骨組織工程是目前治療大段骨缺損措施中最有發展前景的途徑之一，體外構建骨組織工程移植體時常采用生物反應器對細胞—支架復合體進行灌流培養，以獲得具有良好修復效果的骨組織工程移植體。但目前對這一過程中種子細胞（特別是干細胞）生長率的理論建模還不完善，尤其是忽略了干細胞與終末細胞的差異。在本實驗室前期研究基礎上，本文利用實驗室自制的灌流裝置對細胞支架復合體施加不同模式和大小的流體剪切力刺激，考察流體剪切力對間充質干細胞（MSCs）增殖和成骨分化的影響，建立了流體剪切力作用對 MSCs 單個細胞生長率影響的回歸分析模型。結果表明，0.022 5 Pa 振蕩剪切力更能促進 MSCs 增殖和成骨分化，同時修正了流體剪切力作用下 MSCs 單個細胞生長率的理論模型。基于以上結果，希望本文研究可為骨組織工程移植體體外灌流培養條件的優化提供理論指導。
引用本文： 李強, 楊力, 呂永鋼. 流體剪切力作用下間充質干細胞在三維支架上生長率理論模型的優化. 生物醫學工程學雜志, 2019, 36(5): 795-802. doi: 10.7507/1001-5515.201904025 復制
引言
骨組織中的主要細胞都是貼壁細胞，基質力學和拓撲結構均會影響其黏附、遷移和增殖能力[1]，可介導細胞的成骨分化[2]和骨重塑過程[3]。流體剪切力是骨組織中另一重要的力學刺激，人體正常活動過程中的力學負載、肌肉收縮、血壓和淋巴引流都能在骨組織中產生流體剪切力作用[4]。基質剛度和流體剪切力在調控骨祖細胞的生物學行為中均起關鍵作用[5]，因此構建與體內骨組織類似的力學微環境有助于提高骨組織工程移植體的修復效果。本課題組前期通過將不同比例的膠原和羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）混合物表襯在脫細胞骨支架上，制備出一種新穎的微結構一致而基質剛度不同的三維（three-dimensional，3D）支架，實驗結果證實該支架能夠促進大鼠骨髓來源間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的黏附、生長及成骨分化，有助于在體招募 MSCs，誘導其分化為成骨細胞，并為血管生成提供適宜的 3D 微環境[6]。體外實驗進一步證實，流體剪切力有助于進一步提高適宜剛度支架的骨修復能力[7]。
目前，組織工程中常用的生物反應器可為細胞支架復合體提供一種動態力學環境，即在均勻地提供營養物質的同時對細胞施加一定的剪切力刺激[8]，使之克服體外靜態培養引起的營養物質供應不足和代謝廢物排放不暢等缺陷。Raimondi 等[9]發現對復合細胞的 3D 支架施加 1.5～13.5 mPa 的流體剪切力刺激，能夠提高小鼠胚胎成骨細胞前體細胞 MC3T3-E1 的活性。剪切力在 0.05～25 mPa 范圍內能夠通過改善該細胞的遷移和黏附，明顯提高種子細胞的活力和增殖能力[10]。MSCs 的分化也受剪切力大小的調節，有研究表明，低剪切力（0.2 Pa）能夠促進 MSCs 向內皮細胞分化，而高剪切力（1 Pa）則會阻礙 MSCs 向內皮細胞的分化，促進其向平滑肌細胞的分化[11]。流體剪切力的加載速率也能夠介導 MSCs 向不同譜系分化，MSCs 直接加載 1 Pa 剪切力 20 min 后，向軟骨樣細胞分化；在 0～2 min 內剪切力逐漸從 0 增加到 1 Pa 然后保持 20 min，能夠促進 MSCs 向成骨樣細胞分化；而在 0～20 min 內剪切力逐漸從 0 增加到 1 Pa 時，MSCs 沒有明顯的分化傾向[12]。由此可見，體外培養過程中，選擇施加不同大小和模式的剪切力對骨組織工程具有非常重要的意義，因此建立流體剪切力作用下細胞生長動力學模型，可為剪切力加載過程控制和優化提供理論依據。
早在 1959 年 Contois[13]就建立了細菌生長動力學模型，而為研究動植物細胞體外培養的生長規律，近年來多位研究人員對此模型進行了修正。例如，Galban 等[14]考慮到營養供應和細胞接觸抑制作用，修正了 Contois 生長動力學模型，使之能夠更準確地描述軟骨細胞生長。Liu 等[15]根據 Gemmiti 等[16]和 Li 等[17]的實驗數據，考慮到剪切力對細胞生長的影響，對軟骨細胞生長率作了進一步修正，得到單個細胞生長率 K 如式（1）所示：
 |
其中，Rg 是最大細胞生長率（單位為：s?1），Kc 是 Contois 飽和常數，Rd 是細胞死亡率（單位為：s?1），ρcell 是細胞的質量密度（單位為：g/cm3），τ 是細胞受到的局部流體剪切力（單位為：Pa），σβ 是細胞相體積，Cβ 是氧濃度（單位為：mol/cm3），a 和 b 是任意常數。但將上述模型應用于干細胞仍然存在局限性，譬如該模型沒有考慮流體剪切力對干細胞分化的影響。基于此，本文將大鼠骨髓來源 MSCs 種植到實驗室前期制備的具有適宜剛度的脫細胞骨支架材料[局部剛度為（37.70 ± 19.60）kPa]上，利用實驗室自制的灌流裝置對細胞支架復合體施加不同大小和模式的流體剪切力刺激，分析不同剪切力下 MSCs 增殖的實驗結果，建立流體剪切力作用對 MSCs 單個細胞生長率影響的回歸分析模型，以期為 MSCs 體外灌流培養條件的優化提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
