本文研究了牛心包液氮冷凍并減薄后的性能變化，并與豬心包進行了對比。采用蘇木精-伊紅（HE）染色的方法進行組織學微結構觀察，并通過拉伸試驗評價了冷凍和減薄對心包力學性能的影響，組織學觀察和力學性能評價均采用豬心包作為對照。結果表明牛心包在液氮冷凍后性能未見區別；冷凍減薄后，割線模量和極限強度與豬心包基本相當，彈性模量略高于豬心包。研究表明，牛心包減薄容易獲得理想的厚度和預期的性能，其可作為經導管瓣膜瓣葉材料的一種選擇。
引用本文： 金昌, 吳澤斌, 靳永富, 王麗珍, 鐘生平, 樊瑜波. 牛心包液氮冷凍減薄后性能研究. 生物醫學工程學雜志, 2019, 36(5): 827-833. doi: 10.7507/1001-5515.201901033 復制
引言
經導管瓣膜植入術因其創傷小、恢復快等特點，自 2002 年 Cribier 等[1]完成首例植入后，發展迅速，對不可外科手術或外科手術存在高風險的患者已經取得了良好的術后效果[2-3]。但經導管瓣膜植入前需要將瓣膜壓縮進小直徑的輸送鞘管，以降低瓣膜植入引起的血管并發癥的發生率[4-6]。因此，經導管瓣膜瓣葉必須很薄，才能裝入小直徑的輸送鞘管，但同時又要有足夠的厚度，以承受工作時產生的各種應力。
牛心包作為生物瓣膜的瓣葉已有 40 多年的歷史[7]，雖然具有與天然心臟瓣膜相似的力學性質和良好的可獲得性，但其較厚，因此部分經導管瓣膜選用更薄的豬心包作為瓣葉以滿足較小的輸送直徑[8-9]。但是，瓣膜瓣葉對心包的厚度和一致性有一定要求，豬飼養期較短，其心包通常因為太薄而不能滿足使用要求，獲取一定厚度的豬心包需要額外增加豬的飼養期，會導致成本的增加，并存在一定的難度。生物瓣膜瓣葉的實際生產中，也會因心包厚度問題浪費掉大量心包。考慮到牛心包作為瓣葉材料已被幾十年的臨床應用認可，因此如果能夠將牛心包減薄，適應小輸送直徑的經導管瓣膜需要，同時提高生物瓣膜瓣葉心包的使用率，降低生產成本，則具有重要的經濟價值。
有研究提出使用激光或切削等方式來減薄牛心包[10-12]，但心包很軟，常規的切削加工存在很大的難度。為便于切削加工，Kutty 等[13]提出在?20 ℃ 下冷凍，然后將心包在冷凍狀態下進行切削以減薄。但前述研究只提出了相應的心包減薄的方法，未見到對減薄后心包性能的研究，更未見到相似厚度豬心包和牛心包對比研究的報道。
液氮作為一種常見的冷凍技術，已被廣泛用于異體瓣膜的冷凍和保存[14-16]，因此本研究采用液氮對牛心包進行冷凍，在冷凍狀態下對其進行減薄，獲得預定厚度的心包。本文首先研究冷凍前后的牛心包微結構的變化，然后以定量方式評價牛心包在冷凍和減薄前后的彈性模量、割線模量和拉伸強度等力學參數的變化，并與類似厚度的豬心包進行比較。本研究將為小輸送直徑的經導管瓣膜瓣葉提供一種新的材料選擇，并提高現有生物瓣膜牛心包的使用率，降低生產成本。
1 材料和方法
1.1 樣品準備
本研究中所用的牛心包由金仕生物科技（常熟）有限公司提供。牛心包首先從牛屠宰場獲得，保存在磷酸鹽緩沖液中，然后將心包上附著的脂肪清除，用 Hanks 溶液清洗，最后用 0.4% 的戊二醛磷酸緩沖溶液固定。將固定后的心包平整鋪在戊二醛保存液中保存備用。
通過透射光觀察心包，選擇無明顯缺陷的牛心包，在心包片上相鄰位置按圖1a 所示，選取長 45 mm、寬 5 mm 的 2 條矩形心包條作為一組。然后用精度為 0.01 mm 的厚度測量儀按圖1b 所示，測量心包條上 A-E 共 5 點的厚度，選取各點厚度在（0.4 ± 0.05）mm 的牛心包條作為試驗樣品，然后取各測量點厚度的平均值作為每條心包條的厚度。然后按照同樣的方法選取長 45 mm、寬 5 mm、各點厚度在（0.2 ± 0.05）mm 的矩形豬心包條作為對照組。
