電磁場（EMF）作用對神經系統功能的影響，現已成為電磁生物效應領域廣泛關注的問題。本文旨在從神經信息網絡連接角度探究工頻 EMF 長期作用對大腦認知功能的影響及其機制。本文將斯普拉格·道利（SD）大鼠隨機分為 3 組，其中模型Ⅰ組將 SD 大鼠置于 2 mT 工頻 EMF 中作用 24 d；模型Ⅱ組將 SD 大鼠置于 2 mT 工頻 EMF 中作用 48 d；對照組 SD 大鼠未經工頻 EMF 作用。隨后，采集不同組別 SD 大鼠執行工作記憶（WM）任務過程中前額皮層（PFC）16 通道的局部場電位信號（LFPs），并基于定向傳遞函數（DTF）構建 LFPs 因果連接網絡，最終通過對比各組 SD 大鼠在 WM 過程中 LFPs 信號因果網絡特征參數及行為學表現的異同，探討工頻 EMF 長期作用對 WM 的影響。本文研究結果顯示，模型Ⅱ組大鼠執行 WM 任務達到正確率 80% 以上所需時間及次數明顯多于對照組。WM 任務中，模型Ⅰ、Ⅱ組因果網絡連接強度及全局效率值均明顯低于對照組；且模型Ⅱ組中因果網絡連接密度值明顯低于模型Ⅰ組及對照組。結果表明，經 2 mT 工頻 EMF 的長期作用，PFC 的 LFPs 信號間因果網絡連接強度及全局效率降低，并影響 SD 大鼠的行為學表現。本文的研究結果從神經網絡信息傳遞的角度揭示了工頻 EMF 作用影響大腦認知功能的可能機制，可為進一步研究其作用機制提供重要的支持。
引用本文： 李雙燕, 溫雪晗, 桑浩鈞, 徐桂芝. 工頻電磁場長期作用影響工作記憶中局部場電位因果網絡連接特征. 生物醫學工程學雜志, 2018, 35(6): 829-836. doi: 10.7507/1001-5515.201806004 復制
引言
隨著電氣、電子設備在生活和工作中應用得日益廣泛和電磁環境的日益復雜，電磁場（electromagnetic field，EMF）作用是否對人類健康具有潛在影響的問題也受到越來越多的關注[1-2]。近年來，有文獻報道長期暴露于 EMF 下會造成中樞神經系統功能障礙。其中，腦部對 EMF 輻射最為敏感[3-4]。若大腦功能受損，將給人們的日常生活及工作帶來嚴重影響。因此，EMF 作用對大腦認知功能的影響，現已成為電磁生物效應研究領域廣泛關注的重要問題。
在我國，極低頻電磁場（extremely low frequency electromagnetic field，ELF-EMF）尤其是工頻 EMF 是人們在日常生活工作中接觸最頻繁的 EMF 類型之一，其具有作用持續時間長的特點。而某些職業受限于本身工作環境和性質的影響，使從事這些工作的人員面臨長時間處于相對較高強度的工頻 EMF 作用環境中。有研究表明，長期暴露在 ELF-EMF 中會對職業人群的心理狀態、作業能力產生明顯的影響，并與阿爾茨海默癥等神經退行性疾病的發生有關[5]。王東等[6]模擬職業工作場所 ELF-EMF 環境，將大鼠長時間暴露于其中后觀測其學習記憶行為，發現 ELF-EMF 暴露有可能損傷大鼠的記憶功能。因此，研究較高強度的工頻 EMF 長期作用對大腦認知功能是否產生影響及其潛在機制，能夠對長期處于較高強度工頻 EMF 環境中工作人員健康的保護提供參考。
在許多復雜認知功能的實現中，工作記憶（working memory，WM）起了十分重要的作用。WM 通常定義為對信息進行暫時存儲與處理的容量有限的記憶系統[7-8] ，其主要責任腦區之一為前額葉皮層（prefrontal cortex，PFC）。近年來，大量研究表明，PFC 中神經元的活動與 WM 功能的實現密切相關[9-10]。與動物相關的研究表明，在 WM 任務執行過程中，PFC 神經元電活動信號能夠編碼 WM[11-12]。而在 WM 功能障礙的大鼠 PFC 中，不同位點記錄所得局部場電位（local field potentials，LFPs）信號間網絡連接特征與 WM 功能正常的大鼠之間存在差異[13-14]，上述提及的 LFPs 信號是從大腦皮層、亞皮層或核團等區域記錄所得的微電極尖端附近興奮性和抑制性突觸電活動的總和[15]。以上研究也表明，神經元作為神經系統功能實現的基本單元，其電生理活動直接與神經系統功能相關。因此，將神經電生理與行為學相結合進行研究，有望為進一步探索 EMF 作用對神經系統功能影響的機制提供理論支持。
基于此，本文選取斯普拉格·道利（Sprague-Dawley，SD）大鼠作為研究對象，搭建了頻率為 50 Hz、強度為 2 mT 的工頻 EMF 環境，可長期施加于 SD 大鼠。然后運用在體植入式微電極陣列記錄技術，記錄和獲取置于 2 mT 工頻 EMF 中作用 24 d 的模型Ⅰ組 SD 大鼠、置于 2 mT 工頻 EMF 中作用 48 d 的模型Ⅱ組 SD 大鼠，以及未經 2 mT 工頻 EMF 作用的對照組 SD 大鼠的 WM 責任腦區——PFC 的 16 通道 LFPs 信號。隨后，應用基于定向傳遞函數（directed transfer function，DTF）算法的頻域格蘭杰因果分析方法，構建 LFPs 信號因果連接網絡；并進一步對比模型Ⅰ組、模型Ⅱ組與對照組 SD 大鼠在 WM 過程中 LFPs 信號的網絡連接特征的異同。本研究期望能夠從神經網絡信息傳遞的角度揭示工頻 EMF 作用影響大腦認知功能的可能機制，并為進一步研究其作用機制提供重要的支持。
1 材料與方法
1.1 構建工頻 EMF 作用的大鼠模型
本實驗使用雄性成年 SD 大鼠共 15 只（300～350 g），購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，將其隨機分為 3 組（模型Ⅰ組、模型Ⅱ組及對照組），每組 5 只。其中，模型Ⅰ組是將 SD 大鼠置于 2 mT 工頻 EMF 中作用 24 d，每天連續作用 8 h；模型Ⅱ組是將 SD 大鼠置于 2 mT 工頻 EMF 中作用 48 d，每天連續作用 8 h；對照組 SD 大鼠未經 2 mT 工頻 EMF 作用。
