本研究考察微振動刺激（MVS）對小鼠骨髓來源間充質干細胞（M-BMSCs）的早期力學適應性及成骨分化的調控作用。在體外給予 M-BMSCs 微振動刺激，檢測細胞增殖及堿性磷酸酶（ALP）表達，熒光染色觀察細胞凋亡與細胞骨架，流式檢測細胞凋亡，通過 RT-PCR 檢測早期成骨相關基因 runt 相關轉錄因子 2（Runx2）、Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）、ALP 表達，Western blotting 檢測細胞外調節蛋白激酶 1/2（ERK1/2）磷酸水平。研究結果顯示，微振動刺激誘導了細胞早期凋亡（受力 1 天后），但周期性受力 3 天后細胞的凋亡現象明顯減少，而細胞的增殖活性并未受到明顯影響；同時，微振動刺激促進了細胞骨架 F-actin 蛋白、ALP 合成和 ERK1/2 的磷酸化，并上調了 Runx2、Col-Ⅰ、ALP 的基因表達。研究結果表明微振動刺激能對 M-BMSCs 的細胞活性和結構產生早期適應性改變與調節，從而促進了細胞的早期成骨分化。
引用本文： 吳金結, 吳月皓, 陳雪寧, 智偉. 微振動環境調控小鼠骨髓間充質干細胞的早期力學適應性及成骨分化. 生物醫學工程學雜志, 2020, 37(1): 96-104. doi: 10.7507/1001-5515.201903056 復制
引言
骨作為人體最主要的承力組織，骨量的維持主要取決于骨組織中成骨細胞與破骨細胞的動態平衡，其改建與代謝平衡受到力學刺激的共同調控，包括拉應力、壓應力和剪切應力、微振動等[1-4]。研究顯示細胞受到力學刺激后，通過細胞外基質-整合素-細胞骨架系統、離子通道、G 蛋白與酪氨酸激酶等多種途徑將細胞外的力學信號轉變為生物化學信號傳導到細胞內，從而引發一系列應答反應，如細胞增殖、分化、凋亡、蛋白表達等[5-7]。研究同時發現，細胞并非對所有的力學刺激都會產生適應性變化，過高的強度與頻率會使細胞發生不可逆死亡，只有當頻率與強度在一定范圍內，細胞才能維持正常的生物活性和結構，產生適應性改變[8-9]。微振動刺激（micro-vibration stimulation，MVS）是一種生理適應性力學負荷，該刺激一般是振幅 ≤ 50 μm、強度 < 1 × g、頻率范圍在 1～100 Hz 的低幅度、低強度、低頻率力學刺激，具有促進骨形成和重建的效應。研究顯示振動刺激可以調控成骨細胞與間充質干細胞的增殖和分化行為[10-11]。但目前對于力學刺激調控細胞應答的研究多側重于應力刺激對細胞的成骨分化及力學信號轉導機制方面[12]，對于細胞早期的力學適應性行為及其與成骨分化之間的相關性影響方面卻鮮有報道。力學適應性極有可能影響細胞在力學刺激條件下的細胞活性與成骨分化行為，并且提高細胞的力學適應性也將改善組織工程骨構建后的植入效果。
盡管目前已有不少工作探索了 MVS 對間充質干細胞分化和增殖的調控作用及機制[13-15]，但這些工作仍存在以下問題需要深入探討和完善：一是 MVS 環境設置，目前見于文獻報道的類似研究所采用的 MVS 環境均為非生理環境，細胞置于單純振動裝置上進行加力刺激，這無疑會影響到細胞的活性狀態，從而影響實驗結果的準確性。而在本研究中，我們采用了自主研發設計并獲得發明專利授權的微振動培養一體裝置，該裝置確保細胞在體外能處于適宜的生理環境下接受力學刺激，從而使得研究結果更加準確可靠。二是目前的研究聚焦于細胞的增殖和分化，但對細胞受力早期的生物學行為相關性關注很少，例如凋亡、細胞骨架蛋白表達與細胞增殖分化之間的相關性聯系。而這些指標能夠體現間充質干細胞受到力學刺激后所發生的生物學活動，進而直接或間接反映細胞的力學適應性[12, 16]。
目前絕大部分力學加載模型所帶來的流體剪切力為單向式，例如由灌注式、機械攪拌式和旋轉壁式等加載方式所產生的流體剪切力[17-18]。研究發現，人體骨組織受到各種應力作用時，骨組織中的骨小管網絡在應力負荷下發生形變，引起網絡中微流體流動，從而使效應細胞受到流體剪切力[19]。體內骨組織的組織液流動主要是以運動時的雙向流動和靜態轉為動態時的單向流動。本研究所用的微振動培養一體裝置能夠在飽和濕度、37℃ 及 5% CO2 的生理環境下給予培養皿振動，進一步產生作用于細胞的流體剪切應力刺激，而在刺激過程中保持生理環境是絕大部分振動裝置所不具備的關鍵要素。研究顯示，振動時培養皿內液體流動方向由中央向外周發生波動，這是皿內液體受到振動而產生流動的結果，皿內細胞進而受到流體剪切應力的作用[20]。人體骨組織在生理環境下受到的力學刺激主要包括彎曲、壓縮以及扭轉載荷，一般不同的行為所產生的頻率不同，例如在正常行走時與奔跑時的負荷頻率[21-22]。在力學刺激中，微振動是唯一可以使液體產生雙向流動的加載方式[1]，而本裝置所帶來的微振動能夠使液體產生振蕩流，從而模擬運動時骨組織所產生的雙向流體流動。
此外，已有的研究表明一定范圍頻率的振蕩流體在細胞與細胞間相互作用和骨原細胞的成骨分化方面有積極的影響[23-24]。因此我們認為由設備產生的微振動刺激能夠為細胞提供模擬體內生理狀態下的應力刺激，故將其描述為生理應力刺激。基于此，本研究通過自主研發的微振動培養一體裝置能夠提供飽和濕度、適宜的 CO2 濃度與溫度，在體外更真實地模擬體內的生理應力環境[20, 25-26]，從而更加可靠地評估小鼠骨髓間充質干細胞（mouse bone marrow mesenchymal stem cells，M-BMSCs）受到 MVS 后所發生的凋亡、增殖與分化等生物學行為。這一研究為構建組織工程骨中種子細胞的優化提供理論依據，為構建成骨活性增強的組織工程骨提供依據，為臨床骨缺損的再生修復治療提供可能。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
