雙組分快速固化生物軟組織黏合劑的研制_《生物醫學工程學雜志》

作者：

黃娟 ¹ , 李浩榕 ² ,  王謙 ²

1. 浙江理工大學生命科學學院（杭州 310018）;
2. 中國科學院理化技術研究所杭州研究院（杭州 310018）;

關鍵詞：

貽貝足絲蛋白透明質酸黏附蛋白層層組裝快速固化

DOI：

10.7507/1001-5515.201805045

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摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

貽貝足絲蛋白（MFp）是一類能夠在水下迅速固化，并能黏附在不同基材表面的特殊蛋白質，作為蛋白類生物黏合劑具有廣泛的應用前景。本文在大腸桿菌中高效可溶性地表達了貽貝足絲融合蛋白 Sumo-Fp3（SFp3），并通過蘑菇酪氨酸酶在柱催化，將其中約 5% 的酪氨酸殘基轉化為 DOPA。在含 DOPA 的 SFp3（DSFp3）中加入分子量為 1 500 kD 的透明質酸后，形成的雙組分生物膠水在牛皮表面的黏附力超過氰基丙烯酸鹽組織粘合劑Dermabond^®的兩倍，并在 5 min 內達到最大黏附強度的 52% 。通過生物膜層干涉技術和掃描電子顯微鏡，觀測到透明質酸與 DSFp3 存在靜電層層組裝行為，并形成緊密片層結構。本研究為蛋白質類生物膠水黏附強度低、固化慢提供了一種解決方法和理論基礎。

引用本文： 黃娟, 李浩榕, 王謙. 雙組分快速固化生物軟組織黏合劑的研制. 生物醫學工程學雜志, 2018, 35(6): 921-927. doi: 10.7507/1001-5515.201805045 復制

引言

醫用軟組織黏合劑使用方便，能快速封閉切口或創口，在眼科、心臟修補、血管等手術中具有極其顯著的優勢^[1]。醫用組織黏合劑可分為化學類和生物類。化學類組織黏合劑以氰基丙烯酸酯類黏合劑為代表，氰基丙烯酸酯類化合物（cyanoacrylate）的極性基團產生誘導效應，使 β 位的碳原子有很強的吸電效應，在水、蛋白質的存在下能迅速發生陰離子聚合，短時間內即可形成較強粘結^[2]。Dermabond^?（2-octyl cyanoacrylate）即是基于氰基丙烯酸酯類的常用黏合劑，其毒性較小，易于使用，3.6 min 可閉合皮膚^[3-4]。盡管 Dermabond^?能夠快速固化，黏合性能強，但仍具有一定的臨床風險，如炎癥反應、異物反應以及促進腫瘤發展等^[5-6]。與化學類組織黏合劑相比，生物軟組織黏合劑具有臨床不良反應少、組織相容性更好以及體內可降解的優點，因而一直是研究熱點。

生物軟組織黏合劑主要分為蛋白類黏合劑和多糖類黏合劑。纖維蛋白黏合劑是最常用的蛋白類黏合劑，臨床上主要用于止血，也可用于吻合周圍神經和固定移植皮膚。纖維蛋白黏合劑由纖維蛋白原和凝血酶組成，纖維蛋白原被凝血酶切后，釋放出纖維蛋白 A 肽及 B 肽，纖維蛋白結合形成多聚體凝塊封閉創口，并發揮止血的作用。人纖維蛋白黏合劑主要對人血漿進行分離純化獲得，受限于血漿供給，還有傳播血液疾病的風險^[7]。

貽貝足絲蛋白（mussel foot proteins，MFP）是極具潛力的生物軟組織黏合劑候選蛋白分子。貽貝足絲蛋白使貽貝在海水中持久且高強度地黏附于各種材料表面，例如鋼鐵、巖石、特氟龍等材料表面^[8]。從貽貝中提取的天然足絲蛋白，在豬小腸黏膜上的黏附強度是氰基丙烯酸辛酯黏合劑的兩倍^[9]。足絲蛋白 3（foot protein 3，Fp3）是主要的界面黏附蛋白之一，并具有最小的分子量和較高的二羥苯丙氨酸（DOPA）含量^[10]。然而 Fp3 蛋白可溶性較差，限制了重組蛋白的研究及應用^[11]。因此，科學家們將水溶性強的蛋白質與 Fp3 融合表達，以增加水溶性。

