本文旨在研究間接共培養條件下血管內皮細胞分泌或代謝產生的物質對于肝癌細胞上皮-間質轉化（EMT）的影響。體外培養人肝癌細胞系 QGY-7703，并與人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）條件培養基進行共培養；倒置相差顯微鏡觀察肝癌細胞形態學的變化；劃痕實驗分析肝癌細胞遷移能力的變化；Western blot 及免疫熒光實驗檢測條件培養基對肝癌細胞 EMT 相關蛋白表達及分布的影響。結果表明，共培養后，QGY-7703 細胞逐漸由多邊形變為紡錘形，遷移能力顯著提高，EMT 相關標志物的表達及分布均出現時序性變化。研究結果證實，間接共培養條件下，血管內皮細胞可誘導肝癌細胞發生 EMT。
引用本文： 許博聞, 何佳, 高文博, 蘇冠月, 劉肖珩, 沈陽. 血管內皮細胞條件培養基對肝癌細胞上皮-間質轉化的影響. 生物醫學工程學雜志, 2020, 37(3): 442-449. doi: 10.7507/1001-5515.201907041 復制
引言
肝癌是臨床最難治療的惡性腫瘤之一，2018 年其致死率在常見癌癥中高居第四位，僅次于肺癌、結直腸癌和胃癌[1]。肝癌細胞的侵襲和轉移能力是導致肝癌預后較差的重要因素。腫瘤發生、生長及轉移需要一定的內部環境，即腫瘤微環境，它是由腫瘤細胞、內皮細胞等多種基質細胞以及細胞因子、細胞外基質等構成的多成分復雜體系，在腫瘤生長、血管新生、腫瘤細胞的遷移和侵襲中均發揮了十分重要的作用[2]。其中，腫瘤血管新生是腫瘤發生發展中的關鍵環節，對于維持腫瘤微環境的穩定性至關重要[3-4]。腫瘤細胞與微環境之間相互依存而又相互影響，已有研究表明，腫瘤細胞可以通過分泌血管生成因子等活性物質，來募集內皮細胞，使內皮細胞在腫瘤細胞周圍形成新生血管網絡[5]。另外，新生血管也會通過旁分泌作用釋放某些生物因子，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[6]，但其具體的調控機制目前尚不十分清楚。
多項研究表明，上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要機制，也是腫瘤發生惡性進展的重要特征之一[7-8]。EMT 是指上皮細胞在一定條件下（如受到細胞外因子刺激）通過特定程序轉化為間質表型細胞的過程。該過程中，細胞頂端基底極性丟失，胞間黏附連接降解，細胞形態發生改變，遷移和侵襲能力增強[9-10]。此外，在上皮表型向間充質表型的轉化過程中也常常伴隨著上皮標志物如 E-鈣粘蛋白（E-cadherin）表達水平的下調和間充質標志物如 N-鈣粘蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）表達水平的上調[11-12]，細胞骨架也會發生重塑，角蛋白細胞骨架轉化為以 Vimentin 為主的細胞骨架[13]。其中，E-cadherin 是調節細胞間黏附的主要分子，通過與 β-連環蛋白（β-catenin）直接結合形成蛋白復合體，連接到肌動蛋白細胞骨架，從而形成細胞間黏附連接，維持上皮細胞的極性和組織的完整性，使細胞的遷移和侵襲性受到抑制[14]。EMT 過程中，E-cadherin 表達下調，位于細胞膜的 E-cadherin 被 N-cadherin 所取代，N-cadherin 表達上調。由于 N-cadherin 在細胞間的連接能力比 E-cadherin 弱，導致細胞間的黏附力降低，胞間連接減少，細胞獲得遷移能力更強的間質細胞表型特征[15]。以往的研究均集中在腫瘤微環境中某單一因子對于腫瘤細胞遷移及侵襲能力的影響，但血管內皮細胞釋放的各種因子對腫瘤細胞遷移及侵襲過程中的 EMT 起到多大的促進作用尚不明確。
共培養模型是體外研究血管內皮細胞與腫瘤細胞之間相互作用的常用模型，主要分為直接式和間接式[16]。為探究血管內皮細胞對于腫瘤細胞 EMT 的影響，我們可以簡單地通過收集血管內皮細胞的培養基（條件培養基），然后用它對腫瘤細胞進行培養來形成一種間接的共培養方式。
本研究以肝癌細胞 QGY-7703 為研究對象，將其與血管內皮細胞條件培養基進行共培養并設置不同的培養時間，探究間接共培養條件下，肝癌細胞形態、遷移能力及 EMT 相關蛋白表達和分布的變化，從而揭示腫瘤微環境中血管內皮細胞所分泌的因子對于肝癌細胞 EMT 行為的影響，以期為肝癌治療提供新的視角和思路。
1 材料和方法
1.1 材料和試劑
實驗所用人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）株購自江蘇省血液研究所，人肝癌細胞系 QGY-7703 購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；RPMI-1640 培養基購自 Gibco 公司（美國）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自中喬新舟公司（上海）；青霉素-鏈霉素溶液和胰蛋白酶購自 HyClone 公司（美國）；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）購自中杉金橋公司（北京）；E-cadherin、N-cadherin 一抗購自 CST 公司（美國），Vimentin 一抗購自 Santa Cruz 公司（美國），GAPDH 一抗、辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗購自 SAB 公司（美國），FITC 和 TRITC 標記的二抗購自中杉金橋公司（北京）；Hoechst33342 染色液購自貝博生物科技公司（上海）。
