精氨酸具有促進傷口愈合的功能[8]。目前，已有研究報道表明方格星蟲有抗氧化、抗疲勞、抗輻射、延緩衰老、抗病毒[9]、調節免疫[10]、抗菌[11]、抗炎和外周鎮痛[12]等功效。其中，免疫調節、抗菌和抗炎功效與傷口愈合聯系比較密切。另有研究報道，同是星蟲的可口革囊星蟲的膠原蛋白具有促進傷口愈合的作用[13]。前期研究發現方格星蟲酶解物具有創傷修復功效，但其機制尚不明確[14]。本研究主要采用小鼠皮膚創傷模型以驗證方格星蟲水提物（Sipunculus nudus extract，SNE）促傷口愈合的作用，在此基礎上，從創傷愈合的四個時期進行相關機制探究，為豐富傷口愈合領域的機制探索，同時更好地開發利用星蟲資源，提高其附加值奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物與原料
本研究選取由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供的無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級昆明（kunming，KM）小鼠作為實驗動物，體重（28.0 ± 2.0）g，合格證編號為：11 401 500 055 889，實驗單位使用許可證編號為：SYXK（粵）20 140 053。
飼養條件：（25 ± 2）℃ 日常飼養，相對濕度為 40%～60%，自由飲水、進食，每日光照 12 h、避光 12 h。本研究所有動物實驗方案均經廣東海洋大學倫理委員會審核批準，所有實驗均按照實驗動物管理和使用指南進行[15]，實驗動物使用許可證號為 SCXK（京）20 160 002。
新鮮方格星蟲，直徑（5 ± 2）mm、長（10 ± 2）cm，購于湛江市東風市場，去除內臟和體腔液，體腔壁用蒸餾水洗凈、瀝干，分裝后置于?20℃ 貯藏。
1.1.2 試劑
云南白藥粉作為陽性對照（positive control，PC）試劑，產品批號：ZBA1512，國藥準字 Z53020798，購自云南白藥集團股份有限公司；焦碳酸二乙酯水，購自上海碧云天生物技術有限公司；核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取試劑盒、RNA 逆轉錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒，購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒、馬森（Masson）染色液試劑盒，購自上海博谷生物科技有限公司；4% 多聚甲醛、水合氯醛、無水乙醇、丙酮，購自國藥集團化學試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、2.5% 戊二醛（電鏡專用）、1% 鋨酸、環氧樹脂，購自北京中興百瑞技術有限公司。
1.2 儀器
本研究所用儀器包括：多功能全自動酶標儀（Thermo Varioskan Flash，Thermo Fisher Scientific Inc.，美國）、高速落地離心機（Thermo Lynx6 000，Thermo Fisher Scientific Inc.，美國）、切片機（RM2 015，Leica Inc.，德國）、超薄切片機（EMUC7，Leica Inc.，德國）、倒置熒光顯微鏡（DMI4 000，Leica Inc.，德國）、透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）（TecnaiG2 20 TWIN，FEI Inc.，美國）、qRT-PCR 儀（CFX96Touch，Bio-Rad Inc.，美國）。
1.3 實驗方法
1.3.1 SNE 的提取工藝
將方格星蟲沖洗、打碎、充分均漿，按照料液比 1：3 加水，調節 pH 為 7.0 后，置于 55℃ 恒溫攪拌水浴鍋，提取 5 h，100℃ 滅菌，8 000 g 離心 20 min，取上清液旋轉蒸發濃縮，冷凍干燥得 SNE。
1.3.2 SNE 的體外止血實驗研究
將 18 只 KM 小鼠隨機分為 3 組：空白（none-treatment，NT）組、SNE 組和 PC 組，每組 6 只。用 250 mg/kg 水合氯醛對 KM 小鼠進行腹腔注射，輕微麻醉，于固定容器中露出尾巴，在距尾端 0.4 cm 處進行斷尾處理，SNE 組和 PC 組分別用消毒棉簽各蘸取 SNE 和云南白藥，按 1 g/kg 給藥，NT 組不予給藥。計時后，每隔 5 s 用濾紙吸取血滴，當濾紙不再粘有血跡后，記下血液停止流出的時間。
1.3.3 建立傷口模型和給藥
將 84 只 KM 小鼠隨機分為 3 組：NT 組、SNE 組和 PC 組，每組 28 只。每只老鼠用 350 mg/kg 水合氯醛麻醉，背部皮膚脫毛消毒后，用直徑 8 mm 打孔器在鼠背部打一個圓孔，切取全層皮膚，深至筋膜，每只動物分籠飼養。NT 組每天不予處理；SNE 組，以無菌水配制 SNE 膏狀物（總氮含量為 2 g/mL），每只小鼠涂抹 60 mg 藥膏；PC 組，每只小鼠各涂抹 30 mg 云南白藥粉。每天給藥一次，連續給藥 28 d。每兩天固定高度拍照一次，用圖像處理軟件 Image J（National Institutes of Health，美國）分析計算傷口愈合率、觀察掉痂時間以及傷口瘢痕形成情況，傷口愈合率計算公式如（1）所示：
 |
式中，S0 是 0 d 傷口面積，SN 是 N d 傷口面積，單位：mm2，其中 N = 0，2，4，
，28。
1.3.4 傷口組織病理學分析
在造模后第 14、21、28 d，每組每次分別處死 7 只 KM 小鼠，沿傷口外周 3 mm，取全層皮膚，從正中間分成兩半，分別用 4% 多聚甲醛固定過夜，經脫水、包埋，制成石蠟切片，一半用于 HE 染色，另一半用于 Masson 染色。第 14 d 和 28 d 取傷口處皮膚，也用 HE 染色，用于測定表皮厚度指數和表皮薄厚比，計算公式如式（2）和式（3）所示。第 14、21、28 d 的傷口皮膚用 Masson 染色，用于觀察傷口的膠原合成與沉積、血管生成、毛囊和汗腺等皮膚附屬器的生成情況。
 |
 |
式中，
是傷口處上皮平均厚度，
是正常皮膚平均厚度，
表示傷口表皮薄處厚度平均值，
表示傷口表皮厚處厚度平均值，單位：μm。
1.3.5 qRT-PCR 分析
采用 qRT-PCR 試劑盒檢測給藥第 7 d 后小鼠創傷皮膚中 TNF-α、IL-1β、TGF-β1 的信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）表達水平；檢測第 14、21、28 d 創面中 I 型膠原蛋白（collagen I，COL1A1）以及第 28 d 創面中 TGF-β1、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、TGF-βRII 和 Smad7 蛋白的 mRNA 水平。用 RNA 提取試劑盒提取皮膚傷口的總 RNA，用 RNA 逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應，用 qRT-PCR 試劑盒定量分析。反應條件為：95℃、30 s；95℃、5 s；60℃、30 s，共 40 個循環。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase，GAPDH）作為內參基因，用于校正計算靶基因的表達水平，使用 2-??CT 方法進行計算。相關引物信息如表 1 所示。
表1
qRT-PCR 引物
Table1.