圖1
樣品準備示意圖
a. 每組兩個心包條的選取方式；b. 心包條厚度測量點位置
Figure1. The schematic diagram of samples preparationa. the selection of two bovine pericardium samples in each group; b the positions of the bovine pericardium sample for thickness measurement
1.2 冷凍和減薄
取 10 組準備好的牛心包條，一條作為對照樣，不作任何處理；另一條平鋪在加工胎具內的凹槽中，加工胎具凹槽的深度略小于預期減薄后的厚度，在心包條上放置蓋板，防止牛心包在冷凍過程中變形。然后整體將牛心包條、胎具和蓋板放入液氮內冷凍 5 min 后取出，去掉蓋板，在室溫下解凍，解凍后測量并記錄心包各點厚度，然后放置到戊二醛保存液中保存。此 10 組樣品用于評測心包冷凍前后性能的差異。
再取 10 組準備好的牛心包條，一條作為對照樣，另一條按照前述方式進行冷凍，冷凍后取出，去掉蓋板，如圖2 所示，將加工胎具固定到切削機床的臺面上，調整刀具到臺面的距離，確保心包條減薄后厚度滿足（0.2 ± 0.05）mm 要求。啟動切削設備將多余的部分切削掉，減薄到預定的厚度。此 10 組樣品用于評測牛心包減薄前后性能的差異。
圖2
牛心包減薄過程示意圖
Figure2.
The schematic diagram of the thinning process for bovine pericardium
1.3 組織學觀察
取 1 組牛心包條，一條作為對照樣，另一條按照前述方式進行冷凍減薄。然后將兩個心包條經 4% 甲醛溶液固定后進行石蠟切片，在標本縱向切面切成 5 μm 厚切片。進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，然后在光學顯微鏡下放大觀察。另取 1 條豬心包條，按照同樣方式進行樣品制備和觀察。
1.4 單軸拉伸測試
為了研究心包冷凍前后以及冷凍減薄前后的力學性質，采用美斯特工業系統（中國）有限公司的 CMT6502 單軸拉伸力學試驗機，分別對 10 組冷凍前后、10 組冷凍并減薄前后的牛心包條，以及 10 條豬心包條進行了拉伸測試。心包條兩端各夾持 [13]5 mm 的高度，拉伸試驗機的拉伸速率設為 5 mm/min，將心包條拉伸直至斷裂，記錄拉伸數據并觀察每個心包條的拉伸過程。
1.5 力學數據分析
圖3 是單軸拉伸獲得的典型的牛心包應力—應變圖。根據文獻[17]，其分為伸長階段 OA 段、線彈性階段 AB 段、斷裂階段 BC 段三個階段；OA 段斜率定義為割線模量，AB 段斜率定義為彈性模量，BC 段斜率定義為破壞模量。圖中 C 點處的應力值定義為極限強度。根據拉伸試驗取得的數據畫出心包條的應力—應變曲線，得到割線模量、彈性模量、極限強度等力學參數，計算各組心包條的平均割線模量、彈性模量和平均極限強度及比值，評估牛心包冷凍減薄后的性能。利用 SPSS 統計學軟件，采用雙樣本 t 檢驗對數據進行統計學分析，P < 0.05 為差異具有統計學意義。另外，為便于直觀對比冷凍減薄對牛心包性能的影響，對牛心包冷凍前后的厚度以及冷凍和減薄前后心包所承受的最大拉力也作了相應的對比。
圖3
典型的縱向牛心包材料應力—應變曲線劃分
Figure3.
