目前二甲基亞砜聯用胎牛血清是凍存細胞常用的保護劑，但是二甲基亞砜對細胞具有毒性損傷，胎牛血清存在攜帶病毒、感染疾病的風險。蠶絲蛋白是一種天然的高分子纖維蛋白，具有良好的生物相容性和親水性。本文將蠶絲蛋白用于低溫保護中，探究其作為低溫保護劑的機制。使用差示掃描量熱法計算蠶絲蛋白的熱滯活性，得出 10 mg/mL 的絲膠蛋白的熱滯活性為 0.96℃，10% 絲素蛋白的熱滯活性為 1.15℃。使用低溫顯微鏡觀察蠶絲蛋白-磷酸鹽緩沖液混合溶液的重結晶現象，發現在?7℃ 的停滯溫度下，孵育 40 min 后，絲膠和絲素蛋白平均晶粒尺寸分別為磷酸鹽緩沖液的 28.99%、3.18%，說明絲膠蛋白和絲素蛋白具有一定的抑制冰晶重結晶的效應。利用傅里葉變換紅外光譜技術分析蠶絲蛋白的基團和二級結構，并定量得到蠶絲蛋白的二級結構含量，其中絲膠蛋白二級結構中無規卷曲含量為 75.62%，β-折疊結構含量為 24.38%；絲素蛋白二級結構中 β-折疊結構含量為 56.68%，無規卷曲結構含量為 22.38%，α-螺旋結構含量為 16.84%。以上分析論證了蠶絲蛋白作為保護劑的可行性，為今后低溫保護劑的選擇提供新的思路。
引用本文： 周新麗, 杜羽琨, 滕蕓, 張宵敏. 蠶絲蛋白低溫保護劑的保護機制分析. 生物醫學工程學雜志, 2019, 36(6): 986-993. doi: 10.7507/1001-5515.201807061 復制
引言
細胞凍存是細胞長期保存的主要方法，在臨床治療以及科學研究中應用廣泛。然而在冷凍保存的過程中，細胞會受到低溫損傷和冰晶損傷，低溫保護劑的添加至關重要[1]。Lovelock 等[2]創新性地以二甲基亞砜（Me2SO）作為冷凍保護劑，成功地凍存了人和牛的紅細胞、牛的精子。此后，Me2SO 聯用胎牛血清（fetal bovine serum，FBS) 作為低溫保護劑已經受到了廣泛的推廣和應用[3-5]。但是 Me2SO 對細胞具有毒性損傷，影響細胞生長等問題[6]，胎牛血清則存在著攜帶病毒、傳染疾病的風險[7]，因此尋找更安全高效的新型保護劑顯得越來越重要。
蠶絲蛋白是一種天然的高分子材料，無污染且來源豐富，主要由絲膠蛋白和絲素蛋白組成。蠶絲蛋白中氨基酸、極性親水基團含量豐富，能與水分子形成很強的相互作用。滕蕓[8]制備了由 1% 絲膠蛋白+10% 絲素蛋白+5% Me2SO 組成的低毒性無血清低溫保護劑用于豬耳成纖維細胞的低溫保存，結果發現與常規低溫保護劑 10% Me2SO +20% FBS 組相比，復溫后使用臺盼藍、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測細胞的存活率，與細胞 24 h 貼壁率均無顯著差異，說明蠶絲蛋白在實現對細胞低溫保護的同時，降低了 Me2SO 的使用濃度。但是關于蠶絲蛋白為什么能作為低溫保護劑，其保護機制和作用機制的研究較少。因此，考慮借鑒抗凍蛋白（antifreeze protein，AFP）的研究方法，通過對比抗凍蛋白的結構和性質，研究蠶絲蛋白的保護機制。
抗凍蛋白在醫學方面的應用主要集中在細胞、組織的低溫保存[9-10]。Rubinsky 團隊[11-12]首次發現抗凍蛋白可以應用于動物卵母細胞的低溫保護劑，將提取自極地魚類的不同分子質量的抗凍蛋白作為豬卵母細胞的低溫保護劑，發現其對卵膜結構完整性有很好的保護作用，同時抑制了離子在低溫下的泄露；經過處理的未成熟豬卵母細胞，將近 50% 能在體內成功發育，接近正常卵母細胞受精發育率。Carpenter 等[13]發現低濃度（5～150 μg/mL）的冬小麥抗凍蛋白可增強紅細胞的存活率，相對高濃度（1.54 mg/mL）的抗凍蛋白對抑制胞外重結晶有明顯效果，可以顯著減少復溫損傷，提高存活率。Amir 等[14]研究了抗凍蛋白對大鼠心臟低溫保存的效果。研究表明，使用 AFPⅢ作為保護劑，在 ? 1.3℃ 下儲存 24 h，沒有冰晶形成，且存活率為 100%。抗凍蛋白的抗凍活性與蛋白質自身結構有關，此外抗凍蛋白還具有熱滯活性、修飾冰晶形態和重結晶抑制活性三種重要特性[15-16]。美洲擬鰈抗凍蛋白（HPLC-6）由 37 個氨基酸殘基組成，疏水性氨基酸殘基約占 67.6%，親水性氨基酸殘基約占 32.4%。HPLC-6 空間幾乎完全由雙親右手 α-螺旋構成，空間構象分析可以清晰地表明連續完整的螺旋化結構與抗凍活性具有密切關系。HPLC-6 的螺旋構象長度是決定抗凍活性強弱的重要因素，長度越長則熱滯活性越高，抗凍活性越強[16]。抗凍蛋白能夠非依數性地降低溶液的冰點，不影響溶液的熔點，從而導致熔點和冰點之間出現差值，這種差值稱為“熱滯活性”（thermal hysteresis activity，THA）。Mao 等[17]從新疆荒漠甲蟲光滑鱉甲 Anatolica polita 提取抗凍蛋白（ApAFP752），并使用差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）測量該抗凍蛋白的熱滯活性，結果發現在冰核含量小于 25.3% 時，DSC 熱流曲線上觀察到明顯的凍結起始溫度的延遲，證明了 ApAFP752 蛋白具有熱滯活性，說明熱滯活性是抗凍蛋白的重要特性。冰晶重結晶是一種以較小冰晶逐漸生長成較大冰晶的過程。重結晶形成的大冰晶會導致細胞及組織在凍存過程中受到致命的冰晶損傷[18]。抗凍蛋白抑制重結晶的特性表現在它與冰晶的作用效果。一般抗凍蛋白在極低的濃度（ < 0.1 μg/mL）下就可以抑制冰晶的重結晶，維持較小且均勻的冰晶晶粒，減小其對細胞和組織的損傷[19]。
本文借鑒抗凍蛋白的研究方法，首先使用差示量熱掃描儀檢測蠶絲蛋白的熱滯活性，以及低溫顯微鏡觀察蠶絲蛋白重結晶抑制活性，再利用傅里葉變換紅外光譜技術檢測蠶絲蛋白的二級結構，分析蠶絲蛋白的氨基酸和基團組成，定量地確定絲膠蛋白和絲素蛋白的二級結構含量。最后結合抗凍蛋白的作用機制，從蠶絲蛋白的結構、物理化學性質層面分析其作為低溫保護劑的保護機制。
1 材料與方法
1.1 材料