1.2 微電極陣列植入
使用戊巴比妥鈉對本文實驗 SD 大鼠進行麻醉，腹腔注射劑量為 30～50 mg/kg。待大鼠麻醉后，將其固定于腦立體定位儀（51670，Stoelting，美國）上。沿矢狀方向切開大鼠頭部皮膚，并去除皮下結締組織，使顱骨暴露。在責任腦區——PFC 附近區域的顱骨上固定 3～4 顆不銹鋼螺釘，用作參考和接地電極。去除 PFC 上方部分顱骨后，植入 16 通道微電極陣列（2 × 8，Plexon，美國），以便采集 PFC 神經電活動信號。PFC 定位為前囟前 2.5～4.5 mm，旁開 0.2～1.0 mm，深度為距離皮層表面 2.5～3.5 mm。在電極到達責任腦區 PFC 后，使用牙科水泥進行包埋固定。大鼠在進行微電極陣列植入手術后，給予 3～5 d 的修養期予以恢復。然后，對 SD 大鼠進行如下文 1.3 小節所示的“T 迷宮 WM 任務”訓練，并獲取 WM 任務過程中大鼠 PFC 的 16 通道 LFPs 信號。
1.3 T 迷宮 WM 任務
T 迷宮 WM 行為學實驗，是一種應用基于食物獎勵的延遲交替任務對 WM 功能進行檢測的行為學檢測方法。本文使用的“T 迷宮”由一個起始臂（臂端為起始區域）和兩個目標臂（臂端分別放置食槽，食槽內可放置食物作為獎勵）組成。
本實驗中，將 SD 大鼠置于 T 迷宮中進行兩天的適應環境訓練（30 min/次，2 次/d）。在此過程中，大鼠可以在迷宮中自由活動、探索。隨后，對大鼠進行 WM 任務訓練（20 次/d）。任務過程簡述如下：每次 WM 任務均包括自由選擇和延遲交替選擇兩個階段。首先為自由選擇階段，在此過程中，大鼠從起始區域出發后，進入兩目標臂中的任意一個，均可獲得食物獎勵。隨后，大鼠回到起始區域，并等待 5 s 后，開始延遲交替選擇任務階段。在此過程中，大鼠必須選擇與自由選擇階段不同的目標臂，才可視為正確執行此次 WM 任務，并獲得食物獎勵。反之，則視為錯誤執行 WM 任務，最終無法獲得食物獎勵。當正確率連續兩天達到 80% 以上時，視為大鼠達到正確率標準，訓練過程結束。
此后，大鼠每天進行兩次 WM 任務檢測（20～30 min/次）。實驗結束后，對不同組別大鼠相同訓練次數下取得的正確率進行對比。
1.4 LFPs 信號獲取及網絡構建
T 迷宮 WM 任務訓練過程結束后，在大鼠執行 T 迷宮 WM 任務檢測的同時，應用在體多通道神經信號采集系統（OmniPlex/128，Plexon，美國），獲取大鼠在 T 迷宮 WM 任務過程中 PFC 神經電活動信號，并進行 0.3～500 Hz 的低通濾波，得到 16 通道的 LFPs 信號（采樣頻率：1 kHz）。由于 LFPs 信號的 θ 頻段（4～12 Hz）為 WM 的主要相關頻段[16]，因此本文將其選取為主要研究對象，即將 0～500 Hz LFPs 信號經過帶通濾波后得到其 θ 頻段信號以構建網絡。
隨后，應用基于 DTF 的頻域格蘭杰因果分析方法，對不同組別 SD 大鼠在執行 WM 任務過程中延遲交替選擇任務階段的 LFPs 信號進行分析。基于各通道 LFPs 之間的 DTF 值構建矩陣，研究模型Ⅰ組、模型Ⅱ組和對照組大鼠 WM 責任腦區 PFC 的 LFPs 因果網絡特征模式，其原理及計算步驟如式（1）～式（6）所示。
基于 n 個通道的 LFPs 時間序列建立多變量自回歸（multivariate autoregressive，MVAR）模型，設 n 個通道的時間序列信號為如式（1）所示：
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其中 Xn 是第 n 通道的時間序列。
構建 MVAR 模型，如式（2）所示：
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其中，E（t）為估計誤差，
為系數矩陣，p 為通過貝葉斯信息準則（Bayesian information criteria，BIC）估計的 MVAR 模型階數。
MVAR 模型經傅里葉變換轉換到頻域，如式（3）所示：
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其中，f 表示頻率，A 是頻域系數矩陣，H（f）是傳遞矩陣，可以表示為如式（4）所示：
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基于傳遞矩陣 H，從通道 j 到通道 i 的因果連接值 rij（f）定義如式（5）所示：
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其中，k 為總通道數。當i ≠ j時，rij 越大說明通道 j 與通道 i 的因果連接程度越強，反之則越弱。當i = j時，rij 為 0。
基于此，WM 過程中 LFPs θ 頻段信號構建的 DTF 連接矩陣［以符號 DTF（f）表示］，定義如式（6）所示：
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1.5 基于 DTF 的 LFPs 信號網絡連接特性分析
為進一步對比分析不同組別大鼠在執行 WM 過程中 LFPs 信號網絡連接特性的異同，本文選取基于圖論的網絡連接密度（以符號 D 表示）和全局效率（以符號 Eglobal 表示）來定量表征網絡連接特性。