M-BMSCs 由四川大學生物材料工程技術研究中心提供，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、α-MEM 培養基（GIBCO 公司，美國），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Excell 公司，中國），AlamarBlue 溶液、Annexin V 凋亡檢測試劑盒（Thermo fisher 公司，美國），碘化丙啶（PI）、鈣黃綠素（Calcein）、FITC 標記的鬼筆環肽、4,6-二氨基－2－苯基吲哚（DAPI）（翊圣公司，中國），增強型 RIPA 細胞裂解液、BCA 總蛋白測定試劑盒（BOSTER 公司，中國），細胞總 RNA 提取試劑盒（天根公司，中國），引物合成由上海生工有限公司完成，一抗、二抗（谷歌公司，中國），iScriptTM cDNA Synthesis Kit 試劑盒、iQTM SYBR? Green supermix 試劑盒、PCR 反應儀、ChemiDocTMXRS+化學發光儀器、BD accuri C6 Plus（Bio-Rad 公司，美國）。
1.2 細胞培養與接種
M-BMSCs 培養在含有 10% FBS 的 α-MEM 培養基內，添加 1% 青霉素/鏈霉素，置于 5% CO2、37℃ 及飽和濕度的細胞孵箱孵育。將細胞培養至第五代消化，按照 1.5 × 105/孔的密度接種于 24 孔板，靜置 24 h 后進行振動加載。
1.3 微振動加載
采用自主設計制備的微振動培養一體裝置[27]（中國發明專利授權號：CN 106399096 B），該裝置包括信號發生器、信號放大器、信號檢測器、孵箱及內部的振動臺五大結構。目前的研究顯示頻率為 40 Hz、振幅為 50 μm、強度 0.3 g 的微振動有利于誘導細胞的成骨分化[26]，因此在本研究中將樣品分為振動（vibration stress，VS）組和靜態（static state，SS）組。將振動組樣品固定于振動臺臺面上，振動參數設置為：振幅為 50 μm，強度為 0.3 g，頻率為 40 Hz，振動方向及波形為垂直正弦波。將接種后的孔板每隔 24 h 置于微振動培養一體裝置內固定于振動臺臺面上，給予振動刺激 30 min，并同時給予 37℃、5% CO2、飽和濕度環境培養。
1.4 微振動對 M-BMSCs 增殖活性影響
將第 5 代的 M-BMSCs 按照每孔 0.4 × 104 個細胞接種于 96 孔板，分為 VS 組與 SS 組，每組 5 個平行樣。應用 1.3 節的加載方式，在第 1～7 天檢測細胞增殖活性。加入 10% AlamarBlue 溶液，細胞孵箱孵育，在酶標儀波長 570 nm/600 nm 檢測樣品光密度（optical density，OD）值。
1.5 微振動對 M-BMSCs 凋亡影響
將第 5 代 M-BMSCs 按照每皿 5 × 105 個細胞接種于培養皿內，分為 VS 組與 SS 組，應用 1.3 節的加載方式，在第 1、3 天定量檢測細胞的凋亡情況。0.25% 胰酶消化細胞，PBS 清洗一次，緩沖液清洗一次，按照 5 × 105/mL 密度取 200 μL 細胞懸液，加入 FITC/APC 染液 5 μL 孵育 10 min，緩沖液清洗一次，重懸細胞加入 PI 染液 5 μL，上機檢測。
1.6 M-BMSCs 凋亡熒光染色
將第 5 代 M-BMSCs 按照 1 × 104 個/片接種于細胞爬片，置于 24 孔板，分為 VS 組與 SS 組，應用 1.3 節的加載參數，第 1、3 天激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞凋亡。加入 PI 溶液避光孵育 20 min，PBS 清洗 2 次，加入 Calcein 溶液避光孵育 20 min，PBS 清洗 2 次，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察，PI 激發/發射波長為 535 nm/615 nm，Calcein 激發/發射波長為 490 nm/515 nm。
1.7 M-BMSCs 細胞骨架熒光染色
將第 5 代 M-BMSCs 按照 1 × 103 個/片接種于細胞玻片上，置于 24 孔板，分為 VS 組與 SS 組，應用 1.3 節的加載參數，第 1、3 天激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞骨架。棄去培養基，37℃ 預熱的 PBS 清洗細胞 2 次，4% 甲醛溶液固定細胞，PBS 清洗細胞 2 次，0.5% Triton X-100 透化處理，PBS 清洗 2 次，FITC 標記的鬼筆環肽覆蓋細胞玻片孵育 30 min，PBS 清洗 3 次，DAPI 復染細胞核，清洗玻片，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察，FITC 激發/發射波長為 496 nm/516 nm，DAPI 激發/發射波長為 364 nm/454 nm。
1.8 M-BMSCs 堿性磷酸酶活性檢測
細胞加載 MVS 后，于第 7 天檢測細胞堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）蛋白表達量。用增強型 RIPA 裂解液處理，12 000 r/min 離心 10 min，取出上清液。50 μL 細胞裂解液加入 50 μL ALP 測定工作液，37℃ 孵育 15 min，加入 3 mol/L NaOH 終止反應，在酶標儀波長 405 nm 下檢測 OD 值，利用 BCA 試劑盒測定樣品的蛋白濃度，計算 NP/min/蛋白量。
1.9 RT-PCR 檢測 M-BMSCs 成骨相關基因表達
細胞加載 MVS 后，于第 1、4、7 天檢測細胞成骨基因 runt 相關轉錄因子 2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、Ⅰ型膠原（Collagen Ⅰ，Col-Ⅰ）、ALP 的表達。棄去培養基，PBS 清洗 2 次，細胞總 RNA 提取試劑盒裂解細胞，提取總 mRNA。利用 iScriptTM cDNA Synthesis Kit 將提取的 mRNA 反轉錄為 cDNA，采用 iQTM SYBR Green Supermix 試劑盒進行 RT-PCR 檢測。成骨基因引物序列見表 1。
表1
Runx2、Col-Ⅰ和 ALP 引物序列
Table1.