Typical stress-strain curves of the bovine pericardium for longitudinal fiber orientation
2 結果
2.1 組織學觀察
圖4 為牛心包冷凍前和冷凍減薄后以及未冷凍豬心包 HE 染色后的切片，圖中未見牛心包在冷凍前和冷凍減薄后微結構上有任何差異。可以看出牛心包和豬心包的粗糙面，即漿膜側形態略有不同，可能是纖維編織的方式不同所致，牛心包粗糙面和光滑面更容易辨識。牛心包和豬心包內膠原纖維均呈波浪狀排列，豬心包的纖維較疏松，無明顯紊亂，纖維間明顯可見有細胞分布；牛心包的纖維排列更致密，能明顯看出兩者截面內纖維排布的差異性。
圖4
HE 染色后心包微結構照片
Figure4.
Histologic photos of pericardiums
2.2 冷凍前后力學性能
圖5 為牛心包冷凍前后的力學性能對比結果。試驗共測試 10 組樣品，獲得 8 組有效數據。從應力應變曲線和冷凍前后的厚度上可以看出，牛心包液氮冷凍后，與未冷凍相比兩者未見明顯區別。冷凍后割線模量略低于冷凍前，但差異無統計學意義。在彈性模量、極限強度和承受的最大拉力方面，冷凍后心包略高于未冷凍的心包，但差異也無統計學意義。
圖5
牛心包冷凍前后的力學性能（*P < 0.05）
Figure5.
The mechanical properties of bovine pericardium before and after liquid nitrogen freezing (*P < 0.05)
2.3 減薄前后力學性能
圖6 為牛心包冷凍并減薄后前后的力學性能對比結果。試驗共測試 10 組樣品，獲得 10 組有效數據。從應力應變曲線可以看出，液氮冷凍并減薄后的牛心包以及未作任何處理的豬心包，與未冷凍減薄的牛心包相比，曲線形式上未見明顯區別，但可承受的極限應力明顯低于未減薄的牛心包，兩組間差異具有統計學意義（P < 0.05）。對于割線模量、極限強度，未減薄的牛心包最高，豬心包略低，減薄后的牛心包最低，三者差異均無統計學意義。對于彈性模量，未減薄的牛心包最高，減薄后的牛心包次之，豬心包最低，雖然存在差異，但差異無統計學意義。整體來看，除極限應力外，其他性能差異均無統計學意義，但減薄后牛心包對應指標略低于減薄前，割線模量、彈性模量和極限強度大體降低為減薄前的 80%。相對于豬心包，割線模量、彈性模量和極限強度上的差異雖均無統計學意義，但牛心包彈性模量的值相對較高。
圖6
心包減薄前后力學性能及與豬心包的對比（*P < 0.05）
Figure6.
The mechanical properties of bovine pericardium before and after thinning in comparison with porcine pericardium (*P < 0.05)
3 討論
3.1 冷凍前后性能比較
牛心包在液氮冷凍后微結構無可見區別，這點與之前報道的采用液氮冷凍人體自然瓣膜的研究結果一致，該研究也表明采用液氮冷凍后瓣膜的組織結構與冷凍前相似[14-16]。表明液氮可以應用于牛心包的冷凍，不會對心包的微結構產生改變。
力學性能方面可以看出，采用液氮冷凍后的牛心包與未冷凍的相比，其割線模量、彈性模量和厚度差別不大，差異均無統計學意義。這也從側面印證了冷凍前后心包的微結構未產生可見的變化。極限強度的差異雖無統計學意義，但其值有所增加。這可能是因為雖然選取的每組心包條中的兩個心包條位置接近，但因為心包纖維走向多變[18-19]，在選擇時雖特別注意保持兩個心包條的纖維走向的一致性，但難免有所差異，心包纖維走向的差異會對心包力學性能產生明顯影響[17, 20-22]。從散點圖上測試點的離散情況也可以看出，有兩個測試點冷凍后明顯離散較大。