此外，透明質酸（35 kD）能與 Fp131 融合蛋白（在 Fp3 的 N 端和 C 端各有 6 個 Fp1 的 10 肽重復序列）結合，形成直徑為 5～20 μm 的囊泡結構，使復合物的黏附強度增加了 1.1 倍^[2-11]。雖然該復合物固化時間長達 24 h，較難應用于臨床，但為研發高性能生物軟組織黏合劑提供了新的思路。

透明質酸是由重復雙糖單位組成的酸性黏多糖，糖鏈長度決定了不同分子量的透明質酸黏彈性、流動性等基本屬性^[12]。為了提高蛋白類黏合劑的黏合強度和加快其固化速度，我們重組表達了融合蛋白 SFp3（Sumo-Fp3）并系統研究 SFp3 與不同分子量的透明質酸形成的二組分的黏合劑的性能。為了更直觀地考察含 DOPA 的 SFp3 和透明質酸的相互作用，我們采用生物膜層干涉技術實時監測其結合過程，利用掃描電子顯微鏡觀察固化后的微觀結構。本研究在機制和實效上有助于實現具有快速固化和高強度黏附能力的蛋白-多糖雙組分黏合劑。

1 材料和方法

1.1 試劑

大腸桿菌表達載體 pE-Sumo 購自 LifeSensors 公司；克隆菌種 E. coliDH5α、BL21（DE3）、質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒購自 TIANGEN 公司；核酸聚合酶，限制性內切酶 BsaⅠ、XhoⅠ購自 NEB 公司；DNA Ligation Kit Ver.2.1 購自 Takara 公司；基因和引物合成、核酸測序委托 Genewiz 公司；Ni-NTA 親和層析柱購自 BioRad 公司；蘑菇酪氨酸酶購自 Sigma 公司；透明質酸購自華熙福瑞達生物醫藥有限公司。

1.2 SFp3 重組表達載體的構建

根據紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）Fp3 成熟肽的基因序列（GenBank 數據庫編號：AB049579）分別設計正、反向引物。在正向 Fp3-F 引物的 5＇端加入酶切位點 BsaⅠ；在反向 Fp3-R 引物的 5＇端加入酶切位點 XhoⅠ。引物序列如下，Fp3-F：GGTCTCAAGG TGCCGATTATTATGGC；Fp3-R：CCGCTCGAGTCATTATTAATGATGGTGATGATGG。PCR 擴增反應循環為：98℃ 預變性 2 min；98℃ 變性 10 s；58℃ 退火 30 s；72℃ 延伸 2 min；循環 35 次。擴增產物用試劑盒純化后，和表達載體 pE-Sumo 以 BsaⅠ和 XhoⅠ雙酶切，用 DNA Ligation Kit Ver.2.1 連接后轉化至 DH5α 感受態細胞中，涂布于含氨芐青霉素抗性的 LB 平板上，挑取陽性單克隆測序驗證。