Primers sequence of Runx2, Col-Ⅰ and ALP
1.10 Western blotting 檢測 ERK1/2 信號通路磷酸化
將第 5 代的 M-BMSCs 按照每皿接種 5 × 105 個細胞，分為 VS 組與 SS 組，在第 1、3 天進行 Western blotting 檢測細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信號通路磷酸化。棄去培養基，PBS 清洗 2 次，加入含 1% 廣譜酶抑制劑與磷酸化酶抑制劑的增強型 RIPA 細胞裂解液充分裂解，12 000 r/min 離心 10 min，分離上清液。BCA 法測定樣品總蛋白濃度，配制 10% SD-PAGE 膠將 95℃ 變性后的蛋白分離，然后轉入 PVDF 膜上，將膜置于一抗孵育，再置于二抗孵育，最后將膜置于 ChemiDocTMXRS+化學發光儀器內曝光顯影。使用軟件 Image lab 記錄目的條帶灰度值并計算與之相應的 β-actin 比值。
1.11 統計學處理
每組樣品為 5 個，所有參數均做小樣本 t 檢驗，P < 0.05 為差異有統計學意義。
2 結果與討論
2.1 M-BMSC 增殖活性
增殖實驗結果如圖 1 所示，實驗組和對照組的 OD 值均隨時間延長而遞增，在第 7 天到達最高值。微振動加載早期（第 1 天）兩組細胞的 OD 值無明顯差異，在加力第 2 天和第 3 天，VS 組呈現出較明顯的促進細胞生長的趨勢，但隨著加力時間的延長（第 4 天以后），VS 組的細胞生長速率有所減緩，在第 6 天 VS 組細胞的增殖活性較 SS 組高，而其他時間點 VS 組與 SS 組的 OD 值無顯著差別。在力學加載早期（第 1～3 天），VS 組細胞在啟動凋亡程序清除部分力學適應性較差細胞的情況下，相對于 SS 組細胞仍具有更高的增殖行為，這說明 MVS 在早期能夠顯著提高具有力學適應性的細胞的增殖活性，這抵消了受力后細胞因死亡（凋亡）帶來的數量減少（第 1 天）。而到了后期兩組之間無明顯差異，說明 MVS 帶來的促增殖作用主要體現在細胞受力早期，而并非是一種長時性效應。這可能是因為后期細胞對力學刺激產生適應改變后，激活了骨向分化應答，因此增殖活性也有所回落[28]。該結果也說明 MVS 并未對細胞的增殖活性造成負向影響。
圖1
微振動對 M-BMSCs 增殖的影響
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研究顯示，振動刺激能激活效應細胞的細胞進程，包括細胞增殖、黏附、分化等。査丁勝等[29]的研究發現 20～50 Hz 的振動刺激能促進成骨細胞增殖活性。Kim 等的研究也顯示 30～40 Hz、0.3 g 的振動能顯著促進人 BMSCs 的增殖[1]。而 Zhou 等[8]的研究則發現 40～60 Hz、0.3 g 的微振動在促進人 BMSCs 成骨分化的同時對細胞增殖有抑制作用。大量研究已經證實間充質干細胞在對應力刺激做出響應的同時，也會受到細胞所處微環境的調控，甚至是細胞種屬的影響[30-31]。而本研究結果則顯示在模擬生理環境下，40 Hz、0.3 g、50 μm、30 min/天、正弦波的微振動能促進細胞早期的增殖行為，但隨后這種促進作用逐漸減弱，這可能是因為隨著周期性力學刺激的加載，細胞應答逐漸以骨向分化為主，從而使細胞的增殖速率有所減緩。
2.2 M-BMSCs 凋亡檢測與熒光染色觀察
微振動加載后細胞凋亡流式檢測結果如圖 2 所示，通過 FITC/APC 與 PI 對細胞進行標記，早期凋亡細胞會發生細胞膜外翻，進而被 FITC/APC 結合散發綠色熒光，晚期凋亡和死亡細胞的細胞膜不完整，因而能夠被 PI 進入結合細胞核，使其散發紅色熒光，以此定量區分處于不同狀態的細胞。加力 1 天后，VS 組出現 9.1% 的早期凋亡細胞，而 SS 組出現 5.9% 的早期凋亡細胞，VS 組的晚期凋亡細胞數量高于 SS 組。加力 3 天后，VS 組早期凋亡細胞數量較多，達到了 12%，但 SS 組死亡細胞數量達到 7.1%，兩組之間晚期凋亡細胞數量無顯著差異，這一結果提示不耐受 MVS 的細胞可能進一步通過凋亡被清除，留下的細胞除了發生早期凋亡外，其死亡細胞數量較 SS 組有所下降。結合細胞增殖活性，細胞加載微振動后，不耐受 MVS 的細胞被排除，留下的細胞相對于 SS 組細胞具有更好的力學適應性與增殖活性。
圖2
細胞凋亡的流式檢測
UL：死亡細胞；UR：晚期凋亡細胞；LL：正常細胞；LR：早期凋亡細胞
Figure2. Flow detection of M-BSMCs apoptosisUL: dead cells; UR: late apoptosis cells; LL: normal cells; LR: early apoptosis cells
通過 Calcein 與 PI 對細胞進行染色（見圖 3），正常細胞的細胞膜具有選擇透過性，因此只能通過 Calcein，細胞呈現綠色形態；早凋細胞的細胞膜被打破，因此可以被 PI 進入，細胞內部呈現綠色，周圍被 PI 染色呈現紅色形態；晚凋細胞細胞膜不具備選擇透過性，完全被 PI 染色，呈現紅色形態。加力 1 天后，VS 組和 SS 組細胞均保持完整的細胞形態，SS 組細胞胞質內顯示明亮的綠色熒光，而 VS 組部分細胞胞質外圍出現紅色熒光，內部則顯示綠色熒光，說明細胞有較明顯的凋亡現象，這一結果與流式檢測結果比較吻合。加力 3 天后，兩組細胞均呈現緊密堆積狀態，SS 組可見呈現紅色熒光的零星細胞，其形態收縮變圓，說明細胞有晚期凋亡現象；VS 組細胞胞質內呈現綠色熒光，凋亡細胞數量較少。
圖3
激光共聚焦觀察 M-BMSCs 的凋亡
綠色：鈣黃綠素；紅色：碘化丙啶。白色箭頭示晚凋細胞，黃色箭頭示早凋細胞
Figure3. Laser confocal observation of apoptosis of M-BMSCsgreen: Calcein; red: PI. White arrow: late withered cell: yellow arrow: withered cells