Primers used for qRT-PCR analysis
1.3.6 膠原纖維 TEM 分析
取造模后第 21 d 的皮膚傷口組織放入 2.5% 戊二醛，4℃ 過夜固定，PBS 漂洗 3 次，4℃ 預冷的 1% 鋨酸固定 2～3 h，PBS 浸洗 3 次，每次 20 min。按梯度 30%、50%、70%、80%、85%、90%、95%、100% 乙醇脫水 15 min，100% 乙醇徹底脫水 2 次，每次 10 min。接著用丙酮：環氧樹脂（2∶1）、丙酮：環氧樹脂（1∶1）、環氧樹脂，于 37℃ 恒溫箱依次進行滲透，每次 12 h。包埋、固化、修塊和染色后，于 200 kV 加速電壓觀察，放大倍率 5 000×，測量每個膠原纖維的直徑。
1.3.7 數據統計與分析
數據分析、圖片處理和作圖分別采用統計學軟件 JMP10（SAS Inc.，美國）、圖像處理軟件 Image J（National Institutes of Health，美國）和科技作圖軟件 Origin9.0（OriginLab Inc.，美國）。用最小二乘均值 t 檢驗分析組間差異，結果以均值 ± 標準差表示，P < 0.05 為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 止血作用分析
如圖 1 所示，NT 組、SNE 組和 PC 組止血時間分別為（186.6 ± 22.6）、（132.0 ± 23.5）、（113.6 ± 20.4）s。與 NT 組相比，SNE 組止血時間明顯降低（P < 0.01）。SNE 組和 PC 組表現出相似的止血效果，止血時間的差異無統計學意義（P > 0.05）。
圖1
SNE 對小鼠尾部出血時間的影響（n = 6，* P < 0.05， ** P < 0.01）
Figure1.
Effects of SNE treatment on tail bleeding time in mice (n = 6, * P < 0.05, ** P < 0.01)
2.2 創面愈合觀察
各組創面隨時間變化愈合情況如圖 2 所示，相比 NT 組，SNE 組愈合效果明顯，特別是第 28 d，SNE 組改善了傷口的外觀，表面光滑平坦，而 NT 組產生明顯的疤痕。
圖2
NT 組、SNE 組和 PC 組的傷口創面愈合情況
Figure2.
The wound healing of NT，SNE and PC group
如圖 3 所示，SNE 組在第 6～20 d 期間，創面愈合率均高于 NT 組，差異具有統計學意義（P < 0.05）；在第 8、12、14 d，SNE 組的創面愈合率明顯高于 PC 組（P < 0.05）。其中傷后第 10 d，SNE 組、PC 組和 NT 組愈合率分別達到 84.85% ± 5.73%、72.56% ± 13.14% 和 58.48% ± 17.21%。各組傷口掉痂的時間如圖 4 所示，與 NT 組相比，SNE 組和 PC 組的掉痂時間均明顯縮短（P < 0.05）。
圖3
SNE 對創傷愈合率的影響（n = 7，* P < 0.05 ** P < 0.01，SNE 組與 NT 組比）
Figure3.
Effect of SNE on wound closure (n = 7, Compared with the NT group, * P < 0.05, ** P < 0.01)
圖4
掉痂所用的時間（n = 17，* P < 0.05，** P < 0.01）
Figure4.
Time of scab removal (n = 17, * P < 0.05, ** P < 0.01)
2.3 IL-1β、TNF-α 和 TGF-β1 mRNA 水平
qRT-PCR 結果如圖 5 所示，在造模后第 7 d，相比 NT 組，SNE 組和 PC 組小鼠創面組織中 TNF-α、IL-1β 和 TGF-β1 的 mRNA 水平均明顯降低（P < 0.01）；SNE 組 TNF-α 的 mRNA 水平明顯低于 PC 組（P < 0.05），而 SNE 組的 IL-1β 和 TGF-β1 表達水平與 PC 組相當，兩組間的差異無統計學意義（P > 0.05）。
圖5
小鼠皮膚創面 TNF-α、IL-1β 和 TGF-β1 的表達水平（n = 4，* P < 0.05，** P < 0.01）
Figure5.
Expression of TNF-α，IL-1β and TGF-β1 in wound of mice skin (n = 4, * P < 0.05, ** P < 0.01)
2.4 HE 染色病理分析
HE 染色切片結果如圖 6 所示，第 14 d 和 28 d，SNE 組和 PC 組小鼠創面表皮變薄和平坦，而 NT 組表皮明顯不均勻和增厚，邊緣呈舌狀突起，類似于瘢痕疙瘩。進一步分析表皮厚度指數發現，第 28 d，SNE 組和 PC 組的表皮厚度指數（指數值越接近 1 提示表皮層越接近正常皮膚）分別為 2.23 ± 0.54、1.96 ± 0.44，均明顯低于 NT 組的 3.82 ± 0.42（P < 0.01），如圖 7 所示。而 SNE 組和 PC 組的表皮薄厚比均明顯大于 NT 組（P < 0.01），如圖 8 所示，數值上更趨近于 1，表明 SNE 組和 PC 組小鼠的表皮恢復得明顯均勻、平坦光滑。
圖6
組織學分析創面表皮的愈合質量
Figure6.