1.3 重組 SFp3 蛋白的表達、純化及后修飾

將測序鑒定的 pE-Sumo/Fp3 質粒轉化至 BL21（DE3）感受態細胞中，涂布于含氨芐青霉素抗性的 LB 平板上，挑取陽性單克隆在 LB 培養基中過夜培養。菌液按照 1∶100 進行擴大培養，在菌液 OD₆₀₀ 為 0.5～0.6 時加入異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG，1 mmol/L）進行誘導。16℃ 誘導過夜后，離心收菌，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌菌體。裂解液（300 mmol/L NaCl，100 mmol/L PBS，1% triton X100，pH 7.4）重懸菌體，冰浴超聲破碎，離心棄沉淀。上清加入已平衡的鎳柱，以清洗液 A（100 mmol/L 咪唑，100 mmol/L PBS，pH 7.4）清洗鎳柱。用 PBS 洗柱后，加入 0.5 g/L 蘑菇酪氨酸酶（20 mmol/L 硼酸鈉，100 mmol/L PBS，100 mmol/L 抗壞血酸，pH 7.0）室溫孵育 3 h。清洗液 A 清洗，洗脫液 B（500 mmol/L 咪唑，100 mmol/L PBS，pH 5.0）洗脫目的蛋白。5% 醋酸溶液透析，并用 3 kD 超濾離心管濃縮蛋白樣品至約 70 g/L。

采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用儀（美國，Waters，ACQUITY^TIMUPLC&Q-TOF MS Premier）檢測標準溶液中酪氨酸和 DOPA 的保留時間及提取離子峰面積。相同色譜、質譜條件下分析 SFp3 蛋白酸水解產物，根據提取離子峰面積計算游離酪氨酸和 DOPA 的含量。

1.4 Zeta 電位測定

采用納米激光粒度儀（奧地利，Anton Paar，Litesizer 500）測定 0.1 g/L 透明質酸或 SFp3 溶液（pH 3、5、7）的 Zeta 電位。

1.5 萬能材料測試機檢測黏附強度

將聚四氟乙烯膜分割為 10 mm × 25 mm 小塊，并標出 10 mm × 10 mm 的待粘結區域。在兩塊聚四氟乙烯膜的粘結區域分別加入 100 μg 不含 DOPA 的 SFp3 和含 DOPA 的 SFp3，醋酸鈉緩沖溶液調整總體積至 30 μL，交疊涂勻，放置于溫度 37℃、相對濕度 70%～80% 的孵育箱中固化。萬能材料測試機（美國，Instron，5966）負載單元為 500 N，拉伸速率 10 mm/min。測試樣本數為 3（n = 3）。

將牛皮分割為 10 mm × 25 mm 小塊，并標出 10 mm × 10 mm 的待粘結區域。在兩塊牛皮的粘結區域分別加入含 DOPA 的 SFp3 和 HA，醋酸鈉緩沖溶液調整總體積至 30 μL，交疊涂勻，放置于溫度 37℃、相對濕度 70%～80% 的孵育箱中固化。相同步驟處理涂布有等體積 Dermabond^?的牛皮或者四氟乙烯膜。萬能材料測試機負載單元為 500 N，拉伸速率 10 mm/min。測試樣本數為 3（n = 3）。

1.6 分子相互作用儀研究層層組裝行為

分子相互作用儀（美國，Pall ForteBio，OctetK2）含 DOPA 的 SFp3 溶液（1 g/L，pH 5）中加入 NHS-PEG4-Biotin 室溫孵育 1 h，進行蛋白生物素修飾。親和素標記的檢測器放置在純水中 15 min，清潔表面。將清潔后的檢測器放入生物素修飾的 DSFp3 溶液（1 g/L，pH 5）中結合 10 min，再放入醋酸鈉緩沖液（100 mmol/L，pH 5）清洗 60 s。然后將檢測器放入分子量分別為 8 kD 或 1 500 kD 的 HA 溶液（0.4 g/L）中，結合 60 s 后，再放入醋酸鈉緩沖液（100 mmol/L，pH 5）清洗 60 s。將已結合透明質酸的檢測器放入 DSFp3 溶液（1 g/L，pH 5）中結合 60 s，再放入醋酸鈉緩沖液（100 mmol/L，pH 5）清洗 60 s。有序重復上述步驟，逐層結合透明質酸或 SFp3。

1.7 掃描電鏡觀察表面結構

濃度約 70 g/L 含 DOPA 的 SFp3（DSFp3）溶液在 37℃ 固化 3 h，形成淡黃色凝膠。將該凝膠涂布在銅片表面，掃描電子顯微鏡（日本，Hitachi，SU3500）觀察凝膠結構。取 10 mm 寬紙條，兩末端分別涂布 DSFp3（100 μg）和 HA（1 500 kD，25 μg），立刻混合兩末端的物質，約 30 s 后分開，紙條的兩表面間形成絲狀。采用掃描電子顯微鏡觀察黏絲截面形貌。