細胞凋亡是有特定控制的細胞自主有序死亡，又稱程序性細胞死亡[32-33]。細胞的凋亡具有不可逆轉性。研究表明適當的機械力學刺激可以促進細胞的生長、分化和功能的維持，但過度或持續時間過長的力學刺激又會對細胞的結構和功能造成損害[34]。本研究的結果顯示盡管在微振動加載早期細胞出現了早凋行為，但這種行為未產生大量細胞死亡且未對細胞正常生物學行為造成影響，這可能是細胞通過結構和形態調整適應了這種力學刺激，即獲得了力學自適應性[35-36]。通過 MVS 使得不耐受刺激的細胞發生凋亡而被清除，進而留下具有力學適應性的細胞，這一現象提示本研究給予細胞的 MVS 是一種生理適應性力學載荷，在少部分不耐受力學刺激的細胞被清除后，大部分細胞均能獲得力學適應性，以及更強的增殖活性。
2.3 M-BMSCs 細胞骨架染色
圖 4 所示為 VS 組與 SS 組細胞骨架染色。加載 MVS 1 天后，VS 組細胞較 SS 組鋪展度更高，形態均為多角形，SS 組細胞形態不均一。VS 組細胞內肌動蛋白微絲沿細胞長軸排列，較 SS 組分布更為有序，熒光表達也更為明亮，說明 VS 組細胞 F-actin 蛋白表達量顯著高于 SS 組。微振動加力 3 天后，兩組細胞熒光亮度均有所降低，SS 組降低更為明顯，且細胞有明顯增殖，排列緊密，細胞內肌動蛋白微絲分布無序，VS 組細胞相較于 SS 組鋪展度更高，微絲分布有序且熒光亮度高于 SS 組。
圖4
微振動對 M-BMSCs 中 F-actin 蛋白表達的影響
藍色：細胞核；綠色：聚合態微絲
Figure4. Effect of MVS on expression of F-action in M-BMSCs cellsblue: nucleus; green: F-action
細胞骨架是真核細胞胞質中的纖維狀網架，具有維持細胞形態及運動的功能，由微絲、微管和中間纖維組成。肌動蛋白與核膜相連，當有外力作用于細胞時，力學信號經細胞外基質-整合素-受體傳遞到細胞內，骨架系統發生解聚和重排，引發細胞形態變化[37-38]，并激活細胞基因組，引起細胞生長、蛋白質合成等應答反應。本研究顯示 MVS 力學刺激通過引起細胞骨架重構、F-actin 蛋白絲增粗及定向排列引起了 M-BMSCs 形態的變化，并在受力早期激活了細胞的增殖行為。隨著細胞周期性受力一段時間后，MVS 產生力學信號通過重構的細胞骨架進一步對細胞作用，促使細胞骨向分化以及細胞鋪展黏附，也因此抑制了細胞的增殖。研究結果顯示細胞受到力學刺激后會發生結構與形態的快速改建與功能響應，當細胞在早期完成了適應性改變且清除不耐受力學刺激的細胞后，存活的細胞將會獲得力學刺激耐受性，這就意味著細胞與支架復合后植入體內將會更快地適應體內生理應力的刺激[16]。
2.4 微振動調控 M-BMSCs 堿性磷酸酶表達
ALP 活性定量檢測結果顯示（見圖 5），VS 組在第 7 天的 ALP 表達顯著高于 SS 組（P < 0.05），這說明 VS 組細胞具有更好的成骨分化趨勢。M-BMSCs 分化初期會伴隨 ALP 的上升，ALP 是 M-BMSCs 分化的重要標志，ALP 作為成骨細胞系發育中期的標志物，反映其代謝水平，與細胞鈣化及細胞外基質礦化有著緊密聯系。研究表明 MVS 可以促進間充質干細胞成骨標志物 ALP、骨橋蛋白、Col-Ⅰ以及血管內皮生長因子的表達，這與本研究的 ALP 檢測結果是一致的，這也與本研究中細胞增殖的結果互為印證。這一現象與目前文獻報道的細胞分化促進的同時會使得細胞增殖活性降低的現象相一致，目前研究認為[26]，振動在促進人 BMSCs 成骨分化的同時，會降低細胞的增殖活性。本研究則發現，MVS 在促進 M-BMSCs 成骨分化的同時能夠提高細胞的增殖活性，這可能是由于本研究所用的微振動培養一體裝置在細胞接受 MVS 的同時提供了適宜的生理環境，排除了細胞因環境變化而造成的生理活性的異常。此外，不同的細胞來源可能也會對結果有一定的影響。
圖5
微振動對 M-BMSCs 堿性磷酸酶活性的影響
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2.5 M-BMSCs 早期成骨相關基因表達
由 RT-PCR 結果可見（見圖 6），相對于 SS 組細胞，VS 組細胞 Runx2、Col-Ⅰ和 ALP 的基因表達在第 4 天和第 7 天顯著高于 SS 組，Runx2 在第 4 天時表達最高，Col-Ⅰ和 ALP 在第 7 天時表達最高（P < 0.05）。骨系細胞在成骨分化過程中通常按照相似的時序性基因表達模式和框架。一般來說，Runx2 作為成骨細胞的特異性轉錄因子，是干細胞早期向成骨分化的特征性表達因子，在骨形成和重建過程中發揮重要作用；ALP 和 Col-Ⅰ是成骨細胞分泌的主要細胞外基質蛋白，在成骨細胞中期也就是細胞外基質合成階段表達[39-40]。從 RT-PCR 結果看，SS 組的 M-BMSCs 成骨分化相關基因 Runx2 在第 1 天即達到表達水平頂峰，而 VS 組則在第 4 天到達頂峰，相較于 SS 組推遲了，這可能是因為 VS 組在受力早期處于增殖活性增強狀態，從而抑制了細胞的分化行為。而兩組的 Col-Ⅰ和 ALP 表達盡管均在第 7 天達到頂峰，但 VS 組的表達顯著高于 SS 組，這說明 VS 組具有更強的促骨向分化能力。本研究的結果證明了 MVS 能夠促進 M-BMSCs 早期增殖和中期骨向分化，促進細胞外基質礦化及相關膠原合成，并且這種促進仍然遵循了生理狀態下骨系細胞成骨分化的時序性基因表達。
圖6
微振動對二維培養 M-BMSCs 成骨相關基因早期表達的影響
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2.6 M-BMSCs 的 ERK1/2 信號通路磷酸化表達
圖 7 為 Western blotting 的驗證結果。圖 7a 為 ERK1/2、pERK 與 β-action 蛋白的化學發光圖，目的蛋白分子量為 44 kD 左右；圖 7b 為通過歸一化處理后的各組 ERK1/2 的磷酸化比例直方圖，以 SS-D1 表達量為參考，通過 Image Lab 計算各組 pERK 相對于 SS-D1 的 pERK 的相對灰度值、ERK1/2 的相對灰度值與 β-action 的相對灰度值。經過計算處理的 Western blotting 結果顯示，第 1 天和第 3 天 VS 組細胞的 ERK1/2 磷酸化比例均明顯高于 SS 組（P < 0.05），且 VS 組與 SS 組 ERK1/2 的磷酸化比例在第 1 天表達最高，隨后兩組細胞的 ERK1/2 磷酸化比例均明顯下降，MVS 能夠顯著促進 ERK1/2 的磷酸化。