Histological analysis of the healing quality of wound epidermis
圖7
創面的表皮厚度指數（n = 4，* P < 0.05，** P < 0.01）
Figure7.
Epidermal thickness index of wound epidermis (n = 4, * P < 0.05, ** P < 0.01)
圖8
創面的表皮薄厚比（n = 4，* P < 0.05，** P < 0.01）
Figure8.
Thin/thick ratio of epithelial thickness of wound epidermis (n = 4, * P < 0.05, ** P < 0.01)
2.5 Masson 染色病理和 COL1A1 mRNA 分析
創面組織切片經 Masson 染色后如圖 9 所示，圖中圓形、箭頭和正方形標志分別代表皮脂腺，毛囊和血管。造模 14 d 后，NT 組和 PC 組創面未見血管、毛囊、皮脂腺等皮膚附屬物的生成，膠原主要是平行排列，而 SNE 組的創面開始產生了皮脂腺；21 d 時，相比 NT 組，SNE 組創面已產生了包括血管和毛囊在內的成熟肉芽組織，膠原蛋白沉積形成有序的籃筐編織樣式排列，已經具備正常真皮的特征。28 d 時，SNE 組已經具有血管、毛囊、皮脂腺等正常皮膚特征，真皮膠原重塑情況優于 NT 組。
圖9
Masson 染色切片分析創口真皮位置膠原沉積和重組情況
Figure9.
Analysis of Masson-stained sections for collagen deposition and recombination at the wound dermal
qRT-PCR 分析結果顯示：傷后第 14 d，SNE 處理的小鼠傷口組織 COL1A1 水平明顯高于 NT 組（P < 0.05），而 21 d、28 d 其表達明顯低于 NT 組（P < 0.01），如圖 10 所示。結果表明，造模 14 d 后，SNE 通過調控創面 COL1A1 高水平表達，促進膠原纖維重塑和血管的形成。第 21 d，傷口愈合進入重塑的關鍵時期。因而，采用 TEM 進一步觀察第 21 d 組織重塑過程中的膠原纖維。
圖10
小鼠皮膚創面的 COL1A1 的表達（n = 4，* P < 0.05， ** P < 0.01）
Figure10.
Expression of type I collagen in wound of mice skin (n = 4, * P < 0.05, ** P < 0.01)
2.6 TEM 分析
TEM 結果如圖 11 所示，NT 組、SNE 組、PC 組和正常皮膚的膠原纖維直徑平均值分別為 108.7 nm、66.7 nm、52.3 nm 和 59.5 nm。SNE 組和 PC 組與正常皮膚結構外觀相似，膠原纖維比較圓，輪廓清晰，而 NT 組具有明顯結構異常（紅色箭頭標注），包括多個膠原之間不清晰的輪廓，趨向于局灶側向性融合，形成更大的膠原纖維。直徑分布分析結果顯示：SNE 組和 PC 組纖維直徑較小，分布范圍較為集中（30～90）nm，而 NT 組的膠原纖維直徑比較大，分布范圍也比較廣（60～160）nm。
圖11
傷后 21 d 創口膠原纖維分布
Figure11.
Distribution of collagen fibers at 21 days post-wounding
2.7 TGF-β/Smads 信號通路相關蛋白的 mRNA 水平
如圖 12 所示，qRT-PCR 檢測小鼠皮膚創面組中 TGF-β/Smads 信號通路相關蛋白 TGF-β1、TGF-βRII、Smad7、α-SMA 基因的相對表達量。相比 NT 組，SNE 組和 PC 組 Smad7 的 mRNA 水平上調，TGF-βRII、COL1A1 和 α-SMA 的 mRNA 水平下調，差異具有統計學意義（P < 0.05），而 SNE 組與 PC 組的差異無統計學意義（P > 0.05）。
圖12
TGF-β/Smads 信號通路幾種相關的因子的表達（n = 4，* P < 0.05，** P < 0.01）
Figure12.
Expression of several factors related to TGF-β / Smads signaling pathway (n = 4, * P < 0.05, ** P < 0.01)
3 討論
課題組前期初步探明方格星蟲酶解物具有止血和促進小鼠皮膚創傷修復的功效，但其有效成分及其機制尚不明確[14]。為進一步探討有效成分及其作用機制，本研究圍繞 SNE 促進小鼠皮膚創傷愈合的活性及其機制開展。SNE 的主要成分是礦物質、氨基酸、水溶性多糖、多肽等物質。其中，精氨酸和牛磺酸在方格星蟲中含量極高[7, 16]，具有促進傷口愈合的作用[8, 17]，這可能在 SNE 促進傷口愈合中起到重要作用。本研究中，SNE 能明顯提高小鼠創傷愈合率并縮短掉痂時間（P < 0.05）（見圖 3、圖 4）。SNE 組小鼠表皮生長完全、創面毛細血管和膠原纖維生長明顯優于 NT 組，愈合后傷口光滑平整，無瘢痕形成（見圖 6、圖 9、圖 11），其作用機制可能與 SNE 干預傷口愈合過程的四個時期有密切聯系。
SNE 能夠明顯縮短止血時間（見圖 1），表現出良好的止血活性，這可能與 SNE 中鈣、鋅含量高有關[18]。鈣離子在凝血機制中被稱為凝血因子Ⅳ，是多種因子的輔因子，可以同其他凝血因子一起逐級將凝血酶原轉化成凝血酶，參與到內外源性凝血途徑中的多個環節；而鋅離子能夠增強血小板活性[19]。纖維蛋白凝塊形成及血小板的聚集，在創傷處釋放多種生長因子，進一步刺激內皮擴散、遷移和管型形成。隨后，巨噬細胞、單核細胞和中性粒細胞共同參與免疫防御，釋放大量生長因子、細胞炎癥因子（TNF-α、IL-1β 等）、血管生成素和黏附分子等，進一步促進傷口止血[4, 20]。因而，SNE 止血活性是加快創傷愈合的重要原因之一。