1.2 細胞培養
將 HUVEC 接種于含有 10% FBS、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素的 RPMI-1640 完全培養基中，置于含有 5% CO2 的 37℃ 恒溫細胞培養箱中靜置培養。待細胞生長至 80%～90% 融合，用 0.25% 胰蛋白酶消化后傳代培養。取對數生長期的細胞進行后續實驗。QGY-7703 細胞培養方法與 HUVEC 相同。
1.3 HUVEC 條件培養基的制備
當 HUVEC 融合度達 90% 時，棄去原有培養基，用無菌 PBS 清洗 3 次，然后加入適量無血清 RPMI-1640 培養基饑餓處理，約 24 h 后收集培養基，于 1 000 r/min 條件下離心 10 min 以除去培養基中懸浮的細胞，取上清液，即為 HUVEC 條件培養基。置于?20℃ 保存備用。
1.4 細胞形態學觀察
當 QGY-7703 細胞接近融合時，棄去原有培養基，用無菌 PBS 清洗 3 次，然后分別加入制備好的 HUVEC 條件培養基，于培養箱中靜置培養，分別培養 0、2、4、8、8 + 4、8 + 8 h（后兩組分別用條件培養基培養 8 h 后再換回 RPMI-1640 完全培養基繼續培養 4 h 或 8 h）后，置于倒置相差顯微鏡（CK X 41 型，Olympus，日本）下觀察細胞形態，并隨機選取五個視野拍照記錄。
1.5 劃痕實驗——細胞遷移能力分析
待 QGY-7703 細胞形成單層融合后，將培養基換成無血清 RPMI-1640 培養基饑餓處理過夜。然后棄去培養基，PBS 清洗后分別加入制備好的 HUVEC 條件培養基，處理 0、2、8 h，用直尺和滅菌處理的細胞刮刀或者微量移液槍的槍尖在單層細胞上刮出一條均勻的劃痕（大約 500 μm 寬）。用 PBS 小心清洗 3 次后加入無血清 RPMI-1640 培養基，于培養箱中靜置培養，在各時間點（0、6、12、24 h）置于倒置相差顯微鏡（CK X 41 型，Olympus，日本）下觀察細胞遷移情況，分別隨機選取三個視野拍照記錄。
1.6 Western blot 實驗
當培養瓶中的 QGY-7703 細胞融合度達 90% 時，將培養基換成 HUVEC 條件培養基處理 0、4、8、8 + 4 h 后，用 4℃ 預冷的 PBS 清洗 3 次，RIPA 裂解液裂解后離心，即得到總蛋白樣品。用 BCA 法測定蛋白樣品的濃度，經煮沸變性后，等量的蛋白（30 μg）被加入聚丙烯酰胺凝膠樣品孔中。電泳分離、轉膜完成后，PVDF 膜置于含有 5% 脫脂奶粉和 0.05% 吐溫-20 的 TBST 中室溫封閉 2～3 h。加入稀釋的 GAPDH（1∶5 000）、E-cadherin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶200）等一抗反應液，4℃ 輕搖孵育過夜。TBST 洗膜三次后加入稀釋的 HRP 標記的二抗（山羊抗小鼠 IgG/山羊抗兔 IgG，1∶5 000）反應液，室溫輕搖孵育 1 h，最后進行 ECL 顯影。用 Image Lab 軟件對圖像進行灰度分析后，將目的蛋白與內參的灰度值的比值作為半定量指標。
1.7 免疫熒光實驗
將 QGY-7703 細胞制成細胞懸液，均勻接種于 14 mm 圓形細胞爬片上，待融合度達 90% 時，用 HUVEC 條件培養基處理 0、4、8、8 + 4 h。經 PBS 清洗 2 次后，用 4% 多聚甲醛室溫固定 30 min，接著，樣品在 5% 山羊血清中室溫封閉 30 min。加入用 1% 山羊血清稀釋的 E-cadherin（1∶200）、N-cadherin（1∶200）、Vimentin（1∶50）等一抗，4℃ 孵育過夜。PBS 清洗 3 次后加入 FITC 標記的山羊抗兔 IgG 第二抗體（1∶25）和 TRITC 標記的山羊抗小鼠 IgG 第二抗體（1∶25），室溫孵育 1 h。PBS 清洗 3 次后，用 1 × 染色緩沖液按 1∶100 比例稀釋 Hoechst33342 染色液，加入樣品中室溫孵育 10 min，再用 PBS 清洗 4 次后封片。在激光掃描共聚焦顯微鏡（LSM710，蔡司，德國）下觀察并拍照記錄。
1.8 統計學分析
實驗所得數據以均值 ± 標準差表示，用 SPSS 統計軟件對數據進行分析，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和 Tukey’s 檢驗對各組數據進行統計分析。P < 0.05 表示差異有統計學意義。
2 結果
2.1 間接共培養條件下肝癌細胞形態的變化
用 HUVEC 條件培養基分別處理 QGY-7703 細胞不同時間后，于倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞的形態變化。如圖 1 所示，對照組 QGY-7703 細胞呈不規則的多邊形，且胞間排列緊密，呈現出上皮樣特征。共培養 2 h 后，部分細胞發生紡錘形改變，胞體拉伸，呈現出間質樣特征。隨著條件培養基處理時間的延長，4、8 h 組細胞逐漸由多邊形變為紡錘形，長短軸之比顯著增加。而將條件培養基換回 RPMI-1640 完全培養基繼續培養 4 h 或 8 h 后（8 + 4、8 + 8 h），細胞形態又逐步恢復為與對照組類似的不規則多邊形，長短軸之比降低。
圖1
間接共培養條件下 QGY-7703 細胞形態的變化及長短軸之比的統計圖
標尺 = 10 μm；*，
scale bar = 10 μm; *,
2.2 間接共培養條件下肝癌細胞遷移能力的變化