圖7
微振動對二維培養 M-BMSCs 的 ERK1/2 磷酸化的影響
a. 目的蛋白化學發光成像；b. ERK1/2 磷酸化比例直方圖. *
a. chemiluminiscence imaging of the target protein; b: histogram of proportion of ERK1/2 activation. *
ERK1/2 是絲裂原激活蛋白激酶家族的一個成員，是與細胞增殖、分化和凋亡相關的信號轉導因子[41-43]。研究表明，ERK1/2 信號通路中 ERK1/2 的磷酸化水平顯示了 MVS 對細胞分化的作用。本研究結果表明 MVS 可以促進 M-BMSCs 中 ERK1/2 的磷酸化，并且促進成骨早期分化。這提示 ERK1/2 磷酸化對細胞的早期成骨分化存在促進作用。此外，細胞在受力早期（第 1 天）增殖活性增強，F-actin 表達增加可能也與 ERK1/2 的磷酸化增高存在正性關系。
3 結論
力學加載模型、頻率與強度的不同都會對細胞的生物學行為產生不同的影響。本研究采用自主設計微振動培養一體裝置，在體外給予 M-BMSCs 以頻率 40 Hz、強度 0.3 g、振幅 50 μm、時間 30 min/天的周期性微振動刺激。研究結果顯示 MVS 能對 M-BMSCs 的生物活性和結構產生早期適應性改變與調節，并可能通過力學適應性細胞骨架重構從而促進了細胞的早期成骨分化。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
骨作為人體最主要的承力組織，骨量的維持主要取決于骨組織中成骨細胞與破骨細胞的動態平衡，其改建與代謝平衡受到力學刺激的共同調控，包括拉應力、壓應力和剪切應力、微振動等[1-4]。研究顯示細胞受到力學刺激后，通過細胞外基質-整合素-細胞骨架系統、離子通道、G 蛋白與酪氨酸激酶等多種途徑將細胞外的力學信號轉變為生物化學信號傳導到細胞內，從而引發一系列應答反應，如細胞增殖、分化、凋亡、蛋白表達等[5-7]。研究同時發現，細胞并非對所有的力學刺激都會產生適應性變化，過高的強度與頻率會使細胞發生不可逆死亡，只有當頻率與強度在一定范圍內，細胞才能維持正常的生物活性和結構，產生適應性改變[8-9]。微振動刺激（micro-vibration stimulation，MVS）是一種生理適應性力學負荷，該刺激一般是振幅 ≤ 50 μm、強度 < 1 × g、頻率范圍在 1～100 Hz 的低幅度、低強度、低頻率力學刺激，具有促進骨形成和重建的效應。研究顯示振動刺激可以調控成骨細胞與間充質干細胞的增殖和分化行為[10-11]。但目前對于力學刺激調控細胞應答的研究多側重于應力刺激對細胞的成骨分化及力學信號轉導機制方面[12]，對于細胞早期的力學適應性行為及其與成骨分化之間的相關性影響方面卻鮮有報道。力學適應性極有可能影響細胞在力學刺激條件下的細胞活性與成骨分化行為，并且提高細胞的力學適應性也將改善組織工程骨構建后的植入效果。
盡管目前已有不少工作探索了 MVS 對間充質干細胞分化和增殖的調控作用及機制[13-15]，但這些工作仍存在以下問題需要深入探討和完善：一是 MVS 環境設置，目前見于文獻報道的類似研究所采用的 MVS 環境均為非生理環境，細胞置于單純振動裝置上進行加力刺激，這無疑會影響到細胞的活性狀態，從而影響實驗結果的準確性。而在本研究中，我們采用了自主研發設計并獲得發明專利授權的微振動培養一體裝置，該裝置確保細胞在體外能處于適宜的生理環境下接受力學刺激，從而使得研究結果更加準確可靠。二是目前的研究聚焦于細胞的增殖和分化，但對細胞受力早期的生物學行為相關性關注很少，例如凋亡、細胞骨架蛋白表達與細胞增殖分化之間的相關性聯系。而這些指標能夠體現間充質干細胞受到力學刺激后所發生的生物學活動，進而直接或間接反映細胞的力學適應性[12, 16]。
目前絕大部分力學加載模型所帶來的流體剪切力為單向式，例如由灌注式、機械攪拌式和旋轉壁式等加載方式所產生的流體剪切力[17-18]。研究發現，人體骨組織受到各種應力作用時，骨組織中的骨小管網絡在應力負荷下發生形變，引起網絡中微流體流動，從而使效應細胞受到流體剪切力[19]。體內骨組織的組織液流動主要是以運動時的雙向流動和靜態轉為動態時的單向流動。本研究所用的微振動培養一體裝置能夠在飽和濕度、37℃ 及 5% CO2 的生理環境下給予培養皿振動，進一步產生作用于細胞的流體剪切應力刺激，而在刺激過程中保持生理環境是絕大部分振動裝置所不具備的關鍵要素。研究顯示，振動時培養皿內液體流動方向由中央向外周發生波動，這是皿內液體受到振動而產生流動的結果，皿內細胞進而受到流體剪切應力的作用[20]。人體骨組織在生理環境下受到的力學刺激主要包括彎曲、壓縮以及扭轉載荷，一般不同的行為所產生的頻率不同，例如在正常行走時與奔跑時的負荷頻率[21-22]。在力學刺激中，微振動是唯一可以使液體產生雙向流動的加載方式[1]，而本裝置所帶來的微振動能夠使液體產生振蕩流，從而模擬運動時骨組織所產生的雙向流體流動。
此外，已有的研究表明一定范圍頻率的振蕩流體在細胞與細胞間相互作用和骨原細胞的成骨分化方面有積極的影響[23-24]。因此我們認為由設備產生的微振動刺激能夠為細胞提供模擬體內生理狀態下的應力刺激，故將其描述為生理應力刺激。基于此，本研究通過自主研發的微振動培養一體裝置能夠提供飽和濕度、適宜的 CO2 濃度與溫度，在體外更真實地模擬體內的生理應力環境[20, 25-26]，從而更加可靠地評估小鼠骨髓間充質干細胞（mouse bone marrow mesenchymal stem cells，M-BMSCs）受到 MVS 后所發生的凋亡、增殖與分化等生物學行為。這一研究為構建組織工程骨中種子細胞的優化提供理論依據，為構建成骨活性增強的組織工程骨提供依據，為臨床骨缺損的再生修復治療提供可能。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
