小鼠動物模型作為科學研究中最常用的實驗工具，在兩個世紀的發展中受到了研究人員的廣泛青睞。小鼠白血病動物模型出現于 20 世紀 30 年代，在近 90 年的發展過程中，研究者們開發出了多種類型的小鼠白血病模型來模擬人類白血病的發生發展和藥物治療過程，這在一定程度上推動了白血病發生發展分子機制的闡明和靶向治療白血病藥物的研發進程。考慮到髓系白血病，特別是急性髓系白血病目前在臨床上沒有很好的治療措施，急需闡明其新的分子機制和開發新的治療靶點，本文重點綜述了近幾年最常用的髓系白血病小鼠模型，包括小鼠品系、髓系白血病細胞類型、成模方式等，以期為相關科研工作者在髓系白血病研究過程中選擇動物模型時提供一定的參考。
引用本文： 葛晨濤, 付彩云. 常見髓系白血病小鼠模型的研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2019, 36(5): 885-892. doi: 10.7507/1001-5515.201903012 復制
引言
白血病是一類造血干細胞惡性克隆性疾病，克隆性白血病細胞因為增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等機制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，并浸潤其他非造血組織和器官，同時抑制正常造血功能。在 2018 年腫瘤年報中，新增 437 033 例白血病病例，占所有新增腫瘤病例的 2.4%[1]。常見白血病可分為髓系和淋巴系兩大類，根據白血病的分化程度和自然病程的長短，髓系白血病又可分為急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）和慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia，CML）兩大類。AML 是一種血液系統惡性增生性疾病，也是一種遺傳異質性癌癥，起源于造血干細胞，起因是骨髓中未成熟原始粒細胞快速且不受控制的生長，其大量積聚并滲入其他組織，導致 AML 患者正常造血功能的抑制。CML 是一種骨髓增生性疾病，以費城（Ph）染色體為特征，9 號染色體（ch9）和 22 號染色體（ch22）的長臂之間相互易位。該易位導致 9 號染色體上的 ABL 基因和 22 號染色體上的 BCR 基因融合，形成編碼 BCR-ABL 癌蛋白的 DNA 序列，該癌蛋白是促進不受控制的骨髓細胞生成的組成型活性酪氨酸激酶。這種疾病最初由 Craigie、Bennett 和 Virchow 在 1845 年描述[2]，占所有白血病的 15%。大多數 CML 患者處于慢性期，其癥狀可以通過格列衛等靶向藥物進行控制，但是 CML 患者一旦進入急變期，將轉變為 AML 并伴隨一系列 AML 的臨床特征，如發熱、出血、貧血和浸潤等。
小鼠是由小家鼠演變而來，作為模式生物的一種，被廣泛應用于科學研究中。它廣泛分布于世界各地，經長期人工飼養選擇培育，已育成 1 000 多近交系和獨立的遠交群。早在 17 世紀就有人用小鼠做實驗，有文獻記載的可以追溯到 19 世紀[3]，小鼠已成為使用量最大、研究最詳盡的哺乳類實驗動物。1930 年，人們開始使用小鼠白血病模型[4]。如今小鼠的品系有上千種，用于白血病動物模型的一般分為近交系和突變系兩種，簡要總結見表 1。
表1
常見白血病模型所用小鼠品系
Table1.
Mouse strains used in common mouse models of leukemia
科學研究過程中會根據實驗目的不同選擇不同的小鼠品系和白血病小鼠模型。常用的白血病小鼠模型有三種：異種移植模型、基因修飾型白血病模型和誘發性白血病模型（見圖 1）。髓系白血病小鼠模型已經在科學研究中得到廣泛使用，但目前少見相關綜述，為了科研工作者能更加方便快捷地選擇符合實驗目的的小鼠模型，現對近年相關文獻進行總結。
圖1
常用的白血病小鼠模型
a. 異種移植模型：白血病細胞系來源或患者來源的白血病細胞通過各種手段移植到小鼠體內，得到白血病小鼠；b. 基因修飾模型：通過將目的基因導入小鼠基因組，獲得基因修飾小鼠模型；c. 誘發性模型：通過化學或物理手段誘導使小鼠產生人為的白血病
Figure1. Common mouse models of leukemiaa. xenograft model: leukemia cells derived from leukemia cell lines or patient-derived leukemia cells are transplanted into mice by various means to obtain leukemia mice; b. genetic modification model: a genetically modified mouse model was obtained by introducing a gene of interest into a mouse genome; c. induced model: the mouse is induced to produce artificial leukemia by chemical or physical means
1 異種移植模型
異種移植模型是最常用的動物模型，其具體內容就是將白血病細胞移植到免疫缺陷的小鼠體內，細胞來源可分為白血病細胞系細胞（見表 2）、患者來源的細胞以及轉染的小鼠骨髓細胞。
表2
常用髓系白血病細胞株
Table2.