蠶繭（廣西平果桑移天下絲綢有限公司）、絲膠蛋白（日本和光純藥（Wako）集團）、溴化鉀、溴化鋰（國藥集團化學試劑有限公司）、雙蒸水（自制）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）。
絲膠蛋白溶液：絲膠蛋白作為細胞培養基質常用的濃度范圍為 0.1%～1%[20]，且都能在一定程度上促進細胞的生長和繁殖。因此本文選擇絲膠蛋白濃度為 1% 進行實驗。稱量 10 mg 絲膠蛋白粉末，溶解于 1 mL 雙蒸水或 PBS 溶液中，配置成濃度為 10 mg/mL 的絲膠蛋白溶液。
絲素蛋白溶液：根據文獻[21]的制備方法，將蠶繭除雜處理后，在 0.02 mol/L 碳酸鈉溶液中脫膠處理 30 min。得到的絲素纖維沖洗烘干后，60℃ 條件下用 9.3 mol/L 溴化鋰溶解 4 h。將絲素蛋白溶液進行透析、離心、濃縮等處理，處理后所得的絲素溶液用雙蒸水或 PBS 配置成濃度為 10% 的絲素蛋白溶液，于 4℃ 冰箱中保存備用。
1.2 方法
1.2.1 蠶絲蛋白熱滯活性測量方法
采用差示掃描量熱儀（DSC200 F3，Netzsch，德國）對蠶絲蛋白的熱滯活性進行測定。將絲膠蛋白和絲素蛋白用 PBS 分別制備成 10 mg/mL 和 10% 濃度的樣品放入 DSC 樣品皿中。先以 1℃/min 的速率慢速降溫至?25℃，平衡 5 min，使樣品結冰固化，再以 1℃/min 速率慢速升溫至 10℃，從樣品熔融峰上得到樣品的熔點 Tm 和熔融焓值 ΔHm。樣品再以 1℃/min 的速率慢速降溫至?25℃，平衡 5 min，使其固化。再以 1℃/min 的速率慢速復溫至樣品熔融峰所涵蓋溫度區間的某一溫度，平衡 5 min，使樣品處于部分熔融狀態，這一溫度稱為“停滯溫度”，即 Th[22]。再以 1℃/min 的速率慢速降溫至?15℃。由于冰晶生長，DSC 降溫曲線上出現結晶放熱峰，其起始溫度為 T0。若樣本具有抗凍活性，結晶峰的出現將被延遲，T0 和 Th 存在差異。利用 Netzsch-Proteus 的分析軟件 Proteus Analysis 對熱流曲線進行分析，確定溫度區間為 Th?2 < T0 < Th，再次凍結起始溫度 T0 為沿該溫度區間兩節點所做切線相交點所對應的溫度。由此可以計算：
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改變 Th，重復上述實驗過程，可計算出不同停滯溫度下蠶絲蛋白的熱滯活性。
在 Th 溫度時，部分融化的樣品中初始冰晶量（Ф）可由延遲的冰晶放熱量即凍結焓 ΔHr 與完全融化的熱量即熔融焓 ΔHm 計算得到：
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1.2.2 蠶絲蛋白重結晶抑制作用測定
采用低溫顯微系統觀察蠶絲蛋白的重結晶抑制作用[23]。低溫顯微系統主要由低溫制冷系統（BCS196，Linkam Scientific，英國）、帶有攝像功能的光學顯微鏡（BX51，Olympus，日本）和溫度控制軟件（Linksys32，Linkam Scientific，英國）組成。將絲膠蛋白和絲素蛋白用 PBS 分別制備成 10 mg/mL 和 10%（V/V）濃度的樣品。取 1 μL 樣品利用液體的表面張力將溶液吸至兩個載玻片之間，以 PBS 溶液為對照組。樣品放入低溫臺內，以 90℃/min 的速率降至 ? 40℃，維持 1 min 后用同樣的速率升溫至 ? 7℃，維持 45 min。溫度過低絲素蛋白溶液冰晶還未融化，溫度過高則 PBS 溶液冰晶基本融化。當停留溫度為 ? 7℃ 時，此溫度下三種溶液的現象變化區分最為明顯，冰晶部分開始融化，出現重結晶現象。設置拍攝時間為 1 s，通過 Image J 軟件分析三種溶液中冰晶的平均晶粒尺寸，并分別比較絲膠和絲素蛋白與 PBS 溶液平均晶粒尺寸的比例（mean grain size rate，MGSR），分析絲膠和絲素蛋白的重結晶抑制作用。晶粒尺寸越小，冰晶越多，說明重結晶抑制作用越強。
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1.2.3 蠶絲蛋白二級結構測定方法
采用傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet iS50，Thermo Scientific，美國）對蠶絲蛋白的二級結構進行測定。首先使用壓片機制作 10 mg/mL 絲膠蛋白、10% 絲素蛋白樣品薄膜，然后將樣品薄膜放在紅外光譜儀中進行表征，每次表征前需用空白的溴化鉀壓片掃描作為背景分析，掃描過程中實時扣除 CO2 和 H2O 干擾。每個樣本制作 3 個錠片，每個錠片采集 3 張譜圖，取其平均譜圖作為最后的樣品譜圖。利用 Omnic V8.0 數據處理軟件自動校正基線，做傅里葉去卷積和二階導數譜，估出各子峰的峰位；再利用 Origin 8.5 數據處理軟件采用 Gausse 函數對二階導數譜和傅里葉去卷積譜進行多次擬合，手動選定各子峰的峰位，使重疊的不同譜帶完全分開，確定各子峰和不同二級結構的對應關系，根據其積分面積計算各種二級結構的相對百分含量。
2 結果與討論
2.1 蠶絲蛋白的熱滯活性分析
圖1 顯示了雙蒸水、絲素蛋白溶液、絲膠蛋白溶液冷凍和熔融過程的熱流溫度曲線，分析可得各溶液的熔點和熔融焓值。由圖可知，雙蒸水、絲素蛋白溶液、絲膠蛋白溶液的熔點分別為?1.1、?3.0、?1.4℃，所以設置雙蒸水停滯溫度 Th 取值分別為：?0.6、?0.8、?1.0、?1.2℃；絲膠蛋白溶液停滯溫度 Th 取值分別為：?3.4、?3.2、?3.0、?2.8、?2.6℃；絲素蛋白溶液停滯溫度 Th 取值分別為：?1.8、?1.6、?1.4、?1.2、?1.0℃。圖2 顯示了不同停滯溫度下雙蒸水、絲素蛋白溶液、絲膠蛋白溶液凍結和熔融過程的 DSC 曲線，分析可得三種樣品的停滯溫度（Th）、再次凍結起始溫度（T0）、THA 以及冰核含量（Φ），見表1。
圖1
雙蒸水、蠶絲蛋白溶液的凍結-融化曲線
Figure1.
