深部腦刺激（DBS）中常用的電脈沖高頻刺激（HFS）已在多種腦疾病的治療中取得良好療效。研究HFS期間刺激下游神經元動作電位發放及其與刺激脈沖之間關系的動態變化，對于揭示DBS的作用機制、開發閉環刺激等新型刺激模式都具有重要意義。為了直觀地展示HFS期間（尤其在HFS起始階段）神經元活動的動態變化，本文設計了一種二維光柵圖，將HFS期間神經元的動態活動圖示化，并研究了光柵圖分辨率的變化對圖示化效果的影響。研究發現，利用該光柵圖研究大鼠海馬CA1區軸突HFS的作用，能夠直觀地展現周期性脈沖刺激期間單個神經元動作電位（即鋒電位）的鎖相性和潛伏期等指標隨時間的動態變化。并且，還可以直觀地比較刺激啟動前、后的鋒電位發放變化，清晰地顯示緊隨HFS結束后的鋒電位發放靜息期等其他信息。此外，通過調整分辨率，該光柵圖可以適應發放強度不同的神經元活動的圖示化。與常規光柵圖相比，新設計的光柵圖提供的信息更多，圖像更清晰，為研究高頻腦刺激過程中神經元的活動提供了一種新工具。
引用本文： 黃璐, 王兆祥, 封洲燕. 深部腦刺激期間神經元動態活動的光柵圖描述方法. 生物醫學工程學雜志, 2019, 36(2): 177-182. doi: 10.7507/1001-5515.201805016 復制
引言
深部腦刺激（deep brain stimulation，DBS）已經在帕金森病、肌張力障礙等神經系統疾病的治療上取得了令人矚目的成效；并且，在難治性癲癇、強迫癥等疾病的治療中也展現了良好的應用前景[1-2]。然而，其作用機制至今尚無定論[1, 3]。
臨床 DBS 通常使用直徑為 1 mm 左右的細電極將電脈沖施加于刺激位點，脈沖頻率通常高于 100 Hz，被稱為高頻刺激（high frequency stimulation，HFS）。考察刺激目標區域的神經元動作電位發放是研究 DBS 作用機制的重要方法。許多研究結果表明，HFS 的作用并不僅限于直接抑制或興奮電極周圍神經元胞體的活動，還可以激活電極周圍的傳出軸突纖維[4-5]。此興奮作用沿著軸突傳導出去，可以調制下游廣泛區域內的神經元活動，并且這種調制是動態變化的，在 HFS 初始階段尤為明顯[6-8]。因此，考察刺激下游神經元動作電位發放的動態變化可以深入揭示 DBS 的作用機制[9]，并且可以為 DBS 新型刺激模式的開發提供依據。例如，閉環刺激（或自適應刺激）會頻繁地開啟和關閉刺激，從而誘發動態（暫態）過程。而目前對于 DBS 期間的神經元發放的研究多為穩態過程，對于動態過程的研究較少，且缺乏描述方法。為此，本文將為研究神經元活動動態過程提供一種光柵圖描述方法。
DBS 期間神經元鋒電位（即胞外記錄的動作電位）的發放率以及鋒電位與刺激脈沖之間的關系（如潛伏期和鎖相性等）是揭示 DBS 機制的重要考察指標，它們可以反映刺激誘導的神經元輸出的變化[10-11]。其中，發放率反映神經元興奮性的強弱[12]；潛伏期是鋒電位與其前導脈沖的時間距離，可以反映刺激誘發的興奮的傳導速度[13-14]；鎖相性表示鋒電位與刺激脈沖之間是否存在一定的相位關系，可以反映刺激對于鋒電位發放的調制作用的強弱[10, 15]。
光柵圖常被用于描述神經元動作電位發放的時間關系，具有較好的直觀性[16]。本文以大鼠海馬 CA1 區軸突高頻刺激期間下游神經元鋒電位發放的描述為例，將光柵圖用于呈現高頻刺激期間鋒電位發放的動態變化，實現上述發放率、潛伏期和鎖相性等指標的圖示化，并分析不同的光柵圖分辨率對于各個指標圖示效果的影響。該圖示化方法為研究各種神經元在電刺激期間的動態響應提供了一種新工具，對于深入揭示 DBS 的機制具有重要意義。
1 方法
1.1 二維光柵圖的設計