本文主要試劑：脫氧核糖核酸酶Ⅰ（deoxyribonuclease I，DNase I）（Sigma-Aldrich，美國）、聚乙二醇對異辛基苯基醚 Triton X-100（Sigma-Aldrich，美國）、甲醇（川東化工，中國）、無水乙醇（川東化工，中國）、低糖達爾伯克改良伊格爾培養基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）（Gibco，美國）、Ⅰ型膠原（上海物竟化工，中國）、胎牛血清[Natocor-Industria Biológica（NTC），阿根廷]、胰蛋白酶（索萊寶，中國）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）（索萊寶，中國）、葡聚糖（索萊寶，中國）、熒光染料雙苯并咪唑 Hoechst 33258（Sigma-Aldrich，美國）、多聚甲醛（川東化工，中國）、骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）抗體（Bioss，中國）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）抗體（Abcam，英國）、兔鏈霉卵白素-生物素法檢測系統（北京中杉金橋，中國）、馬松（Masson）三染色試劑盒（南京建成，中國），蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining，H-E）染色試劑盒（Beyotime，中國）。
此外，還包括：
（1）HA：通過四水硝酸鈣（科龍化工，中國）和十二水磷酸三鈉（科龍化工，中國）制備。
（2）TNE 緩沖液：由 10 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷（索萊寶、中國）、1 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉（上海生工，中國）和 1 mol/L 氯化鈉（川東化工，中國）配制。
（3）裂解液：由 50 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉、1 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉和 0.1% Triton X-100 配制。
本文主要儀器：可編程精密注射泵（Harvard，美國）、CO2 培養箱（Forma Steri-Cult，Thermo Scientific，美國），多功能酶標儀（Infinite F200 Pro，Tecan，瑞士）。
1.2 大鼠 MSCs 分離和培養
斯潑累格·多雷（Sprague Dawley，SD）大鼠，體重為 130～150 g，雌性，購自陸軍軍醫大學大坪醫院實驗動物中心。動物研究實驗得到重慶大學動物倫理委員會的批準。
取 SD 大鼠，引頸處死后，無菌條件下取雙側股骨與脛骨，暴露骨髓腔，用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基反復沖洗骨髓腔，充分吹打混勻，然后分裝至培養瓶，在 37℃、5% CO2、飽和濕度環境培養。待培養瓶中細胞融合度約為 80%～90% 時，使用 0.25% 胰蛋白酶消化，按 1：3 傳代擴增，取第四代的 MSCs 用于后續實驗。
1.3 支架制備
參照本實驗室前期研究成果[6]，截取豬股骨頭的松質骨，制備成直徑為 10 mm、高為 5 mm 的圓柱體，依次進行 1% Triton X-100 溶液脫細胞處理 48 h，甲醇脫脂處理 36 h，DNase I 37℃ 溫育 2 h，無水乙醇振蕩處理 4 h，然后用去離子水清洗干凈后，37℃ 干燥，獲得脫細胞骨支架。將制備好的脫細胞骨支架浸入質量分數為 0.7% 的膠原和 22% 的 HA 混合溶液（膠原/HA）中 6 h，輕輕攪拌，使脫細胞骨支架表面均勻包被膠原/HA 混合溶液，然后進行冷凍干燥 24 h，最后通過 60Co γ 射線（25 kGy）滅菌后，無菌密封后干燥保存，備用。
1.4 細胞接種及流體剪切力加載
參照實驗室前期研究成果[7]，由可編程精密注射泵、3D 流動腔、儲液瓶、注射器和軟管連接成灌流裝置，其中 3D 流動腔是由 4 個獨立的灌注腔體組成。將 20 μL MSCs 細胞懸液（5 × 106 個/mL）均勻滴加到預先濕潤的支架上，4 h 后加入 3 mL 含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基置于 CO2 培養箱培養。靜態培養 48 h 后，將支架轉移至灌流裝置內，采用單向流（1 mL/min，30 min/d）或者振蕩流（1 mL/min，1/60 Hz，30 min/d）進行灌流實驗，在不同時間點（0、3、5、7、10、14、16、18、21 d）取樣進行檢測。
實驗中，通過添加不同濃度的葡聚糖改變灌流培養液粘度，從而實現在不改變流量的前提下改變剪切力，避免營養物質濃度的影響。參照文獻[18]提供的剪切力范圍，本文通過添加質量分數分別為 0%、3.5%、6% 的葡聚糖，使流體剪切力大小分別為 0.007 5 Pa、0.015 0 Pa、0.022 5 Pa。
1.5 DNA 定量
取細胞支架復合物，PBS 清洗兩遍，在無菌條件下搗碎支架并加入 500 μL 的裂解液，室溫裂解 2～4 h。依次超聲 30 s，渦旋 5～10 s，5 000 r/min 離心 2 min，取上清液作為待測樣品。在 96 孔板中分別加入 90 μL TNE 緩沖液、10 μL 待測樣品和 100 μL（20 μg/mL）的 Hoechst 檢測溶液，避光孵育 5 min，使用多功能酶標儀在激發波長 360 nm 和發射波長 465 nm 條件下檢測熒光強度，根據標準曲線計算出樣品的 DNA 總量，根據每個 MSCs 細胞的 DNA 含量（6.2 pg）計算出細胞數量[19]。
1.6 組織學染色
將不同時間點的細胞支架復合物取樣后通過 4% 的多聚甲醛固定，然后進行脫鈣處理，制作成常規石蠟切片。然后將切片脫蠟、梯度水化根據不同試劑盒的操作過程進行 H-E、Masson 染色以及免疫組化 OPN 和 OCN 染色。