Freezing-melting curve of silk protein solution
圖2
雙蒸水、蠶絲蛋白不同停滯溫度凍結和熔融過程的 DSC 曲線
a.雙蒸水；b.絲素蛋白；c.絲膠蛋白
Figure2. DSC curves of freezing and melting processes of double steamed water and silk proteins at different temperaturesa. double steamed water; b. fibroin protein; c. sericin protein
表1
雙蒸水和蠶絲蛋白溶液的熱滯活性和冰晶含量
Table1.
Thermal hysteresis activity and ice crystal content of double steamed water and silk protein solutions
通過比較發現絲膠蛋白、絲素蛋白溶液的冰核含量都隨 Th 的升高而逐漸減小，THA 隨著冰核含量的減少而逐漸增大，體系中冰核含量越少時（約 6%），溶液的抗凍活性越強。當絲膠蛋白濃度為 1%，停滯溫度為 ? 2.6℃ 時，其 THA 最大為 0.96℃，此時體系內冰核含量為 6.45%；當絲素蛋白濃度為 10%，停滯溫度為?1.0℃ 時，其 THA 為 1.15℃，此時體系內冰核含量為 6.04%。從表1 中可以看出，隨著停滯溫度的不斷增加，絲膠、絲素蛋白的 THA 隨冰核含量的減小而不斷增加，已經有報道顯示昆蟲的抗凍蛋白的 THA 為 5～6℃，魚類抗凍蛋白的 THA 為 1.0～1.5℃，植物抗凍蛋白的 THA 為 0.1～0.45℃[24]。可見蠶絲蛋白的 THA 高于來自植物的抗凍蛋白的 THA，低于昆蟲抗凍蛋白的 THA，與魚類抗凍蛋白的 THA 相似。
Wu 等[25]發現抗凍蛋白的熱滯活性隨初始冰晶量的減少而增大。溶液中冰晶初始含量越低，則冰晶表面抗凍蛋白的吸附覆蓋程度越高，對冰晶生長的抑制作用越強，溶液完全結晶的時間越長，熱滯活性越高[26]。實驗研究表明，抗凍蛋白與冰晶之間的確有氫鍵的結合。因此，我們推斷蠶絲蛋白可能具有與抗凍蛋白相同的抗凍機制，在凍結過程中，蠶絲蛋白通過與冰晶表面的氧原子形成氫鍵吸附于冰晶表面，增大了冰晶表面積與體積之比，形成了較大的表面自由能[27-28]，只有通過降低凝固點，將能量從體系中排出，冰晶才能繼續生長，從而起到抑制冰晶生長的效果。
2.2 蠶絲蛋白重結晶抑制作用分析
圖3 為 PBS、10% 絲素蛋白、10 mg/mL 絲膠蛋白三種溶液在?7℃ 條件下孵育 45 min 的低溫顯微圖片。觀察初始階段三種溶液中的冰晶大小，PBS 溶液中冰晶最大，其次為絲膠蛋白，絲素蛋白溶液最小。比較同種溶液不同孵育時間發現，隨著時間的增加，PBS 溶液中冰晶逐漸增大，絲膠蛋白溶液中冰晶有緩慢生長的趨勢，絲素蛋白溶液中冰晶基本不隨時間的變化而變化。比較相同停滯時間不同溶液的冰晶大小和形狀發現，PBS 溶液中形成的冰晶最大，形狀基本呈多邊形。因為冰再結晶是一種熱力學驅動的過程，具有較高表面積與體積比的較小冰晶在熱力學上不如具有較低表面積與體積比的大冰晶穩定。當系統試圖降低其自由能時，水分子從小冰晶遷移到液體中，隨后轉移到生長的冰晶中，導致總表面積與體積比的總體凈減少，最終在這個過程中，樣品中冰晶和液體的總量保持不變，而冰晶的數量減少，冰晶的平均尺寸增加。與在對照組 PBS 溶液中形成的大冰晶相比，絲膠和絲素蛋白溶液中形成的冰晶較小，且形狀不規則。以前的研究表明，抗凍蛋白通過與冰面的結合來干擾冰晶的遷移，從而實現再結晶抑制，因此可見蠶絲蛋白具有重結晶抑制能力與其結合冰的能力直接相關。Li 等[29]利用低溫顯微鏡觀察了絲膠肽（3K-SP）溶液在 ? 7℃ 下孵育 40 min 過程中的冰晶變化，發現絲膠肽溶液中冰晶基本維持不變，且冰晶形狀較小，說明絲膠肽具有一定的重結晶抑制作用。
圖3
PBS、絲膠和絲素蛋白溶液的低溫顯微圖片
Figure3.
Micrographs of PBS, sericin and silk fibroin solution at low temperature
圖4 為絲膠和絲素蛋白與 PBS 溶液平均晶粒尺寸的比例。從圖4 可以看出，在孵育初始階段，絲膠蛋白溶液的平均晶粒尺寸為 PBS 溶液的 45.37%，絲素蛋白溶液為 PBS 溶液的 8.28%。隨著孵育時間的增加，絲膠蛋白溶液的平均晶粒尺寸比例逐漸減小，15 min 后基本維持不變，為 28.99%；絲素蛋白溶液平均晶粒尺寸比例在前 5 min 下降明顯，5 min 后基本維持不變，為 3.18%。比較絲膠和絲素蛋白溶液前 15 min 的冰晶尺寸變化，絲素蛋白溶液的冰晶生長速率較慢，且冰晶形成的尺寸明顯小于絲膠蛋白溶液，說明絲素蛋白具有較強的重結晶抑制作用。
圖4
絲膠和絲素蛋白與 PBS 溶液平均晶粒尺寸的比例圖
Figure4.