創面局部的炎癥反應是傷口愈合的基礎，過度炎癥反應會對自身正常組織造成傷害，不利于傷口愈合，也是導致異常瘢痕形成的主要原因[4, 21]。IL-1β 和 TNF-α 是重要的炎癥因子和炎癥反應重要標志之一。研究表明，創傷愈合中晚期通過抑制炎性反應，能夠促進肉芽組織生成，加快創面的修復，減少增生性瘢痕生成[22]。文獻報道，胎兒創傷[23]和口腔黏膜創傷[24]可以實現快速無疤痕愈合，其作用與其愈合過程中顯示出比較低的炎癥反應有關。本研究中發現，創傷 7 d 后，相比 NT 組，SNE 組的 IL-1β 和 TNF-α 均明顯降低（見圖 5），表明 SNE 具有一定的抗炎活性。Zhang 等[12]也報道了方格星蟲所提取的水提物有抗炎活性。實驗結果提示 SNE 可能通過降低炎癥因子的水平，從而起到促進創傷愈合和延緩纖維化過程的作用。TGF-β1 是 FB 的強效趨化因子，作用于炎性細胞和修復細胞，產生細胞的趨化性遷移、增生分化，以及促進 ECM 合成與分泌等生物學效應[25-26]，在創傷愈合過程中參與并調節創面的炎性反應、ECM 沉積、組織纖維化和 HS 的形成[6, 27]。文獻報道，HS 中 TGF-β1 的表達明顯高于正常皮膚，在胎兒傷口中，添加外源性 TGF-β1 會導致產生與成年人一樣的瘢痕形成作用，而 TGF-β1 中和抗體可降低傷口局部 TGF-β1 水平從而減少 ECM 沉積[6, 28]。本實驗中，SNE 給藥 7 d 后，相比 NT 組，SNE 組表現出比較低的 TGF-β1 mRNA 水平（見圖 5）。HE、Masson 染色切片、TEM 對后期創面結構觀察結果顯示 SNE 組表皮變更薄和平坦，真皮層膠原重塑形成有序的籃筐狀編織樣式排列，產生了和正常皮膚相似的結構和外觀。而 NT 組則表現出肥胖性增厚和凹凸不平，邊緣呈舌狀突起，真皮層膠原呈平行排列過度堆積，部分纖維形成局灶側向性融合，類似于瘢痕疙瘩（見圖 6、圖 9、圖 11）。該結果表明，SNE 在炎癥期通過下調 TGF-β1 mRNA 水平能夠抑制瘢痕的產生。
TGF-β1 作為創傷愈合及瘢痕形成的生長因子類信號分子，其信號轉導通路研究較多的是 TGF-β/Smads 通路[6]。TGF-β1 通過與細胞表面受體 TGF-βRII 結合啟動該通路的信號傳導，而 Smads 家族蛋白則承擔起 TGF-β1 信號從表面受體至細胞核的傳導，干預轉導途徑的各個環節，可影響纖維化及 ECM 沉積的進程[29, 30]。其中 Smad7 屬于抑制性蛋白，在 TGF-β/Smads 信號轉導通路中起到負反饋調節作用。文獻報道，通過抑制、阻斷 TGF-β/Smads 信號轉導通路，可減少 FB 活化，導致過度膠原沉積（COL1A1）、α-SMA 生成及向 MFB 轉變，進而抑制 HS 產生。抑制該信號轉導的途徑主要有減少細胞因子 TGF-β1 的釋放，抑制 Smad3、Smad4、TGF-βRII 的表達，增加 Smad7 的表達等途徑[6, 31-33]。本研究中，在造模 28 d 后，相比 NT 組，SNE 組小鼠的皮膚中的 TGF-β1 和 TGF-βRII 的表達水平明顯上調（P < 0.01），而 Smad7 表達水平明顯下調（見圖 12），差異具有統計學意義（P < 0.05）。此外，SNE 組 MFB 特異性標記蛋白（α-SMA）和 COL1A1 的表達，明顯低于 NT 組（P < 0.01）（見圖 10 和12）。以上結果提示，SNE 可通過減少細胞因子 TGF-β1 的釋放、下調 TGF-βRII 受體表達以及上調 Smad7 的表達來干預 TGF-β/Smads 信號通路轉導，從而抑制 FB 過度分化，達到促愈合、抑制瘢痕生成的目的。
4 結論
綜上所述，SNE 具有促進傷口愈合和抑制增生性瘢痕生成作用，其作用機制與止血、調節炎癥因子、促進膠原纖維重塑以及調控 TGF-β/Smads 信號通路傳導有密切關聯。因此，本研究成果將為 SNE 作為促進創傷修復和抗瘢痕制劑的臨床應用提供理論依據。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
皮膚是人體最大的器官，其主要功能是隔絕機體與外界環境，形成一層對人體的保護屏障[1]。如果受損的皮膚不能及時修復，創面很容易受到感染，嚴重的創傷甚至危及生命。瘢痕（Scar）是機體創傷愈合的必然產物，但如果瘢痕增生過度，則引起外形及功能異常而產生增生性瘢痕（hyperplasia scar，HS），給患者的身心健康帶來嚴重的影響。因而，不斷探索新型創傷修復活性物質受到創傷修復領域的廣泛關注。創傷愈合主要包含止血凝血期、炎癥期、增殖期和組織重塑期四個時期[2]。在機體遭受創傷后，血小板激活，分泌相關細胞因子促使血液凝集止血，同時刺激機體產生炎癥反應[3]。進入炎癥期，炎癥細胞吞噬清除機體中的污染物，分泌各種細胞因子刺激成纖維細胞（fibroblast，FB）分裂、合成膠原[4]。增殖期，FB 產生膠原蛋白、纖維連接蛋白（fibronectin，FN）等細胞外基質（extracellular matrix，ECM）成分，合成肉芽組織，同時分化為肌成纖維細胞（myofibroblast，MFB），再上皮化和傷口收縮，而內皮細胞則完成創面的血管再生[2, 4]。組織重塑期，在免疫細胞、神經細胞及多種生長因子的共同調節下，基質蛋白和結締組織不斷進行合成和分解，最后完成組織重建、傷口收縮、瘢痕形成及功能恢復等過程[4-5]。在皮膚創傷愈合整個過程中，各類因子與 ECM 協同發揮修復功能，包括促炎因子白細胞介素-β（interleukin-β，IL-β）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、轉化生長因子-β（transforming growth factor alpha，TGF-β）、TGF-α 等[4]。其中，TGF-β1 是纖維化疾病的重要影響因子，通過 TGF-β/Smads 信號通路轉導，主導創傷早期炎性反應、創面愈合及后期病理性瘢痕的形成。該途徑受多種因子調控，如 TGF-β II 型受體（type II TGF-β receptors，TGF-βRII）、Smads 家族蛋白等。因而，研究 TGF-β/Smads 信號轉導，可為臨床創傷愈合及病理性瘢痕的防治奠定理論基礎[6]。