一維光柵圖常被用于描述神經元發放的鋒電位在單個時間坐標軸上的位置。為了同時顯示鋒電位在周期性的脈沖刺激間期（inter-pulse-interval，IPI）的發放位置，本文增加一個 IPI 時間坐標軸，從而構成具有兩個時間坐標軸的二維光柵圖。并且，兩個坐標的分辨率可調，光柵點的大小隨著此分辨率的改變而變化。光柵點較大時可以代表多個鋒電位，其鋒電位個數用灰度或顏色來表示。這種二維光柵圖利用 MATLAB 程序制作，其中使用的關鍵作圖函數是“imagesc （）”。光柵圖的細節見下文結果部分的論述。
1.2 大鼠海馬區 HFS 期間神經元鋒電位信號的獲取
本文使用的神經元鋒電位信號取自 Sprague-Dawley 麻醉大鼠的急性實驗。大鼠購自中國浙江省醫學科學院實驗動物中心，其使用遵循浙江大學實驗動物管理的相關規則。動物手術、電極植入、電信號采集和電刺激實施等方法與已報道的相似[17-18]，此處不再復述。簡而言之，將 16 通道微陣列記錄電極植入大鼠海馬 CA1 區，將同芯雙極刺激電極植入到記錄位點上游的輸入通路 Schaffer 側支，并施加 HFS 用于激活下游神經元（圖 1a 左上）。HFS 為脈寬 0.1 ms 的雙相電流型脈沖波，電流強度為 0.3 mA，脈沖頻率為 100 Hz，持續時間為 2 min。
圖1
利用常規二維光柵圖顯示 HFS 期間神經元發放的動態變化
a. 電極位置示意圖和持續 2 min 的 100 Hz HFS 期間的 MUA 信號；b. 為（a）信號中神經元鋒電位的常規二維光柵圖（下）、發放率曲線（上）和 PSTH 曲線（右）
Figure1. A regular two-dimension (2D) raster plot illustrating the dynamics of neuronal firing during HFSa. schematic diagrams of the electrode locations and an example of a MUA signal during 2 min 100 Hz HFS; b. 2D raster plot (below) of the spike sequence in (a) with the curve of firing rate (above) and the curve of PSTH (right)
在 HFS 期間及前后記錄海馬 CA1 區的電信號，原始記錄信號的頻帶為 0.3～5 000 Hz，采樣率為 20 kHz（采樣周期為 0.05 ms）。鋒電位信號的檢測和分類方法詳見已有的報道[17-18]。簡述如下：首先，應用線性插值法去除原始寬頻帶信號中的刺激偽跡；然后，進行高通濾波（截止頻率為 500 Hz），獲得多單元鋒電位信號（multiple unit activity，MUA）；再應用閾值法檢測相鄰 4 個通道 MUA 信號中包含的鋒電位，并提取鋒電位的幅值等特征值進行聚類分析，獲得各個不同神經元的單元鋒電位信號，并將鋒電位的負峰時間點作為動作電位的發放時刻，用于制作二維光柵圖。
2 結果
2.1 利用二維光柵圖描述神經元鋒電位發放隨時間的變化
在海馬 CA1 區 Schaffer 側支施加 100 Hz 的 HFS 時，在刺激的初期會誘發下游神經元群體產生同步的動作電位發放，即群峰電位（population spike，PS），之后 PS 消失，而 MUA 持續存在（圖 1a 右上）。此現象與已有的報道一致[18]。