Average grain size ratio of sericin and fibroin to PBS solution
2.3 絲膠蛋白、絲素蛋白的二級結構
絲膠蛋白是一種球狀蛋白，占蠶絲纖維總量的 20%～30%。圖5a 為絲膠蛋白紅外光譜圖，可以觀察到 1 658 cm?1附近是酰胺Ⅰ的特征吸收峰，1 541 cm?1 附近是酰胺Ⅱ的特征吸收峰，1 242 cm?1 附近是酰胺Ⅲ帶特征吸收峰。1 391 cm?1 處的波帶歸因于 C—H 和 O—H 彎曲，1 073 cm?1 處的波帶指定為 C—OH 伸縮振動。比對不同結構所對應的波數值的經驗數據[30]，可以得出絲膠蛋白二級結構主要為無規卷曲結構，含有部分 β-折疊結構。酰胺Ⅰ吸收譜帶主要是 C＝O 的伸縮振動，對于研究蛋白質二級結構最有價值。因此，本研究用酰胺Ⅰ帶（1 700～1 600 cm?1）分析絲膠蛋白的二級結構。將酰胺Ⅰ帶進行去卷積和二階導數處理，可準確得到三個子峰，分別為 1 639、1 664、1 693 cm?1。比對經驗值，各組峰對應的蛋白質二級結構之間的關系為：1 639、1 664 cm?1 為無規卷曲結構，1 693 cm?1 為 β-折疊結構。確定子峰的數目及位置后，對絲膠蛋白原始光譜酰胺Ⅰ帶進行曲線擬合，根據其積分面積計算各二級結構的相對百分含量。擬合結果如圖5c 所示。經過計算，無規卷曲含量為 75.62%，β-折疊結構含量為 24.38%。
圖5
蠶絲蛋白紅外光譜圖及 Guassian 曲線擬合譜
a. 絲膠蛋白紅外光譜圖；b. 絲素蛋白紅外光譜圖；c. 絲膠蛋白酰胺Ⅰ帶 Guassian 曲線擬合譜；d. 絲素蛋白酰胺Ⅲ帶 Guassian 曲線擬合譜
Figure5. Infrared spectra of silk protein and fitting spectrum of Guassian curvea. infrared spectrum of sericin protein; b. infrared spectrum of fibroin protein; c. sericin protein amide Ⅰ with Guassian curve fitting spectrum; d. fibroin protein amide Ⅲ with Guassian curve fitting spectrum
絲素蛋白占蠶絲纖維總量的 70%～80%，圖5b 為絲素蛋白的紅外光譜圖，可以觀察到在 3 295 cm?1 處主要代表沒有形成氫鍵的自由-NH 的振動，為較強的—OH 吸收峰；在 1 627 cm?1 附近是酰胺Ⅰ的特征吸收峰；在 1 522 cm?1 處的吸收譜帶是酰胺Ⅱ的特征吸收峰譜帶；在 1 235 cm?1附近為酰胺Ⅲ的特征吸收；在 892 cm?1 附近為酰胺Ⅳ的吸收帶；在 693 cm?1 附近為酰胺Ⅴ的特征吸收帶。比對不同結構所對應的波數值的經驗數據[31]，絲素蛋白的二級結構主要以 β-折疊結構為主，也含有部分的 α-螺旋結構和無規卷曲結構。選擇酰胺Ⅲ帶（1 220～1 330 cm?1）來分析絲素蛋白二級結構，對絲素蛋白原始圖譜酰胺Ⅲ帶分別進行去卷積和二階導數處理，準確得到四個子峰，分別為：1 232、1 262、1 286、1 307 cm?1。根據比對經驗值，各組峰對應的蛋白質二級結構之間的關系為：1 232 cm?1 對應 β-折疊結構，1 262 cm?1 對應無規卷曲結構，1 286 cm?1對應 β-轉角結構，1 307 cm?1對應 α-螺旋。對絲素蛋白原始圖譜酰胺Ⅲ帶進行曲線擬合，根據曲線的積分面積計算各二級結構的相對百分含量。擬合結果如圖5d 所示。絲素蛋白二級結構中 β-折疊結構百分含量最高（56.68%），其次為無規卷曲結構（22.38%），α-螺旋結構（16.84%），還含有少量的 β-轉角結構（4.13%）。
絲膠蛋白的二級構象主要為無規卷曲，氨基酸殘基排列不規則，但絲膠蛋白是一種球狀蛋白，親水基團裸露在外側，使蛋白質表面形成水化層，吸附并覆蓋到冰晶的表面，從而抑制冰晶的生長。絲膠蛋白含有的反向平行 β-折疊結構，使結構外側親水基團易與水分子和冰晶上的氧原子產生氫鍵作用，同樣具有抑制冰晶生長的作用。絲素蛋白二級結構主要為反向平行 β-折疊結構，β-折疊側鏈及末端都含有親水基團羥基、羧基或氨基。一方面能與水形成氫鍵作用，另一方面側鏈上的氫鍵能與冰晶上的氧原子結合，通過屏障和覆蓋作用阻止冰晶生長。此外，α-螺旋結構外側親水基團同樣能與水分子產生氫鍵作用與冰晶上的氧原子結合，從而起到抑制冰晶生長的作用。與其他抗凍蛋白二級結構進行比較，魚類抗凍蛋白的二級結構包括無規卷曲、α-螺旋、β-折疊以及 α-螺旋和 β-折疊的混合結構，植物抗凍蛋白的二級結構與昆蟲抗凍蛋白的二級結構相似，也存在大量的 β-折疊[32-33]。可以發現絲素蛋白相比于絲膠蛋白，與其他抗凍蛋白在二級結構上更具有相似性[15]。絲素蛋白抑制冰晶生長的效果好于絲膠蛋白，我們推測是因為絲膠蛋白的 β-折疊結構含量較少，也缺乏 α-螺旋結構，雖然存在大量的無規卷曲結構，但與冰晶表面形成的氫鍵數量少于絲素蛋白。結合 DSC 曲線和低溫顯微結果，絲膠蛋白、絲素蛋白中 β-折疊百分含量不同可能是二者冰晶抑制效果產生差異的主要原因。
3 結論