1.7 流體剪切力對單個細胞生長率影響模型的建立
不同培養條件下，MSCs 細胞在 t + Δt 時刻的單個細胞生長率 
，其計算公式如式（2）所示：
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其中，
和 
分別為 
和 
時刻的細胞數量，
為時間增量（單位為：s）。
的取值為 0、3、5、7、10、14、16、18 d，
的取值為 2、3、4 d。
流體剪切力對單個細胞生長率的影響表示為灌流培養條件與靜態培養條件下單個細胞生長率的差值。單向流體剪切力對單個細胞生長率的影響記為 g（τ，t）= Kg ? Ks，振蕩流體剪切力對單個細胞生長率的影響記為 f（τ，t）= Kf ? Ks，其中 Kg 代表單向流體剪切力下單個細胞生長率，Kf 代表振蕩流體剪切力作用下的單個細胞生長率，Ks 代表靜態培養條件下的單個細胞生長率。根據剪切力作用的大小和模式，對單個細胞生長率差異建立回歸分析模型，擬合流體剪切力對單個細胞生長率的影響。
1.8 統計學分析
本文實驗過程中實驗重復次數 n ≥ 3，統計數據用平均值 ± 標準差來表示，并用數據分析和繪圖軟件 Origin 8.0（OriginLab，美國）進行數據統計分析。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）對實驗數據進行差異性分析，P < 0.05 表示兩組數據之間差異具有統計學意義。使用辦公軟件 Microsoft Office Excel（Microsoft，美國）建立回歸分析模型，同時用統計產品與服務解決方案（statistical product and service solutions，SPSS）軟件（IBM，美國）對模型進行檢驗。
2 結果
2.1 流體剪切力對 MSCs 增殖的影響
為研究不同流體剪切力對 MSCs 增殖的影響，本研究將細胞培養條件設置為靜態培養和加載不同大小的流體剪切力狀態下培養。當培養條件為靜態培養、中等（0.015 0 Pa）和較小（0.007 5 Pa）流體剪切力作用下時，支架上 MSCs 細胞數量隨培養時間延長先增多后減少，但出現峰值的時間點和大小不同，而在較大流體剪切力（0.022 5 Pa）作用下，細胞數量隨培養時間延長持續增加，如圖 1 所示。靜態培養條件下，細胞數量在第 14 d 達到峰值，為 2.28 × 105 個，增殖了（5.26 ± 0.77）倍。0.015 0 Pa 和 0.007 5 Pa 單向流體剪切力作用下，細胞數量分別在 7 d 和 10 d 左右達到峰值，為 2.88 × 105 個（0.015 0 Pa）和 2.20 × 105 個（0.007 5 Pa）。0.015 0 Pa 和 0.007 5 Pa 振蕩流體剪切力作用下，細胞數量在 14 d 達到峰值，分別為 2.80 × 105 個（0.015 0 Pa）和 2.26 × 105 個（0.007 5 Pa）。
圖1
單向和振蕩流體剪切力作用下細胞的生長曲線（n ≥ 3）
Figure1.
Cells growth curve under unidirectional and oscillatory fluid shear stress（n ≥ 3）
2.2 流體剪切力對支架上細胞分布和成骨分化的影響
如圖 2 所示，H-E 染色結果表明，流體剪切力促進了 MSCs 細胞在支架內部的均勻分布和胞外基質分泌，而且振蕩流體剪切力的作用效果優于單向流體剪切力。而 Masson 染色結果顯示，相同模式流體剪切力作用下，流體剪切力較大組（0.022 5 Pa）在 14 d 和 21 d 的膠原分泌量多于剪切力較小的兩組（0.007 5 Pa 和 0.015 0 Pa）。大小相同的流體剪切力作用相同時間后，相較于單向流體剪切力，振蕩流體剪切力作用下膠原分泌量增多。14 d 的免疫組化結果顯示，相同流體剪切力作用模式下，OCN 和 OPN 的表達量都隨剪切力的增大而增加，且相同流體剪切力大小時，振蕩流體剪切力的作用略微高于單向流體剪切力作用，如圖 2 左圖所示。流體剪切力作用 21 d 后，OCN 的表達趨勢與 14 d 的結果較為一致，而各組的 OPN 表達量沒有明顯的差異，如圖 2 右圖所示。因此，在本文實驗條件下，較大的流體剪切力（0.022 5 Pa）更能促 MSCs 細胞成骨分化，且振蕩流體剪切力促成骨分化的效果強于單向流體剪切力。
圖2
流體剪切力作用 14 d 和 21 d 對 MSCs 成骨分化的影響
Figure2.
Effects of fluid shear stress on the osteogenic differentiation of MSCs on 14 d and 21 d
2.3 流體剪切力對單個細胞生長率影響的擬合
分析單向流體剪切力作用對單個細胞生長率的影響 g（τ，t），采用最小二乘法估計參數，得到擬合度達到 0.991 的回歸方程如式（3）所示：
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式（3）中，g（τ，t）表示單向流體剪切力對單個細胞生長率的影響，τ 表示流體剪切力大小，t 表示細胞培養時間。如圖 3 左圖所示，在本文實驗條件下（0～0.022 5 Pa），與靜態培養相比，單向流體剪切力作用前期細胞生長率降低，作用后期又有助于提高細胞生長率。在 0～0.035 0 Pa 范圍內由式（3）獲得的單個細胞生長率與文獻[15]獲得的值在一個數量級范圍（8 × 10?6 s?1），后文將僅針對這一范圍（0～0.035 0 Pa）內的流體剪切力作用進行討論。
圖3
單向和振蕩流體剪切力對單個細胞生長率的影響
Figure3.