為檢測共培養條件下 QGY-7703 細胞遷移能力的變化，用 HUVEC 條件培養基分別培養 QGY-7703 細胞 0、2、8 h，然后對細胞進行劃痕實驗，在 0、6、12、24 h 等時間點記錄細胞的遷移距離。如圖 2 所示，共培養 2 h 后的細胞在 24 h 時的遷移距離較對照組而言顯著提高（P < 0.05），共培養 8 h 后的細胞在各個觀察時間點的遷移距離均顯著高于對照組（P < 0.05），并且遷移距離隨著共培養時間的延長而增加。以上結果表明，HUVEC 條件培養基可以促進肝癌細胞的遷移，且遷移能力與共培養時間呈現正相關性。
圖2
間接共培養條件下 QGY-7703 細胞遷移情況的顯微鏡照片及遷移距離的統計圖
標尺 = 500 μm；*，
scale bar = 500 μm; *,
2.3 間接共培養條件下肝癌細胞上皮標志物表達的變化
為探究間接共培養條件下血管內皮細胞對肝癌細胞 EMT 的影響，我們采用 Western blot 實驗檢測共培養后肝癌細胞中典型上皮標志物 E-cadherin 的表達變化。如圖 3 所示，采用 HUVEC 條件培養基對 QGY-7703 細胞進行處理后，與對照組比較，E-cadherin 的表達顯著下調，并且隨著共培養時間的延長而逐漸降低。當換回 RPMI-1640 完全培養基繼續培養 4 h 后，E-cadherin 表達量繼續降低。以上結果說明 HUVEC 條件培養基可以下調肝癌細胞 QGY-7703 中上皮標志物 E-cadherin 的表達，且呈現一定程度的時間依賴性。
圖3
間接共培養條件下 QGY-7703 細胞中上皮標志物 E-cadherin 的表達水平和相對表達量的統計圖
*，
*,
2.4 間接共培養條件下肝癌細胞間充質標志物表達的變化
除上皮標志物的變化外，EMT 過程中還伴隨著 N-cadherin、Vimentin 等間充質標志物表達的上調。Western blot 實驗結果如圖 4 所示，共培養 4 h 時 N-cadherin 的表達首先呈下降趨勢；但隨著時間的延長，共培養 8 h 后，與對照組相比，N-cadherin 的表達出現顯著上調；換回 RPMI-1640 完全培養基之后與共培養 8 h 相比并沒有顯著差異。而 Vimentin 在共培養 4 h 和 8 h 時表達量均出現明顯升高，且隨著時間的延長而逐漸增加；在共培養 8 h 后換回 RPMI-1640 完全培養基繼續培養 4 h，Vimentin 的表達又顯著降低，與對照組相比差異無統計學意義。這說明 HUVEC 條件培養基可以上調肝癌細胞 QGY-7703 中間充質標志物 N-cadherin 和 Vimentin 的表達。結合上皮標志物的變化情況，證實了在腫瘤微環境中，血管內皮細胞所分泌的因子可以誘導肝癌細胞發生 EMT。
圖4
間接共培養條件下 QGY-7703 細胞中間充質標志物 N-cadherin 和 Vimentin 的表達水平及相對表達量的統計圖*，P < 0.05
Figure4.
The expression level of mesenchymal markers N-cadherin and Vimentin in QGY-7703 cells under indirect co-culture condition and the statistical graph of relative expression
*,
2.5 間接共培養條件下肝癌細胞 EMT 相關蛋白分布的變化
為進一步驗證 HUVEC 條件培養基對于肝癌細胞 QGY-7703 發生 EMT 的影響，我們采用免疫熒光實驗檢測了在共培養條件下，QGY-7703 細胞中 E-cadherin、N-cadherin 及 Vimentin 的分布變化，實驗結果如圖 5、圖 6 所示。圖 5 顯示，在對照組中，E-cadherin 主要分布在胞質和胞膜區域，其中胞質區域所占比例較大，而 N-cadherin 雖也分布在胞質和胞膜，但胞膜區域所占比例較大。HUVEC 條件培養基刺激 4 h 后，E-cadherin 和 N-cadherin 的分布均發生明顯變化，E-cadherin 逐漸往胞質聚集，而 N-cadherin 變化趨勢相反，逐漸往胞膜聚集。隨著共培養時間的延長，上述變化趨勢更加明顯，8 h 時，E-cadherin 基本全部定位在胞質區域，N-cadherin 大部分定位在細胞膜上。換回 RPMI-1640 完全培養基培養 4 h 后，E-cadherin 和 N-cadherin 的分布恢復為類似對照組的情況，部分 E-cadherin 轉移到細胞膜，而大部分 N-cadherin 回到胞質中。圖 6 顯示，與 Western blot 結果一致，在對照組中 Vimentin 的表達相對較低，纖維狀結構較少，共培養后其表達出現上調，且呈現由細胞核向外的放射狀分布，纖維狀結構明顯。以上結果說明 HUVEC 條件培養基可以影響肝癌細胞 QGY-7703 中 EMT 相關蛋白的分布，進一步證實血管內皮細胞所分泌的因子可以促進肝癌細胞 EMT 的發生。
圖5
間接共培養條件下 QGY-7703 細胞中 E-cadherin 和 N-cadherin 分布的變化
綠色熒光：E-cadherin；紅色熒光：N-cadherin；標尺 = 20 μm
Figure5. The changes of distribution of E-cadherin and N-cadherin in QGY-7703 cells under indirect co-culture conditiongreen: E-cadherin; red: N-cadherin; scale bar = 20 μm
圖6
間接共培養條件下 QGY-7703 細胞中 Vimentin 分布的變化