本文從蠶絲蛋白的二級結構、熱滯活性以及重結晶抑制效應三個方面入手，分析其作為低溫保護劑的可行性。通過 DSC 法測量蠶絲蛋白的熱滯活性，10 mg/mL 絲膠蛋白熱滯活性為 0.96℃，10%（V/V）絲素蛋白的熱滯活性為 1.15℃。利用低溫顯微鏡觀察蠶絲蛋白-PBS 混合溶液的重結晶抑制活性，發現在?7℃ 的停滯溫度下，初始階段絲膠蛋白和絲素蛋白溶液平均晶粒尺寸比例分別為 PBS 溶液的 45.37%、8.28%，孵育 40 min 后晶粒尺寸占比分別為 28.99%、3.18%，說明絲膠蛋白和絲素蛋白具有一定的抑制冰晶重結晶的效應。利用傅里葉變換紅外分析技術，定量地得到了蛋白的二級結構含量。絲膠蛋白無規卷曲含量為 75.62%，β-折疊結構含量為 24.38%。絲素蛋白二級結構中 β-折疊結構含量為 56.68%，其次為無規卷曲結構（22.38%），及 α-螺旋結構（16.84%）。以上分析論證了蠶絲蛋白作為保護劑的可行性，為低溫保護劑的選擇提供了新的思路。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
細胞凍存是細胞長期保存的主要方法，在臨床治療以及科學研究中應用廣泛。然而在冷凍保存的過程中，細胞會受到低溫損傷和冰晶損傷，低溫保護劑的添加至關重要[1]。Lovelock 等[2]創新性地以二甲基亞砜（Me2SO）作為冷凍保護劑，成功地凍存了人和牛的紅細胞、牛的精子。此后，Me2SO 聯用胎牛血清（fetal bovine serum，FBS) 作為低溫保護劑已經受到了廣泛的推廣和應用[3-5]。但是 Me2SO 對細胞具有毒性損傷，影響細胞生長等問題[6]，胎牛血清則存在著攜帶病毒、傳染疾病的風險[7]，因此尋找更安全高效的新型保護劑顯得越來越重要。
蠶絲蛋白是一種天然的高分子材料，無污染且來源豐富，主要由絲膠蛋白和絲素蛋白組成。蠶絲蛋白中氨基酸、極性親水基團含量豐富，能與水分子形成很強的相互作用。滕蕓[8]制備了由 1% 絲膠蛋白+10% 絲素蛋白+5% Me2SO 組成的低毒性無血清低溫保護劑用于豬耳成纖維細胞的低溫保存，結果發現與常規低溫保護劑 10% Me2SO +20% FBS 組相比，復溫后使用臺盼藍、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測細胞的存活率，與細胞 24 h 貼壁率均無顯著差異，說明蠶絲蛋白在實現對細胞低溫保護的同時，降低了 Me2SO 的使用濃度。但是關于蠶絲蛋白為什么能作為低溫保護劑，其保護機制和作用機制的研究較少。因此，考慮借鑒抗凍蛋白（antifreeze protein，AFP）的研究方法，通過對比抗凍蛋白的結構和性質，研究蠶絲蛋白的保護機制。
抗凍蛋白在醫學方面的應用主要集中在細胞、組織的低溫保存[9-10]。Rubinsky 團隊[11-12]首次發現抗凍蛋白可以應用于動物卵母細胞的低溫保護劑，將提取自極地魚類的不同分子質量的抗凍蛋白作為豬卵母細胞的低溫保護劑，發現其對卵膜結構完整性有很好的保護作用，同時抑制了離子在低溫下的泄露；經過處理的未成熟豬卵母細胞，將近 50% 能在體內成功發育，接近正常卵母細胞受精發育率。Carpenter 等[13]發現低濃度（5～150 μg/mL）的冬小麥抗凍蛋白可增強紅細胞的存活率，相對高濃度（1.54 mg/mL）的抗凍蛋白對抑制胞外重結晶有明顯效果，可以顯著減少復溫損傷，提高存活率。Amir 等[14]研究了抗凍蛋白對大鼠心臟低溫保存的效果。研究表明，使用 AFPⅢ作為保護劑，在 ? 1.3℃ 下儲存 24 h，沒有冰晶形成，且存活率為 100%。抗凍蛋白的抗凍活性與蛋白質自身結構有關，此外抗凍蛋白還具有熱滯活性、修飾冰晶形態和重結晶抑制活性三種重要特性[15-16]。美洲擬鰈抗凍蛋白（HPLC-6）由 37 個氨基酸殘基組成，疏水性氨基酸殘基約占 67.6%，親水性氨基酸殘基約占 32.4%。HPLC-6 空間幾乎完全由雙親右手 α-螺旋構成，空間構象分析可以清晰地表明連續完整的螺旋化結構與抗凍活性具有密切關系。HPLC-6 的螺旋構象長度是決定抗凍活性強弱的重要因素，長度越長則熱滯活性越高，抗凍活性越強[16]。抗凍蛋白能夠非依數性地降低溶液的冰點，不影響溶液的熔點，從而導致熔點和冰點之間出現差值，這種差值稱為“熱滯活性”（thermal hysteresis activity，THA）。Mao 等[17]從新疆荒漠甲蟲光滑鱉甲 Anatolica polita 提取抗凍蛋白（ApAFP752），并使用差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）測量該抗凍蛋白的熱滯活性，結果發現在冰核含量小于 25.3% 時，DSC 熱流曲線上觀察到明顯的凍結起始溫度的延遲，證明了 ApAFP752 蛋白具有熱滯活性，說明熱滯活性是抗凍蛋白的重要特性。冰晶重結晶是一種以較小冰晶逐漸生長成較大冰晶的過程。重結晶形成的大冰晶會導致細胞及組織在凍存過程中受到致命的冰晶損傷[18]。抗凍蛋白抑制重結晶的特性表現在它與冰晶的作用效果。一般抗凍蛋白在極低的濃度（ < 0.1 μg/mL）下就可以抑制冰晶的重結晶，維持較小且均勻的冰晶晶粒，減小其對細胞和組織的損傷[19]。
本文借鑒抗凍蛋白的研究方法，首先使用差示量熱掃描儀檢測蠶絲蛋白的熱滯活性，以及低溫顯微鏡觀察蠶絲蛋白重結晶抑制活性，再利用傅里葉變換紅外光譜技術檢測蠶絲蛋白的二級結構，分析蠶絲蛋白的氨基酸和基團組成，定量地確定絲膠蛋白和絲素蛋白的二級結構含量。最后結合抗凍蛋白的作用機制，從蠶絲蛋白的結構、物理化學性質層面分析其作為低溫保護劑的保護機制。
1 材料與方法
1.1 材料
蠶繭（廣西平果桑移天下絲綢有限公司）、絲膠蛋白（日本和光純藥（Wako）集團）、溴化鉀、溴化鋰（國藥集團化學試劑有限公司）、雙蒸水（自制）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）。