Myeloid leukemia cell lines
根據實驗目的選擇不同的小鼠和細胞后，通常的接種方式有皮下接種、眼眶后接種、骨髓接種和尾靜脈接種。在接種細胞之前，需要盡可能地破壞小鼠體內殘存的免疫力，方法有射線輻射法和藥物處理兩種。射線輻射是指用半致死的 γ 射線輻射小鼠，該方法始于 1956 年 Congdon 等[5]發現射線可以很大程度上破壞小鼠的免疫力。藥物處理是指用免疫抑制劑來破壞小鼠的殘存免疫力，常用的有環磷酰胺等，在 1951 年 Burchenal 等[6]首次用藥物來抑制小鼠的免疫力。
1.1 皮下接種
皮下接種是較為常見的一種接種方式，其優點是操作簡便，易于觀察，成瘤效果好（見表 3[7-28]）。從近年來的文獻中我們可以看到，BALB/c-nude 小鼠在皮下接種受體小鼠中最受歡迎，這可能與它沒有毛的特性有關，有利于實驗者觀察腫瘤的生長情況。皮下接種的驗證成瘤方式為直接觀察，并用游標卡尺測量腫瘤的長和寬，計算腫瘤體積公式為：V = （長度 × 寬度2）/2（其中寬度定義為兩次測量中較小的一次，長度定義為兩者中較大者）。在腫瘤達到 100～150 mm3時開始使用藥物處理，當腫瘤過大或者注射細胞 30 天左右處死小鼠，取出腫瘤和需要的臟器。腫瘤和臟器可以切片染色，觀察白血病的侵染情況；也可以通過將其制成蛋白樣品來探究白血病發生發展的分子機制；還可以將組織塊分散為單細胞懸液，通過流式細胞儀分選出目標細胞群，進一步實驗。
表3
皮下注射接種小鼠白血病模型
Table3.
Mouse models for leukemia by subcutaneous inoculation
1.2 眼眶后接種
眼眶后接種在異種移植模型中屬于應用較少的方式。在近 5 年的文章中，McGill 等[29]通過眼眶后接種將 C1498 細胞移植到 C57BL/6 小鼠（1 × 106個細胞/小鼠）研究藍莓提取物抗 AML 功效；Ferreira 等[30]將從 hCG-PML-RARα 轉基因小鼠獲得的白血病細胞（2 × 106個細胞/小鼠）注射到 10～12 周齡的 NOD-SCID 小鼠眼叢中，評估磷酸乙醇胺能否成為治療白血病的藥物；Zhang 等[31]將 MV-4-11 細胞（2.5 × 106個細胞/小鼠）通過眼眶后接種到 NOD-SCID 小鼠，證明了 CD244 可作為治療 AML 的新型治療靶標。從上述三例實驗我們可以發現，NOD-SCID 小鼠是眼眶后接種的首選實驗對象，而眼眶后接種的最大缺點可能在于實驗難度過大，建模成功率不高。
1.3 骨髓接種
骨髓接種是指通過鉆骨針在小鼠股骨鉆孔，然后使用微量進樣器將白血病細胞直接注入骨髓腔的接種方式。這種方式通常都用來觀察白血病細胞對骨的破壞性以及白細胞骨轉移后的治療方式。Nóbrega-Pereira 等[32]將 HEL 細胞注射到 NSG 小鼠（1 × 105個細胞/小鼠）的右脛骨中，研究靶向耐藥性白血病細胞的線粒體代謝途徑的分子機制；Yoshimi 等[33]將從慢性粒單核細胞白血病（chronic myelomonocytic leukemia，CMML）和青少年髓單核細胞白血病（juvenile myelomonocytic leukemia，JMML）患者的外周血中分離得到的 CD34+細胞注射到 NSG 小鼠（0.2 × 106～1.18 × 106個細胞/小鼠）的股骨中，研究在 NSG 小鼠中 CMML 和 JMML 疾病起始和成熟白血病細胞的發展；Mori 等[22]將 MV-4-11-luc 細胞（1 × 106細胞/小鼠）注射到雌性 NOD-SCID 小鼠的左脛骨骨髓，通過全身的生物發光成像監測腫瘤生長；Liyanage 等[11]將原始 AML 細胞（2 × 106～3 × 106個細胞/小鼠）注射到雌性 NOD-SCID 小鼠的右股骨中，一段時間后處死取左股骨，收集骨髓腔中的細胞，通過流式定量評估左股骨中的原代 AML 植入；Zhang 等[31]將 MV-4-11 細胞（2.5 × 106個細胞/小鼠）注射到 NOD-SCID 小鼠脛骨中，用作評估靶向 CD244 治療白血病的療效。骨髓接種白血病細胞之后，通過基于流式細胞術的血液（縱向）和外周器官（末期疾病階段）中腫瘤細胞數量的計數來評估腫瘤進展。NSG 小鼠和 NOD-SCID 小鼠是骨髓接種的熱門動物，這與它們的重度免疫缺陷有關；骨髓接種的最大優點在于其模擬發源于骨髓的白血病在小鼠體內的發展過程，這對研究白血病在人體的發展具有重要借鑒作用。