M-BMSCs 由四川大學生物材料工程技術研究中心提供，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、α-MEM 培養基（GIBCO 公司，美國），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Excell 公司，中國），AlamarBlue 溶液、Annexin V 凋亡檢測試劑盒（Thermo fisher 公司，美國），碘化丙啶（PI）、鈣黃綠素（Calcein）、FITC 標記的鬼筆環肽、4,6-二氨基－2－苯基吲哚（DAPI）（翊圣公司，中國），增強型 RIPA 細胞裂解液、BCA 總蛋白測定試劑盒（BOSTER 公司，中國），細胞總 RNA 提取試劑盒（天根公司，中國），引物合成由上海生工有限公司完成，一抗、二抗（谷歌公司，中國），iScriptTM cDNA Synthesis Kit 試劑盒、iQTM SYBR? Green supermix 試劑盒、PCR 反應儀、ChemiDocTMXRS+化學發光儀器、BD accuri C6 Plus（Bio-Rad 公司，美國）。
1.2 細胞培養與接種
M-BMSCs 培養在含有 10% FBS 的 α-MEM 培養基內，添加 1% 青霉素/鏈霉素，置于 5% CO2、37℃ 及飽和濕度的細胞孵箱孵育。將細胞培養至第五代消化，按照 1.5 × 105/孔的密度接種于 24 孔板，靜置 24 h 后進行振動加載。
1.3 微振動加載
采用自主設計制備的微振動培養一體裝置[27]（中國發明專利授權號：CN 106399096 B），該裝置包括信號發生器、信號放大器、信號檢測器、孵箱及內部的振動臺五大結構。目前的研究顯示頻率為 40 Hz、振幅為 50 μm、強度 0.3 g 的微振動有利于誘導細胞的成骨分化[26]，因此在本研究中將樣品分為振動（vibration stress，VS）組和靜態（static state，SS）組。將振動組樣品固定于振動臺臺面上，振動參數設置為：振幅為 50 μm，強度為 0.3 g，頻率為 40 Hz，振動方向及波形為垂直正弦波。將接種后的孔板每隔 24 h 置于微振動培養一體裝置內固定于振動臺臺面上，給予振動刺激 30 min，并同時給予 37℃、5% CO2、飽和濕度環境培養。
1.4 微振動對 M-BMSCs 增殖活性影響
將第 5 代的 M-BMSCs 按照每孔 0.4 × 104 個細胞接種于 96 孔板，分為 VS 組與 SS 組，每組 5 個平行樣。應用 1.3 節的加載方式，在第 1～7 天檢測細胞增殖活性。加入 10% AlamarBlue 溶液，細胞孵箱孵育，在酶標儀波長 570 nm/600 nm 檢測樣品光密度（optical density，OD）值。
1.5 微振動對 M-BMSCs 凋亡影響
將第 5 代 M-BMSCs 按照每皿 5 × 105 個細胞接種于培養皿內，分為 VS 組與 SS 組，應用 1.3 節的加載方式，在第 1、3 天定量檢測細胞的凋亡情況。0.25% 胰酶消化細胞，PBS 清洗一次，緩沖液清洗一次，按照 5 × 105/mL 密度取 200 μL 細胞懸液，加入 FITC/APC 染液 5 μL 孵育 10 min，緩沖液清洗一次，重懸細胞加入 PI 染液 5 μL，上機檢測。
1.6 M-BMSCs 凋亡熒光染色
將第 5 代 M-BMSCs 按照 1 × 104 個/片接種于細胞爬片，置于 24 孔板，分為 VS 組與 SS 組，應用 1.3 節的加載參數，第 1、3 天激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞凋亡。加入 PI 溶液避光孵育 20 min，PBS 清洗 2 次，加入 Calcein 溶液避光孵育 20 min，PBS 清洗 2 次，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察，PI 激發/發射波長為 535 nm/615 nm，Calcein 激發/發射波長為 490 nm/515 nm。
1.7 M-BMSCs 細胞骨架熒光染色
將第 5 代 M-BMSCs 按照 1 × 103 個/片接種于細胞玻片上，置于 24 孔板，分為 VS 組與 SS 組，應用 1.3 節的加載參數，第 1、3 天激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞骨架。棄去培養基，37℃ 預熱的 PBS 清洗細胞 2 次，4% 甲醛溶液固定細胞，PBS 清洗細胞 2 次，0.5% Triton X-100 透化處理，PBS 清洗 2 次，FITC 標記的鬼筆環肽覆蓋細胞玻片孵育 30 min，PBS 清洗 3 次，DAPI 復染細胞核，清洗玻片，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察，FITC 激發/發射波長為 496 nm/516 nm，DAPI 激發/發射波長為 364 nm/454 nm。
1.8 M-BMSCs 堿性磷酸酶活性檢測
細胞加載 MVS 后，于第 7 天檢測細胞堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）蛋白表達量。用增強型 RIPA 裂解液處理，12 000 r/min 離心 10 min，取出上清液。50 μL 細胞裂解液加入 50 μL ALP 測定工作液，37℃ 孵育 15 min，加入 3 mol/L NaOH 終止反應，在酶標儀波長 405 nm 下檢測 OD 值，利用 BCA 試劑盒測定樣品的蛋白濃度，計算 NP/min/蛋白量。
1.9 RT-PCR 檢測 M-BMSCs 成骨相關基因表達
細胞加載 MVS 后，于第 1、4、7 天檢測細胞成骨基因 runt 相關轉錄因子 2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、Ⅰ型膠原（Collagen Ⅰ，Col-Ⅰ）、ALP 的表達。棄去培養基，PBS 清洗 2 次，細胞總 RNA 提取試劑盒裂解細胞，提取總 mRNA。利用 iScriptTM cDNA Synthesis Kit 將提取的 mRNA 反轉錄為 cDNA，采用 iQTM SYBR Green Supermix 試劑盒進行 RT-PCR 檢測。成骨基因引物序列見表 1。
表1
Runx2、Col-Ⅰ和 ALP 引物序列
Table1.