絲膠蛋白溶液：絲膠蛋白作為細胞培養基質常用的濃度范圍為 0.1%～1%[20]，且都能在一定程度上促進細胞的生長和繁殖。因此本文選擇絲膠蛋白濃度為 1% 進行實驗。稱量 10 mg 絲膠蛋白粉末，溶解于 1 mL 雙蒸水或 PBS 溶液中，配置成濃度為 10 mg/mL 的絲膠蛋白溶液。
絲素蛋白溶液：根據文獻[21]的制備方法，將蠶繭除雜處理后，在 0.02 mol/L 碳酸鈉溶液中脫膠處理 30 min。得到的絲素纖維沖洗烘干后，60℃ 條件下用 9.3 mol/L 溴化鋰溶解 4 h。將絲素蛋白溶液進行透析、離心、濃縮等處理，處理后所得的絲素溶液用雙蒸水或 PBS 配置成濃度為 10% 的絲素蛋白溶液，于 4℃ 冰箱中保存備用。
1.2 方法
1.2.1 蠶絲蛋白熱滯活性測量方法
采用差示掃描量熱儀（DSC200 F3，Netzsch，德國）對蠶絲蛋白的熱滯活性進行測定。將絲膠蛋白和絲素蛋白用 PBS 分別制備成 10 mg/mL 和 10% 濃度的樣品放入 DSC 樣品皿中。先以 1℃/min 的速率慢速降溫至?25℃，平衡 5 min，使樣品結冰固化，再以 1℃/min 速率慢速升溫至 10℃，從樣品熔融峰上得到樣品的熔點 Tm 和熔融焓值 ΔHm。樣品再以 1℃/min 的速率慢速降溫至?25℃，平衡 5 min，使其固化。再以 1℃/min 的速率慢速復溫至樣品熔融峰所涵蓋溫度區間的某一溫度，平衡 5 min，使樣品處于部分熔融狀態，這一溫度稱為“停滯溫度”，即 Th[22]。再以 1℃/min 的速率慢速降溫至?15℃。由于冰晶生長，DSC 降溫曲線上出現結晶放熱峰，其起始溫度為 T0。若樣本具有抗凍活性，結晶峰的出現將被延遲，T0 和 Th 存在差異。利用 Netzsch-Proteus 的分析軟件 Proteus Analysis 對熱流曲線進行分析，確定溫度區間為 Th?2 < T0 < Th，再次凍結起始溫度 T0 為沿該溫度區間兩節點所做切線相交點所對應的溫度。由此可以計算：
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改變 Th，重復上述實驗過程，可計算出不同停滯溫度下蠶絲蛋白的熱滯活性。
在 Th 溫度時，部分融化的樣品中初始冰晶量（Ф）可由延遲的冰晶放熱量即凍結焓 ΔHr 與完全融化的熱量即熔融焓 ΔHm 計算得到：
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1.2.2 蠶絲蛋白重結晶抑制作用測定
采用低溫顯微系統觀察蠶絲蛋白的重結晶抑制作用[23]。低溫顯微系統主要由低溫制冷系統（BCS196，Linkam Scientific，英國）、帶有攝像功能的光學顯微鏡（BX51，Olympus，日本）和溫度控制軟件（Linksys32，Linkam Scientific，英國）組成。將絲膠蛋白和絲素蛋白用 PBS 分別制備成 10 mg/mL 和 10%（V/V）濃度的樣品。取 1 μL 樣品利用液體的表面張力將溶液吸至兩個載玻片之間，以 PBS 溶液為對照組。樣品放入低溫臺內，以 90℃/min 的速率降至 ? 40℃，維持 1 min 后用同樣的速率升溫至 ? 7℃，維持 45 min。溫度過低絲素蛋白溶液冰晶還未融化，溫度過高則 PBS 溶液冰晶基本融化。當停留溫度為 ? 7℃ 時，此溫度下三種溶液的現象變化區分最為明顯，冰晶部分開始融化，出現重結晶現象。設置拍攝時間為 1 s，通過 Image J 軟件分析三種溶液中冰晶的平均晶粒尺寸，并分別比較絲膠和絲素蛋白與 PBS 溶液平均晶粒尺寸的比例（mean grain size rate，MGSR），分析絲膠和絲素蛋白的重結晶抑制作用。晶粒尺寸越小，冰晶越多，說明重結晶抑制作用越強。
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1.2.3 蠶絲蛋白二級結構測定方法
采用傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet iS50，Thermo Scientific，美國）對蠶絲蛋白的二級結構進行測定。首先使用壓片機制作 10 mg/mL 絲膠蛋白、10% 絲素蛋白樣品薄膜，然后將樣品薄膜放在紅外光譜儀中進行表征，每次表征前需用空白的溴化鉀壓片掃描作為背景分析，掃描過程中實時扣除 CO2 和 H2O 干擾。每個樣本制作 3 個錠片，每個錠片采集 3 張譜圖，取其平均譜圖作為最后的樣品譜圖。利用 Omnic V8.0 數據處理軟件自動校正基線，做傅里葉去卷積和二階導數譜，估出各子峰的峰位；再利用 Origin 8.5 數據處理軟件采用 Gausse 函數對二階導數譜和傅里葉去卷積譜進行多次擬合，手動選定各子峰的峰位，使重疊的不同譜帶完全分開，確定各子峰和不同二級結構的對應關系，根據其積分面積計算各種二級結構的相對百分含量。
2 結果與討論
2.1 蠶絲蛋白的熱滯活性分析
圖1 顯示了雙蒸水、絲素蛋白溶液、絲膠蛋白溶液冷凍和熔融過程的熱流溫度曲線，分析可得各溶液的熔點和熔融焓值。由圖可知，雙蒸水、絲素蛋白溶液、絲膠蛋白溶液的熔點分別為?1.1、?3.0、?1.4℃，所以設置雙蒸水停滯溫度 Th 取值分別為：?0.6、?0.8、?1.0、?1.2℃；絲膠蛋白溶液停滯溫度 Th 取值分別為：?3.4、?3.2、?3.0、?2.8、?2.6℃；絲素蛋白溶液停滯溫度 Th 取值分別為：?1.8、?1.6、?1.4、?1.2、?1.0℃。圖2 顯示了不同停滯溫度下雙蒸水、絲素蛋白溶液、絲膠蛋白溶液凍結和熔融過程的 DSC 曲線，分析可得三種樣品的停滯溫度（Th）、再次凍結起始溫度（T0）、THA 以及冰核含量（Φ），見表1。
圖1
雙蒸水、蠶絲蛋白溶液的凍結-融化曲線
Figure1.