3.2 減薄前后性能比較
采用液氮冷凍并減薄后的牛心包與未冷凍減薄的牛心包相比，應力應變曲線形式上未見明顯區別，只是承受的極限應力明顯降低。說明心包減薄只對應地去除了心包的一層承力層，并未對心包結構和其他性能產生嚴重影響。
關于割線模量、彈性模量和極限強度，其主要取決于心包的內在結構，如果心包厚度方向各部位結構性能一致，減薄只引起整體承力能力的變化，相應模量和強度指標不應有變化。減薄后彈性模量和極限強度相對于減薄前其差異雖無統計學意義，但也均減小到約 80%，因此可能需要更大數據量進一步確認其差異的統計學意義。減薄去除掉的是貼近心包粗糙面的部分，可能牛心包貼近粗糙面部分的剛性更大，承力能力更強，導致減薄后彈性模量和極限強度降低。通常瓣葉類生物材料的承力主要依賴于膠原纖維[7]，從圖4 可以看出牛心包粗糙面波浪形態的膠原纖維較明顯。割線模量對應的主要是心包變形伸長階段[17]，當膠原纖維去除較多時，承力層減少，心包拉伸變形時前期伸長則會明顯增加，因此割線模量會有所降低，這從應力應變曲線上也可以看出。
3.3 減薄后牛心包與豬心包性能比較
生物瓣膜時代，豬心包很少使用，最近十幾年隨著經導管瓣膜對小輸送直徑的需求，豬心包已被廣泛地研究[23-26]。從本研究看，減薄后的牛心包與豬心包相比，應力應變曲線非常接近，割線模量和極限強度略低于同等厚度的豬心包，但其差異無統計學意義。雖然兩者彈性模量的差異也不具有統計學意義，但可以看出牛心包略高于豬心包，表明減薄后牛心包相對于豬心包彈性模量更大的特性被予以保留。Caballero 等[23]的研究也表明牛心包相對豬心包具有更大的彈性模量，并指出此特點有利于提高瓣膜性能。
測試中發現豬心包的微結構與 McGregor 等[25]的研究相近，其纖維相對細密，如圖4 所示，試驗中簡單辨別其纖維走向不太容易，只是盡可能選擇纖維走向與心包條長軸方向一致的心包。而對于牛心包條，為便于對比和從經濟角度考慮，只要求減薄前后的兩個心包條纖維走向盡可能一致，并未約定纖維走向與拉伸方向的關系。如纖維走向與拉伸方向一致，會明顯提高心包的強度[17, 20-22]，這點也可以從圖6b 的數據中看出，纖維走向相對一致的豬心包，其偏差相對較窄，而未區分走向的牛心包，其誤差線更長。因此如考慮纖維走向影響，減薄后的牛心包的強度可能會高于豬心包。
實際測試中發現豬心包很薄，挑選厚度在（0.2 ± 0.05）mm 的心包難度很大。豬心包的厚度多在0.1～0.15 mm，如要獲得較厚的豬心包，可能需要額外增加豬的飼養周期，產生額外成本。因此雖然同等厚度的豬心包和減薄后的牛心包在極限強度上相當，但牛心包減薄后厚度可控制，很容易獲得承力明顯高于豬心包的稍厚的牛心包。對于經導管瓣膜，瓣葉厚度一般為 0.25 mm，研究表明較薄的經導管瓣膜瓣葉相對于較厚的生物瓣膜瓣葉，其耐久性會降低[27]。而對于牛心包，其心包厚度通常在 0.3 mm 以上，因此，液氮冷凍后減薄可大幅提高牛心包的利用率，降低成本。生物瓣膜瓣葉也可采用此工藝減薄過厚牛心包，提高心包的使用率。
4 結論與展望
本文對牛心包采用液氮冷凍前后以及冷凍減薄前后的性能進行了研究。對于牛心包，研究表明在冷凍前后其性能差異無統計學意義。將減薄前和減薄后的牛心包與未作任何處理的豬心包進行對比表明：對于割線模量、極限強度，未減薄的牛心包最高，豬心包略低，減薄后的牛心包最低，但三者的差異無統計學意義；彈性模量方面的差異雖也無統計學意義，但未減薄的牛心包最高，減薄后的牛心包次之，豬心包最低，牛心包彈性模量較豬心包略高的特性在減薄后得到保留；減薄后牛心包整體力學指標略低于減薄前，割線模量、彈性模量和極限強度大體降低為減薄前的 80%。
本研究表明牛心包液氮冷凍減薄可通過較低的成本，獲得滿足經導管瓣膜要求的低厚度且性能不低于同等厚度豬心包的瓣葉，因此本研究在探索經導管瓣膜瓣葉材料、提高生物瓣膜心包使用率，以及降低成本方面提供了一種較好的選擇。