目前，市面上促傷口愈合的藥物和保健品主要根據傷口愈合的四個時期來設計的，如止血藥、抗菌藥、抗炎藥或者促進膠原蛋白合成藥等。按來源分，主要有中草藥、化學藥品、基因工程藥品及海洋藥物等，其中中草藥居多，而海洋來源藥物和保健品占很小一部分。因此，開發能促進創傷愈合和預防病理性瘢痕形成的海洋活性物質成為創傷領域關注的焦點[4]。
方格星蟲（Sipunculus nudus）是一種經濟底棲生物，其營養豐富，半必需氨基酸精氨酸含量極高[7]，而精氨酸具有促進傷口愈合的功能[8]。目前，已有研究報道表明方格星蟲有抗氧化、抗疲勞、抗輻射、延緩衰老、抗病毒[9]、調節免疫[10]、抗菌[11]、抗炎和外周鎮痛[12]等功效。其中，免疫調節、抗菌和抗炎功效與傷口愈合聯系比較密切。另有研究報道，同是星蟲的可口革囊星蟲的膠原蛋白具有促進傷口愈合的作用[13]。前期研究發現方格星蟲酶解物具有創傷修復功效，但其機制尚不明確[14]。本研究主要采用小鼠皮膚創傷模型以驗證方格星蟲水提物（Sipunculus nudus extract，SNE）促傷口愈合的作用，在此基礎上，從創傷愈合的四個時期進行相關機制探究，為豐富傷口愈合領域的機制探索，同時更好地開發利用星蟲資源，提高其附加值奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物與原料
本研究選取由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供的無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級昆明（kunming，KM）小鼠作為實驗動物，體重（28.0 ± 2.0）g，合格證編號為：11 401 500 055 889，實驗單位使用許可證編號為：SYXK（粵）20 140 053。
飼養條件：（25 ± 2）℃ 日常飼養，相對濕度為 40%～60%，自由飲水、進食，每日光照 12 h、避光 12 h。本研究所有動物實驗方案均經廣東海洋大學倫理委員會審核批準，所有實驗均按照實驗動物管理和使用指南進行[15]，實驗動物使用許可證號為 SCXK（京）20 160 002。
新鮮方格星蟲，直徑（5 ± 2）mm、長（10 ± 2）cm，購于湛江市東風市場，去除內臟和體腔液，體腔壁用蒸餾水洗凈、瀝干，分裝后置于?20℃ 貯藏。
1.1.2 試劑
云南白藥粉作為陽性對照（positive control，PC）試劑，產品批號：ZBA1512，國藥準字 Z53020798，購自云南白藥集團股份有限公司；焦碳酸二乙酯水，購自上海碧云天生物技術有限公司；核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取試劑盒、RNA 逆轉錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒，購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒、馬森（Masson）染色液試劑盒，購自上海博谷生物科技有限公司；4% 多聚甲醛、水合氯醛、無水乙醇、丙酮，購自國藥集團化學試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、2.5% 戊二醛（電鏡專用）、1% 鋨酸、環氧樹脂，購自北京中興百瑞技術有限公司。
1.2 儀器
本研究所用儀器包括：多功能全自動酶標儀（Thermo Varioskan Flash，Thermo Fisher Scientific Inc.，美國）、高速落地離心機（Thermo Lynx6 000，Thermo Fisher Scientific Inc.，美國）、切片機（RM2 015，Leica Inc.，德國）、超薄切片機（EMUC7，Leica Inc.，德國）、倒置熒光顯微鏡（DMI4 000，Leica Inc.，德國）、透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）（TecnaiG2 20 TWIN，FEI Inc.，美國）、qRT-PCR 儀（CFX96Touch，Bio-Rad Inc.，美國）。
1.3 實驗方法
1.3.1 SNE 的提取工藝
將方格星蟲沖洗、打碎、充分均漿，按照料液比 1：3 加水，調節 pH 為 7.0 后，置于 55℃ 恒溫攪拌水浴鍋，提取 5 h，100℃ 滅菌，8 000 g 離心 20 min，取上清液旋轉蒸發濃縮，冷凍干燥得 SNE。
1.3.2 SNE 的體外止血實驗研究
將 18 只 KM 小鼠隨機分為 3 組：空白（none-treatment，NT）組、SNE 組和 PC 組，每組 6 只。用 250 mg/kg 水合氯醛對 KM 小鼠進行腹腔注射，輕微麻醉，于固定容器中露出尾巴，在距尾端 0.4 cm 處進行斷尾處理，SNE 組和 PC 組分別用消毒棉簽各蘸取 SNE 和云南白藥，按 1 g/kg 給藥，NT 組不予給藥。計時后，每隔 5 s 用濾紙吸取血滴，當濾紙不再粘有血跡后，記下血液停止流出的時間。
1.3.3 建立傷口模型和給藥
將 84 只 KM 小鼠隨機分為 3 組：NT 組、SNE 組和 PC 組，每組 28 只。每只老鼠用 350 mg/kg 水合氯醛麻醉，背部皮膚脫毛消毒后，用直徑 8 mm 打孔器在鼠背部打一個圓孔，切取全層皮膚，深至筋膜，每只動物分籠飼養。NT 組每天不予處理；SNE 組，以無菌水配制 SNE 膏狀物（總氮含量為 2 g/mL），每只小鼠涂抹 60 mg 藥膏；PC 組，每只小鼠各涂抹 30 mg 云南白藥粉。每天給藥一次，連續給藥 28 d。每兩天固定高度拍照一次，用圖像處理軟件 Image J（National Institutes of Health，美國）分析計算傷口愈合率、觀察掉痂時間以及傷口瘢痕形成情況，傷口愈合率計算公式如（1）所示：