Effects of unidirectional and oscillatory fluid shear stress on the single-cell growth rate
同理，獲得振蕩流體剪切力作用對單個細胞生長率的影響 f（τ，t）回歸方程如式（4）所示：
 |
上述回歸方程的擬合度達到 0.990。式（4）中 f（τ，t）表示單向流體剪切力對單個細胞生長率的影響，τ 表示流體剪切力大小，t 表示細胞培養時間。如圖 3 右圖所示，在本文實驗條件下（0～0.022 5 Pa），中與靜態培養相比，振蕩流體剪切力作用 7～17 d 時降低細胞生長率，培養到 17～21 d 時又有助于提高細胞生長率。
2.4 理論模型驗證
將式（3）和式（4）的理論計算值與實驗數據進行比較，實驗值與理論模型計算值基本保持在同一個數量級，且大部分相對誤差小于 30%。參照文獻[20]提供的方法可知，單向流體剪切力下，擬合結果與實驗值的平均相對誤差為 ? 4.39%；振蕩流體剪切力下，擬合結果與實驗值的平均相對誤差為 ? 2.16%；均在 ± 10% 范圍以內。然后，本文運用 SPSS 軟件對單向和振蕩流體剪切力兩種作用模式下擬合的理論值與實驗值進行兩個獨立樣本 t 檢驗和柯爾莫可洛夫—斯米洛夫檢驗（Kolmogorov-Smirnov test，K-S test）[21]，P 值均大于 0.05，表明兩種模式下擬合的理論值與實驗值之間差異沒有統計學意義。因此式（3）和式（4）可作為單向和振蕩流體剪切力作用對單個細胞生長率影響的理論公式，用于理論預測流體剪切力作用下 MSCs 細胞的生長狀況。
如圖 3 所示，顯示了流體剪切力對單個細胞生長率的影響隨培養時間和剪切力大小的變化，表明流體剪切力對單個細胞生長率的影響呈時間依賴性。在本文實驗條件下，當流體剪切力在 0～0.022 5 Pa 范圍時，相同大小的流體剪切力對單個細胞生長率的影響隨著時間呈現先降低后增加的趨勢，g（τ，t）和 f（τ，t）在 7～14 d 時為負數，流體剪切力各組單個細胞生長率低于靜態培養的生長率。可能是因為 0～7 d 時流體剪切力通過激活細胞外調節蛋白激酶 1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK 1/2）信號通路，致使細胞質內 Ca2+ 增加，促進 MSCs 細胞增殖[22]，且流體流動促進了物質運輸也有利于細胞增殖[6]。培養 7 d 后流體剪切力各組細胞數量明顯多于靜態組，細胞傳代多次后，增殖能力逐漸減弱。如 0.015 0 Pa 單向流體剪切力組細胞在 7 d 時增殖大約 6 倍，而靜態組在 7 d 時只增殖約 2 倍，根據復制性衰老現象，此時靜態培養組細胞的增殖能力大于流體剪切力各組。g（τ，t）和 f（τ，t）為負值，說明與靜態培養相比，流體剪切力對單個細胞生長率呈現負影響，但并不意味著加載流體剪切力各組的細胞呈現負增長，如圖 4、圖 5 所示。g（τ，t）和 f（τ，t）在 19～21 d 時為正數，且數值隨著培養時間增加而增大，這可能與流體剪切力能夠促進抗細胞凋亡相關[23]。
圖4
靜態培養和單向流體剪切力作用下單個細胞生長率以及單向流體剪切力作用下單個細胞生長率與靜態培養時的差異
Figure4.
Single-cell growth rate under static culture and unidirectional fluid shear stress，and the difference of single-cell growth rate between static culture and unidirectional fluid shear stress
圖5
振蕩流體剪切力作用下單個細胞生長率以及振蕩流體剪切力作用下單個細胞生長率與靜態培養時的差異
Figure5.
Single-cell growth rate under oscillatory fluid shear stress，and the difference of single-cell growth rate between oscillatory fluid shear stress and static culture
3 討論與總結
組織工程中，利用生物反應器加載流體剪切力刺激可增強營養物質和氧氣的運輸，促進細胞存活[24]。本文首先考察了不同模式和大小的流體剪切力作用對 MSCs 細胞增殖的影響，發現大小為 0.015 0 Pa 和 0.007 5 Pa 的流體剪切力刺激會使 MSCs 細胞數量先增加后減少。Sikavitsas 等[25]利用 0.01 Pa 流體剪切力刺激大鼠 MSCs 細胞也發現細胞數量在 0～8 d 逐漸增加，在 8 d 時達到峰值，而在 8～16 d 逐漸減少。體外培養時，MSCs 細胞增殖能力隨著代數的增加而下降[26]，凋亡能力會增加，當增殖能力和凋亡能力相等時細胞數量停止增加。隨著培養時間的繼續延長，凋亡能力大于增殖能力，細胞數量將會逐漸減少。本文還進一步發現，0.015 0 Pa 和 0.007 5 Pa 流體剪切力刺激初期（0～7 d），單向流體剪切力對細胞增殖的作用更強，Du 等[27]在小鼠成骨樣 MC3T3-E1 細胞上也發現類似的現象。與 0.015 0 Pa 和 0.007 5 Pa 流體剪切力作用不同，0.022 5 Pa 流體剪切力刺激使 MSCs 細胞數量逐漸增加，說明 MSCs 細胞增殖對流體剪切力的響應呈剪切力大小依賴。
與終末細胞不同，流體剪切力不僅會對 MSCs 增殖產生作用，也會影響 MSCs 細胞的分化，本文也發現高剪切力（0.022 5 Pa）促 MSCs 細胞膠原分泌和成骨分化的能力更強，如圖 2 所示。基于此，本文修正了文獻[15]的流體剪切力對單個細胞生長率影響公式（1），其中，單向流體剪切力作用下單個細胞生長率表達式如式（5）所示：