后續需要進一步研究評價不同減薄去除量、光滑面減薄、纖維走向等的影響，以便系統地給出牛心包減薄后的力學性能，更好地控制瓣葉減薄后的性能和質量，指導經導管瓣膜瓣葉的設計和生產。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
經導管瓣膜植入術因其創傷小、恢復快等特點，自 2002 年 Cribier 等[1]完成首例植入后，發展迅速，對不可外科手術或外科手術存在高風險的患者已經取得了良好的術后效果[2-3]。但經導管瓣膜植入前需要將瓣膜壓縮進小直徑的輸送鞘管，以降低瓣膜植入引起的血管并發癥的發生率[4-6]。因此，經導管瓣膜瓣葉必須很薄，才能裝入小直徑的輸送鞘管，但同時又要有足夠的厚度，以承受工作時產生的各種應力。
牛心包作為生物瓣膜的瓣葉已有 40 多年的歷史[7]，雖然具有與天然心臟瓣膜相似的力學性質和良好的可獲得性，但其較厚，因此部分經導管瓣膜選用更薄的豬心包作為瓣葉以滿足較小的輸送直徑[8-9]。但是，瓣膜瓣葉對心包的厚度和一致性有一定要求，豬飼養期較短，其心包通常因為太薄而不能滿足使用要求，獲取一定厚度的豬心包需要額外增加豬的飼養期，會導致成本的增加，并存在一定的難度。生物瓣膜瓣葉的實際生產中，也會因心包厚度問題浪費掉大量心包。考慮到牛心包作為瓣葉材料已被幾十年的臨床應用認可，因此如果能夠將牛心包減薄，適應小輸送直徑的經導管瓣膜需要，同時提高生物瓣膜瓣葉心包的使用率，降低生產成本，則具有重要的經濟價值。
有研究提出使用激光或切削等方式來減薄牛心包[10-12]，但心包很軟，常規的切削加工存在很大的難度。為便于切削加工，Kutty 等[13]提出在?20 ℃ 下冷凍，然后將心包在冷凍狀態下進行切削以減薄。但前述研究只提出了相應的心包減薄的方法，未見到對減薄后心包性能的研究，更未見到相似厚度豬心包和牛心包對比研究的報道。
液氮作為一種常見的冷凍技術，已被廣泛用于異體瓣膜的冷凍和保存[14-16]，因此本研究采用液氮對牛心包進行冷凍，在冷凍狀態下對其進行減薄，獲得預定厚度的心包。本文首先研究冷凍前后的牛心包微結構的變化，然后以定量方式評價牛心包在冷凍和減薄前后的彈性模量、割線模量和拉伸強度等力學參數的變化，并與類似厚度的豬心包進行比較。本研究將為小輸送直徑的經導管瓣膜瓣葉提供一種新的材料選擇，并提高現有生物瓣膜牛心包的使用率，降低生產成本。
1 材料和方法
1.1 樣品準備
本研究中所用的牛心包由金仕生物科技（常熟）有限公司提供。牛心包首先從牛屠宰場獲得，保存在磷酸鹽緩沖液中，然后將心包上附著的脂肪清除，用 Hanks 溶液清洗，最后用 0.4% 的戊二醛磷酸緩沖溶液固定。將固定后的心包平整鋪在戊二醛保存液中保存備用。
通過透射光觀察心包，選擇無明顯缺陷的牛心包，在心包片上相鄰位置按圖1a 所示，選取長 45 mm、寬 5 mm 的 2 條矩形心包條作為一組。然后用精度為 0.01 mm 的厚度測量儀按圖1b 所示，測量心包條上 A-E 共 5 點的厚度，選取各點厚度在（0.4 ± 0.05）mm 的牛心包條作為試驗樣品，然后取各測量點厚度的平均值作為每條心包條的厚度。然后按照同樣的方法選取長 45 mm、寬 5 mm、各點厚度在（0.2 ± 0.05）mm 的矩形豬心包條作為對照組。
圖1
樣品準備示意圖
a. 每組兩個心包條的選取方式；b. 心包條厚度測量點位置
Figure1. The schematic diagram of samples preparationa. the selection of two bovine pericardium samples in each group; b the positions of the bovine pericardium sample for thickness measurement