紅色熒光：Vimentin；藍色熒光：細胞核；標尺 = 10 μm
Figure6. The changes of distribution of Vimentin in QGY-7703 cells under indirect co-culture conditionred: Vimentin; blue: nucleus; scale bar = 10 μm
3 討論
肝癌是一種常見的惡性腫瘤，具有發展快、預后差、易復發和病死率高等特點，而這些均與腫瘤細胞極易發生遷移、侵襲和轉移的特性密切相關。遷移是一個多步驟的復雜過程，受到腫瘤微環境中多種因素的調控，如血管內皮細胞等基質細胞的影響，多種細胞因子、生長因子和趨化因子的調節等[17]。已有研究表明，在微環境中，腫瘤細胞與血管內皮細胞之間存在著各種相互作用，腫瘤細胞可以通過分泌血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）等促進內皮細胞在腫瘤細胞周圍形成新生血管網絡[18]。反之，新生血管中的內皮細胞作為腫瘤微環境的重要組成部分，也會合成并分泌某些細胞因子，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，以協助其轉移到遠端組織。Costanza 等[19]最新的研究證實轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）可通過與整合素 αVβ5 結合來激活粘著斑激酶信號通路，從而使胰腺癌細胞糖酵解作用增強，遷移能力提高。本研究采用間接共培養方式探究了血管內皮細胞 HUVEC 條件培養基對于肝癌細胞 QGY-7703 形態及遷移能力的影響。結果顯示，HUVEC 條件培養基可以促使 QGY-7703 細胞由不規則多邊形的上皮樣向紡錘狀的間充質樣發生轉換（見圖 1）。此外，間接共培養條件下 QGY-7703 細胞的遷移能力明顯提高，且遷移距離隨著共培養時間的增加而增加（見圖 2），說明在腫瘤微環境中，血管內皮細胞的分泌因子可以促進肝癌細胞的遷移。
EMT 機制近年來被認為是上皮來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的新機制[20-21]。在 EMT 過程中，腫瘤細胞可由上皮表型向間質表型轉化，跨膜蛋白 E-cadherin 被 N-cadherin 所取代，E-cadherin 向胞質移位，表達水平下調，而 N-cadherin 向細胞膜轉移，表達上調。同時，細胞骨架重塑，角蛋白細胞骨架轉化為以 Vimentin 為主的細胞骨架，極性丟失，黏附力下降，從而更有利于遷移和侵襲[22-23]。Rawal 等[24]研究表明，在 HBV 誘導的肝細胞癌中，來自鄰近內皮細胞的分泌因子，如 TGF-β 等會導致乙型肝炎 X 蛋白感染的肝癌細胞中 CD133 的表達升高，并使其轉化為間質表型，轉移能力增強。本研究在間接共培養方式下，探究了血管內皮細胞 HUVEC 的分泌因子對于肝癌細胞 QGY-7703 發生 EMT 的影響。研究結果顯示，一方面，共培養 4 h 和 8 h 后 E-cadherin 表達均顯著下調（見圖 3），而換回正常培養條件之后未觀察到其表達水平的回復，可能是由于 E-cadherin 響應較為滯后；另一方面，共培養 8 h 后可觀察到間充質標志物 N-cadherin 和 Vimentin 的表達均顯著上調（見圖 4）。其中，N-cadherin 的表達量在共培養 4 h 時首先呈下調趨勢，在 8 h 時才顯著上升，而恢復完全培養基之后仍然呈上調趨勢，可能是 N-cadherin 對于共培養條件變化的響應比較緩慢所導致的；而 Vimentin 的表達則呈現時間依賴性，隨著共培養時間的延長而逐漸增加。此外，免疫熒光實驗結果表明，共培養條件下，E-cadherin 往胞質聚集，而 N-cadherin 變化趨勢相反，往胞膜聚集，且在 8 h 時最為顯著（見圖 5）；Vimentin 呈現由細胞核向外的放射狀分布，纖維狀結構明顯（見圖 6）。位于細胞膜的 E-cadherin 隨著共培養時間的增加逐漸減少，而由黏附力更低的 N-cadherin 所取代，導致細胞與細胞之間的黏附性降低，同時 Vimentin 形成的纖維狀骨架結構更加明顯，細胞由原來排列緊密的多邊形變為排列松散的紡錘狀形態，極性改變，使得細胞的遷移能力大大提高。以上結果說明血管內皮細胞分泌的因子可以誘導肝癌細胞發生 EMT。研究顯示，抑制 E-cadherin 需要表達多種 EMT 轉錄因子，如 Snail、Twist 等。在Ⅲ型 EMT 過程中，Twist 可不依賴 Snail 獨立發揮抑制 E-cadherin 表達而增強 N-cadherin 表達的作用，Twist 也是 EMT 形成的標志物[25]。盡管如此，Twist 等轉錄因子最終也是通過調節其他蛋白的表達從而參與 EMT 過程，因此 E-cadherin、N-cadherin 可作為 EMT 發生的更重要的標志物。HUVEC 條件培養基誘導肝癌細胞發生 EMT 的具體分子機制仍有待更深層次的驗證。
研究表明條件培養基是個具有多種成分的復雜體系，HUVEC 條件培養基中包含了各種生物因子，比如蛋白質、脂質、核酸和外泌體等，它們都有可能參與影響肝癌細胞的 EMT 過程[26-27]。Zhuang 等[28]發現，癌相關成纖維細胞的條件培養基中 TGFβ1 的含量相比正常成纖維細胞的條件培養基更多，且可以通過 lncRNA-ZEB2NAT 誘導膀胱癌細胞發生 EMT。另有研究認為，前列腺癌相關成纖維細胞分泌的外泌體可以促進前列腺癌細胞發生 EMT，該作用是通過外泌體中的 miRNA-21 實現的[29]。HUVEC 條件培養基中具體是哪種成分在促進肝癌細胞 EMT 中起到決定性作用仍有待探索。