Freezing-melting curve of silk protein solution
圖2
雙蒸水、蠶絲蛋白不同停滯溫度凍結和熔融過程的 DSC 曲線
a.雙蒸水；b.絲素蛋白；c.絲膠蛋白
Figure2. DSC curves of freezing and melting processes of double steamed water and silk proteins at different temperaturesa. double steamed water; b. fibroin protein; c. sericin protein
表1
雙蒸水和蠶絲蛋白溶液的熱滯活性和冰晶含量
Table1.
Thermal hysteresis activity and ice crystal content of double steamed water and silk protein solutions
通過比較發現絲膠蛋白、絲素蛋白溶液的冰核含量都隨 Th 的升高而逐漸減小，THA 隨著冰核含量的減少而逐漸增大，體系中冰核含量越少時（約 6%），溶液的抗凍活性越強。當絲膠蛋白濃度為 1%，停滯溫度為 ? 2.6℃ 時，其 THA 最大為 0.96℃，此時體系內冰核含量為 6.45%；當絲素蛋白濃度為 10%，停滯溫度為?1.0℃ 時，其 THA 為 1.15℃，此時體系內冰核含量為 6.04%。從表1 中可以看出，隨著停滯溫度的不斷增加，絲膠、絲素蛋白的 THA 隨冰核含量的減小而不斷增加，已經有報道顯示昆蟲的抗凍蛋白的 THA 為 5～6℃，魚類抗凍蛋白的 THA 為 1.0～1.5℃，植物抗凍蛋白的 THA 為 0.1～0.45℃[24]。可見蠶絲蛋白的 THA 高于來自植物的抗凍蛋白的 THA，低于昆蟲抗凍蛋白的 THA，與魚類抗凍蛋白的 THA 相似。
Wu 等[25]發現抗凍蛋白的熱滯活性隨初始冰晶量的減少而增大。溶液中冰晶初始含量越低，則冰晶表面抗凍蛋白的吸附覆蓋程度越高，對冰晶生長的抑制作用越強，溶液完全結晶的時間越長，熱滯活性越高[26]。實驗研究表明，抗凍蛋白與冰晶之間的確有氫鍵的結合。因此，我們推斷蠶絲蛋白可能具有與抗凍蛋白相同的抗凍機制，在凍結過程中，蠶絲蛋白通過與冰晶表面的氧原子形成氫鍵吸附于冰晶表面，增大了冰晶表面積與體積之比，形成了較大的表面自由能[27-28]，只有通過降低凝固點，將能量從體系中排出，冰晶才能繼續生長，從而起到抑制冰晶生長的效果。
2.2 蠶絲蛋白重結晶抑制作用分析
圖3 為 PBS、10% 絲素蛋白、10 mg/mL 絲膠蛋白三種溶液在?7℃ 條件下孵育 45 min 的低溫顯微圖片。觀察初始階段三種溶液中的冰晶大小，PBS 溶液中冰晶最大，其次為絲膠蛋白，絲素蛋白溶液最小。比較同種溶液不同孵育時間發現，隨著時間的增加，PBS 溶液中冰晶逐漸增大，絲膠蛋白溶液中冰晶有緩慢生長的趨勢，絲素蛋白溶液中冰晶基本不隨時間的變化而變化。比較相同停滯時間不同溶液的冰晶大小和形狀發現，PBS 溶液中形成的冰晶最大，形狀基本呈多邊形。因為冰再結晶是一種熱力學驅動的過程，具有較高表面積與體積比的較小冰晶在熱力學上不如具有較低表面積與體積比的大冰晶穩定。當系統試圖降低其自由能時，水分子從小冰晶遷移到液體中，隨后轉移到生長的冰晶中，導致總表面積與體積比的總體凈減少，最終在這個過程中，樣品中冰晶和液體的總量保持不變，而冰晶的數量減少，冰晶的平均尺寸增加。與在對照組 PBS 溶液中形成的大冰晶相比，絲膠和絲素蛋白溶液中形成的冰晶較小，且形狀不規則。以前的研究表明，抗凍蛋白通過與冰面的結合來干擾冰晶的遷移，從而實現再結晶抑制，因此可見蠶絲蛋白具有重結晶抑制能力與其結合冰的能力直接相關。Li 等[29]利用低溫顯微鏡觀察了絲膠肽（3K-SP）溶液在 ? 7℃ 下孵育 40 min 過程中的冰晶變化，發現絲膠肽溶液中冰晶基本維持不變，且冰晶形狀較小，說明絲膠肽具有一定的重結晶抑制作用。
圖3
PBS、絲膠和絲素蛋白溶液的低溫顯微圖片
Figure3.
Micrographs of PBS, sericin and silk fibroin solution at low temperature
圖4 為絲膠和絲素蛋白與 PBS 溶液平均晶粒尺寸的比例。從圖4 可以看出，在孵育初始階段，絲膠蛋白溶液的平均晶粒尺寸為 PBS 溶液的 45.37%，絲素蛋白溶液為 PBS 溶液的 8.28%。隨著孵育時間的增加，絲膠蛋白溶液的平均晶粒尺寸比例逐漸減小，15 min 后基本維持不變，為 28.99%；絲素蛋白溶液平均晶粒尺寸比例在前 5 min 下降明顯，5 min 后基本維持不變，為 3.18%。比較絲膠和絲素蛋白溶液前 15 min 的冰晶尺寸變化，絲素蛋白溶液的冰晶生長速率較慢，且冰晶形成的尺寸明顯小于絲膠蛋白溶液，說明絲素蛋白具有較強的重結晶抑制作用。
圖4
絲膠和絲素蛋白與 PBS 溶液平均晶粒尺寸的比例圖
Figure4.