1.2 冷凍和減薄
取 10 組準備好的牛心包條，一條作為對照樣，不作任何處理；另一條平鋪在加工胎具內的凹槽中，加工胎具凹槽的深度略小于預期減薄后的厚度，在心包條上放置蓋板，防止牛心包在冷凍過程中變形。然后整體將牛心包條、胎具和蓋板放入液氮內冷凍 5 min 后取出，去掉蓋板，在室溫下解凍，解凍后測量并記錄心包各點厚度，然后放置到戊二醛保存液中保存。此 10 組樣品用于評測心包冷凍前后性能的差異。
再取 10 組準備好的牛心包條，一條作為對照樣，另一條按照前述方式進行冷凍，冷凍后取出，去掉蓋板，如圖2 所示，將加工胎具固定到切削機床的臺面上，調整刀具到臺面的距離，確保心包條減薄后厚度滿足（0.2 ± 0.05）mm 要求。啟動切削設備將多余的部分切削掉，減薄到預定的厚度。此 10 組樣品用于評測牛心包減薄前后性能的差異。
圖2
牛心包減薄過程示意圖
Figure2.
The schematic diagram of the thinning process for bovine pericardium
1.3 組織學觀察
取 1 組牛心包條，一條作為對照樣，另一條按照前述方式進行冷凍減薄。然后將兩個心包條經 4% 甲醛溶液固定后進行石蠟切片，在標本縱向切面切成 5 μm 厚切片。進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，然后在光學顯微鏡下放大觀察。另取 1 條豬心包條，按照同樣方式進行樣品制備和觀察。
1.4 單軸拉伸測試
為了研究心包冷凍前后以及冷凍減薄前后的力學性質，采用美斯特工業系統（中國）有限公司的 CMT6502 單軸拉伸力學試驗機，分別對 10 組冷凍前后、10 組冷凍并減薄前后的牛心包條，以及 10 條豬心包條進行了拉伸測試。心包條兩端各夾持 [13]5 mm 的高度，拉伸試驗機的拉伸速率設為 5 mm/min，將心包條拉伸直至斷裂，記錄拉伸數據并觀察每個心包條的拉伸過程。
1.5 力學數據分析
圖3 是單軸拉伸獲得的典型的牛心包應力—應變圖。根據文獻[17]，其分為伸長階段 OA 段、線彈性階段 AB 段、斷裂階段 BC 段三個階段；OA 段斜率定義為割線模量，AB 段斜率定義為彈性模量，BC 段斜率定義為破壞模量。圖中 C 點處的應力值定義為極限強度。根據拉伸試驗取得的數據畫出心包條的應力—應變曲線，得到割線模量、彈性模量、極限強度等力學參數，計算各組心包條的平均割線模量、彈性模量和平均極限強度及比值，評估牛心包冷凍減薄后的性能。利用 SPSS 統計學軟件，采用雙樣本 t 檢驗對數據進行統計學分析，P < 0.05 為差異具有統計學意義。另外，為便于直觀對比冷凍減薄對牛心包性能的影響，對牛心包冷凍前后的厚度以及冷凍和減薄前后心包所承受的最大拉力也作了相應的對比。
圖3
典型的縱向牛心包材料應力—應變曲線劃分
Figure3.
Typical stress-strain curves of the bovine pericardium for longitudinal fiber orientation
2 結果
2.1 組織學觀察
圖4 為牛心包冷凍前和冷凍減薄后以及未冷凍豬心包 HE 染色后的切片，圖中未見牛心包在冷凍前和冷凍減薄后微結構上有任何差異。可以看出牛心包和豬心包的粗糙面，即漿膜側形態略有不同，可能是纖維編織的方式不同所致，牛心包粗糙面和光滑面更容易辨識。牛心包和豬心包內膠原纖維均呈波浪狀排列，豬心包的纖維較疏松，無明顯紊亂，纖維間明顯可見有細胞分布；牛心包的纖維排列更致密，能明顯看出兩者截面內纖維排布的差異性。
圖4
HE 染色后心包微結構照片
Figure4.