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振蕩流體剪切力作用下單個細胞生長率表達式如式（6）所示：
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式（5）和式（6）中，等式右邊第一項和第二項為營養物質和細胞接觸對細胞增殖的影響，第三項為流體剪切力對 MSCs 增殖的影響，考慮了流體剪切力影響干細胞分化的因素。
綜上，本文利用實驗室前期自制的灌流裝置對種在脫細胞骨支架上大鼠 MSCs 細胞施加了不同模式和大小的流體剪切力刺激，考察了流體剪切力對 MSCs 細胞增殖和成骨分化的影響，結果表明 0.022 5 Pa 的振蕩流體剪切力更有利于 MSCs 細胞的增殖和成骨分化，進一步修正了實驗條件下 MSCs 細胞體外培養的單個細胞生長率隨時間和剪切力變化的理論模型，可為優化 MSCs 細胞體外灌流培養條件提供理論支持。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
骨組織中的主要細胞都是貼壁細胞，基質力學和拓撲結構均會影響其黏附、遷移和增殖能力[1]，可介導細胞的成骨分化[2]和骨重塑過程[3]。流體剪切力是骨組織中另一重要的力學刺激，人體正常活動過程中的力學負載、肌肉收縮、血壓和淋巴引流都能在骨組織中產生流體剪切力作用[4]。基質剛度和流體剪切力在調控骨祖細胞的生物學行為中均起關鍵作用[5]，因此構建與體內骨組織類似的力學微環境有助于提高骨組織工程移植體的修復效果。本課題組前期通過將不同比例的膠原和羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）混合物表襯在脫細胞骨支架上，制備出一種新穎的微結構一致而基質剛度不同的三維（three-dimensional，3D）支架，實驗結果證實該支架能夠促進大鼠骨髓來源間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的黏附、生長及成骨分化，有助于在體招募 MSCs，誘導其分化為成骨細胞，并為血管生成提供適宜的 3D 微環境[6]。體外實驗進一步證實，流體剪切力有助于進一步提高適宜剛度支架的骨修復能力[7]。
目前，組織工程中常用的生物反應器可為細胞支架復合體提供一種動態力學環境，即在均勻地提供營養物質的同時對細胞施加一定的剪切力刺激[8]，使之克服體外靜態培養引起的營養物質供應不足和代謝廢物排放不暢等缺陷。Raimondi 等[9]發現對復合細胞的 3D 支架施加 1.5～13.5 mPa 的流體剪切力刺激，能夠提高小鼠胚胎成骨細胞前體細胞 MC3T3-E1 的活性。剪切力在 0.05～25 mPa 范圍內能夠通過改善該細胞的遷移和黏附，明顯提高種子細胞的活力和增殖能力[10]。MSCs 的分化也受剪切力大小的調節，有研究表明，低剪切力（0.2 Pa）能夠促進 MSCs 向內皮細胞分化，而高剪切力（1 Pa）則會阻礙 MSCs 向內皮細胞的分化，促進其向平滑肌細胞的分化[11]。流體剪切力的加載速率也能夠介導 MSCs 向不同譜系分化，MSCs 直接加載 1 Pa 剪切力 20 min 后，向軟骨樣細胞分化；在 0～2 min 內剪切力逐漸從 0 增加到 1 Pa 然后保持 20 min，能夠促進 MSCs 向成骨樣細胞分化；而在 0～20 min 內剪切力逐漸從 0 增加到 1 Pa 時，MSCs 沒有明顯的分化傾向[12]。由此可見，體外培養過程中，選擇施加不同大小和模式的剪切力對骨組織工程具有非常重要的意義，因此建立流體剪切力作用下細胞生長動力學模型，可為剪切力加載過程控制和優化提供理論依據。
早在 1959 年 Contois[13]就建立了細菌生長動力學模型，而為研究動植物細胞體外培養的生長規律，近年來多位研究人員對此模型進行了修正。例如，Galban 等[14]考慮到營養供應和細胞接觸抑制作用，修正了 Contois 生長動力學模型，使之能夠更準確地描述軟骨細胞生長。Liu 等[15]根據 Gemmiti 等[16]和 Li 等[17]的實驗數據，考慮到剪切力對細胞生長的影響，對軟骨細胞生長率作了進一步修正，得到單個細胞生長率 K 如式（1）所示：
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其中，Rg 是最大細胞生長率（單位為：s?1），Kc 是 Contois 飽和常數，Rd 是細胞死亡率（單位為：s?1），ρcell 是細胞的質量密度（單位為：g/cm3），τ 是細胞受到的局部流體剪切力（單位為：Pa），σβ 是細胞相體積，Cβ 是氧濃度（單位為：mol/cm3），a 和 b 是任意常數。但將上述模型應用于干細胞仍然存在局限性，譬如該模型沒有考慮流體剪切力對干細胞分化的影響。基于此，本文將大鼠骨髓來源 MSCs 種植到實驗室前期制備的具有適宜剛度的脫細胞骨支架材料[局部剛度為（37.70 ± 19.60）kPa]上，利用實驗室自制的灌流裝置對細胞支架復合體施加不同大小和模式的流體剪切力刺激，分析不同剪切力下 MSCs 增殖的實驗結果，建立流體剪切力作用對 MSCs 單個細胞生長率影響的回歸分析模型，以期為 MSCs 體外灌流培養條件的優化提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