圖 1a 下方的 3 個小段信號的放大圖分別為 HFS 前（橙色）、HFS 前期（藍色）和 HFS 后期（紅色）的同一個神經元的鋒電位信號。其中，一維光柵圖顯示了該神經元鋒電位的發放序列。將這種光柵序列按照 HFS 的 IPI 依次排列而構成二維光柵圖，就可以顯示鋒電位在 100 Hz 的 HFS 每個 IPI（10 ms）中分布的變化（見圖 1b）。每個光柵點表示一個鋒電位。由圖中可見，HFS 前的基線記錄期間，鋒電位在虛擬的 IPI 中均勻分布（橙色箭頭所示）。而在 HFS 開始后，鋒電位卻集中在 IPI 的 6～8 ms 區間（藍色箭頭所示），平均潛伏期約為 7 ms。這表明 HFS 期間，鋒電位與刺激脈沖之間存在明顯的相位關系。而且，隨著 HFS 的持續，鋒電位的發放呈現逐漸遷移的動態過程，在 HFS 后期，鋒電位發放的潛伏期逐漸后移至約 9 ms 處，且集中趨勢逐漸減弱，部分鋒電位發放遷移至下一刺激脈沖之后（如圖 1a 右下的放大圖中，鋒電位的潛伏期可為 11.3 ms，大于 10 ms 的 IPI 長度），在二維光柵圖中表現為向右下角遷移（紅色箭頭所示）。將 IPI 均勻分為 50 個區間，區間寬度設為 0.2 ms，統計各區間內光柵點的總個數，得到圖 1b 右側的刺激后時間直方圖（peri-stimulus-time histogram，PSTH），其波峰分布進一步反映了鋒電位的相位關系。將刺激持續時間均勻分為 130 個區間（區間寬度設為 1 s），統計各區間內光柵點的總個數，得到圖 1b 上方的發放率曲線。可見，HFS 后期神經元的發放率較平穩，刺激的 40～120 s 期間，平均發放率為 66.6 個/s，明顯高于刺激前的基礎發放率（平均值為 38.2 個/s）。
雖然這種常規二維光柵圖能夠反映鋒電位與刺激脈沖之間的關系，但是，用于描述數分鐘 HFS 期間的鋒電位發放時，由于 IPI 的數量太多（對于 100 Hz 刺激每分鐘有 6 000 個 IPI），圖中數以萬計的光柵太細小，不利于觀察。特別是較稀疏的鋒電位發放難以考察（如圖 1b 紅色箭頭所示）。為了解決此問題，本文將光柵圖的橫坐標“刺激持續時間”的分辨率從單個 IPI 的 10 ms 增至 1 s，同時將縱坐標“IPI 時間”的分辨率由 0.05 ms 的采樣間隔增至 0.1 ms，從而增大每個光柵點的面積，并采用灰度或者彩色兩種方法來體現各光柵點所包含時間范圍內的鋒電位數量。這種改進的二維光柵圖可以突顯鋒電位發放率較高的時間區域。
2.2 利用改進光柵圖描述 HFS 期間的鋒電位動態變化
以時長為 2 min 的 HFS 數據（圖 2a）為例，雖然常規二維光柵圖（圖 2b）能夠在一定程度上展現 HFS 期間鋒電位的鎖相性和潛伏期等特性，但光柵點過于細小。相比之下，改進光柵圖（圖 2c 所示的灰度圖和圖 2d 所示的彩色圖）累計 1 s 的 IPI 數據用于作圖，使得 2 min 的 100 Hz 刺激期間光柵列數從常規圖的 12 000 列下降至 120 列，大大增加了各列光柵點的寬度；同時，IPI 的分辨率降低也增加了光柵點的高度。這樣，通過調節兩個坐標的分辨率，改進的光柵圖增大了光柵點的面積，使得光柵圖所包含的信息更豐富且更清晰。
圖2
利用改進光柵圖顯示 HFS 期間鋒電位發放的動態變化
a. 持續 2 min 的 100 Hz 高頻刺激期間的鋒電位信號；b. 常規二維光柵圖；c. 改進的二維灰度光柵圖；d. 改進的二維彩色光柵圖
Figure2. Newly designed raster plot illustrating the dynamics of neuronal firing during HFSa. MUA signal during a 2-min 100 Hz HFS; b. regular raster plot; c. newly designed raster plots with gray-scale; d. newly designed raster plots with color-scale