1.8 統計學處理

應用 SPSS 16.0 進行統計學分析，實驗數據用平均值 ± 標準差表示，兩組間比較采用 t 檢驗，P < 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SFp3 的重組表達、純化和修飾

由于溶解性差和部分區域不具備固定結構，貽貝足絲蛋白的重組表達一直是個難題。我們首先嘗試了在大腸桿菌中直接表達貽貝足絲蛋白 Fp3，但是沒有檢測到明顯的可溶表達。Sumo 蛋白標簽具有促溶能力，因此將 Sumo 融合在 Fp3 基因序列的 N 端，以增加融合蛋白的可溶性。在大腸桿菌菌株 BL21（DE3）中表達后，可溶性重組 SFp3 融合蛋白約為總蛋白的 7%。經 Sumo 蛋白 N 端的 His 6 標簽親和層析純化后，SFp3 產率約為 3 mg/L。Tris-Tricine SDS-PAGE 凝膠電泳（見圖 1a）中，SFp3 遷移位置約為 23 kD，形成了一條清晰不拖尾的條帶，說明 SFp3 可溶性好且穩定。我們也嘗試了用 Sumo 蛋白酶降解 SFp3，SDS-PAGE 分析顯示酶解后生成了 Sumo 標簽蛋白（約 17 kD）和 Fp3 產物（約 7 kD）（見圖 1b）。

圖1 Tris-Tricine SDS-PAGE 考馬斯亮藍鑒定 SFp3 的表達和純化

a. 在大腸桿菌中表達并純化 SFp3 重組蛋白。泳道 1：全菌裂解樣品；泳道 2：親和純化獲得的 SFp3 蛋白。b. 蛋白酶切驗證 SFp3。泳道 1：蛋白 marker；泳道 2：SFp3 蛋白；泳道 3：SUMO 蛋白酶消化 SFp3 蛋白，形成兩條新的蛋白條帶

Figure1. Tris-Tricine SDS-PAGE with Coomassie brilliant blue staining to analyze SFp3 expression and purification

a. purification of recombinant SFp3 from E. coli BL21. Lane 1: whole-cell lysate; Lane 2: purified SFp3. b. enzyme digestion analysis of SFp3 by SUMO protease 1. Lane 1: protein marker; Lane 2: SFp3 before digestion; Lane 3: SFp3 digested by SUMO protease 1

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DOPA 是貽貝足絲蛋白產生黏性的重要分子基礎。為了將重組蛋白中的酪氨酸殘基轉化為 DOPA，我們采用了蘑菇酪氨酸酶催化的方法。pH 值在 5～7 時，蘑菇酪氨酸酶的活力較高。Fp3 蛋白在 pH 5～7 的緩沖液中溶解性 < 0.1 g/L，而 SFp3 在 pH 5 的醋酸鈉緩沖液中溶解性 > 1 g/L，因此選擇 SFp3 進行后續試驗。根據文獻報道，將蘑菇酪氨酸酶與 SFp3 在溶液中孵育，結果顯示 DOPA 轉化效率極低，且難以將蘑菇酪氨酸酶分離。于是建立了在柱催化方法：將 SFp3 結合在 Ni-NTA 親和樹脂上，采用蘑菇酪氨酸酶催化，沖洗分離酪氨酸酶，然后洗脫 SFp3。這樣能夠成功獲得 DSFp3 重組蛋白。為了鑒定 DOPA 的含量，DSFp3 經酸解后，通過超高效液相色譜—四極桿飛行時間質譜法測定溶液中游離酪氨酸和 DOPA 含量，結果表明約 5% 酪氨酸殘基轉化為 DOPA。此轉化效率與文獻中蘑菇酪氨酸酶催化其他貽貝足絲融合蛋白的效率接近 ^[13]。