Primers sequence of Runx2, Col-Ⅰ and ALP
1.10 Western blotting 檢測 ERK1/2 信號通路磷酸化
將第 5 代的 M-BMSCs 按照每皿接種 5 × 105 個細胞，分為 VS 組與 SS 組，在第 1、3 天進行 Western blotting 檢測細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信號通路磷酸化。棄去培養基，PBS 清洗 2 次，加入含 1% 廣譜酶抑制劑與磷酸化酶抑制劑的增強型 RIPA 細胞裂解液充分裂解，12 000 r/min 離心 10 min，分離上清液。BCA 法測定樣品總蛋白濃度，配制 10% SD-PAGE 膠將 95℃ 變性后的蛋白分離，然后轉入 PVDF 膜上，將膜置于一抗孵育，再置于二抗孵育，最后將膜置于 ChemiDocTMXRS+化學發光儀器內曝光顯影。使用軟件 Image lab 記錄目的條帶灰度值并計算與之相應的 β-actin 比值。
1.11 統計學處理
每組樣品為 5 個，所有參數均做小樣本 t 檢驗，P < 0.05 為差異有統計學意義。
2 結果與討論
2.1 M-BMSC 增殖活性
增殖實驗結果如圖 1 所示，實驗組和對照組的 OD 值均隨時間延長而遞增，在第 7 天到達最高值。微振動加載早期（第 1 天）兩組細胞的 OD 值無明顯差異，在加力第 2 天和第 3 天，VS 組呈現出較明顯的促進細胞生長的趨勢，但隨著加力時間的延長（第 4 天以后），VS 組的細胞生長速率有所減緩，在第 6 天 VS 組細胞的增殖活性較 SS 組高，而其他時間點 VS 組與 SS 組的 OD 值無顯著差別。在力學加載早期（第 1～3 天），VS 組細胞在啟動凋亡程序清除部分力學適應性較差細胞的情況下，相對于 SS 組細胞仍具有更高的增殖行為，這說明 MVS 在早期能夠顯著提高具有力學適應性的細胞的增殖活性，這抵消了受力后細胞因死亡（凋亡）帶來的數量減少（第 1 天）。而到了后期兩組之間無明顯差異，說明 MVS 帶來的促增殖作用主要體現在細胞受力早期，而并非是一種長時性效應。這可能是因為后期細胞對力學刺激產生適應改變后，激活了骨向分化應答，因此增殖活性也有所回落[28]。該結果也說明 MVS 并未對細胞的增殖活性造成負向影響。
圖1
微振動對 M-BMSCs 增殖的影響
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研究顯示，振動刺激能激活效應細胞的細胞進程，包括細胞增殖、黏附、分化等。査丁勝等[29]的研究發現 20～50 Hz 的振動刺激能促進成骨細胞增殖活性。Kim 等的研究也顯示 30～40 Hz、0.3 g 的振動能顯著促進人 BMSCs 的增殖[1]。而 Zhou 等[8]的研究則發現 40～60 Hz、0.3 g 的微振動在促進人 BMSCs 成骨分化的同時對細胞增殖有抑制作用。大量研究已經證實間充質干細胞在對應力刺激做出響應的同時，也會受到細胞所處微環境的調控，甚至是細胞種屬的影響[30-31]。而本研究結果則顯示在模擬生理環境下，40 Hz、0.3 g、50 μm、30 min/天、正弦波的微振動能促進細胞早期的增殖行為，但隨后這種促進作用逐漸減弱，這可能是因為隨著周期性力學刺激的加載，細胞應答逐漸以骨向分化為主，從而使細胞的增殖速率有所減緩。
2.2 M-BMSCs 凋亡檢測與熒光染色觀察
微振動加載后細胞凋亡流式檢測結果如圖 2 所示，通過 FITC/APC 與 PI 對細胞進行標記，早期凋亡細胞會發生細胞膜外翻，進而被 FITC/APC 結合散發綠色熒光，晚期凋亡和死亡細胞的細胞膜不完整，因而能夠被 PI 進入結合細胞核，使其散發紅色熒光，以此定量區分處于不同狀態的細胞。加力 1 天后，VS 組出現 9.1% 的早期凋亡細胞，而 SS 組出現 5.9% 的早期凋亡細胞，VS 組的晚期凋亡細胞數量高于 SS 組。加力 3 天后，VS 組早期凋亡細胞數量較多，達到了 12%，但 SS 組死亡細胞數量達到 7.1%，兩組之間晚期凋亡細胞數量無顯著差異，這一結果提示不耐受 MVS 的細胞可能進一步通過凋亡被清除，留下的細胞除了發生早期凋亡外，其死亡細胞數量較 SS 組有所下降。結合細胞增殖活性，細胞加載微振動后，不耐受 MVS 的細胞被排除，留下的細胞相對于 SS 組細胞具有更好的力學適應性與增殖活性。
圖2
細胞凋亡的流式檢測
UL：死亡細胞；UR：晚期凋亡細胞；LL：正常細胞；LR：早期凋亡細胞
Figure2. Flow detection of M-BSMCs apoptosisUL: dead cells; UR: late apoptosis cells; LL: normal cells; LR: early apoptosis cells
通過 Calcein 與 PI 對細胞進行染色（見圖 3），正常細胞的細胞膜具有選擇透過性，因此只能通過 Calcein，細胞呈現綠色形態；早凋細胞的細胞膜被打破，因此可以被 PI 進入，細胞內部呈現綠色，周圍被 PI 染色呈現紅色形態；晚凋細胞細胞膜不具備選擇透過性，完全被 PI 染色，呈現紅色形態。加力 1 天后，VS 組和 SS 組細胞均保持完整的細胞形態，SS 組細胞胞質內顯示明亮的綠色熒光，而 VS 組部分細胞胞質外圍出現紅色熒光，內部則顯示綠色熒光，說明細胞有較明顯的凋亡現象，這一結果與流式檢測結果比較吻合。加力 3 天后，兩組細胞均呈現緊密堆積狀態，SS 組可見呈現紅色熒光的零星細胞，其形態收縮變圓，說明細胞有晚期凋亡現象；VS 組細胞胞質內呈現綠色熒光，凋亡細胞數量較少。
圖3
激光共聚焦觀察 M-BMSCs 的凋亡
綠色：鈣黃綠素；紅色：碘化丙啶。白色箭頭示晚凋細胞，黃色箭頭示早凋細胞
Figure3. Laser confocal observation of apoptosis of M-BMSCsgreen: Calcein; red: PI. White arrow: late withered cell: yellow arrow: withered cells
細胞凋亡是有特定控制的細胞自主有序死亡，又稱程序性細胞死亡[32-33]。細胞的凋亡具有不可逆轉性。研究表明適當的機械力學刺激可以促進細胞的生長、分化和功能的維持，但過度或持續時間過長的力學刺激又會對細胞的結構和功能造成損害[34]。本研究的結果顯示盡管在微振動加載早期細胞出現了早凋行為，但這種行為未產生大量細胞死亡且未對細胞正常生物學行為造成影響，這可能是細胞通過結構和形態調整適應了這種力學刺激，即獲得了力學自適應性[35-36]。通過 MVS 使得不耐受刺激的細胞發生凋亡而被清除，進而留下具有力學適應性的細胞，這一現象提示本研究給予細胞的 MVS 是一種生理適應性力學載荷，在少部分不耐受力學刺激的細胞被清除后，大部分細胞均能獲得力學適應性，以及更強的增殖活性。
2.3 M-BMSCs 細胞骨架染色