首先，引入最短路徑長度（以符號 Lij 表示）的概念，其定義為：將每一個通道作為一個節點，求取 DTF 矩陣中各非零元素的倒數值，作為網絡不同節點之間的最短路徑長度。最短路徑長度 Lij 可以表示為如式（7）所示：
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當 rij 為 0 時，通道 j 與通道 i 之間的因果連接為無效連接，因此當 rij 為 0 時，最短路徑長度 Lij 不存在。
在上述基礎上，進一步求取網絡連接密度和全局效率。其中網絡連接密度反應了網絡中節點之間連接的緊密程度，節點之間的連接數目越多、強度越大，網絡連接密度越大[17]，其定義如式（8）所示：
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其中，N 表示通道數，K 表示網絡中所有節點之間實際存在的最短路徑的數目。連接密度的取值范圍為0 ≤ D ≤ 1。當網絡連接狀態為理想情況時，即每個節點與網絡中其余節點之間均存在最短路徑時，連接密度取最大值為 1。
全局效率指的是一個網絡中各節點之間最短路徑長度的調和平均數的倒數，它是衡量網絡對信息的總體傳輸能力全局指標[18]。全局效率越高，網絡節點之間傳遞信息的速率越快，全局效率 Eglobal 如式（9）所示：
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其中，N 表示節點數，Lij 為節點 i 與 j 之間最短路徑長度。Eglobal 的取值范圍為 [0，1][19-20]。
1.6 統計分析
本文中所得實驗數據均以均值 ± 標準差表示，采用科克倫 Q（cochran Q）檢驗對不同組別大鼠在相同訓練次數（每組大鼠每訓練 100 次為一組對比數據，5 只/組，20 次/只）下執行 WM 任務的正確率進行統計學分析，采用柯爾莫可洛夫-斯米洛夫（kolmogorov-smirnov，K-S）檢驗對不同組別大鼠達到 WM 任務正確率標準所用天數進行統計學分析。此外，在 WM 任務執行正確率到達 80% 以后，隨機選取每只大鼠 40 次 WM 任務過程中的 LFPs 信號，構建其 θ 頻段因果網絡。隨后應用 K-S 檢驗對不同組別大鼠在執行 WM 任務中 LFPs 信號 θ 頻段因果網絡的平均 DTF 值、因果網絡連接密度和全局效率進行統計學分析，以判斷不同組別大鼠 WM 任務過程中因果網絡連接特征值間的差異是否具有統計學意義。當概率值 P < 0.05 時，認為不同組別數據間的差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 工頻 EMF 長期作用對大鼠 T 迷宮 WM 任務正確率的影響
對不同組別大鼠達到 WM 任務正確率標準所用天數進行對比分析，結果顯示，模型Ⅱ組大鼠達到正確率標準所用天數為 d =（12.4 ± 3.0） d，與對照組大鼠達到正確率標準所用天數 d =（7.2 ± 2.4） d 之間的差異性具有統計學意義（K-S 檢驗，P < 0.05， n = 5）。模型Ⅰ組大鼠所用天數為 d =（11 ± 4.8） d，與對照組和模型Ⅱ組之間的差異均不具有統計學意義（K-S 檢驗，P > 0.05， n = 5）。
進一步對相同訓練次數下，不同組別大鼠執行 WM 任務的正確率進行對比，統計不同組別大鼠從訓練開始至訓練過程結束每經過 100 次訓練（5 只/組，20 次/只）WM 任務正確率的變化。結果如圖 1 所示，在訓練初始時，即每組前 100 次訓練，模型Ⅰ組與模型Ⅱ組執行 WM 任務的正確率均高于對照組（Cochran Q 檢驗，P < 0.05， n = 100）。隨著訓練次數的增加，對照組的正確率迅速增加，在 500 次訓練后，相同訓練次數下對照組的正確率高于模型Ⅰ組與模型Ⅱ組的正確率。并且對照組的正確率率先達到正確率標準（約 1 200 次訓練后）。與對照組相比，模型Ⅰ組、模型Ⅱ組大鼠均需要經歷更多的訓練次數（約 1 500 次）才能達到正確率標準；而模型Ⅰ組與模型Ⅱ組達到正確率標準所需訓練次數基本相同（均為 1 500 次左右）。
圖1
不同組別大鼠 T 迷宮 WM 任務正確率對比
*
*
此結果表明，工頻 EMF 長期作用使大鼠在 T 迷宮 WM 任務訓練階段達到正確率標準所用天數更多，所需訓練次數也更多。同時，結果分析顯示，模型Ⅰ組與模型Ⅱ組大鼠達到 WM 任務正確率標準所用天數之間的差異不具有統計學意義，所需訓練次數基本相同。
2.2 工頻 EMF 長期作用對 WM 中 LFPs 網絡連接特性影響
為研究不同組別大鼠在達到 WM 任務正確率標準后，其 WM 責任腦區 PFC 的神經電活動是否存在差異，進一步對各組大鼠在 T 迷宮 WM 任務中延遲交替選擇階段的 LFPs 信號進行基于 DTF 的因果網絡構建及網絡連接特征分析。
如圖 2 所示，為不同組別大鼠在一次 WM 任務過程中，16 通道 θ 頻段信號的因果連接 DTF 矩陣經過統一歸一化處理后的結果圖。其中，橫軸和縱軸均代表通道數，矩陣中的每個元素對應從橫軸對應通道到縱軸對應通道的 DTF 值，即因果連接強度。歸一化后 DTF 取值越接近 1，則代表相應兩個通道之間的因果性連接越強。對比可知，對照組 DTF 矩陣中通道間強度較高的連接數目多于模型Ⅰ組和模型Ⅱ組；而模型Ⅱ組大鼠的因果連接 DTF 矩陣中通道間因果連接強度最弱，并且通道之間連接數目最少；模型Ⅰ組 DTF 矩陣中，通道間連接數目與對照組相比，未見明顯減少，但不同通道間的因果連接強度低于對照組，連接強度較高的通道數明顯減少。
圖2
不同組別大鼠 WM 任務中統一歸一化的 DTF 矩陣
Figure2.