2.2 SFp3 和透明質酸構成的雙組分黏合劑的性能測試

我們首先測試了 SFp3 在 DOPA 修飾前后的黏合能力。萬能材料測試機是檢測黏附強度的常用儀器之一，可以在不同的基材表面上進行檢測，例如骨骼、皮膚、金屬和塑料等（見圖 2a）。聚四氟乙烯常用于炊具和醫療器械的防粘涂層，可用于靈敏地檢測黏合劑。結果表明，未修飾的 SFp3 幾乎不能粘結聚四氟乙烯膜。然而，經蘑菇酪氨酸酶催化轉化后的 DSFp3 在聚四氟乙烯膜上的黏附強度測量為（0.036 ± 0.007）MPa。因此，酪氨酸轉化為 DOPA 顯著增強了 SFp3 的黏附能力，與文獻報道的結果一致^[11-13]。

DSFp3 在 37℃ 固化 3 h 能形成淡黃色黏性凝膠。為了提高黏合性能和縮短固化時間，在其中添加了透明質酸。由于聚四氟乙烯膜自身的強度低，不能承受較高的拉伸力，同時也為了測試表面更接近皮膚，我們使用牛皮作為黏合劑的測試基材。當僅使用透明質酸的時候，牛皮不能被粘結。只有 DSFp3 與透明質酸混合才能粘合牛皮，證明 DSFp3 是粘結的必須組分。為了獲得透明質酸與 DSFp3 的最佳質量比，我們改變了體系中透明質酸的質量并測量黏附強度（見圖 2b）。當 DSFp3 與透明質酸質量比為 4∶1 時，牛皮的黏附強度達到最大值（0.22 ± 0.03）MPa。繼續增加透明質酸質量，膠水的黏附強度無顯著變化。

進一步研究了不同分子量的透明質酸對黏附強度的影響。如圖 2c 結果所示，分子量越大的透明質酸，形成的黏附強度越大。例如，使用 8 kD 的透明質酸時，混合物的黏附強度為（0.14 ± 0.03）MPa；當透明質酸分子量增大到 1 500 kD 時，黏附強度增大到（0.25 ± 0.05）MPa。

確定優化后的透明質酸的分子量（1 500 kD）和質量比（DSFp3∶HA=4∶1）之后，測量黏合劑的固化速度。測試結果如圖 2d 所示，黏合強度隨著時間而增強，在半小時左右達到最大值。我們的黏合劑的黏附強度最大值超過相同體積 Dermabond^?的 2 倍，即比市場上常用的化學類黏合劑更加牢固。另外，透明質酸和 DSFp3 固化 5 min 后，就能達到最大黏附強度的 52%。這種快速固化的優異性能將有利于其實際運用。

圖2 透明質酸對 DSFp3 黏附強度和固化的作用

a. 萬能材料測試機檢測黏附強度的示意圖；b. 100 μg DSFp3 與不同質量的透明質酸（1 500 kD）固化 1 h 后的黏附強度，與 50 μg 透明質酸組比較，** P < 0.01；c. 100 μg DSFp3 與 25 μg 的不同分子量的透明質酸固化 1 h 后的黏附強度，與 1 500 kD 透明質酸組比較，** P < 0.01；d. DSFp3 與透明質酸（1 500 kD）固化不同時間后的黏附強度，與 30 μL Dermabond^?固化 1 h 后進行比較，* P < 0.05，** P < 0.01

Figure2. Effect of hyaluronic acid (HA) on SFp3 adhesive strength and solidification

a. schematic illustration of measurement of the adhesive strength using the universal material testing machine; b. adhesive strength of 100 μg DOPA-containing SFp3 and different amounts of HA (1 500 kD) cured at 37 °C for 1 h before measurement, ** P < 0.01 vs 50 μg HA; c. adhesive strength of 100 μg DOPA-containing SFp3 and 25 μg HA with different molecular weight cured at 37 °C for 1 h before measurement, ** P < 0.01 vs 1 500 kD HA; d. adhesive strength of 100 μg DOPA-containing SFp3 and 25 μg HA (1 500 kD) was cured for indicated duration, compared with 30 μL Dermabond^? cured for 1 h before measurement, * P < 0.05, ** P < 0.01