Average grain size ratio of sericin and fibroin to PBS solution
2.3 絲膠蛋白、絲素蛋白的二級結構
絲膠蛋白是一種球狀蛋白，占蠶絲纖維總量的 20%～30%。圖5a 為絲膠蛋白紅外光譜圖，可以觀察到 1 658 cm?1附近是酰胺Ⅰ的特征吸收峰，1 541 cm?1 附近是酰胺Ⅱ的特征吸收峰，1 242 cm?1 附近是酰胺Ⅲ帶特征吸收峰。1 391 cm?1 處的波帶歸因于 C—H 和 O—H 彎曲，1 073 cm?1 處的波帶指定為 C—OH 伸縮振動。比對不同結構所對應的波數值的經驗數據[30]，可以得出絲膠蛋白二級結構主要為無規卷曲結構，含有部分 β-折疊結構。酰胺Ⅰ吸收譜帶主要是 C＝O 的伸縮振動，對于研究蛋白質二級結構最有價值。因此，本研究用酰胺Ⅰ帶（1 700～1 600 cm?1）分析絲膠蛋白的二級結構。將酰胺Ⅰ帶進行去卷積和二階導數處理，可準確得到三個子峰，分別為 1 639、1 664、1 693 cm?1。比對經驗值，各組峰對應的蛋白質二級結構之間的關系為：1 639、1 664 cm?1 為無規卷曲結構，1 693 cm?1 為 β-折疊結構。確定子峰的數目及位置后，對絲膠蛋白原始光譜酰胺Ⅰ帶進行曲線擬合，根據其積分面積計算各二級結構的相對百分含量。擬合結果如圖5c 所示。經過計算，無規卷曲含量為 75.62%，β-折疊結構含量為 24.38%。
圖5
蠶絲蛋白紅外光譜圖及 Guassian 曲線擬合譜
a. 絲膠蛋白紅外光譜圖；b. 絲素蛋白紅外光譜圖；c. 絲膠蛋白酰胺Ⅰ帶 Guassian 曲線擬合譜；d. 絲素蛋白酰胺Ⅲ帶 Guassian 曲線擬合譜
Figure5. Infrared spectra of silk protein and fitting spectrum of Guassian curvea. infrared spectrum of sericin protein; b. infrared spectrum of fibroin protein; c. sericin protein amide Ⅰ with Guassian curve fitting spectrum; d. fibroin protein amide Ⅲ with Guassian curve fitting spectrum
絲素蛋白占蠶絲纖維總量的 70%～80%，圖5b 為絲素蛋白的紅外光譜圖，可以觀察到在 3 295 cm?1 處主要代表沒有形成氫鍵的自由-NH 的振動，為較強的—OH 吸收峰；在 1 627 cm?1 附近是酰胺Ⅰ的特征吸收峰；在 1 522 cm?1 處的吸收譜帶是酰胺Ⅱ的特征吸收峰譜帶；在 1 235 cm?1附近為酰胺Ⅲ的特征吸收；在 892 cm?1 附近為酰胺Ⅳ的吸收帶；在 693 cm?1 附近為酰胺Ⅴ的特征吸收帶。比對不同結構所對應的波數值的經驗數據[31]，絲素蛋白的二級結構主要以 β-折疊結構為主，也含有部分的 α-螺旋結構和無規卷曲結構。選擇酰胺Ⅲ帶（1 220～1 330 cm?1）來分析絲素蛋白二級結構，對絲素蛋白原始圖譜酰胺Ⅲ帶分別進行去卷積和二階導數處理，準確得到四個子峰，分別為：1 232、1 262、1 286、1 307 cm?1。根據比對經驗值，各組峰對應的蛋白質二級結構之間的關系為：1 232 cm?1 對應 β-折疊結構，1 262 cm?1 對應無規卷曲結構，1 286 cm?1對應 β-轉角結構，1 307 cm?1對應 α-螺旋。對絲素蛋白原始圖譜酰胺Ⅲ帶進行曲線擬合，根據曲線的積分面積計算各二級結構的相對百分含量。擬合結果如圖5d 所示。絲素蛋白二級結構中 β-折疊結構百分含量最高（56.68%），其次為無規卷曲結構（22.38%），α-螺旋結構（16.84%），還含有少量的 β-轉角結構（4.13%）。
絲膠蛋白的二級構象主要為無規卷曲，氨基酸殘基排列不規則，但絲膠蛋白是一種球狀蛋白，親水基團裸露在外側，使蛋白質表面形成水化層，吸附并覆蓋到冰晶的表面，從而抑制冰晶的生長。絲膠蛋白含有的反向平行 β-折疊結構，使結構外側親水基團易與水分子和冰晶上的氧原子產生氫鍵作用，同樣具有抑制冰晶生長的作用。絲素蛋白二級結構主要為反向平行 β-折疊結構，β-折疊側鏈及末端都含有親水基團羥基、羧基或氨基。一方面能與水形成氫鍵作用，另一方面側鏈上的氫鍵能與冰晶上的氧原子結合，通過屏障和覆蓋作用阻止冰晶生長。此外，α-螺旋結構外側親水基團同樣能與水分子產生氫鍵作用與冰晶上的氧原子結合，從而起到抑制冰晶生長的作用。與其他抗凍蛋白二級結構進行比較，魚類抗凍蛋白的二級結構包括無規卷曲、α-螺旋、β-折疊以及 α-螺旋和 β-折疊的混合結構，植物抗凍蛋白的二級結構與昆蟲抗凍蛋白的二級結構相似，也存在大量的 β-折疊[32-33]。可以發現絲素蛋白相比于絲膠蛋白，與其他抗凍蛋白在二級結構上更具有相似性[15]。絲素蛋白抑制冰晶生長的效果好于絲膠蛋白，我們推測是因為絲膠蛋白的 β-折疊結構含量較少，也缺乏 α-螺旋結構，雖然存在大量的無規卷曲結構，但與冰晶表面形成的氫鍵數量少于絲素蛋白。結合 DSC 曲線和低溫顯微結果，絲膠蛋白、絲素蛋白中 β-折疊百分含量不同可能是二者冰晶抑制效果產生差異的主要原因。
3 結論
本文從蠶絲蛋白的二級結構、熱滯活性以及重結晶抑制效應三個方面入手，分析其作為低溫保護劑的可行性。通過 DSC 法測量蠶絲蛋白的熱滯活性，10 mg/mL 絲膠蛋白熱滯活性為 0.96℃，10%（V/V）絲素蛋白的熱滯活性為 1.15℃。利用低溫顯微鏡觀察蠶絲蛋白-PBS 混合溶液的重結晶抑制活性，發現在?7℃ 的停滯溫度下，初始階段絲膠蛋白和絲素蛋白溶液平均晶粒尺寸比例分別為 PBS 溶液的 45.37%、8.28%，孵育 40 min 后晶粒尺寸占比分別為 28.99%、3.18%，說明絲膠蛋白和絲素蛋白具有一定的抑制冰晶重結晶的效應。利用傅里葉變換紅外分析技術，定量地得到了蛋白的二級結構含量。絲膠蛋白無規卷曲含量為 75.62%，β-折疊結構含量為 24.38%。絲素蛋白二級結構中 β-折疊結構含量為 56.68%，其次為無規卷曲結構（22.38%），及 α-螺旋結構（16.84%）。以上分析論證了蠶絲蛋白作為保護劑的可行性，為低溫保護劑的選擇提供了新的思路。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