Normalized DTF matrix of different groups during working memory tasks
為驗證上述結果的普遍性，隨機選取每組大鼠在 200 次（5 只/組，40 次/只）WM 任務過程中的 LFPs 信號進行分析。計算每次 WM 任務中各通道 LFPs 信號 θ 頻段間的 DTF 值，構建因果矩陣后，計算其平均 DTF 值、因果網絡連接密度和全局效率，并進一步進行統計學分析，結果如圖 3、圖 4 所示。
如圖 3 所示為不同組別大鼠在執行 WM 任務過程中，θ 頻段信號間的平均 DTF 值。由圖中可以看出，對照組的平均 DTF 值高于模型Ⅰ組（ K-S 檢驗，P < 0.05， n = 200）和模型Ⅱ組的平均 DTF 值（K-S 檢驗，P < 0.05， n = 200），差異具有統計學意義。同時模型Ⅰ組的平均 DTF 值與模型Ⅱ組的平均 DTF 值（K-S 檢驗，P < 0.05， n = 200）之間的差異也具有統計學意義。由于平均 DTF 值反映了信號間的平均因果連接強度，因此，隨著工頻 EMF 作用時間的增加，信號間的因果連接強度呈下降趨勢。
圖3
不同組別大鼠 WM 任務中平均 DTF 值（n = 200）
Figure3.
Comparisons of averaged DTF during WM task between different groups (n = 200)
進一步對不同組別大鼠在執行 WM 任務過程中的因果網絡連接密度和全局效率進行對比分析，結果如圖 4 所示。其中，對照組大鼠在執行 WM 任務過程中，因果網絡連接密度值略高于模型Ⅰ組，但差異不具有統計學意義（圖 4 左，K-S 檢驗，P < 0.05， n = 200）。而模型Ⅱ組的因果網絡連接密度值明顯小于對照組（圖 4 左，K-S 檢驗，P < 0.05， n = 200）和模型Ⅰ組（圖 4 左，K-S 檢驗，P < 0.05， n = 200），差異具有統計學意義。
由圖 4 右可以看出，對照組大鼠在執行 WM 過程中，LFPs 信號的全局效率值高于模型Ⅰ組（K-S 檢驗，P < 0.05， n = 200）和模型Ⅱ組（K-S 檢驗，P < 0.05， n = 200），差異具有統計學意義。同時模型Ⅰ組與模型Ⅱ組的全局效率值之間的差異也具有統計學意義（K-S 檢驗，P < 0.05， n = 200）。
圖4
不同組別大鼠 WM 過程中因果網絡連接密度和全局效率（n = 200）
Figure4.
Comparisons of network density and global efficiency during WM between different groups (n = 200)
3 討論與分析
本文通過對比分析工頻 EMF 長期作用模型組大鼠與對照組大鼠在 T 迷宮 WM 任務訓練過程中行為學表現，及訓練過程結束后延遲交替任務階段 PFC 腦區的 LFPs 信號 θ 頻段之間因果網絡連接特性的異同，探討工頻 EMF 長期作用對 WM 的影響。
本文研究結果顯示，工頻 EMF 作用 48 d 的模型Ⅱ組大鼠達到正確率標準所用天數多于對照組，兩者之間的差異具有統計學意義。工頻 EMF 作用 24 d 的模型Ⅰ組大鼠達到正確率標準所用天數與對照組以及模型Ⅱ組之間的差異不具有統計學意義。進一步對相同訓練次數下，不同組別大鼠執行 WM 任務的正確率進行對比，結果顯示：對照組大鼠達到正確率標準所需訓練次數少于模型Ⅰ組和模型Ⅱ組大鼠，模型Ⅰ組和模型Ⅱ組大鼠所需訓練次數基本相同（均約為 1 500 次）。以上結果說明，工頻 EMF 長時間作用對大鼠的大腦認知功能有抑制作用，且抑制作用效果與作用時間長短有關，但并非線性相關。例如，模型Ⅰ組大鼠、模型Ⅱ組大鼠及對照組大鼠達到 WM 任務正確率標準所用平均天數及訓練次數均不與工頻 EMF 作用天數呈線性相關。但由于本文的實驗設計的局限性，使得每組實驗動物的樣本量較少（5 只/組），因此，對行為學部分的分析結果，不具有較好的統計學意義，有待進一步的補充完善。
由于神經元是神經系統功能實現的基本單元，而神經元生理活動的直接體現為神經電活動信號：如 LFPs 信號和峰電位（spikes），因此，研究神經元電活動信號的特征模式對探索神經系統功能實現或障礙的機制具有重要意義。因此，本文中進一步對不同組別大鼠在 WM 過程中，LFPs 信號 θ 頻段的網絡連接特性變化進行分析，從神經網絡信息傳遞的角度探索工頻 EMF 長時間作用對 WM 的影響。
本文研究結果顯示，2 mT 工頻 EMF 長期作用，使大鼠在執行 WM 過程中，PFC 腦區不同位點 LFPs 信號 θ 頻段間的平均 DTF 值和全局效率降低。并且，隨著作用時間的增加，網絡連接密度值也呈下降趨勢。此外，分析結果顯示，在工頻 EMF 作用下，首先受到影響的是信號間的平均 DTF 值和全局效率，模型Ⅰ組和模型Ⅱ組大鼠在執行 WM 任務過程中因果網絡的平均 DTF 值及全局效率值均低于對照組，且差異具有統計學意義。而隨著工頻 EMF 作用時間的增加，可能導致大鼠 PFC 腦區不同位點信號間連接強度逐漸減弱直至消失，使得網絡連接數目減少，網絡連接密度值降低，因此，僅 2 mT 工頻 EMF 作用 48 d 的模型Ⅱ組大鼠的網絡連接密度值與對照組之間的差異具有統計學意義。