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2.3 DSFp3 和透明質酸構成的黏合劑的形態研究

為了解透明質酸對 DSFp3 形態的影響，以探索上述優良黏附性能的成因，采用掃描電子顯微鏡觀測了 DSFp3 在添加透明質酸前后的形態變化。DSFp3 固化 3 h 后能形成黏性凝膠，凝膠在掃描電子顯微鏡下呈現三維網狀結構。當加入 1 500 kD 透明質酸后約 30 s，DSFp3 與透明質酸形成黏絲并迅速固化。用掃描電子顯微鏡觀測固化后的黏絲截面，觀察到多層片狀結構，與之前的網狀結構形成鮮明的對比（見圖 3）。

圖3 光學照片和掃描電子顯微鏡觀測 DSFp3 凝膠和加入透明質酸（1 500 kD）后形成的黏絲截面 Figure3. Photographs and scanning electron micrographs of the gel formed by DOPA-containing SFp3 and the strings formed by DOPA- containing SFp3 and HA (1 500 kD)

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2.4 DSFp3 和透明質酸能進行逐層組裝

掃描電子顯微鏡揭示的凝膠結構提示 DSFp3 和透明質酸能在微觀上形成規則的層狀結構。由于很多有序結構是自組裝形成的，我們測量了 SFp3 蛋白和透明質酸的 Zeta 電位。在 pH 5 的醋酸鈉緩沖液中，SFp3 和 DSFp3 的電勢分別為18.4、3.6 mV，而透明質酸的電勢為–13.8 mV。可見酪氨酸轉化為 DOPA 后降低了 SFp3 蛋白電勢，這有助于減少分子間靜電斥力，促進聚合。由于 SFp3 蛋白分子與透明質酸多糖分子分別帶有不同的電荷，靜電相互作用力可能是 SFp3 和透明質酸結合的主要驅動力。

為了更直觀地考察 DSFp3 和透明質酸的相互作用，我們采用生物膜層干涉技術實時監測它們的結合過程。生物膜層干涉技術能夠實時檢測大分子的相互作用引起的生物膜變化。生物大分子與檢測器結合后，在分子相互作用儀檢測器形成穩定的生物膜，通過光波的相位移動就能檢測生物膜垂直方向的厚度。將 DSFp3 固定在檢測器的表面，依次把檢測器放入透明質酸或 DSFp3 溶液中，監測膜層厚度的變化。傳感器結合透明質酸或 DSFp3 產生的厚度變化值為 ΔHA 或 ΔDSFp3。

由圖 4a 的結果可以看出，透明質酸和 DSFp3 能夠依次成膜，逐步增加膜的厚度。DSFp3 結合引起的厚度增加（ΔDSFp3）比透明質酸（ΔHA）高出近一個數量級，這跟 DSFp3 是球形結構而透明質酸是鏈狀結構的情況相吻合。隨著層層組裝的進行達到 10 次后，DSFp3 與 8 kD 的透明質酸在傳感器表面形成的生物膜厚度可達到 59 nm，而 DSFp3 與 1 500 kD 的透明質酸在傳感器表面形成的生物膜厚度只達到 16.2 nm。比較 DSFp3 每層的厚度（ΔDSFp3），與 8 kD 的透明質酸結合時，每層 ΔDSFp3 呈指數增長；而與 1 500 kD 的透明質酸結合時，每層 ΔDSFp3 的數值增加很少（見圖 4b），每次 DSFp3 結合的數量近似相同。同樣方法分析透明質酸每層的厚度（ΔHA）變化，發現結合 8 kD 的透明質酸時，每層 ΔHA 數值也都在隨層數而增長；然而結合 1 500 kD 的透明質酸時，ΔHA 為負值，表明在結合過程中厚度降低，且每層降低數值近似相同（見圖 4c）。高分子量透明質酸具有較長的柔性糖鏈，能夠形成線團、螺旋等空間結構，這些結構可以伸展并穿插到其他聚電解質層里。因此，當 1 500 kD 的透明質酸結合 DSFp3 層后，糖鏈構象改變可能引起生物膜的厚度在結合階段降低。這些數據有力地說明，當 1 500 kD 的透明質酸和 DSFp3 結合時，每層結合的量二者基本保持不變，因而能夠形成均一、穩定且緊密的層狀結構。