Histologic photos of pericardiums
2.2 冷凍前后力學性能
圖5 為牛心包冷凍前后的力學性能對比結果。試驗共測試 10 組樣品，獲得 8 組有效數據。從應力應變曲線和冷凍前后的厚度上可以看出，牛心包液氮冷凍后，與未冷凍相比兩者未見明顯區別。冷凍后割線模量略低于冷凍前，但差異無統計學意義。在彈性模量、極限強度和承受的最大拉力方面，冷凍后心包略高于未冷凍的心包，但差異也無統計學意義。
圖5
牛心包冷凍前后的力學性能（*P < 0.05）
Figure5.
The mechanical properties of bovine pericardium before and after liquid nitrogen freezing (*P < 0.05)
2.3 減薄前后力學性能
圖6 為牛心包冷凍并減薄后前后的力學性能對比結果。試驗共測試 10 組樣品，獲得 10 組有效數據。從應力應變曲線可以看出，液氮冷凍并減薄后的牛心包以及未作任何處理的豬心包，與未冷凍減薄的牛心包相比，曲線形式上未見明顯區別，但可承受的極限應力明顯低于未減薄的牛心包，兩組間差異具有統計學意義（P < 0.05）。對于割線模量、極限強度，未減薄的牛心包最高，豬心包略低，減薄后的牛心包最低，三者差異均無統計學意義。對于彈性模量，未減薄的牛心包最高，減薄后的牛心包次之，豬心包最低，雖然存在差異，但差異無統計學意義。整體來看，除極限應力外，其他性能差異均無統計學意義，但減薄后牛心包對應指標略低于減薄前，割線模量、彈性模量和極限強度大體降低為減薄前的 80%。相對于豬心包，割線模量、彈性模量和極限強度上的差異雖均無統計學意義，但牛心包彈性模量的值相對較高。
圖6
心包減薄前后力學性能及與豬心包的對比（*P < 0.05）
Figure6.
The mechanical properties of bovine pericardium before and after thinning in comparison with porcine pericardium (*P < 0.05)
3 討論
3.1 冷凍前后性能比較
牛心包在液氮冷凍后微結構無可見區別，這點與之前報道的采用液氮冷凍人體自然瓣膜的研究結果一致，該研究也表明采用液氮冷凍后瓣膜的組織結構與冷凍前相似[14-16]。表明液氮可以應用于牛心包的冷凍，不會對心包的微結構產生改變。
力學性能方面可以看出，采用液氮冷凍后的牛心包與未冷凍的相比，其割線模量、彈性模量和厚度差別不大，差異均無統計學意義。這也從側面印證了冷凍前后心包的微結構未產生可見的變化。極限強度的差異雖無統計學意義，但其值有所增加。這可能是因為雖然選取的每組心包條中的兩個心包條位置接近，但因為心包纖維走向多變[18-19]，在選擇時雖特別注意保持兩個心包條的纖維走向的一致性，但難免有所差異，心包纖維走向的差異會對心包力學性能產生明顯影響[17, 20-22]。從散點圖上測試點的離散情況也可以看出，有兩個測試點冷凍后明顯離散較大。
3.2 減薄前后性能比較
采用液氮冷凍并減薄后的牛心包與未冷凍減薄的牛心包相比，應力應變曲線形式上未見明顯區別，只是承受的極限應力明顯降低。說明心包減薄只對應地去除了心包的一層承力層，并未對心包結構和其他性能產生嚴重影響。