綜上所述，較高強度工頻 EMF 長期作用會抑制大鼠的 WM，且作用時間的增加可能使得 WM 受抑制程度增加。如工頻 EMF 作用 48 d 的模型Ⅱ組大鼠達到 WM 任務正確率標準所用平均天數多于模型Ⅰ組大鼠。此外，模型Ⅱ組大鼠在執行 WM 任務過程中，PFC 腦區不同位點 LFPs 信號 θ 頻段間因果網絡連接特征值也低于模型Ⅰ組大鼠。因此，工頻 EMF 長期作用影響 WM 的可能機制為：長期的工頻 EMF 作用，抑制了 WM 責任腦區不同位點信號間的連接強度，使得網絡全局效率降低，并影響大鼠的行為學表現。隨著作用時間的增加，進一步使得 PFC 腦區不同位點 LFPs 信號 θ 頻段間網絡連接密度值降低。LFPs 信號 θ 頻段間的平均 DTF 值和全局效率對 EMF 作用的影響較為敏感，所以有可能成為研究 EMF 作用影響神經系統功能的新方法之一。但工頻 EMF 長期作用對大鼠 WM 的抑制作用是否具有可逆性，以及這種可逆性的存在與否和 EMF 作用時間的長短是否相關，還需要進一步的探索。
引言
隨著電氣、電子設備在生活和工作中應用得日益廣泛和電磁環境的日益復雜，電磁場（electromagnetic field，EMF）作用是否對人類健康具有潛在影響的問題也受到越來越多的關注[1-2]。近年來，有文獻報道長期暴露于 EMF 下會造成中樞神經系統功能障礙。其中，腦部對 EMF 輻射最為敏感[3-4]。若大腦功能受損，將給人們的日常生活及工作帶來嚴重影響。因此，EMF 作用對大腦認知功能的影響，現已成為電磁生物效應研究領域廣泛關注的重要問題。
在我國，極低頻電磁場（extremely low frequency electromagnetic field，ELF-EMF）尤其是工頻 EMF 是人們在日常生活工作中接觸最頻繁的 EMF 類型之一，其具有作用持續時間長的特點。而某些職業受限于本身工作環境和性質的影響，使從事這些工作的人員面臨長時間處于相對較高強度的工頻 EMF 作用環境中。有研究表明，長期暴露在 ELF-EMF 中會對職業人群的心理狀態、作業能力產生明顯的影響，并與阿爾茨海默癥等神經退行性疾病的發生有關[5]。王東等[6]模擬職業工作場所 ELF-EMF 環境，將大鼠長時間暴露于其中后觀測其學習記憶行為，發現 ELF-EMF 暴露有可能損傷大鼠的記憶功能。因此，研究較高強度的工頻 EMF 長期作用對大腦認知功能是否產生影響及其潛在機制，能夠對長期處于較高強度工頻 EMF 環境中工作人員健康的保護提供參考。
在許多復雜認知功能的實現中，工作記憶（working memory，WM）起了十分重要的作用。WM 通常定義為對信息進行暫時存儲與處理的容量有限的記憶系統[7-8] ，其主要責任腦區之一為前額葉皮層（prefrontal cortex，PFC）。近年來，大量研究表明，PFC 中神經元的活動與 WM 功能的實現密切相關[9-10]。與動物相關的研究表明，在 WM 任務執行過程中，PFC 神經元電活動信號能夠編碼 WM[11-12]。而在 WM 功能障礙的大鼠 PFC 中，不同位點記錄所得局部場電位（local field potentials，LFPs）信號間網絡連接特征與 WM 功能正常的大鼠之間存在差異[13-14]，上述提及的 LFPs 信號是從大腦皮層、亞皮層或核團等區域記錄所得的微電極尖端附近興奮性和抑制性突觸電活動的總和[15]。以上研究也表明，神經元作為神經系統功能實現的基本單元，其電生理活動直接與神經系統功能相關。因此，將神經電生理與行為學相結合進行研究，有望為進一步探索 EMF 作用對神經系統功能影響的機制提供理論支持。
基于此，本文選取斯普拉格·道利（Sprague-Dawley，SD）大鼠作為研究對象，搭建了頻率為 50 Hz、強度為 2 mT 的工頻 EMF 環境，可長期施加于 SD 大鼠。然后運用在體植入式微電極陣列記錄技術，記錄和獲取置于 2 mT 工頻 EMF 中作用 24 d 的模型Ⅰ組 SD 大鼠、置于 2 mT 工頻 EMF 中作用 48 d 的模型Ⅱ組 SD 大鼠，以及未經 2 mT 工頻 EMF 作用的對照組 SD 大鼠的 WM 責任腦區——PFC 的 16 通道 LFPs 信號。隨后，應用基于定向傳遞函數（directed transfer function，DTF）算法的頻域格蘭杰因果分析方法，構建 LFPs 信號因果連接網絡；并進一步對比模型Ⅰ組、模型Ⅱ組與對照組 SD 大鼠在 WM 過程中 LFPs 信號的網絡連接特征的異同。本研究期望能夠從神經網絡信息傳遞的角度揭示工頻 EMF 作用影響大腦認知功能的可能機制，并為進一步研究其作用機制提供重要的支持。
1 材料與方法
1.1 構建工頻 EMF 作用的大鼠模型
本實驗使用雄性成年 SD 大鼠共 15 只（300～350 g），購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，將其隨機分為 3 組（模型Ⅰ組、模型Ⅱ組及對照組），每組 5 只。其中，模型Ⅰ組是將 SD 大鼠置于 2 mT 工頻 EMF 中作用 24 d，每天連續作用 8 h；模型Ⅱ組是將 SD 大鼠置于 2 mT 工頻 EMF 中作用 48 d，每天連續作用 8 h；對照組 SD 大鼠未經 2 mT 工頻 EMF 作用。
1.2 微電極陣列植入
使用戊巴比妥鈉對本文實驗 SD 大鼠進行麻醉，腹腔注射劑量為 30～50 mg/kg。待大鼠麻醉后，將其固定于腦立體定位儀（51670，Stoelting，美國）上。沿矢狀方向切開大鼠頭部皮膚，并去除皮下結締組織，使顱骨暴露。在責任腦區——PFC 附近區域的顱骨上固定 3～4 顆不銹鋼螺釘，用作參考和接地電極。去除 PFC 上方部分顱骨后，植入 16 通道微電極陣列（2 × 8，Plexon，美國），以便采集 PFC 神經電活動信號。PFC 定位為前囟前 2.5～4.5 mm，旁開 0.2～1.0 mm，深度為距離皮層表面 2.5～3.5 mm。在電極到達責任腦區 PFC 后，使用牙科水泥進行包埋固定。大鼠在進行微電極陣列植入手術后，給予 3～5 d 的修養期予以恢復。然后，對 SD 大鼠進行如下文 1.3 小節所示的“T 迷宮 WM 任務”訓練，并獲取 WM 任務過程中大鼠 PFC 的 16 通道 LFPs 信號。