圖 4 所示為 VS 組與 SS 組細胞骨架染色。加載 MVS 1 天后，VS 組細胞較 SS 組鋪展度更高，形態均為多角形，SS 組細胞形態不均一。VS 組細胞內肌動蛋白微絲沿細胞長軸排列，較 SS 組分布更為有序，熒光表達也更為明亮，說明 VS 組細胞 F-actin 蛋白表達量顯著高于 SS 組。微振動加力 3 天后，兩組細胞熒光亮度均有所降低，SS 組降低更為明顯，且細胞有明顯增殖，排列緊密，細胞內肌動蛋白微絲分布無序，VS 組細胞相較于 SS 組鋪展度更高，微絲分布有序且熒光亮度高于 SS 組。
圖4
微振動對 M-BMSCs 中 F-actin 蛋白表達的影響
藍色：細胞核；綠色：聚合態微絲
Figure4. Effect of MVS on expression of F-action in M-BMSCs cellsblue: nucleus; green: F-action
細胞骨架是真核細胞胞質中的纖維狀網架，具有維持細胞形態及運動的功能，由微絲、微管和中間纖維組成。肌動蛋白與核膜相連，當有外力作用于細胞時，力學信號經細胞外基質-整合素-受體傳遞到細胞內，骨架系統發生解聚和重排，引發細胞形態變化[37-38]，并激活細胞基因組，引起細胞生長、蛋白質合成等應答反應。本研究顯示 MVS 力學刺激通過引起細胞骨架重構、F-actin 蛋白絲增粗及定向排列引起了 M-BMSCs 形態的變化，并在受力早期激活了細胞的增殖行為。隨著細胞周期性受力一段時間后，MVS 產生力學信號通過重構的細胞骨架進一步對細胞作用，促使細胞骨向分化以及細胞鋪展黏附，也因此抑制了細胞的增殖。研究結果顯示細胞受到力學刺激后會發生結構與形態的快速改建與功能響應，當細胞在早期完成了適應性改變且清除不耐受力學刺激的細胞后，存活的細胞將會獲得力學刺激耐受性，這就意味著細胞與支架復合后植入體內將會更快地適應體內生理應力的刺激[16]。
2.4 微振動調控 M-BMSCs 堿性磷酸酶表達
ALP 活性定量檢測結果顯示（見圖 5），VS 組在第 7 天的 ALP 表達顯著高于 SS 組（P < 0.05），這說明 VS 組細胞具有更好的成骨分化趨勢。M-BMSCs 分化初期會伴隨 ALP 的上升，ALP 是 M-BMSCs 分化的重要標志，ALP 作為成骨細胞系發育中期的標志物，反映其代謝水平，與細胞鈣化及細胞外基質礦化有著緊密聯系。研究表明 MVS 可以促進間充質干細胞成骨標志物 ALP、骨橋蛋白、Col-Ⅰ以及血管內皮生長因子的表達，這與本研究的 ALP 檢測結果是一致的，這也與本研究中細胞增殖的結果互為印證。這一現象與目前文獻報道的細胞分化促進的同時會使得細胞增殖活性降低的現象相一致，目前研究認為[26]，振動在促進人 BMSCs 成骨分化的同時，會降低細胞的增殖活性。本研究則發現，MVS 在促進 M-BMSCs 成骨分化的同時能夠提高細胞的增殖活性，這可能是由于本研究所用的微振動培養一體裝置在細胞接受 MVS 的同時提供了適宜的生理環境，排除了細胞因環境變化而造成的生理活性的異常。此外，不同的細胞來源可能也會對結果有一定的影響。
圖5
微振動對 M-BMSCs 堿性磷酸酶活性的影響
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2.5 M-BMSCs 早期成骨相關基因表達
由 RT-PCR 結果可見（見圖 6），相對于 SS 組細胞，VS 組細胞 Runx2、Col-Ⅰ和 ALP 的基因表達在第 4 天和第 7 天顯著高于 SS 組，Runx2 在第 4 天時表達最高，Col-Ⅰ和 ALP 在第 7 天時表達最高（P < 0.05）。骨系細胞在成骨分化過程中通常按照相似的時序性基因表達模式和框架。一般來說，Runx2 作為成骨細胞的特異性轉錄因子，是干細胞早期向成骨分化的特征性表達因子，在骨形成和重建過程中發揮重要作用；ALP 和 Col-Ⅰ是成骨細胞分泌的主要細胞外基質蛋白，在成骨細胞中期也就是細胞外基質合成階段表達[39-40]。從 RT-PCR 結果看，SS 組的 M-BMSCs 成骨分化相關基因 Runx2 在第 1 天即達到表達水平頂峰，而 VS 組則在第 4 天到達頂峰，相較于 SS 組推遲了，這可能是因為 VS 組在受力早期處于增殖活性增強狀態，從而抑制了細胞的分化行為。而兩組的 Col-Ⅰ和 ALP 表達盡管均在第 7 天達到頂峰，但 VS 組的表達顯著高于 SS 組，這說明 VS 組具有更強的促骨向分化能力。本研究的結果證明了 MVS 能夠促進 M-BMSCs 早期增殖和中期骨向分化，促進細胞外基質礦化及相關膠原合成，并且這種促進仍然遵循了生理狀態下骨系細胞成骨分化的時序性基因表達。
圖6
微振動對二維培養 M-BMSCs 成骨相關基因早期表達的影響
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2.6 M-BMSCs 的 ERK1/2 信號通路磷酸化表達
圖 7 為 Western blotting 的驗證結果。圖 7a 為 ERK1/2、pERK 與 β-action 蛋白的化學發光圖，目的蛋白分子量為 44 kD 左右；圖 7b 為通過歸一化處理后的各組 ERK1/2 的磷酸化比例直方圖，以 SS-D1 表達量為參考，通過 Image Lab 計算各組 pERK 相對于 SS-D1 的 pERK 的相對灰度值、ERK1/2 的相對灰度值與 β-action 的相對灰度值。經過計算處理的 Western blotting 結果顯示，第 1 天和第 3 天 VS 組細胞的 ERK1/2 磷酸化比例均明顯高于 SS 組（P < 0.05），且 VS 組與 SS 組 ERK1/2 的磷酸化比例在第 1 天表達最高，隨后兩組細胞的 ERK1/2 磷酸化比例均明顯下降，MVS 能夠顯著促進 ERK1/2 的磷酸化。
圖7
微振動對二維培養 M-BMSCs 的 ERK1/2 磷酸化的影響
a. 目的蛋白化學發光成像；b. ERK1/2 磷酸化比例直方圖. *
a. chemiluminiscence imaging of the target protein; b: histogram of proportion of ERK1/2 activation. *
ERK1/2 是絲裂原激活蛋白激酶家族的一個成員，是與細胞增殖、分化和凋亡相關的信號轉導因子[41-43]。研究表明，ERK1/2 信號通路中 ERK1/2 的磷酸化水平顯示了 MVS 對細胞分化的作用。本研究結果表明 MVS 可以促進 M-BMSCs 中 ERK1/2 的磷酸化，并且促進成骨早期分化。這提示 ERK1/2 磷酸化對細胞的早期成骨分化存在促進作用。此外，細胞在受力早期（第 1 天）增殖活性增強，F-actin 表達增加可能也與 ERK1/2 的磷酸化增高存在正性關系。
3 結論
力學加載模型、頻率與強度的不同都會對細胞的生物學行為產生不同的影響。本研究采用自主設計微振動培養一體裝置，在體外給予 M-BMSCs 以頻率 40 Hz、強度 0.3 g、振幅 50 μm、時間 30 min/天的周期性微振動刺激。研究結果顯示 MVS 能對 M-BMSCs 的生物活性和結構產生早期適應性改變與調節，并可能通過力學適應性細胞骨架重構從而促進了細胞的早期成骨分化。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