1.4 尾靜脈接種
尾靜脈接種是指將細胞通過尾靜脈直接接種到小鼠的血液系統中，主要優點是可形成全身性擴散的白血病模型，符合白血病臨床進展規律，此模型以動物生存期作為評價藥效的主要指標。尾靜脈注射白血病細胞后，可通過白細胞（white blood cell，WBC）計數、活體成像（注射細胞帶有熒光素酶基因）、流式細胞儀每周監測血液學計數等方法，并利用以下標準驗證白血病模型是否構建成功：外周血中存在至少 1%的原始細胞和 3 × 104細胞/L 以上的白細胞增多，血紅蛋白水平低于 10 g/dL，血小板低于 5 × 105細胞/L[34]。表 4 顯示了尾靜脈接種小鼠常用的細胞類型和受體小鼠[35-59]，統計結果表明接種人源白血病細胞的受體小鼠多數為 NSG 小鼠；接種小鼠白血病細胞 C1498 細胞則多選用 C57BL/6 小鼠。患者來源的異種移植模型（patient derived xenograft model，PDX）是將患者來源的外周血單核細胞經過增殖接種到小鼠體內，構建白血病小鼠模型。將患者的血液樣品經過密度梯度離心，得到外周血單核細胞；使用單克隆抗體 CD45-FITC、CD19-APC、CD10-PerCP-Cy5.5、CD34-PE-Cy7 和 NG2-PE 進行免疫表型分析，分選出目標細胞群，經過體外培養達到足夠數量，將細胞注射到小鼠的尾靜脈中[60]。
表4
尾靜脈注射接種小鼠白血病模型
Table4.
Mouse models for leukemia by tail vein inoculation
2 基因修飾型白血病模型
目前從文獻中得知骨髓腫瘤的遺傳形式與至少 10 個基因的種系突變有關，包括 ANKRD26、CEBPA、DDX41、ETV6、GATA2、RUNX1、SRP72、TERC、TERT 和 TP53[61-63]。在最近的一項研究中，SRSF2、SF3B1、U2AF1、ZRSR2、ASXL1、EZH2、BCOR 或 STAG2 中突變的存在定義了 AML 的獨特遺傳亞型，其與臨床證實的繼發性 AML 具有相似的臨床病理學特征[64]。Basova[65]通過將 PU.1 敲降模型（PU.1ure/ure）與 p53-/-突變小鼠雜交得到 PU.1ure/urep53-/-小鼠，在這種小鼠中產生高度侵襲性的 AML。Omidvar 等[66]將 MRP8BCL-2 小鼠與 MRP8NRASD12 小鼠雜交，產生 MRP8［BCL-2/NRASD12］小鼠，具有顯著較差的存活率，根據血樣結果可分為人類 AML 樣或未成熟的小鼠骨髓性白血病。Tsai 等[67]對新生非 M3 的 391 名 AML 患者進行基因檢測，發現 37 名患者（9.5%）具有 cohesin 基因突變，同時在這 37 例病例中檢測上述白血病常見突變基因，結果顯示，30 名（81.1%）患者至少還有一種其他基因突變，如 FLT3-ITD（21.6%）、NPM1（21.6%）、RUNX1 或 ASXL1。Mullenders 等[68]描述了 cohesin 在造血干細胞和祖細胞（hematopoietic stem and progenitor cell，HSPC）穩態中的作用。首先，他們用針對 Rad21、Smc3 和 Smc1a 基因的 shRNA 轉染小鼠骨髓 HSPC，結果表明它們的重新植入能力和髓樣分化缺陷迅速增加。然后，他們構建具有 cohesin 下調的小鼠模型，一系列檢測結果顯示該模型小鼠具有骨髓瘤形成的臨床特征。Harada 等[69]在 C57BL/6 小鼠中構建 GATA2 亞型突變體（G2fGN/fGN），檢查年輕（42～99 天齡）、中年（100～249 天齡）和老年（250 天或更多）小鼠的造血指數，發現 G2fGN/fGN小鼠在其一生中患有血小板減少癥，并且在老年時期患有白細胞增多癥，這些發現表明 G2fGN/fGN小鼠中的 GATA2 嚴重損害了 HSPC，這導致了造血系統腫瘤的發展，這些數據意味著 GATA2 可能參與或促成人類白血病的發生。