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式中，S0 是 0 d 傷口面積，SN 是 N d 傷口面積，單位：mm2，其中 N = 0，2，4，，28。
1.3.4 傷口組織病理學分析
在造模后第 14、21、28 d，每組每次分別處死 7 只 KM 小鼠，沿傷口外周 3 mm，取全層皮膚，從正中間分成兩半，分別用 4% 多聚甲醛固定過夜，經脫水、包埋，制成石蠟切片，一半用于 HE 染色，另一半用于 Masson 染色。第 14 d 和 28 d 取傷口處皮膚，也用 HE 染色，用于測定表皮厚度指數和表皮薄厚比，計算公式如式（2）和式（3）所示。第 14、21、28 d 的傷口皮膚用 Masson 染色，用于觀察傷口的膠原合成與沉積、血管生成、毛囊和汗腺等皮膚附屬器的生成情況。
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式中， 是傷口處上皮平均厚度， 是正常皮膚平均厚度， 表示傷口表皮薄處厚度平均值， 表示傷口表皮厚處厚度平均值，單位：μm。
1.3.5 qRT-PCR 分析
采用 qRT-PCR 試劑盒檢測給藥第 7 d 后小鼠創傷皮膚中 TNF-α、IL-1β、TGF-β1 的信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）表達水平；檢測第 14、21、28 d 創面中 I 型膠原蛋白（collagen I，COL1A1）以及第 28 d 創面中 TGF-β1、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、TGF-βRII 和 Smad7 蛋白的 mRNA 水平。用 RNA 提取試劑盒提取皮膚傷口的總 RNA，用 RNA 逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應，用 qRT-PCR 試劑盒定量分析。反應條件為：95℃、30 s；95℃、5 s；60℃、30 s，共 40 個循環。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase，GAPDH）作為內參基因，用于校正計算靶基因的表達水平，使用 2-??CT 方法進行計算。相關引物信息如表 1 所示。
表1
qRT-PCR 引物
Table1.
Primers used for qRT-PCR analysis
1.3.6 膠原纖維 TEM 分析
取造模后第 21 d 的皮膚傷口組織放入 2.5% 戊二醛，4℃ 過夜固定，PBS 漂洗 3 次，4℃ 預冷的 1% 鋨酸固定 2～3 h，PBS 浸洗 3 次，每次 20 min。按梯度 30%、50%、70%、80%、85%、90%、95%、100% 乙醇脫水 15 min，100% 乙醇徹底脫水 2 次，每次 10 min。接著用丙酮：環氧樹脂（2∶1）、丙酮：環氧樹脂（1∶1）、環氧樹脂，于 37℃ 恒溫箱依次進行滲透，每次 12 h。包埋、固化、修塊和染色后，于 200 kV 加速電壓觀察，放大倍率 5 000×，測量每個膠原纖維的直徑。
1.3.7 數據統計與分析
數據分析、圖片處理和作圖分別采用統計學軟件 JMP10（SAS Inc.，美國）、圖像處理軟件 Image J（National Institutes of Health，美國）和科技作圖軟件 Origin9.0（OriginLab Inc.，美國）。用最小二乘均值 t 檢驗分析組間差異，結果以均值 ± 標準差表示，P < 0.05 為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 止血作用分析
如圖 1 所示，NT 組、SNE 組和 PC 組止血時間分別為（186.6 ± 22.6）、（132.0 ± 23.5）、（113.6 ± 20.4）s。與 NT 組相比，SNE 組止血時間明顯降低（P < 0.01）。SNE 組和 PC 組表現出相似的止血效果，止血時間的差異無統計學意義（P > 0.05）。
圖1
SNE 對小鼠尾部出血時間的影響（n = 6，* P < 0.05， ** P < 0.01）
Figure1.
Effects of SNE treatment on tail bleeding time in mice (n = 6, * P < 0.05, ** P < 0.01)
2.2 創面愈合觀察
各組創面隨時間變化愈合情況如圖 2 所示，相比 NT 組，SNE 組愈合效果明顯，特別是第 28 d，SNE 組改善了傷口的外觀，表面光滑平坦，而 NT 組產生明顯的疤痕。
圖2
NT 組、SNE 組和 PC 組的傷口創面愈合情況
Figure2.
The wound healing of NT，SNE and PC group
如圖 3 所示，SNE 組在第 6～20 d 期間，創面愈合率均高于 NT 組，差異具有統計學意義（P < 0.05）；在第 8、12、14 d，SNE 組的創面愈合率明顯高于 PC 組（P < 0.05）。其中傷后第 10 d，SNE 組、PC 組和 NT 組愈合率分別達到 84.85% ± 5.73%、72.56% ± 13.14% 和 58.48% ± 17.21%。各組傷口掉痂的時間如圖 4 所示，與 NT 組相比，SNE 組和 PC 組的掉痂時間均明顯縮短（P < 0.05）。
圖3
SNE 對創傷愈合率的影響（n = 7，* P < 0.05 ** P < 0.01，SNE 組與 NT 組比）
Figure3.
Effect of SNE on wound closure (n = 7, Compared with the NT group, * P < 0.05, ** P < 0.01)
圖4
掉痂所用的時間（n = 17，* P < 0.05，** P < 0.01）
Figure4.