本文主要試劑：脫氧核糖核酸酶Ⅰ（deoxyribonuclease I，DNase I）（Sigma-Aldrich，美國）、聚乙二醇對異辛基苯基醚 Triton X-100（Sigma-Aldrich，美國）、甲醇（川東化工，中國）、無水乙醇（川東化工，中國）、低糖達爾伯克改良伊格爾培養基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）（Gibco，美國）、Ⅰ型膠原（上海物竟化工，中國）、胎牛血清[Natocor-Industria Biológica（NTC），阿根廷]、胰蛋白酶（索萊寶，中國）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）（索萊寶，中國）、葡聚糖（索萊寶，中國）、熒光染料雙苯并咪唑 Hoechst 33258（Sigma-Aldrich，美國）、多聚甲醛（川東化工，中國）、骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）抗體（Bioss，中國）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）抗體（Abcam，英國）、兔鏈霉卵白素-生物素法檢測系統（北京中杉金橋，中國）、馬松（Masson）三染色試劑盒（南京建成，中國），蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining，H-E）染色試劑盒（Beyotime，中國）。
此外，還包括：
（1）HA：通過四水硝酸鈣（科龍化工，中國）和十二水磷酸三鈉（科龍化工，中國）制備。
（2）TNE 緩沖液：由 10 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷（索萊寶、中國）、1 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉（上海生工，中國）和 1 mol/L 氯化鈉（川東化工，中國）配制。
（3）裂解液：由 50 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉、1 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉和 0.1% Triton X-100 配制。
本文主要儀器：可編程精密注射泵（Harvard，美國）、CO2 培養箱（Forma Steri-Cult，Thermo Scientific，美國），多功能酶標儀（Infinite F200 Pro，Tecan，瑞士）。
1.2 大鼠 MSCs 分離和培養
斯潑累格·多雷（Sprague Dawley，SD）大鼠，體重為 130～150 g，雌性，購自陸軍軍醫大學大坪醫院實驗動物中心。動物研究實驗得到重慶大學動物倫理委員會的批準。
取 SD 大鼠，引頸處死后，無菌條件下取雙側股骨與脛骨，暴露骨髓腔，用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基反復沖洗骨髓腔，充分吹打混勻，然后分裝至培養瓶，在 37℃、5% CO2、飽和濕度環境培養。待培養瓶中細胞融合度約為 80%～90% 時，使用 0.25% 胰蛋白酶消化，按 1：3 傳代擴增，取第四代的 MSCs 用于后續實驗。
1.3 支架制備
參照本實驗室前期研究成果[6]，截取豬股骨頭的松質骨，制備成直徑為 10 mm、高為 5 mm 的圓柱體，依次進行 1% Triton X-100 溶液脫細胞處理 48 h，甲醇脫脂處理 36 h，DNase I 37℃ 溫育 2 h，無水乙醇振蕩處理 4 h，然后用去離子水清洗干凈后，37℃ 干燥，獲得脫細胞骨支架。將制備好的脫細胞骨支架浸入質量分數為 0.7% 的膠原和 22% 的 HA 混合溶液（膠原/HA）中 6 h，輕輕攪拌，使脫細胞骨支架表面均勻包被膠原/HA 混合溶液，然后進行冷凍干燥 24 h，最后通過 60Co γ 射線（25 kGy）滅菌后，無菌密封后干燥保存，備用。
1.4 細胞接種及流體剪切力加載
參照實驗室前期研究成果[7]，由可編程精密注射泵、3D 流動腔、儲液瓶、注射器和軟管連接成灌流裝置，其中 3D 流動腔是由 4 個獨立的灌注腔體組成。將 20 μL MSCs 細胞懸液（5 × 106 個/mL）均勻滴加到預先濕潤的支架上，4 h 后加入 3 mL 含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基置于 CO2 培養箱培養。靜態培養 48 h 后，將支架轉移至灌流裝置內，采用單向流（1 mL/min，30 min/d）或者振蕩流（1 mL/min，1/60 Hz，30 min/d）進行灌流實驗，在不同時間點（0、3、5、7、10、14、16、18、21 d）取樣進行檢測。
實驗中，通過添加不同濃度的葡聚糖改變灌流培養液粘度，從而實現在不改變流量的前提下改變剪切力，避免營養物質濃度的影響。參照文獻[18]提供的剪切力范圍，本文通過添加質量分數分別為 0%、3.5%、6% 的葡聚糖，使流體剪切力大小分別為 0.007 5 Pa、0.015 0 Pa、0.022 5 Pa。
1.5 DNA 定量
取細胞支架復合物，PBS 清洗兩遍，在無菌條件下搗碎支架并加入 500 μL 的裂解液，室溫裂解 2～4 h。依次超聲 30 s，渦旋 5～10 s，5 000 r/min 離心 2 min，取上清液作為待測樣品。在 96 孔板中分別加入 90 μL TNE 緩沖液、10 μL 待測樣品和 100 μL（20 μg/mL）的 Hoechst 檢測溶液，避光孵育 5 min，使用多功能酶標儀在激發波長 360 nm 和發射波長 465 nm 條件下檢測熒光強度，根據標準曲線計算出樣品的 DNA 總量，根據每個 MSCs 細胞的 DNA 含量（6.2 pg）計算出細胞數量[19]。
1.6 組織學染色
將不同時間點的細胞支架復合物取樣后通過 4% 的多聚甲醛固定，然后進行脫鈣處理，制作成常規石蠟切片。然后將切片脫蠟、梯度水化根據不同試劑盒的操作過程進行 H-E、Masson 染色以及免疫組化 OPN 和 OCN 染色。