Kaur 等[70]通過構建 NPM1c+ 慢病毒轉染人 CD34+HSPC，轉染效率為 5%～20%，通過心內注射將轉染和未轉染的 HSPC 的混合物植入 NSG 新生鼠中，在重建后 8 周開始監測小鼠的人白細胞重建和外周血中的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達。結果顯示，注射轉染 NPM1c+ 的 HSPC 的小鼠存活時間顯著低于對照組小鼠，且病毒轉染效率越高，存活時間越短；模型小鼠表現出貧血、血細胞生成障礙、骨髓和血液中白血病細胞的存在，以及白血病細胞向其他器官的浸潤等現象，結果顯示 NPM1c 可能參與白血病的發生發展。
3 誘發性白血病模型
誘發性白血病模型是指用物理或化學的方式作用于小鼠，使其產生白血病。化學手段是通過一些致癌或致突變的藥劑，如烷基化劑 N-乙基-亞硝基脲（N-Ethyl-N-nitrosourea，ENU）[71-72]。物理方法則是通過一些電離輻射（如 γ 射線）誘發小鼠形成白血病模型。誘發性白血病模型的優點是操作方便，缺點是成模的效率低，并且模型小鼠的個體差異過大。Bernard 等[73]在 8 周齡 WKAH/Hkm 大鼠上，每周 5 天口服給藥 6 mg 的 N-丁基亞硝基脲（N-Butylnitrosourea，BNU）（先溶解在 0.3 mL 乙醇中，再用飲用水進一步稀釋至 15 mL），連續給藥 24 周，接著觀察所有大鼠 12 個月，并通過流式細胞術檢測外周血監測白血病進程。BNU 處理組總誘導白血病為 60% ± 6%，在白血病大鼠中，白細胞的數量急劇增加，還觀察到貧血和血小板減少癥。Sugiyama 等[74]使用 Long-Evans 大鼠，通過尾靜脈注射二羥甲基丁酸（dimethylolbutanoic acid，DMBA）的脂質乳劑（含有 15% 棉籽油、0.5% DMBA、大豆卵磷脂和 Pluronic F68）構建大鼠白血病模型，使用 25～45 mg/kg 的 DMBA 劑量，在 27 天開始以 10～14 天的間隔進行 5～6 次，作為標準方案，通常使用降低劑量為 45、40、35、30 和 25 mg/kg，因為老年動物對 DMBA 的耐受性較差。在注射 DMBA 前 1 天和注射 7 天后進行血液檢查，并進行肝臟活組織檢查。行活組織檢查時，在乙醚麻醉下通過腹部切口切除肝臟周邊的楔形（約 50 mg）。通過每周一次的血液檢查發現，外周血在晚期顯示輕度或中度白細胞增多；在組織學檢查中，大的胚細胞侵入肝竇，最終完全取代竇狀隙；在脾臟中，白血病細胞侵入紅髓，淋巴濾泡保存至晚期；在淋巴結、骨髓和腎上腺中層不斷發現白血病浸潤。另外，DMBA 誘導的白血病在 N-ras 基因的密碼子 61 處始終具有 A > T 顛換二堿基突變。
4 結論與展望
腫瘤小鼠模型可以用來研究腫瘤的發生發展機制，也可用來評價治療腫瘤的臨床前藥物的效果，從而為藥物研發提供臨床前藥效學的實驗數據支持，以及預測該臨床前藥物可能的不良反應和毒副作用；盡管藥物在小鼠上進行過臨床前的動物實驗研究，但是從動物模型到腫瘤臨床試驗的平均成功轉換率低于 8%[75]，甚至存在可能導致實驗患者死亡的風險[76]。因此完善改進現有的臨床前實驗動物模型，提高臨床前藥物動物水平實驗結果適用于人體水平的準確率，是亟待解決的科學問題。本文著重介紹了髓系白血病小鼠的異種移植模型，這也是目前髓系白血病研究中最常用的模型，從最初的皮下接種細胞發展到現在的靜脈接種細胞，從原先最基礎的近交系小鼠發展到現在的 NSG 突變系小鼠，建模成功率和有效性都有了極大改善。基因修飾模型是在基因編輯技術基礎上發展起來的動物模型，目前，基因修飾小鼠白血病模型應用還不廣泛，建模技術還有待完善和進一步提高，通過后續科學家們共同的努力，相信今后髓系白血病的基因修飾白血病模型可能為臨床前白血病藥物的篩選提供更加貼合臨床實際的動物模型，從而助力臨床髓系白血病藥物研發的進程。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