關于割線模量、彈性模量和極限強度，其主要取決于心包的內在結構，如果心包厚度方向各部位結構性能一致，減薄只引起整體承力能力的變化，相應模量和強度指標不應有變化。減薄后彈性模量和極限強度相對于減薄前其差異雖無統計學意義，但也均減小到約 80%，因此可能需要更大數據量進一步確認其差異的統計學意義。減薄去除掉的是貼近心包粗糙面的部分，可能牛心包貼近粗糙面部分的剛性更大，承力能力更強，導致減薄后彈性模量和極限強度降低。通常瓣葉類生物材料的承力主要依賴于膠原纖維[7]，從圖4 可以看出牛心包粗糙面波浪形態的膠原纖維較明顯。割線模量對應的主要是心包變形伸長階段[17]，當膠原纖維去除較多時，承力層減少，心包拉伸變形時前期伸長則會明顯增加，因此割線模量會有所降低，這從應力應變曲線上也可以看出。
3.3 減薄后牛心包與豬心包性能比較
生物瓣膜時代，豬心包很少使用，最近十幾年隨著經導管瓣膜對小輸送直徑的需求，豬心包已被廣泛地研究[23-26]。從本研究看，減薄后的牛心包與豬心包相比，應力應變曲線非常接近，割線模量和極限強度略低于同等厚度的豬心包，但其差異無統計學意義。雖然兩者彈性模量的差異也不具有統計學意義，但可以看出牛心包略高于豬心包，表明減薄后牛心包相對于豬心包彈性模量更大的特性被予以保留。Caballero 等[23]的研究也表明牛心包相對豬心包具有更大的彈性模量，并指出此特點有利于提高瓣膜性能。
測試中發現豬心包的微結構與 McGregor 等[25]的研究相近，其纖維相對細密，如圖4 所示，試驗中簡單辨別其纖維走向不太容易，只是盡可能選擇纖維走向與心包條長軸方向一致的心包。而對于牛心包條，為便于對比和從經濟角度考慮，只要求減薄前后的兩個心包條纖維走向盡可能一致，并未約定纖維走向與拉伸方向的關系。如纖維走向與拉伸方向一致，會明顯提高心包的強度[17, 20-22]，這點也可以從圖6b 的數據中看出，纖維走向相對一致的豬心包，其偏差相對較窄，而未區分走向的牛心包，其誤差線更長。因此如考慮纖維走向影響，減薄后的牛心包的強度可能會高于豬心包。
實際測試中發現豬心包很薄，挑選厚度在（0.2 ± 0.05）mm 的心包難度很大。豬心包的厚度多在0.1～0.15 mm，如要獲得較厚的豬心包，可能需要額外增加豬的飼養周期，產生額外成本。因此雖然同等厚度的豬心包和減薄后的牛心包在極限強度上相當，但牛心包減薄后厚度可控制，很容易獲得承力明顯高于豬心包的稍厚的牛心包。對于經導管瓣膜，瓣葉厚度一般為 0.25 mm，研究表明較薄的經導管瓣膜瓣葉相對于較厚的生物瓣膜瓣葉，其耐久性會降低[27]。而對于牛心包，其心包厚度通常在 0.3 mm 以上，因此，液氮冷凍后減薄可大幅提高牛心包的利用率，降低成本。生物瓣膜瓣葉也可采用此工藝減薄過厚牛心包，提高心包的使用率。
4 結論與展望
本文對牛心包采用液氮冷凍前后以及冷凍減薄前后的性能進行了研究。對于牛心包，研究表明在冷凍前后其性能差異無統計學意義。將減薄前和減薄后的牛心包與未作任何處理的豬心包進行對比表明：對于割線模量、極限強度，未減薄的牛心包最高，豬心包略低，減薄后的牛心包最低，但三者的差異無統計學意義；彈性模量方面的差異雖也無統計學意義，但未減薄的牛心包最高，減薄后的牛心包次之，豬心包最低，牛心包彈性模量較豬心包略高的特性在減薄后得到保留；減薄后牛心包整體力學指標略低于減薄前，割線模量、彈性模量和極限強度大體降低為減薄前的 80%。
本研究表明牛心包液氮冷凍減薄可通過較低的成本，獲得滿足經導管瓣膜要求的低厚度且性能不低于同等厚度豬心包的瓣葉，因此本研究在探索經導管瓣膜瓣葉材料、提高生物瓣膜心包使用率，以及降低成本方面提供了一種較好的選擇。
后續需要進一步研究評價不同減薄去除量、光滑面減薄、纖維走向等的影響，以便系統地給出牛心包減薄后的力學性能，更好地控制瓣葉減薄后的性能和質量，指導經導管瓣膜瓣葉的設計和生產。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