1.3 T 迷宮 WM 任務
T 迷宮 WM 行為學實驗，是一種應用基于食物獎勵的延遲交替任務對 WM 功能進行檢測的行為學檢測方法。本文使用的“T 迷宮”由一個起始臂（臂端為起始區域）和兩個目標臂（臂端分別放置食槽，食槽內可放置食物作為獎勵）組成。
本實驗中，將 SD 大鼠置于 T 迷宮中進行兩天的適應環境訓練（30 min/次，2 次/d）。在此過程中，大鼠可以在迷宮中自由活動、探索。隨后，對大鼠進行 WM 任務訓練（20 次/d）。任務過程簡述如下：每次 WM 任務均包括自由選擇和延遲交替選擇兩個階段。首先為自由選擇階段，在此過程中，大鼠從起始區域出發后，進入兩目標臂中的任意一個，均可獲得食物獎勵。隨后，大鼠回到起始區域，并等待 5 s 后，開始延遲交替選擇任務階段。在此過程中，大鼠必須選擇與自由選擇階段不同的目標臂，才可視為正確執行此次 WM 任務，并獲得食物獎勵。反之，則視為錯誤執行 WM 任務，最終無法獲得食物獎勵。當正確率連續兩天達到 80% 以上時，視為大鼠達到正確率標準，訓練過程結束。
此后，大鼠每天進行兩次 WM 任務檢測（20～30 min/次）。實驗結束后，對不同組別大鼠相同訓練次數下取得的正確率進行對比。
1.4 LFPs 信號獲取及網絡構建
T 迷宮 WM 任務訓練過程結束后，在大鼠執行 T 迷宮 WM 任務檢測的同時，應用在體多通道神經信號采集系統（OmniPlex/128，Plexon，美國），獲取大鼠在 T 迷宮 WM 任務過程中 PFC 神經電活動信號，并進行 0.3～500 Hz 的低通濾波，得到 16 通道的 LFPs 信號（采樣頻率：1 kHz）。由于 LFPs 信號的 θ 頻段（4～12 Hz）為 WM 的主要相關頻段[16]，因此本文將其選取為主要研究對象，即將 0～500 Hz LFPs 信號經過帶通濾波后得到其 θ 頻段信號以構建網絡。
隨后，應用基于 DTF 的頻域格蘭杰因果分析方法，對不同組別 SD 大鼠在執行 WM 任務過程中延遲交替選擇任務階段的 LFPs 信號進行分析。基于各通道 LFPs 之間的 DTF 值構建矩陣，研究模型Ⅰ組、模型Ⅱ組和對照組大鼠 WM 責任腦區 PFC 的 LFPs 因果網絡特征模式，其原理及計算步驟如式（1）～式（6）所示。
基于 n 個通道的 LFPs 時間序列建立多變量自回歸（multivariate autoregressive，MVAR）模型，設 n 個通道的時間序列信號為如式（1）所示：
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其中 Xn 是第 n 通道的時間序列。
構建 MVAR 模型，如式（2）所示：
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其中，E（t）為估計誤差，
為系數矩陣，p 為通過貝葉斯信息準則（Bayesian information criteria，BIC）估計的 MVAR 模型階數。
MVAR 模型經傅里葉變換轉換到頻域，如式（3）所示：
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其中，f 表示頻率，A 是頻域系數矩陣，H（f）是傳遞矩陣，可以表示為如式（4）所示：
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基于傳遞矩陣 H，從通道 j 到通道 i 的因果連接值 rij（f）定義如式（5）所示：
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其中，k 為總通道數。當i ≠ j時，rij 越大說明通道 j 與通道 i 的因果連接程度越強，反之則越弱。當i = j時，rij 為 0。
基于此，WM 過程中 LFPs θ 頻段信號構建的 DTF 連接矩陣［以符號 DTF（f）表示］，定義如式（6）所示：
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1.5 基于 DTF 的 LFPs 信號網絡連接特性分析
為進一步對比分析不同組別大鼠在執行 WM 過程中 LFPs 信號網絡連接特性的異同，本文選取基于圖論的網絡連接密度（以符號 D 表示）和全局效率（以符號 Eglobal 表示）來定量表征網絡連接特性。
首先，引入最短路徑長度（以符號 Lij 表示）的概念，其定義為：將每一個通道作為一個節點，求取 DTF 矩陣中各非零元素的倒數值，作為網絡不同節點之間的最短路徑長度。最短路徑長度 Lij 可以表示為如式（7）所示：
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當 rij 為 0 時，通道 j 與通道 i 之間的因果連接為無效連接，因此當 rij 為 0 時，最短路徑長度 Lij 不存在。
在上述基礎上，進一步求取網絡連接密度和全局效率。其中網絡連接密度反應了網絡中節點之間連接的緊密程度，節點之間的連接數目越多、強度越大，網絡連接密度越大[17]，其定義如式（8）所示：
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其中，N 表示通道數，K 表示網絡中所有節點之間實際存在的最短路徑的數目。連接密度的取值范圍為0 ≤ D ≤ 1。當網絡連接狀態為理想情況時，即每個節點與網絡中其余節點之間均存在最短路徑時，連接密度取最大值為 1。
全局效率指的是一個網絡中各節點之間最短路徑長度的調和平均數的倒數，它是衡量網絡對信息的總體傳輸能力全局指標[18]。全局效率越高，網絡節點之間傳遞信息的速率越快，全局效率 Eglobal 如式（9）所示：