白血病是一類造血干細胞惡性克隆性疾病，克隆性白血病細胞因為增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等機制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，并浸潤其他非造血組織和器官，同時抑制正常造血功能。在 2018 年腫瘤年報中，新增 437 033 例白血病病例，占所有新增腫瘤病例的 2.4%[1]。常見白血病可分為髓系和淋巴系兩大類，根據白血病的分化程度和自然病程的長短，髓系白血病又可分為急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）和慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia，CML）兩大類。AML 是一種血液系統惡性增生性疾病，也是一種遺傳異質性癌癥，起源于造血干細胞，起因是骨髓中未成熟原始粒細胞快速且不受控制的生長，其大量積聚并滲入其他組織，導致 AML 患者正常造血功能的抑制。CML 是一種骨髓增生性疾病，以費城（Ph）染色體為特征，9 號染色體（ch9）和 22 號染色體（ch22）的長臂之間相互易位。該易位導致 9 號染色體上的 ABL 基因和 22 號染色體上的 BCR 基因融合，形成編碼 BCR-ABL 癌蛋白的 DNA 序列，該癌蛋白是促進不受控制的骨髓細胞生成的組成型活性酪氨酸激酶。這種疾病最初由 Craigie、Bennett 和 Virchow 在 1845 年描述[2]，占所有白血病的 15%。大多數 CML 患者處于慢性期，其癥狀可以通過格列衛等靶向藥物進行控制，但是 CML 患者一旦進入急變期，將轉變為 AML 并伴隨一系列 AML 的臨床特征，如發熱、出血、貧血和浸潤等。
小鼠是由小家鼠演變而來，作為模式生物的一種，被廣泛應用于科學研究中。它廣泛分布于世界各地，經長期人工飼養選擇培育，已育成 1 000 多近交系和獨立的遠交群。早在 17 世紀就有人用小鼠做實驗，有文獻記載的可以追溯到 19 世紀[3]，小鼠已成為使用量最大、研究最詳盡的哺乳類實驗動物。1930 年，人們開始使用小鼠白血病模型[4]。如今小鼠的品系有上千種，用于白血病動物模型的一般分為近交系和突變系兩種，簡要總結見表 1。
表1
常見白血病模型所用小鼠品系
Table1.
Mouse strains used in common mouse models of leukemia
科學研究過程中會根據實驗目的不同選擇不同的小鼠品系和白血病小鼠模型。常用的白血病小鼠模型有三種：異種移植模型、基因修飾型白血病模型和誘發性白血病模型（見圖 1）。髓系白血病小鼠模型已經在科學研究中得到廣泛使用，但目前少見相關綜述，為了科研工作者能更加方便快捷地選擇符合實驗目的的小鼠模型，現對近年相關文獻進行總結。
圖1
常用的白血病小鼠模型
a. 異種移植模型：白血病細胞系來源或患者來源的白血病細胞通過各種手段移植到小鼠體內，得到白血病小鼠；b. 基因修飾模型：通過將目的基因導入小鼠基因組，獲得基因修飾小鼠模型；c. 誘發性模型：通過化學或物理手段誘導使小鼠產生人為的白血病
Figure1. Common mouse models of leukemiaa. xenograft model: leukemia cells derived from leukemia cell lines or patient-derived leukemia cells are transplanted into mice by various means to obtain leukemia mice; b. genetic modification model: a genetically modified mouse model was obtained by introducing a gene of interest into a mouse genome; c. induced model: the mouse is induced to produce artificial leukemia by chemical or physical means
1 異種移植模型
異種移植模型是最常用的動物模型，其具體內容就是將白血病細胞移植到免疫缺陷的小鼠體內，細胞來源可分為白血病細胞系細胞（見表 2）、患者來源的細胞以及轉染的小鼠骨髓細胞。
表2
常用髓系白血病細胞株
Table2.