綜上所述，本研究采用間接共培養模型，驗證了血管內皮細胞 HUVEC 分泌或代謝產生的物質可誘導肝癌細胞 QGY-7703 發生 EMT，進而影響肝癌細胞的遷移，有望為深入探究腫瘤轉移的分子機制提供一定的理論依據，也為探索新的肝癌治療策略提供思路。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
肝癌是臨床最難治療的惡性腫瘤之一，2018 年其致死率在常見癌癥中高居第四位，僅次于肺癌、結直腸癌和胃癌[1]。肝癌細胞的侵襲和轉移能力是導致肝癌預后較差的重要因素。腫瘤發生、生長及轉移需要一定的內部環境，即腫瘤微環境，它是由腫瘤細胞、內皮細胞等多種基質細胞以及細胞因子、細胞外基質等構成的多成分復雜體系，在腫瘤生長、血管新生、腫瘤細胞的遷移和侵襲中均發揮了十分重要的作用[2]。其中，腫瘤血管新生是腫瘤發生發展中的關鍵環節，對于維持腫瘤微環境的穩定性至關重要[3-4]。腫瘤細胞與微環境之間相互依存而又相互影響，已有研究表明，腫瘤細胞可以通過分泌血管生成因子等活性物質，來募集內皮細胞，使內皮細胞在腫瘤細胞周圍形成新生血管網絡[5]。另外，新生血管也會通過旁分泌作用釋放某些生物因子，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[6]，但其具體的調控機制目前尚不十分清楚。
多項研究表明，上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要機制，也是腫瘤發生惡性進展的重要特征之一[7-8]。EMT 是指上皮細胞在一定條件下（如受到細胞外因子刺激）通過特定程序轉化為間質表型細胞的過程。該過程中，細胞頂端基底極性丟失，胞間黏附連接降解，細胞形態發生改變，遷移和侵襲能力增強[9-10]。此外，在上皮表型向間充質表型的轉化過程中也常常伴隨著上皮標志物如 E-鈣粘蛋白（E-cadherin）表達水平的下調和間充質標志物如 N-鈣粘蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）表達水平的上調[11-12]，細胞骨架也會發生重塑，角蛋白細胞骨架轉化為以 Vimentin 為主的細胞骨架[13]。其中，E-cadherin 是調節細胞間黏附的主要分子，通過與 β-連環蛋白（β-catenin）直接結合形成蛋白復合體，連接到肌動蛋白細胞骨架，從而形成細胞間黏附連接，維持上皮細胞的極性和組織的完整性，使細胞的遷移和侵襲性受到抑制[14]。EMT 過程中，E-cadherin 表達下調，位于細胞膜的 E-cadherin 被 N-cadherin 所取代，N-cadherin 表達上調。由于 N-cadherin 在細胞間的連接能力比 E-cadherin 弱，導致細胞間的黏附力降低，胞間連接減少，細胞獲得遷移能力更強的間質細胞表型特征[15]。以往的研究均集中在腫瘤微環境中某單一因子對于腫瘤細胞遷移及侵襲能力的影響，但血管內皮細胞釋放的各種因子對腫瘤細胞遷移及侵襲過程中的 EMT 起到多大的促進作用尚不明確。
共培養模型是體外研究血管內皮細胞與腫瘤細胞之間相互作用的常用模型，主要分為直接式和間接式[16]。為探究血管內皮細胞對于腫瘤細胞 EMT 的影響，我們可以簡單地通過收集血管內皮細胞的培養基（條件培養基），然后用它對腫瘤細胞進行培養來形成一種間接的共培養方式。
本研究以肝癌細胞 QGY-7703 為研究對象，將其與血管內皮細胞條件培養基進行共培養并設置不同的培養時間，探究間接共培養條件下，肝癌細胞形態、遷移能力及 EMT 相關蛋白表達和分布的變化，從而揭示腫瘤微環境中血管內皮細胞所分泌的因子對于肝癌細胞 EMT 行為的影響，以期為肝癌治療提供新的視角和思路。
1 材料和方法
1.1 材料和試劑
實驗所用人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）株購自江蘇省血液研究所，人肝癌細胞系 QGY-7703 購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；RPMI-1640 培養基購自 Gibco 公司（美國）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自中喬新舟公司（上海）；青霉素-鏈霉素溶液和胰蛋白酶購自 HyClone 公司（美國）；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）購自中杉金橋公司（北京）；E-cadherin、N-cadherin 一抗購自 CST 公司（美國），Vimentin 一抗購自 Santa Cruz 公司（美國），GAPDH 一抗、辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗購自 SAB 公司（美國），FITC 和 TRITC 標記的二抗購自中杉金橋公司（北京）；Hoechst33342 染色液購自貝博生物科技公司（上海）。
1.2 細胞培養
將 HUVEC 接種于含有 10% FBS、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素的 RPMI-1640 完全培養基中，置于含有 5% CO2 的 37℃ 恒溫細胞培養箱中靜置培養。待細胞生長至 80%～90% 融合，用 0.25% 胰蛋白酶消化后傳代培養。取對數生長期的細胞進行后續實驗。QGY-7703 細胞培養方法與 HUVEC 相同。