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其中，N 表示節點數，Lij 為節點 i 與 j 之間最短路徑長度。Eglobal 的取值范圍為 [0，1][19-20]。
1.6 統計分析
本文中所得實驗數據均以均值 ± 標準差表示，采用科克倫 Q（cochran Q）檢驗對不同組別大鼠在相同訓練次數（每組大鼠每訓練 100 次為一組對比數據，5 只/組，20 次/只）下執行 WM 任務的正確率進行統計學分析，采用柯爾莫可洛夫-斯米洛夫（kolmogorov-smirnov，K-S）檢驗對不同組別大鼠達到 WM 任務正確率標準所用天數進行統計學分析。此外，在 WM 任務執行正確率到達 80% 以后，隨機選取每只大鼠 40 次 WM 任務過程中的 LFPs 信號，構建其 θ 頻段因果網絡。隨后應用 K-S 檢驗對不同組別大鼠在執行 WM 任務中 LFPs 信號 θ 頻段因果網絡的平均 DTF 值、因果網絡連接密度和全局效率進行統計學分析，以判斷不同組別大鼠 WM 任務過程中因果網絡連接特征值間的差異是否具有統計學意義。當概率值 P < 0.05 時，認為不同組別數據間的差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 工頻 EMF 長期作用對大鼠 T 迷宮 WM 任務正確率的影響
對不同組別大鼠達到 WM 任務正確率標準所用天數進行對比分析，結果顯示，模型Ⅱ組大鼠達到正確率標準所用天數為 d =（12.4 ± 3.0） d，與對照組大鼠達到正確率標準所用天數 d =（7.2 ± 2.4） d 之間的差異性具有統計學意義（K-S 檢驗，P < 0.05， n = 5）。模型Ⅰ組大鼠所用天數為 d =（11 ± 4.8） d，與對照組和模型Ⅱ組之間的差異均不具有統計學意義（K-S 檢驗，P > 0.05， n = 5）。
進一步對相同訓練次數下，不同組別大鼠執行 WM 任務的正確率進行對比，統計不同組別大鼠從訓練開始至訓練過程結束每經過 100 次訓練（5 只/組，20 次/只）WM 任務正確率的變化。結果如圖 1 所示，在訓練初始時，即每組前 100 次訓練，模型Ⅰ組與模型Ⅱ組執行 WM 任務的正確率均高于對照組（Cochran Q 檢驗，P < 0.05， n = 100）。隨著訓練次數的增加，對照組的正確率迅速增加，在 500 次訓練后，相同訓練次數下對照組的正確率高于模型Ⅰ組與模型Ⅱ組的正確率。并且對照組的正確率率先達到正確率標準（約 1 200 次訓練后）。與對照組相比，模型Ⅰ組、模型Ⅱ組大鼠均需要經歷更多的訓練次數（約 1 500 次）才能達到正確率標準；而模型Ⅰ組與模型Ⅱ組達到正確率標準所需訓練次數基本相同（均為 1 500 次左右）。
圖1
不同組別大鼠 T 迷宮 WM 任務正確率對比
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此結果表明，工頻 EMF 長期作用使大鼠在 T 迷宮 WM 任務訓練階段達到正確率標準所用天數更多，所需訓練次數也更多。同時，結果分析顯示，模型Ⅰ組與模型Ⅱ組大鼠達到 WM 任務正確率標準所用天數之間的差異不具有統計學意義，所需訓練次數基本相同。
2.2 工頻 EMF 長期作用對 WM 中 LFPs 網絡連接特性影響
為研究不同組別大鼠在達到 WM 任務正確率標準后，其 WM 責任腦區 PFC 的神經電活動是否存在差異，進一步對各組大鼠在 T 迷宮 WM 任務中延遲交替選擇階段的 LFPs 信號進行基于 DTF 的因果網絡構建及網絡連接特征分析。
如圖 2 所示，為不同組別大鼠在一次 WM 任務過程中，16 通道 θ 頻段信號的因果連接 DTF 矩陣經過統一歸一化處理后的結果圖。其中，橫軸和縱軸均代表通道數，矩陣中的每個元素對應從橫軸對應通道到縱軸對應通道的 DTF 值，即因果連接強度。歸一化后 DTF 取值越接近 1，則代表相應兩個通道之間的因果性連接越強。對比可知，對照組 DTF 矩陣中通道間強度較高的連接數目多于模型Ⅰ組和模型Ⅱ組；而模型Ⅱ組大鼠的因果連接 DTF 矩陣中通道間因果連接強度最弱，并且通道之間連接數目最少；模型Ⅰ組 DTF 矩陣中，通道間連接數目與對照組相比，未見明顯減少，但不同通道間的因果連接強度低于對照組，連接強度較高的通道數明顯減少。
圖2
不同組別大鼠 WM 任務中統一歸一化的 DTF 矩陣
Figure2.
Normalized DTF matrix of different groups during working memory tasks
為驗證上述結果的普遍性，隨機選取每組大鼠在 200 次（5 只/組，40 次/只）WM 任務過程中的 LFPs 信號進行分析。計算每次 WM 任務中各通道 LFPs 信號 θ 頻段間的 DTF 值，構建因果矩陣后，計算其平均 DTF 值、因果網絡連接密度和全局效率，并進一步進行統計學分析，結果如圖 3、圖 4 所示。
如圖 3 所示為不同組別大鼠在執行 WM 任務過程中，θ 頻段信號間的平均 DTF 值。由圖中可以看出，對照組的平均 DTF 值高于模型Ⅰ組（ K-S 檢驗，P < 0.05， n = 200）和模型Ⅱ組的平均 DTF 值（K-S 檢驗，P < 0.05， n = 200），差異具有統計學意義。同時模型Ⅰ組的平均 DTF 值與模型Ⅱ組的平均 DTF 值（K-S 檢驗，P < 0.05， n = 200）之間的差異也具有統計學意義。由于平均 DTF 值反映了信號間的平均因果連接強度，因此，隨著工頻 EMF 作用時間的增加，信號間的因果連接強度呈下降趨勢。
圖3
不同組別大鼠 WM 任務中平均 DTF 值（n = 200）
Figure3.