1.7 流體剪切力對單個細胞生長率影響模型的建立
不同培養條件下，MSCs 細胞在 t + Δt 時刻的單個細胞生長率 ，其計算公式如式（2）所示：
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其中， 和 分別為 和 時刻的細胞數量， 為時間增量（單位為：s）。 的取值為 0、3、5、7、10、14、16、18 d， 的取值為 2、3、4 d。
流體剪切力對單個細胞生長率的影響表示為灌流培養條件與靜態培養條件下單個細胞生長率的差值。單向流體剪切力對單個細胞生長率的影響記為 g（τ，t）= Kg ? Ks，振蕩流體剪切力對單個細胞生長率的影響記為 f（τ，t）= Kf ? Ks，其中 Kg 代表單向流體剪切力下單個細胞生長率，Kf 代表振蕩流體剪切力作用下的單個細胞生長率，Ks 代表靜態培養條件下的單個細胞生長率。根據剪切力作用的大小和模式，對單個細胞生長率差異建立回歸分析模型，擬合流體剪切力對單個細胞生長率的影響。
1.8 統計學分析
本文實驗過程中實驗重復次數 n ≥ 3，統計數據用平均值 ± 標準差來表示，并用數據分析和繪圖軟件 Origin 8.0（OriginLab，美國）進行數據統計分析。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）對實驗數據進行差異性分析，P < 0.05 表示兩組數據之間差異具有統計學意義。使用辦公軟件 Microsoft Office Excel（Microsoft，美國）建立回歸分析模型，同時用統計產品與服務解決方案（statistical product and service solutions，SPSS）軟件（IBM，美國）對模型進行檢驗。
2 結果
2.1 流體剪切力對 MSCs 增殖的影響
為研究不同流體剪切力對 MSCs 增殖的影響，本研究將細胞培養條件設置為靜態培養和加載不同大小的流體剪切力狀態下培養。當培養條件為靜態培養、中等（0.015 0 Pa）和較小（0.007 5 Pa）流體剪切力作用下時，支架上 MSCs 細胞數量隨培養時間延長先增多后減少，但出現峰值的時間點和大小不同，而在較大流體剪切力（0.022 5 Pa）作用下，細胞數量隨培養時間延長持續增加，如圖 1 所示。靜態培養條件下，細胞數量在第 14 d 達到峰值，為 2.28 × 105 個，增殖了（5.26 ± 0.77）倍。0.015 0 Pa 和 0.007 5 Pa 單向流體剪切力作用下，細胞數量分別在 7 d 和 10 d 左右達到峰值，為 2.88 × 105 個（0.015 0 Pa）和 2.20 × 105 個（0.007 5 Pa）。0.015 0 Pa 和 0.007 5 Pa 振蕩流體剪切力作用下，細胞數量在 14 d 達到峰值，分別為 2.80 × 105 個（0.015 0 Pa）和 2.26 × 105 個（0.007 5 Pa）。
圖1
單向和振蕩流體剪切力作用下細胞的生長曲線（n ≥ 3）
Figure1.
Cells growth curve under unidirectional and oscillatory fluid shear stress（n ≥ 3）
2.2 流體剪切力對支架上細胞分布和成骨分化的影響
如圖 2 所示，H-E 染色結果表明，流體剪切力促進了 MSCs 細胞在支架內部的均勻分布和胞外基質分泌，而且振蕩流體剪切力的作用效果優于單向流體剪切力。而 Masson 染色結果顯示，相同模式流體剪切力作用下，流體剪切力較大組（0.022 5 Pa）在 14 d 和 21 d 的膠原分泌量多于剪切力較小的兩組（0.007 5 Pa 和 0.015 0 Pa）。大小相同的流體剪切力作用相同時間后，相較于單向流體剪切力，振蕩流體剪切力作用下膠原分泌量增多。14 d 的免疫組化結果顯示，相同流體剪切力作用模式下，OCN 和 OPN 的表達量都隨剪切力的增大而增加，且相同流體剪切力大小時，振蕩流體剪切力的作用略微高于單向流體剪切力作用，如圖 2 左圖所示。流體剪切力作用 21 d 后，OCN 的表達趨勢與 14 d 的結果較為一致，而各組的 OPN 表達量沒有明顯的差異，如圖 2 右圖所示。因此，在本文實驗條件下，較大的流體剪切力（0.022 5 Pa）更能促 MSCs 細胞成骨分化，且振蕩流體剪切力促成骨分化的效果強于單向流體剪切力。
圖2
流體剪切力作用 14 d 和 21 d 對 MSCs 成骨分化的影響
Figure2.
Effects of fluid shear stress on the osteogenic differentiation of MSCs on 14 d and 21 d
2.3 流體剪切力對單個細胞生長率影響的擬合
分析單向流體剪切力作用對單個細胞生長率的影響 g（τ，t），采用最小二乘法估計參數，得到擬合度達到 0.991 的回歸方程如式（3）所示：
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式（3）中，g（τ，t）表示單向流體剪切力對單個細胞生長率的影響，τ 表示流體剪切力大小，t 表示細胞培養時間。如圖 3 左圖所示，在本文實驗條件下（0～0.022 5 Pa），與靜態培養相比，單向流體剪切力作用前期細胞生長率降低，作用后期又有助于提高細胞生長率。在 0～0.035 0 Pa 范圍內由式（3）獲得的單個細胞生長率與文獻[15]獲得的值在一個數量級范圍（8 × 10?6 s?1），后文將僅針對這一范圍（0～0.035 0 Pa）內的流體剪切力作用進行討論。
圖3
單向和振蕩流體剪切力對單個細胞生長率的影響
Figure3.