1.3 HUVEC 條件培養基的制備
當 HUVEC 融合度達 90% 時，棄去原有培養基，用無菌 PBS 清洗 3 次，然后加入適量無血清 RPMI-1640 培養基饑餓處理，約 24 h 后收集培養基，于 1 000 r/min 條件下離心 10 min 以除去培養基中懸浮的細胞，取上清液，即為 HUVEC 條件培養基。置于?20℃ 保存備用。
1.4 細胞形態學觀察
當 QGY-7703 細胞接近融合時，棄去原有培養基，用無菌 PBS 清洗 3 次，然后分別加入制備好的 HUVEC 條件培養基，于培養箱中靜置培養，分別培養 0、2、4、8、8 + 4、8 + 8 h（后兩組分別用條件培養基培養 8 h 后再換回 RPMI-1640 完全培養基繼續培養 4 h 或 8 h）后，置于倒置相差顯微鏡（CK X 41 型，Olympus，日本）下觀察細胞形態，并隨機選取五個視野拍照記錄。
1.5 劃痕實驗——細胞遷移能力分析
待 QGY-7703 細胞形成單層融合后，將培養基換成無血清 RPMI-1640 培養基饑餓處理過夜。然后棄去培養基，PBS 清洗后分別加入制備好的 HUVEC 條件培養基，處理 0、2、8 h，用直尺和滅菌處理的細胞刮刀或者微量移液槍的槍尖在單層細胞上刮出一條均勻的劃痕（大約 500 μm 寬）。用 PBS 小心清洗 3 次后加入無血清 RPMI-1640 培養基，于培養箱中靜置培養，在各時間點（0、6、12、24 h）置于倒置相差顯微鏡（CK X 41 型，Olympus，日本）下觀察細胞遷移情況，分別隨機選取三個視野拍照記錄。
1.6 Western blot 實驗
當培養瓶中的 QGY-7703 細胞融合度達 90% 時，將培養基換成 HUVEC 條件培養基處理 0、4、8、8 + 4 h 后，用 4℃ 預冷的 PBS 清洗 3 次，RIPA 裂解液裂解后離心，即得到總蛋白樣品。用 BCA 法測定蛋白樣品的濃度，經煮沸變性后，等量的蛋白（30 μg）被加入聚丙烯酰胺凝膠樣品孔中。電泳分離、轉膜完成后，PVDF 膜置于含有 5% 脫脂奶粉和 0.05% 吐溫-20 的 TBST 中室溫封閉 2～3 h。加入稀釋的 GAPDH（1∶5 000）、E-cadherin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶200）等一抗反應液，4℃ 輕搖孵育過夜。TBST 洗膜三次后加入稀釋的 HRP 標記的二抗（山羊抗小鼠 IgG/山羊抗兔 IgG，1∶5 000）反應液，室溫輕搖孵育 1 h，最后進行 ECL 顯影。用 Image Lab 軟件對圖像進行灰度分析后，將目的蛋白與內參的灰度值的比值作為半定量指標。
1.7 免疫熒光實驗
將 QGY-7703 細胞制成細胞懸液，均勻接種于 14 mm 圓形細胞爬片上，待融合度達 90% 時，用 HUVEC 條件培養基處理 0、4、8、8 + 4 h。經 PBS 清洗 2 次后，用 4% 多聚甲醛室溫固定 30 min，接著，樣品在 5% 山羊血清中室溫封閉 30 min。加入用 1% 山羊血清稀釋的 E-cadherin（1∶200）、N-cadherin（1∶200）、Vimentin（1∶50）等一抗，4℃ 孵育過夜。PBS 清洗 3 次后加入 FITC 標記的山羊抗兔 IgG 第二抗體（1∶25）和 TRITC 標記的山羊抗小鼠 IgG 第二抗體（1∶25），室溫孵育 1 h。PBS 清洗 3 次后，用 1 × 染色緩沖液按 1∶100 比例稀釋 Hoechst33342 染色液，加入樣品中室溫孵育 10 min，再用 PBS 清洗 4 次后封片。在激光掃描共聚焦顯微鏡（LSM710，蔡司，德國）下觀察并拍照記錄。
1.8 統計學分析
實驗所得數據以均值 ± 標準差表示，用 SPSS 統計軟件對數據進行分析，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和 Tukey’s 檢驗對各組數據進行統計分析。P < 0.05 表示差異有統計學意義。
2 結果
2.1 間接共培養條件下肝癌細胞形態的變化
用 HUVEC 條件培養基分別處理 QGY-7703 細胞不同時間后，于倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞的形態變化。如圖 1 所示，對照組 QGY-7703 細胞呈不規則的多邊形，且胞間排列緊密，呈現出上皮樣特征。共培養 2 h 后，部分細胞發生紡錘形改變，胞體拉伸，呈現出間質樣特征。隨著條件培養基處理時間的延長，4、8 h 組細胞逐漸由多邊形變為紡錘形，長短軸之比顯著增加。而將條件培養基換回 RPMI-1640 完全培養基繼續培養 4 h 或 8 h 后（8 + 4、8 + 8 h），細胞形態又逐步恢復為與對照組類似的不規則多邊形，長短軸之比降低。
圖1
間接共培養條件下 QGY-7703 細胞形態的變化及長短軸之比的統計圖
標尺 = 10 μm；*，
scale bar = 10 μm; *,
2.2 間接共培養條件下肝癌細胞遷移能力的變化
為檢測共培養條件下 QGY-7703 細胞遷移能力的變化，用 HUVEC 條件培養基分別培養 QGY-7703 細胞 0、2、8 h，然后對細胞進行劃痕實驗，在 0、6、12、24 h 等時間點記錄細胞的遷移距離。如圖 2 所示，共培養 2 h 后的細胞在 24 h 時的遷移距離較對照組而言顯著提高（P < 0.05），共培養 8 h 后的細胞在各個觀察時間點的遷移距離均顯著高于對照組（P < 0.05），并且遷移距離隨著共培養時間的延長而增加。以上結果表明，HUVEC 條件培養基可以促進肝癌細胞的遷移，且遷移能力與共培養時間呈現正相關性。