Comparisons of averaged DTF during WM task between different groups (n = 200)
進一步對不同組別大鼠在執行 WM 任務過程中的因果網絡連接密度和全局效率進行對比分析，結果如圖 4 所示。其中，對照組大鼠在執行 WM 任務過程中，因果網絡連接密度值略高于模型Ⅰ組，但差異不具有統計學意義（圖 4 左，K-S 檢驗，P < 0.05， n = 200）。而模型Ⅱ組的因果網絡連接密度值明顯小于對照組（圖 4 左，K-S 檢驗，P < 0.05， n = 200）和模型Ⅰ組（圖 4 左，K-S 檢驗，P < 0.05， n = 200），差異具有統計學意義。
由圖 4 右可以看出，對照組大鼠在執行 WM 過程中，LFPs 信號的全局效率值高于模型Ⅰ組（K-S 檢驗，P < 0.05， n = 200）和模型Ⅱ組（K-S 檢驗，P < 0.05， n = 200），差異具有統計學意義。同時模型Ⅰ組與模型Ⅱ組的全局效率值之間的差異也具有統計學意義（K-S 檢驗，P < 0.05， n = 200）。
圖4
不同組別大鼠 WM 過程中因果網絡連接密度和全局效率（n = 200）
Figure4.
Comparisons of network density and global efficiency during WM between different groups (n = 200)
3 討論與分析
本文通過對比分析工頻 EMF 長期作用模型組大鼠與對照組大鼠在 T 迷宮 WM 任務訓練過程中行為學表現，及訓練過程結束后延遲交替任務階段 PFC 腦區的 LFPs 信號 θ 頻段之間因果網絡連接特性的異同，探討工頻 EMF 長期作用對 WM 的影響。
本文研究結果顯示，工頻 EMF 作用 48 d 的模型Ⅱ組大鼠達到正確率標準所用天數多于對照組，兩者之間的差異具有統計學意義。工頻 EMF 作用 24 d 的模型Ⅰ組大鼠達到正確率標準所用天數與對照組以及模型Ⅱ組之間的差異不具有統計學意義。進一步對相同訓練次數下，不同組別大鼠執行 WM 任務的正確率進行對比，結果顯示：對照組大鼠達到正確率標準所需訓練次數少于模型Ⅰ組和模型Ⅱ組大鼠，模型Ⅰ組和模型Ⅱ組大鼠所需訓練次數基本相同（均約為 1 500 次）。以上結果說明，工頻 EMF 長時間作用對大鼠的大腦認知功能有抑制作用，且抑制作用效果與作用時間長短有關，但并非線性相關。例如，模型Ⅰ組大鼠、模型Ⅱ組大鼠及對照組大鼠達到 WM 任務正確率標準所用平均天數及訓練次數均不與工頻 EMF 作用天數呈線性相關。但由于本文的實驗設計的局限性，使得每組實驗動物的樣本量較少（5 只/組），因此，對行為學部分的分析結果，不具有較好的統計學意義，有待進一步的補充完善。
由于神經元是神經系統功能實現的基本單元，而神經元生理活動的直接體現為神經電活動信號：如 LFPs 信號和峰電位（spikes），因此，研究神經元電活動信號的特征模式對探索神經系統功能實現或障礙的機制具有重要意義。因此，本文中進一步對不同組別大鼠在 WM 過程中，LFPs 信號 θ 頻段的網絡連接特性變化進行分析，從神經網絡信息傳遞的角度探索工頻 EMF 長時間作用對 WM 的影響。
本文研究結果顯示，2 mT 工頻 EMF 長期作用，使大鼠在執行 WM 過程中，PFC 腦區不同位點 LFPs 信號 θ 頻段間的平均 DTF 值和全局效率降低。并且，隨著作用時間的增加，網絡連接密度值也呈下降趨勢。此外，分析結果顯示，在工頻 EMF 作用下，首先受到影響的是信號間的平均 DTF 值和全局效率，模型Ⅰ組和模型Ⅱ組大鼠在執行 WM 任務過程中因果網絡的平均 DTF 值及全局效率值均低于對照組，且差異具有統計學意義。而隨著工頻 EMF 作用時間的增加，可能導致大鼠 PFC 腦區不同位點信號間連接強度逐漸減弱直至消失，使得網絡連接數目減少，網絡連接密度值降低，因此，僅 2 mT 工頻 EMF 作用 48 d 的模型Ⅱ組大鼠的網絡連接密度值與對照組之間的差異具有統計學意義。
綜上所述，較高強度工頻 EMF 長期作用會抑制大鼠的 WM，且作用時間的增加可能使得 WM 受抑制程度增加。如工頻 EMF 作用 48 d 的模型Ⅱ組大鼠達到 WM 任務正確率標準所用平均天數多于模型Ⅰ組大鼠。此外，模型Ⅱ組大鼠在執行 WM 任務過程中，PFC 腦區不同位點 LFPs 信號 θ 頻段間因果網絡連接特征值也低于模型Ⅰ組大鼠。因此，工頻 EMF 長期作用影響 WM 的可能機制為：長期的工頻 EMF 作用，抑制了 WM 責任腦區不同位點信號間的連接強度，使得網絡全局效率降低，并影響大鼠的行為學表現。隨著作用時間的增加，進一步使得 PFC 腦區不同位點 LFPs 信號 θ 頻段間網絡連接密度值降低。LFPs 信號 θ 頻段間的平均 DTF 值和全局效率對 EMF 作用的影響較為敏感，所以有可能成為研究 EMF 作用影響神經系統功能的新方法之一。但工頻 EMF 長期作用對大鼠 WM 的抑制作用是否具有可逆性，以及這種可逆性的存在與否和 EMF 作用時間的長短是否相關，還需要進一步的探索。