Time of scab removal (n = 17, * P < 0.05, ** P < 0.01)
2.3 IL-1β、TNF-α 和 TGF-β1 mRNA 水平
qRT-PCR 結果如圖 5 所示，在造模后第 7 d，相比 NT 組，SNE 組和 PC 組小鼠創面組織中 TNF-α、IL-1β 和 TGF-β1 的 mRNA 水平均明顯降低（P < 0.01）；SNE 組 TNF-α 的 mRNA 水平明顯低于 PC 組（P < 0.05），而 SNE 組的 IL-1β 和 TGF-β1 表達水平與 PC 組相當，兩組間的差異無統計學意義（P > 0.05）。
圖5
小鼠皮膚創面 TNF-α、IL-1β 和 TGF-β1 的表達水平（n = 4，* P < 0.05，** P < 0.01）
Figure5.
Expression of TNF-α，IL-1β and TGF-β1 in wound of mice skin (n = 4, * P < 0.05, ** P < 0.01)
2.4 HE 染色病理分析
HE 染色切片結果如圖 6 所示，第 14 d 和 28 d，SNE 組和 PC 組小鼠創面表皮變薄和平坦，而 NT 組表皮明顯不均勻和增厚，邊緣呈舌狀突起，類似于瘢痕疙瘩。進一步分析表皮厚度指數發現，第 28 d，SNE 組和 PC 組的表皮厚度指數（指數值越接近 1 提示表皮層越接近正常皮膚）分別為 2.23 ± 0.54、1.96 ± 0.44，均明顯低于 NT 組的 3.82 ± 0.42（P < 0.01），如圖 7 所示。而 SNE 組和 PC 組的表皮薄厚比均明顯大于 NT 組（P < 0.01），如圖 8 所示，數值上更趨近于 1，表明 SNE 組和 PC 組小鼠的表皮恢復得明顯均勻、平坦光滑。
圖6
組織學分析創面表皮的愈合質量
Figure6.
Histological analysis of the healing quality of wound epidermis
圖7
創面的表皮厚度指數（n = 4，* P < 0.05，** P < 0.01）
Figure7.
Epidermal thickness index of wound epidermis (n = 4, * P < 0.05, ** P < 0.01)
圖8
創面的表皮薄厚比（n = 4，* P < 0.05，** P < 0.01）
Figure8.
Thin/thick ratio of epithelial thickness of wound epidermis (n = 4, * P < 0.05, ** P < 0.01)
2.5 Masson 染色病理和 COL1A1 mRNA 分析
創面組織切片經 Masson 染色后如圖 9 所示，圖中圓形、箭頭和正方形標志分別代表皮脂腺，毛囊和血管。造模 14 d 后，NT 組和 PC 組創面未見血管、毛囊、皮脂腺等皮膚附屬物的生成，膠原主要是平行排列，而 SNE 組的創面開始產生了皮脂腺；21 d 時，相比 NT 組，SNE 組創面已產生了包括血管和毛囊在內的成熟肉芽組織，膠原蛋白沉積形成有序的籃筐編織樣式排列，已經具備正常真皮的特征。28 d 時，SNE 組已經具有血管、毛囊、皮脂腺等正常皮膚特征，真皮膠原重塑情況優于 NT 組。
圖9
Masson 染色切片分析創口真皮位置膠原沉積和重組情況
Figure9.
Analysis of Masson-stained sections for collagen deposition and recombination at the wound dermal
qRT-PCR 分析結果顯示：傷后第 14 d，SNE 處理的小鼠傷口組織 COL1A1 水平明顯高于 NT 組（P < 0.05），而 21 d、28 d 其表達明顯低于 NT 組（P < 0.01），如圖 10 所示。結果表明，造模 14 d 后，SNE 通過調控創面 COL1A1 高水平表達，促進膠原纖維重塑和血管的形成。第 21 d，傷口愈合進入重塑的關鍵時期。因而，采用 TEM 進一步觀察第 21 d 組織重塑過程中的膠原纖維。
圖10
小鼠皮膚創面的 COL1A1 的表達（n = 4，* P < 0.05， ** P < 0.01）
Figure10.
Expression of type I collagen in wound of mice skin (n = 4, * P < 0.05, ** P < 0.01)
2.6 TEM 分析
TEM 結果如圖 11 所示，NT 組、SNE 組、PC 組和正常皮膚的膠原纖維直徑平均值分別為 108.7 nm、66.7 nm、52.3 nm 和 59.5 nm。SNE 組和 PC 組與正常皮膚結構外觀相似，膠原纖維比較圓，輪廓清晰，而 NT 組具有明顯結構異常（紅色箭頭標注），包括多個膠原之間不清晰的輪廓，趨向于局灶側向性融合，形成更大的膠原纖維。直徑分布分析結果顯示：SNE 組和 PC 組纖維直徑較小，分布范圍較為集中（30～90）nm，而 NT 組的膠原纖維直徑比較大，分布范圍也比較廣（60～160）nm。
圖11
傷后 21 d 創口膠原纖維分布
Figure11.
Distribution of collagen fibers at 21 days post-wounding
2.7 TGF-β/Smads 信號通路相關蛋白的 mRNA 水平
如圖 12 所示，qRT-PCR 檢測小鼠皮膚創面組中 TGF-β/Smads 信號通路相關蛋白 TGF-β1、TGF-βRII、Smad7、α-SMA 基因的相對表達量。相比 NT 組，SNE 組和 PC 組 Smad7 的 mRNA 水平上調，TGF-βRII、COL1A1 和 α-SMA 的 mRNA 水平下調，差異具有統計學意義（P < 0.05），而 SNE 組與 PC 組的差異無統計學意義（P > 0.05）。
圖12
TGF-β/Smads 信號通路幾種相關的因子的表達（n = 4，* P < 0.05，** P < 0.01）
Figure12.