Myeloid leukemia cell lines
根據實驗目的選擇不同的小鼠和細胞后，通常的接種方式有皮下接種、眼眶后接種、骨髓接種和尾靜脈接種。在接種細胞之前，需要盡可能地破壞小鼠體內殘存的免疫力，方法有射線輻射法和藥物處理兩種。射線輻射是指用半致死的 γ 射線輻射小鼠，該方法始于 1956 年 Congdon 等[5]發現射線可以很大程度上破壞小鼠的免疫力。藥物處理是指用免疫抑制劑來破壞小鼠的殘存免疫力，常用的有環磷酰胺等，在 1951 年 Burchenal 等[6]首次用藥物來抑制小鼠的免疫力。
1.1 皮下接種
皮下接種是較為常見的一種接種方式，其優點是操作簡便，易于觀察，成瘤效果好（見表 3[7-28]）。從近年來的文獻中我們可以看到，BALB/c-nude 小鼠在皮下接種受體小鼠中最受歡迎，這可能與它沒有毛的特性有關，有利于實驗者觀察腫瘤的生長情況。皮下接種的驗證成瘤方式為直接觀察，并用游標卡尺測量腫瘤的長和寬，計算腫瘤體積公式為：V = （長度 × 寬度2）/2（其中寬度定義為兩次測量中較小的一次，長度定義為兩者中較大者）。在腫瘤達到 100～150 mm3時開始使用藥物處理，當腫瘤過大或者注射細胞 30 天左右處死小鼠，取出腫瘤和需要的臟器。腫瘤和臟器可以切片染色，觀察白血病的侵染情況；也可以通過將其制成蛋白樣品來探究白血病發生發展的分子機制；還可以將組織塊分散為單細胞懸液，通過流式細胞儀分選出目標細胞群，進一步實驗。
表3
皮下注射接種小鼠白血病模型
Table3.
Mouse models for leukemia by subcutaneous inoculation
1.2 眼眶后接種
眼眶后接種在異種移植模型中屬于應用較少的方式。在近 5 年的文章中，McGill 等[29]通過眼眶后接種將 C1498 細胞移植到 C57BL/6 小鼠（1 × 106個細胞/小鼠）研究藍莓提取物抗 AML 功效；Ferreira 等[30]將從 hCG-PML-RARα 轉基因小鼠獲得的白血病細胞（2 × 106個細胞/小鼠）注射到 10～12 周齡的 NOD-SCID 小鼠眼叢中，評估磷酸乙醇胺能否成為治療白血病的藥物；Zhang 等[31]將 MV-4-11 細胞（2.5 × 106個細胞/小鼠）通過眼眶后接種到 NOD-SCID 小鼠，證明了 CD244 可作為治療 AML 的新型治療靶標。從上述三例實驗我們可以發現，NOD-SCID 小鼠是眼眶后接種的首選實驗對象，而眼眶后接種的最大缺點可能在于實驗難度過大，建模成功率不高。
1.3 骨髓接種
骨髓接種是指通過鉆骨針在小鼠股骨鉆孔，然后使用微量進樣器將白血病細胞直接注入骨髓腔的接種方式。這種方式通常都用來觀察白血病細胞對骨的破壞性以及白細胞骨轉移后的治療方式。Nóbrega-Pereira 等[32]將 HEL 細胞注射到 NSG 小鼠（1 × 105個細胞/小鼠）的右脛骨中，研究靶向耐藥性白血病細胞的線粒體代謝途徑的分子機制；Yoshimi 等[33]將從慢性粒單核細胞白血病（chronic myelomonocytic leukemia，CMML）和青少年髓單核細胞白血病（juvenile myelomonocytic leukemia，JMML）患者的外周血中分離得到的 CD34+細胞注射到 NSG 小鼠（0.2 × 106～1.18 × 106個細胞/小鼠）的股骨中，研究在 NSG 小鼠中 CMML 和 JMML 疾病起始和成熟白血病細胞的發展；Mori 等[22]將 MV-4-11-luc 細胞（1 × 106細胞/小鼠）注射到雌性 NOD-SCID 小鼠的左脛骨骨髓，通過全身的生物發光成像監測腫瘤生長；Liyanage 等[11]將原始 AML 細胞（2 × 106～3 × 106個細胞/小鼠）注射到雌性 NOD-SCID 小鼠的右股骨中，一段時間后處死取左股骨，收集骨髓腔中的細胞，通過流式定量評估左股骨中的原代 AML 植入；Zhang 等[31]將 MV-4-11 細胞（2.5 × 106個細胞/小鼠）注射到 NOD-SCID 小鼠脛骨中，用作評估靶向 CD244 治療白血病的療效。骨髓接種白血病細胞之后，通過基于流式細胞術的血液（縱向）和外周器官（末期疾病階段）中腫瘤細胞數量的計數來評估腫瘤進展。NSG 小鼠和 NOD-SCID 小鼠是骨髓接種的熱門動物，這與它們的重度免疫缺陷有關；骨髓接種的最大優點在于其模擬發源于骨髓的白血病在小鼠體內的發展過程，這對研究白血病在人體的發展具有重要借鑒作用。