Effects of unidirectional and oscillatory fluid shear stress on the single-cell growth rate
同理，獲得振蕩流體剪切力作用對單個細胞生長率的影響 f（τ，t）回歸方程如式（4）所示：
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上述回歸方程的擬合度達到 0.990。式（4）中 f（τ，t）表示單向流體剪切力對單個細胞生長率的影響，τ 表示流體剪切力大小，t 表示細胞培養時間。如圖 3 右圖所示，在本文實驗條件下（0～0.022 5 Pa），中與靜態培養相比，振蕩流體剪切力作用 7～17 d 時降低細胞生長率，培養到 17～21 d 時又有助于提高細胞生長率。
2.4 理論模型驗證
將式（3）和式（4）的理論計算值與實驗數據進行比較，實驗值與理論模型計算值基本保持在同一個數量級，且大部分相對誤差小于 30%。參照文獻[20]提供的方法可知，單向流體剪切力下，擬合結果與實驗值的平均相對誤差為 ? 4.39%；振蕩流體剪切力下，擬合結果與實驗值的平均相對誤差為 ? 2.16%；均在 ± 10% 范圍以內。然后，本文運用 SPSS 軟件對單向和振蕩流體剪切力兩種作用模式下擬合的理論值與實驗值進行兩個獨立樣本 t 檢驗和柯爾莫可洛夫—斯米洛夫檢驗（Kolmogorov-Smirnov test，K-S test）[21]，P 值均大于 0.05，表明兩種模式下擬合的理論值與實驗值之間差異沒有統計學意義。因此式（3）和式（4）可作為單向和振蕩流體剪切力作用對單個細胞生長率影響的理論公式，用于理論預測流體剪切力作用下 MSCs 細胞的生長狀況。
如圖 3 所示，顯示了流體剪切力對單個細胞生長率的影響隨培養時間和剪切力大小的變化，表明流體剪切力對單個細胞生長率的影響呈時間依賴性。在本文實驗條件下，當流體剪切力在 0～0.022 5 Pa 范圍時，相同大小的流體剪切力對單個細胞生長率的影響隨著時間呈現先降低后增加的趨勢，g（τ，t）和 f（τ，t）在 7～14 d 時為負數，流體剪切力各組單個細胞生長率低于靜態培養的生長率。可能是因為 0～7 d 時流體剪切力通過激活細胞外調節蛋白激酶 1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK 1/2）信號通路，致使細胞質內 Ca2+ 增加，促進 MSCs 細胞增殖[22]，且流體流動促進了物質運輸也有利于細胞增殖[6]。培養 7 d 后流體剪切力各組細胞數量明顯多于靜態組，細胞傳代多次后，增殖能力逐漸減弱。如 0.015 0 Pa 單向流體剪切力組細胞在 7 d 時增殖大約 6 倍，而靜態組在 7 d 時只增殖約 2 倍，根據復制性衰老現象，此時靜態培養組細胞的增殖能力大于流體剪切力各組。g（τ，t）和 f（τ，t）為負值，說明與靜態培養相比，流體剪切力對單個細胞生長率呈現負影響，但并不意味著加載流體剪切力各組的細胞呈現負增長，如圖 4、圖 5 所示。g（τ，t）和 f（τ，t）在 19～21 d 時為正數，且數值隨著培養時間增加而增大，這可能與流體剪切力能夠促進抗細胞凋亡相關[23]。
圖4
靜態培養和單向流體剪切力作用下單個細胞生長率以及單向流體剪切力作用下單個細胞生長率與靜態培養時的差異
Figure4.
Single-cell growth rate under static culture and unidirectional fluid shear stress，and the difference of single-cell growth rate between static culture and unidirectional fluid shear stress
圖5
振蕩流體剪切力作用下單個細胞生長率以及振蕩流體剪切力作用下單個細胞生長率與靜態培養時的差異
Figure5.
Single-cell growth rate under oscillatory fluid shear stress，and the difference of single-cell growth rate between oscillatory fluid shear stress and static culture
3 討論與總結
組織工程中，利用生物反應器加載流體剪切力刺激可增強營養物質和氧氣的運輸，促進細胞存活[24]。本文首先考察了不同模式和大小的流體剪切力作用對 MSCs 細胞增殖的影響，發現大小為 0.015 0 Pa 和 0.007 5 Pa 的流體剪切力刺激會使 MSCs 細胞數量先增加后減少。Sikavitsas 等[25]利用 0.01 Pa 流體剪切力刺激大鼠 MSCs 細胞也發現細胞數量在 0～8 d 逐漸增加，在 8 d 時達到峰值，而在 8～16 d 逐漸減少。體外培養時，MSCs 細胞增殖能力隨著代數的增加而下降[26]，凋亡能力會增加，當增殖能力和凋亡能力相等時細胞數量停止增加。隨著培養時間的繼續延長，凋亡能力大于增殖能力，細胞數量將會逐漸減少。本文還進一步發現，0.015 0 Pa 和 0.007 5 Pa 流體剪切力刺激初期（0～7 d），單向流體剪切力對細胞增殖的作用更強，Du 等[27]在小鼠成骨樣 MC3T3-E1 細胞上也發現類似的現象。與 0.015 0 Pa 和 0.007 5 Pa 流體剪切力作用不同，0.022 5 Pa 流體剪切力刺激使 MSCs 細胞數量逐漸增加，說明 MSCs 細胞增殖對流體剪切力的響應呈剪切力大小依賴。
與終末細胞不同，流體剪切力不僅會對 MSCs 增殖產生作用，也會影響 MSCs 細胞的分化，本文也發現高剪切力（0.022 5 Pa）促 MSCs 細胞膠原分泌和成骨分化的能力更強，如圖 2 所示。基于此，本文修正了文獻[15]的流體剪切力對單個細胞生長率影響公式（1），其中，單向流體剪切力作用下單個細胞生長率表達式如式（5）所示：
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振蕩流體剪切力作用下單個細胞生長率表達式如式（6）所示：
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式（5）和式（6）中，等式右邊第一項和第二項為營養物質和細胞接觸對細胞增殖的影響，第三項為流體剪切力對 MSCs 增殖的影響，考慮了流體剪切力影響干細胞分化的因素。
綜上，本文利用實驗室前期自制的灌流裝置對種在脫細胞骨支架上大鼠 MSCs 細胞施加了不同模式和大小的流體剪切力刺激，考察了流體剪切力對 MSCs 細胞增殖和成骨分化的影響，結果表明 0.022 5 Pa 的振蕩流體剪切力更有利于 MSCs 細胞的增殖和成骨分化，進一步修正了實驗條件下 MSCs 細胞體外培養的單個細胞生長率隨時間和剪切力變化的理論模型，可為優化 MSCs 細胞體外灌流培養條件提供理論支持。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