圖2
間接共培養條件下 QGY-7703 細胞遷移情況的顯微鏡照片及遷移距離的統計圖
標尺 = 500 μm；*，
scale bar = 500 μm; *,
2.3 間接共培養條件下肝癌細胞上皮標志物表達的變化
為探究間接共培養條件下血管內皮細胞對肝癌細胞 EMT 的影響，我們采用 Western blot 實驗檢測共培養后肝癌細胞中典型上皮標志物 E-cadherin 的表達變化。如圖 3 所示，采用 HUVEC 條件培養基對 QGY-7703 細胞進行處理后，與對照組比較，E-cadherin 的表達顯著下調，并且隨著共培養時間的延長而逐漸降低。當換回 RPMI-1640 完全培養基繼續培養 4 h 后，E-cadherin 表達量繼續降低。以上結果說明 HUVEC 條件培養基可以下調肝癌細胞 QGY-7703 中上皮標志物 E-cadherin 的表達，且呈現一定程度的時間依賴性。
圖3
間接共培養條件下 QGY-7703 細胞中上皮標志物 E-cadherin 的表達水平和相對表達量的統計圖
*，
*,
2.4 間接共培養條件下肝癌細胞間充質標志物表達的變化
除上皮標志物的變化外，EMT 過程中還伴隨著 N-cadherin、Vimentin 等間充質標志物表達的上調。Western blot 實驗結果如圖 4 所示，共培養 4 h 時 N-cadherin 的表達首先呈下降趨勢；但隨著時間的延長，共培養 8 h 后，與對照組相比，N-cadherin 的表達出現顯著上調；換回 RPMI-1640 完全培養基之后與共培養 8 h 相比并沒有顯著差異。而 Vimentin 在共培養 4 h 和 8 h 時表達量均出現明顯升高，且隨著時間的延長而逐漸增加；在共培養 8 h 后換回 RPMI-1640 完全培養基繼續培養 4 h，Vimentin 的表達又顯著降低，與對照組相比差異無統計學意義。這說明 HUVEC 條件培養基可以上調肝癌細胞 QGY-7703 中間充質標志物 N-cadherin 和 Vimentin 的表達。結合上皮標志物的變化情況，證實了在腫瘤微環境中，血管內皮細胞所分泌的因子可以誘導肝癌細胞發生 EMT。
圖4
間接共培養條件下 QGY-7703 細胞中間充質標志物 N-cadherin 和 Vimentin 的表達水平及相對表達量的統計圖*，P < 0.05
Figure4.
The expression level of mesenchymal markers N-cadherin and Vimentin in QGY-7703 cells under indirect co-culture condition and the statistical graph of relative expression
*,
2.5 間接共培養條件下肝癌細胞 EMT 相關蛋白分布的變化
為進一步驗證 HUVEC 條件培養基對于肝癌細胞 QGY-7703 發生 EMT 的影響，我們采用免疫熒光實驗檢測了在共培養條件下，QGY-7703 細胞中 E-cadherin、N-cadherin 及 Vimentin 的分布變化，實驗結果如圖 5、圖 6 所示。圖 5 顯示，在對照組中，E-cadherin 主要分布在胞質和胞膜區域，其中胞質區域所占比例較大，而 N-cadherin 雖也分布在胞質和胞膜，但胞膜區域所占比例較大。HUVEC 條件培養基刺激 4 h 后，E-cadherin 和 N-cadherin 的分布均發生明顯變化，E-cadherin 逐漸往胞質聚集，而 N-cadherin 變化趨勢相反，逐漸往胞膜聚集。隨著共培養時間的延長，上述變化趨勢更加明顯，8 h 時，E-cadherin 基本全部定位在胞質區域，N-cadherin 大部分定位在細胞膜上。換回 RPMI-1640 完全培養基培養 4 h 后，E-cadherin 和 N-cadherin 的分布恢復為類似對照組的情況，部分 E-cadherin 轉移到細胞膜，而大部分 N-cadherin 回到胞質中。圖 6 顯示，與 Western blot 結果一致，在對照組中 Vimentin 的表達相對較低，纖維狀結構較少，共培養后其表達出現上調，且呈現由細胞核向外的放射狀分布，纖維狀結構明顯。以上結果說明 HUVEC 條件培養基可以影響肝癌細胞 QGY-7703 中 EMT 相關蛋白的分布，進一步證實血管內皮細胞所分泌的因子可以促進肝癌細胞 EMT 的發生。
圖5
間接共培養條件下 QGY-7703 細胞中 E-cadherin 和 N-cadherin 分布的變化
綠色熒光：E-cadherin；紅色熒光：N-cadherin；標尺 = 20 μm
Figure5. The changes of distribution of E-cadherin and N-cadherin in QGY-7703 cells under indirect co-culture conditiongreen: E-cadherin; red: N-cadherin; scale bar = 20 μm
圖6
間接共培養條件下 QGY-7703 細胞中 Vimentin 分布的變化
紅色熒光：Vimentin；藍色熒光：細胞核；標尺 = 10 μm
Figure6. The changes of distribution of Vimentin in QGY-7703 cells under indirect co-culture conditionred: Vimentin; blue: nucleus; scale bar = 10 μm
3 討論