Expression of several factors related to TGF-β / Smads signaling pathway (n = 4, * P < 0.05, ** P < 0.01)
3 討論
課題組前期初步探明方格星蟲酶解物具有止血和促進小鼠皮膚創傷修復的功效，但其有效成分及其機制尚不明確[14]。為進一步探討有效成分及其作用機制，本研究圍繞 SNE 促進小鼠皮膚創傷愈合的活性及其機制開展。SNE 的主要成分是礦物質、氨基酸、水溶性多糖、多肽等物質。其中，精氨酸和牛磺酸在方格星蟲中含量極高[7, 16]，具有促進傷口愈合的作用[8, 17]，這可能在 SNE 促進傷口愈合中起到重要作用。本研究中，SNE 能明顯提高小鼠創傷愈合率并縮短掉痂時間（P < 0.05）（見圖 3、圖 4）。SNE 組小鼠表皮生長完全、創面毛細血管和膠原纖維生長明顯優于 NT 組，愈合后傷口光滑平整，無瘢痕形成（見圖 6、圖 9、圖 11），其作用機制可能與 SNE 干預傷口愈合過程的四個時期有密切聯系。
SNE 能夠明顯縮短止血時間（見圖 1），表現出良好的止血活性，這可能與 SNE 中鈣、鋅含量高有關[18]。鈣離子在凝血機制中被稱為凝血因子Ⅳ，是多種因子的輔因子，可以同其他凝血因子一起逐級將凝血酶原轉化成凝血酶，參與到內外源性凝血途徑中的多個環節；而鋅離子能夠增強血小板活性[19]。纖維蛋白凝塊形成及血小板的聚集，在創傷處釋放多種生長因子，進一步刺激內皮擴散、遷移和管型形成。隨后，巨噬細胞、單核細胞和中性粒細胞共同參與免疫防御，釋放大量生長因子、細胞炎癥因子（TNF-α、IL-1β 等）、血管生成素和黏附分子等，進一步促進傷口止血[4, 20]。因而，SNE 止血活性是加快創傷愈合的重要原因之一。
創面局部的炎癥反應是傷口愈合的基礎，過度炎癥反應會對自身正常組織造成傷害，不利于傷口愈合，也是導致異常瘢痕形成的主要原因[4, 21]。IL-1β 和 TNF-α 是重要的炎癥因子和炎癥反應重要標志之一。研究表明，創傷愈合中晚期通過抑制炎性反應，能夠促進肉芽組織生成，加快創面的修復，減少增生性瘢痕生成[22]。文獻報道，胎兒創傷[23]和口腔黏膜創傷[24]可以實現快速無疤痕愈合，其作用與其愈合過程中顯示出比較低的炎癥反應有關。本研究中發現，創傷 7 d 后，相比 NT 組，SNE 組的 IL-1β 和 TNF-α 均明顯降低（見圖 5），表明 SNE 具有一定的抗炎活性。Zhang 等[12]也報道了方格星蟲所提取的水提物有抗炎活性。實驗結果提示 SNE 可能通過降低炎癥因子的水平，從而起到促進創傷愈合和延緩纖維化過程的作用。TGF-β1 是 FB 的強效趨化因子，作用于炎性細胞和修復細胞，產生細胞的趨化性遷移、增生分化，以及促進 ECM 合成與分泌等生物學效應[25-26]，在創傷愈合過程中參與并調節創面的炎性反應、ECM 沉積、組織纖維化和 HS 的形成[6, 27]。文獻報道，HS 中 TGF-β1 的表達明顯高于正常皮膚，在胎兒傷口中，添加外源性 TGF-β1 會導致產生與成年人一樣的瘢痕形成作用，而 TGF-β1 中和抗體可降低傷口局部 TGF-β1 水平從而減少 ECM 沉積[6, 28]。本實驗中，SNE 給藥 7 d 后，相比 NT 組，SNE 組表現出比較低的 TGF-β1 mRNA 水平（見圖 5）。HE、Masson 染色切片、TEM 對后期創面結構觀察結果顯示 SNE 組表皮變更薄和平坦，真皮層膠原重塑形成有序的籃筐狀編織樣式排列，產生了和正常皮膚相似的結構和外觀。而 NT 組則表現出肥胖性增厚和凹凸不平，邊緣呈舌狀突起，真皮層膠原呈平行排列過度堆積，部分纖維形成局灶側向性融合，類似于瘢痕疙瘩（見圖 6、圖 9、圖 11）。該結果表明，SNE 在炎癥期通過下調 TGF-β1 mRNA 水平能夠抑制瘢痕的產生。
TGF-β1 作為創傷愈合及瘢痕形成的生長因子類信號分子，其信號轉導通路研究較多的是 TGF-β/Smads 通路[6]。TGF-β1 通過與細胞表面受體 TGF-βRII 結合啟動該通路的信號傳導，而 Smads 家族蛋白則承擔起 TGF-β1 信號從表面受體至細胞核的傳導，干預轉導途徑的各個環節，可影響纖維化及 ECM 沉積的進程[29, 30]。其中 Smad7 屬于抑制性蛋白，在 TGF-β/Smads 信號轉導通路中起到負反饋調節作用。文獻報道，通過抑制、阻斷 TGF-β/Smads 信號轉導通路，可減少 FB 活化，導致過度膠原沉積（COL1A1）、α-SMA 生成及向 MFB 轉變，進而抑制 HS 產生。抑制該信號轉導的途徑主要有減少細胞因子 TGF-β1 的釋放，抑制 Smad3、Smad4、TGF-βRII 的表達，增加 Smad7 的表達等途徑[6, 31-33]。本研究中，在造模 28 d 后，相比 NT 組，SNE 組小鼠的皮膚中的 TGF-β1 和 TGF-βRII 的表達水平明顯上調（P < 0.01），而 Smad7 表達水平明顯下調（見圖 12），差異具有統計學意義（P < 0.05）。此外，SNE 組 MFB 特異性標記蛋白（α-SMA）和 COL1A1 的表達，明顯低于 NT 組（P < 0.01）（見圖 10 和12）。以上結果提示，SNE 可通過減少細胞因子 TGF-β1 的釋放、下調 TGF-βRII 受體表達以及上調 Smad7 的表達來干預 TGF-β/Smads 信號通路轉導，從而抑制 FB 過度分化，達到促愈合、抑制瘢痕生成的目的。
4 結論
綜上所述，SNE 具有促進傷口愈合和抑制增生性瘢痕生成作用，其作用機制與止血、調節炎癥因子、促進膠原纖維重塑以及調控 TGF-β/Smads 信號通路傳導有密切關聯。因此，本研究成果將為 SNE 作為促進創傷修復和抗瘢痕制劑的臨床應用提供理論依據。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