1.4 尾靜脈接種
尾靜脈接種是指將細胞通過尾靜脈直接接種到小鼠的血液系統中，主要優點是可形成全身性擴散的白血病模型，符合白血病臨床進展規律，此模型以動物生存期作為評價藥效的主要指標。尾靜脈注射白血病細胞后，可通過白細胞（white blood cell，WBC）計數、活體成像（注射細胞帶有熒光素酶基因）、流式細胞儀每周監測血液學計數等方法，并利用以下標準驗證白血病模型是否構建成功：外周血中存在至少 1%的原始細胞和 3 × 104細胞/L 以上的白細胞增多，血紅蛋白水平低于 10 g/dL，血小板低于 5 × 105細胞/L[34]。表 4 顯示了尾靜脈接種小鼠常用的細胞類型和受體小鼠[35-59]，統計結果表明接種人源白血病細胞的受體小鼠多數為 NSG 小鼠；接種小鼠白血病細胞 C1498 細胞則多選用 C57BL/6 小鼠。患者來源的異種移植模型（patient derived xenograft model，PDX）是將患者來源的外周血單核細胞經過增殖接種到小鼠體內，構建白血病小鼠模型。將患者的血液樣品經過密度梯度離心，得到外周血單核細胞；使用單克隆抗體 CD45-FITC、CD19-APC、CD10-PerCP-Cy5.5、CD34-PE-Cy7 和 NG2-PE 進行免疫表型分析，分選出目標細胞群，經過體外培養達到足夠數量，將細胞注射到小鼠的尾靜脈中[60]。
表4
尾靜脈注射接種小鼠白血病模型
Table4.
Mouse models for leukemia by tail vein inoculation
2 基因修飾型白血病模型
目前從文獻中得知骨髓腫瘤的遺傳形式與至少 10 個基因的種系突變有關，包括 ANKRD26、CEBPA、DDX41、ETV6、GATA2、RUNX1、SRP72、TERC、TERT 和 TP53[61-63]。在最近的一項研究中，SRSF2、SF3B1、U2AF1、ZRSR2、ASXL1、EZH2、BCOR 或 STAG2 中突變的存在定義了 AML 的獨特遺傳亞型，其與臨床證實的繼發性 AML 具有相似的臨床病理學特征[64]。Basova[65]通過將 PU.1 敲降模型（PU.1ure/ure）與 p53-/-突變小鼠雜交得到 PU.1ure/urep53-/-小鼠，在這種小鼠中產生高度侵襲性的 AML。Omidvar 等[66]將 MRP8BCL-2 小鼠與 MRP8NRASD12 小鼠雜交，產生 MRP8［BCL-2/NRASD12］小鼠，具有顯著較差的存活率，根據血樣結果可分為人類 AML 樣或未成熟的小鼠骨髓性白血病。Tsai 等[67]對新生非 M3 的 391 名 AML 患者進行基因檢測，發現 37 名患者（9.5%）具有 cohesin 基因突變，同時在這 37 例病例中檢測上述白血病常見突變基因，結果顯示，30 名（81.1%）患者至少還有一種其他基因突變，如 FLT3-ITD（21.6%）、NPM1（21.6%）、RUNX1 或 ASXL1。Mullenders 等[68]描述了 cohesin 在造血干細胞和祖細胞（hematopoietic stem and progenitor cell，HSPC）穩態中的作用。首先，他們用針對 Rad21、Smc3 和 Smc1a 基因的 shRNA 轉染小鼠骨髓 HSPC，結果表明它們的重新植入能力和髓樣分化缺陷迅速增加。然后，他們構建具有 cohesin 下調的小鼠模型，一系列檢測結果顯示該模型小鼠具有骨髓瘤形成的臨床特征。Harada 等[69]在 C57BL/6 小鼠中構建 GATA2 亞型突變體（G2fGN/fGN），檢查年輕（42～99 天齡）、中年（100～249 天齡）和老年（250 天或更多）小鼠的造血指數，發現 G2fGN/fGN小鼠在其一生中患有血小板減少癥，并且在老年時期患有白細胞增多癥，這些發現表明 G2fGN/fGN小鼠中的 GATA2 嚴重損害了 HSPC，這導致了造血系統腫瘤的發展，這些數據意味著 GATA2 可能參與或促成人類白血病的發生。