肝癌是一種常見的惡性腫瘤，具有發展快、預后差、易復發和病死率高等特點，而這些均與腫瘤細胞極易發生遷移、侵襲和轉移的特性密切相關。遷移是一個多步驟的復雜過程，受到腫瘤微環境中多種因素的調控，如血管內皮細胞等基質細胞的影響，多種細胞因子、生長因子和趨化因子的調節等[17]。已有研究表明，在微環境中，腫瘤細胞與血管內皮細胞之間存在著各種相互作用，腫瘤細胞可以通過分泌血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）等促進內皮細胞在腫瘤細胞周圍形成新生血管網絡[18]。反之，新生血管中的內皮細胞作為腫瘤微環境的重要組成部分，也會合成并分泌某些細胞因子，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，以協助其轉移到遠端組織。Costanza 等[19]最新的研究證實轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）可通過與整合素 αVβ5 結合來激活粘著斑激酶信號通路，從而使胰腺癌細胞糖酵解作用增強，遷移能力提高。本研究采用間接共培養方式探究了血管內皮細胞 HUVEC 條件培養基對于肝癌細胞 QGY-7703 形態及遷移能力的影響。結果顯示，HUVEC 條件培養基可以促使 QGY-7703 細胞由不規則多邊形的上皮樣向紡錘狀的間充質樣發生轉換（見圖 1）。此外，間接共培養條件下 QGY-7703 細胞的遷移能力明顯提高，且遷移距離隨著共培養時間的增加而增加（見圖 2），說明在腫瘤微環境中，血管內皮細胞的分泌因子可以促進肝癌細胞的遷移。
EMT 機制近年來被認為是上皮來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的新機制[20-21]。在 EMT 過程中，腫瘤細胞可由上皮表型向間質表型轉化，跨膜蛋白 E-cadherin 被 N-cadherin 所取代，E-cadherin 向胞質移位，表達水平下調，而 N-cadherin 向細胞膜轉移，表達上調。同時，細胞骨架重塑，角蛋白細胞骨架轉化為以 Vimentin 為主的細胞骨架，極性丟失，黏附力下降，從而更有利于遷移和侵襲[22-23]。Rawal 等[24]研究表明，在 HBV 誘導的肝細胞癌中，來自鄰近內皮細胞的分泌因子，如 TGF-β 等會導致乙型肝炎 X 蛋白感染的肝癌細胞中 CD133 的表達升高，并使其轉化為間質表型，轉移能力增強。本研究在間接共培養方式下，探究了血管內皮細胞 HUVEC 的分泌因子對于肝癌細胞 QGY-7703 發生 EMT 的影響。研究結果顯示，一方面，共培養 4 h 和 8 h 后 E-cadherin 表達均顯著下調（見圖 3），而換回正常培養條件之后未觀察到其表達水平的回復，可能是由于 E-cadherin 響應較為滯后；另一方面，共培養 8 h 后可觀察到間充質標志物 N-cadherin 和 Vimentin 的表達均顯著上調（見圖 4）。其中，N-cadherin 的表達量在共培養 4 h 時首先呈下調趨勢，在 8 h 時才顯著上升，而恢復完全培養基之后仍然呈上調趨勢，可能是 N-cadherin 對于共培養條件變化的響應比較緩慢所導致的；而 Vimentin 的表達則呈現時間依賴性，隨著共培養時間的延長而逐漸增加。此外，免疫熒光實驗結果表明，共培養條件下，E-cadherin 往胞質聚集，而 N-cadherin 變化趨勢相反，往胞膜聚集，且在 8 h 時最為顯著（見圖 5）；Vimentin 呈現由細胞核向外的放射狀分布，纖維狀結構明顯（見圖 6）。位于細胞膜的 E-cadherin 隨著共培養時間的增加逐漸減少，而由黏附力更低的 N-cadherin 所取代，導致細胞與細胞之間的黏附性降低，同時 Vimentin 形成的纖維狀骨架結構更加明顯，細胞由原來排列緊密的多邊形變為排列松散的紡錘狀形態，極性改變，使得細胞的遷移能力大大提高。以上結果說明血管內皮細胞分泌的因子可以誘導肝癌細胞發生 EMT。研究顯示，抑制 E-cadherin 需要表達多種 EMT 轉錄因子，如 Snail、Twist 等。在Ⅲ型 EMT 過程中，Twist 可不依賴 Snail 獨立發揮抑制 E-cadherin 表達而增強 N-cadherin 表達的作用，Twist 也是 EMT 形成的標志物[25]。盡管如此，Twist 等轉錄因子最終也是通過調節其他蛋白的表達從而參與 EMT 過程，因此 E-cadherin、N-cadherin 可作為 EMT 發生的更重要的標志物。HUVEC 條件培養基誘導肝癌細胞發生 EMT 的具體分子機制仍有待更深層次的驗證。
研究表明條件培養基是個具有多種成分的復雜體系，HUVEC 條件培養基中包含了各種生物因子，比如蛋白質、脂質、核酸和外泌體等，它們都有可能參與影響肝癌細胞的 EMT 過程[26-27]。Zhuang 等[28]發現，癌相關成纖維細胞的條件培養基中 TGFβ1 的含量相比正常成纖維細胞的條件培養基更多，且可以通過 lncRNA-ZEB2NAT 誘導膀胱癌細胞發生 EMT。另有研究認為，前列腺癌相關成纖維細胞分泌的外泌體可以促進前列腺癌細胞發生 EMT，該作用是通過外泌體中的 miRNA-21 實現的[29]。HUVEC 條件培養基中具體是哪種成分在促進肝癌細胞 EMT 中起到決定性作用仍有待探索。
綜上所述，本研究采用間接共培養模型，驗證了血管內皮細胞 HUVEC 分泌或代謝產生的物質可誘導肝癌細胞 QGY-7703 發生 EMT，進而影響肝癌細胞的遷移，有望為深入探究腫瘤轉移的分子機制提供一定的理論依據，也為探索新的肝癌治療策略提供思路。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