與常規二維光柵圖（圖 2b）相比較，灰度光柵圖（圖 2c）和彩色光柵圖（圖 2d）都能夠較為明顯地呈現圖中右下角稀疏的鋒電位（空心箭頭所示）；而且，也能夠反映鋒電位的密集程度（實心箭頭所示），HFS 前和 HFS 結束后自發的稀疏鋒電位也變得清晰可見。圖中的灰度或彩色表示鋒電位的個數。
此外，改進光柵圖的分辨率降低并不會損失鋒電位發放的動態信息。圖 2c 和圖 2d 都直觀地呈現了 HFS 期間的鋒電位發放與刺激之間的明顯鎖相關系，潛伏期從初始的 7～8 ms 逐步增加并穩定于 8～10 ms 之間，且有部分稀疏的鋒電位發放遷移至光柵圖的右下角。這些動態趨勢都與常規光柵圖（圖 2b）的顯示結果一致，且緊隨 HFS 結束后的鋒電位發放靜息期等其他信息的顯示也更清晰。
2.3 調節光柵圖的分辨率可以改善圖示效果
已有的研究表明，HFS 期間多數神經元的發放率都遠小于刺激頻率[18]。當神經元的發放率較低時，光柵圖的顯示效果較差。此時可以通過調節兩坐標軸分辨率來改善顯示效果。如圖 3 所示為 2 min、100 Hz 的 HFS 下記錄到的發放率較低（5.3 個/s）的神經元鋒電位光柵圖。其中的 9 張子圖的兩個坐標的分辨率各不相同（見圖上方和右側標注）。可見，隨著光柵圖橫、縱坐標的分辨率逐漸降低（兩坐標軸分辨率的取值逐漸增大），鋒電位發放的整體變化趨勢逐漸明朗；但當分辨率過低時，面積過大的光柵點也會導致細節信息的丟失，造成視覺假象，影響判斷。
圖3
調節光柵圖的雙軸分辨率以改善視覺效果
9 個子圖描述同一發放率較低的神經元（5.3 個/s）在 100 Hz HFS 期間的發放。RS 表示刺激持續時間軸的分辨率，RI 表示 IPI 時間軸的分辨率
Figure3. Improving visualization by adjusting the resolutions of coordinate axes of raster plotsThe nine insets are raster plots for identical firing of a neuron with a low firing rate (5.3 spikes/s) during 100 Hz HFS. RS is the resolution of stimulation time. RI is the resolution of IPI time
例如，當 IPI 時間分辨率（縱軸）取采樣周期（0.05 ms）、刺激持續時間的分辨率（橫軸）取為 100 倍 IPI（1 s）時（見圖 3a），各光柵點過于細小。而在圖 3i 中，兩坐標軸的分辨率均降低至圖 3a 的五分之一（IPI 分辨率取 0.25 ms，刺激持續時間分辨率取 5 s），各光柵點的面積明顯增大，圖像清晰且可以判定發放較集中的區域（紅棕色部分），但過大的光柵點容易被誤解為多個鋒電位的密集發放，造成發放率高且集中的假象。而分辨率適中的圖 3e 則表現出良好的圖示化效果，可以正確反映發放率并呈現鋒電位發放的動態變化。
由此可見，調節并選擇合適的分辨率可以獲得更好的光柵圖顯示效果。
3 討論
本文設計了一種具有疊加特性且分辨率可調的改進二維光柵圖，用于描述周期性刺激期間神經元動作電位發放的鎖相性和潛伏期等指標隨時間的動態變化。應用此光柵圖顯示海馬神經元對于軸突 HFS 的響應，清晰地顯示了神經元鋒電位鎖相性逐漸減弱以及潛伏期逐漸延長的過程。這種光柵圖具有如下優點：