Kaur 等[70]通過構建 NPM1c+ 慢病毒轉染人 CD34+HSPC，轉染效率為 5%～20%，通過心內注射將轉染和未轉染的 HSPC 的混合物植入 NSG 新生鼠中，在重建后 8 周開始監測小鼠的人白細胞重建和外周血中的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達。結果顯示，注射轉染 NPM1c+ 的 HSPC 的小鼠存活時間顯著低于對照組小鼠，且病毒轉染效率越高，存活時間越短；模型小鼠表現出貧血、血細胞生成障礙、骨髓和血液中白血病細胞的存在，以及白血病細胞向其他器官的浸潤等現象，結果顯示 NPM1c 可能參與白血病的發生發展。
3 誘發性白血病模型
誘發性白血病模型是指用物理或化學的方式作用于小鼠，使其產生白血病。化學手段是通過一些致癌或致突變的藥劑，如烷基化劑 N-乙基-亞硝基脲（N-Ethyl-N-nitrosourea，ENU）[71-72]。物理方法則是通過一些電離輻射（如 γ 射線）誘發小鼠形成白血病模型。誘發性白血病模型的優點是操作方便，缺點是成模的效率低，并且模型小鼠的個體差異過大。Bernard 等[73]在 8 周齡 WKAH/Hkm 大鼠上，每周 5 天口服給藥 6 mg 的 N-丁基亞硝基脲（N-Butylnitrosourea，BNU）（先溶解在 0.3 mL 乙醇中，再用飲用水進一步稀釋至 15 mL），連續給藥 24 周，接著觀察所有大鼠 12 個月，并通過流式細胞術檢測外周血監測白血病進程。BNU 處理組總誘導白血病為 60% ± 6%，在白血病大鼠中，白細胞的數量急劇增加，還觀察到貧血和血小板減少癥。Sugiyama 等[74]使用 Long-Evans 大鼠，通過尾靜脈注射二羥甲基丁酸（dimethylolbutanoic acid，DMBA）的脂質乳劑（含有 15% 棉籽油、0.5% DMBA、大豆卵磷脂和 Pluronic F68）構建大鼠白血病模型，使用 25～45 mg/kg 的 DMBA 劑量，在 27 天開始以 10～14 天的間隔進行 5～6 次，作為標準方案，通常使用降低劑量為 45、40、35、30 和 25 mg/kg，因為老年動物對 DMBA 的耐受性較差。在注射 DMBA 前 1 天和注射 7 天后進行血液檢查，并進行肝臟活組織檢查。行活組織檢查時，在乙醚麻醉下通過腹部切口切除肝臟周邊的楔形（約 50 mg）。通過每周一次的血液檢查發現，外周血在晚期顯示輕度或中度白細胞增多；在組織學檢查中，大的胚細胞侵入肝竇，最終完全取代竇狀隙；在脾臟中，白血病細胞侵入紅髓，淋巴濾泡保存至晚期；在淋巴結、骨髓和腎上腺中層不斷發現白血病浸潤。另外，DMBA 誘導的白血病在 N-ras 基因的密碼子 61 處始終具有 A > T 顛換二堿基突變。
4 結論與展望
腫瘤小鼠模型可以用來研究腫瘤的發生發展機制，也可用來評價治療腫瘤的臨床前藥物的效果，從而為藥物研發提供臨床前藥效學的實驗數據支持，以及預測該臨床前藥物可能的不良反應和毒副作用；盡管藥物在小鼠上進行過臨床前的動物實驗研究，但是從動物模型到腫瘤臨床試驗的平均成功轉換率低于 8%[75]，甚至存在可能導致實驗患者死亡的風險[76]。因此完善改進現有的臨床前實驗動物模型，提高臨床前藥物動物水平實驗結果適用于人體水平的準確率，是亟待解決的科學問題。本文著重介紹了髓系白血病小鼠的異種移植模型，這也是目前髓系白血病研究中最常用的模型，從最初的皮下接種細胞發展到現在的靜脈接種細胞，從原先最基礎的近交系小鼠發展到現在的 NSG 突變系小鼠，建模成功率和有效性都有了極大改善。基因修飾模型是在基因編輯技術基礎上發展起來的動物模型，目前，基因修飾小鼠白血病模型應用還不廣泛，建模技術還有待完善和進一步提高，通過后續科學家們共同的努力，相信今后髓系白血病的基因修飾白血病模型可能為臨床前白血病藥物的篩選提供更加貼合臨床實際的動物模型，從而助力臨床髓系白血病藥物研發的進程。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