圖4 分子相互作用儀檢測 DSFp3 與透明質酸（HA）形成的層層組裝

a. 用分子相互作用儀分別測量 DSFp3 和 HA（8 kD or 1 500 kD）的結合數據；b. 不同組裝層的 DSFp3 膜厚度變化值（ΔDSFp3）；c. 不同組裝層的透明質酸膜厚度變化值（ΔHA）

Figure4. Biofilm interferometric analysis suggests that hyaluronic acid (HA) and DSFp3 formed layer-by-layer assembly

a. binding data of DSFp3 and HA (8 kD or 1 500 kD) measured by interferometry; b. thickness of DSFp3 layer (ΔDSFp3) in different layers; c. thickness of HA layer (ΔHA) in different layers

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3 討論

Fp3 蛋白中疏水氨基酸數量約為 36%，因而在水溶液中溶解性差。Hwang 等^[14]首先在大腸桿菌中獲得 Fp3 重組蛋白，但在 5% 醋酸溶液中蛋白溶解度約為 1 g/L。通過與 Sumo 蛋白融合，我們成功地在大腸桿菌中高效可溶性地表達和純化了貽貝足絲蛋白 SFp3，在 5% 醋酸溶液中，SFp3 重組蛋白濃度可高達 70 g/L 以上。

純化獲得的重組蛋白通過體外酶催化生成 DOPA 后，需通過高壓分子篩柱分離除去體系中的蘑菇酪氨酸酶^[15]。由于蘑菇酪氨酸酶不會結合 Ni 柱，本文將蘑菇酪氨酸酶與已結合 SFp3 的親和填料共孵育，在柱酶催化完成后，清洗親和填料即可除去蘑菇酪氨酸酶。通過在柱催化，既達到了文獻報道的 DOPA 催化效率^[13]，又簡化了蛋白制備流程。

Gim 等^[16]在 Fp5 基因兩端連接 Fp3 序列，表達并純化 Fp353 融合蛋白。在牛皮表面固化 6 h 后，酪氨酸酶修飾的 Fp353（10 mg）黏附強度約為 0.52 MPa。Lim 等^[11]在含 DOPA 的 Fp131 融合蛋白（40 mg）中加入 35 kD 的透明質酸（10 mg），形成由微囊組成的生物膠水。在鋁表面固化 24 h 后，其黏附強度可達 4 MPa。本工作發現，含 DOPA 的 SFp3 中加入 1 500 kD 的透明質酸能夠制備高黏附強度和快速固化的生物膠水。在牛皮表面，DSFp3（100 μg）與透明質酸（25 μg）固化 30 min 后其黏附強度約為 0.25 MPa，超過相同體積化學膠水 Dermabond^?的兩倍，并且固化 5 min 即可達到 52% 最大黏附力。

由于帶同種電荷的相鄰分子間存在靜電排斥力，聚電解質層內并不是緊密排列。新吸附的聚電解質層向上一層聚電解質擴散，能形成穿插結構^[17]。透明質酸的糖鏈越長，越容易在多層膜中穿插，形成緊密排列的膜結構。因此，高分子量的透明質酸與 DSFp3 逐層結合后，可形成均一緊密的結構，從而提高膠體內聚力，并減少固化時間。本研究結果為解決蛋白質類生物膠水面臨的強度低和固化慢這兩個難題提供了一種途徑，有助于將來制備高效的醫用生物組織黏合劑。

引言