（1）能夠同時顯示多種信息。以神經元對于 HFS 的響應為例，改進的光柵圖可顯示如下信息：鋒電位與刺激脈沖之間的鎖相性、潛伏期及其動態變化；鋒電位在刺激周期內發放的概率分布（表現為光柵點的密集程度和顏色/灰度的深淺）。此外，將刺激前與結束后的自發發放按照虛擬脈沖周期一起作圖（見圖 2），還可以更明確地顯示刺激的作用，以及緊隨刺激結束后鋒電位發放的抑制期和恢復過程[10, 18]。結合鋒電位發放率的變化曲線和 PSTH（見圖 1b），則可以更全面地呈現 HFS 引起的鋒電位發放的動態變化，并對鋒電位發放率和潛伏期等動態信息進行定量分析。這些信息對于研究刺激對于神經元的作用機制至關重要[10-11]。
（2）具有較廣的應用范圍。這種改進的光柵圖不僅適用于周期性的電刺激，如頻率固定的脈沖刺激或者正弦波刺激等；也可用于描述其他周期性的外界刺激（如視覺閃光、體感刺激等）對于神經元活動的作用的研究[19-20]。而且，通過調節光柵圖的分辨率，可以適應鋒電位的不同發放率。在描述發放率較低（< 10 個/s）的神經元活動時，也可以正確、清晰地呈現其整體變化趨勢（見圖 3）。
（3）方法簡單易用。本文使用 MATLAB 函數繪制光柵圖，可以采用位圖和矢量圖兩種方式，其中位圖方式能夠極大地減少制圖、編輯和輸出時的計算機處理時間，分辨率的降低也節省了數據的存儲空間[16]。
此外，這種光柵圖的使用需要注意選擇合適的光柵分辨率。分辨率過高，則光柵點難以觀察；分辨率過低，會導致細節信息的丟失，容易造成視覺假象。分辨率的選擇與鋒電位發放率、IPI 時長、刺激持續時長、圖像尺寸大小等多種因素相關，需要人工輔助判斷和調節參數得到合適的方案。光柵圖的色條對比度也可以人工設定。不過，本文以鋒電位的最大累計數為基準，采用自適應的色調對比度，無需人工調節，也可以根據不同發放率獲得清晰的圖像。
總之，本文所設計的二維光柵圖具有制作簡便、參數可調、適用范圍廣等優點，可直觀反映刺激過程中神經元鋒電位發放的動態變化。為研究 DBS 以及其他各種外加刺激對神經系統的作用機制提供了一種有效的數據分析方法。此外，本文利用改進光柵圖顯示的大鼠海馬軸突刺激期間神經元鋒電位發放時刻的動態變化特性，反映了刺激引起的作用，有待于進一步的深入研究，可以揭示有關軸突傳導阻滯、突觸傳遞失敗等 DBS 的重要機制[10, 15, 18]。
引言
深部腦刺激（deep brain stimulation，DBS）已經在帕金森病、肌張力障礙等神經系統疾病的治療上取得了令人矚目的成效；并且，在難治性癲癇、強迫癥等疾病的治療中也展現了良好的應用前景[1-2]。然而，其作用機制至今尚無定論[1, 3]。
臨床 DBS 通常使用直徑為 1 mm 左右的細電極將電脈沖施加于刺激位點，脈沖頻率通常高于 100 Hz，被稱為高頻刺激（high frequency stimulation，HFS）。考察刺激目標區域的神經元動作電位發放是研究 DBS 作用機制的重要方法。許多研究結果表明，HFS 的作用并不僅限于直接抑制或興奮電極周圍神經元胞體的活動，還可以激活電極周圍的傳出軸突纖維[4-5]。此興奮作用沿著軸突傳導出去，可以調制下游廣泛區域內的神經元活動，并且這種調制是動態變化的，在 HFS 初始階段尤為明顯[6-8]。因此，考察刺激下游神經元動作電位發放的動態變化可以深入揭示 DBS 的作用機制[9]，并且可以為 DBS 新型刺激模式的開發提供依據。例如，閉環刺激（或自適應刺激）會頻繁地開啟和關閉刺激，從而誘發動態（暫態）過程。而目前對于 DBS 期間的神經元發放的研究多為穩態過程，對于動態過程的研究較少，且缺乏描述方法。為此，本文將為研究神經元活動動態過程提供一種光柵圖描述方法。
DBS 期間神經元鋒電位（即胞外記錄的動作電位）的發放率以及鋒電位與刺激脈沖之間的關系（如潛伏期和鎖相性等）是揭示 DBS 機制的重要考察指標，它們可以反映刺激誘導的神經元輸出的變化[10-11]。其中，發放率反映神經元興奮性的強弱[12]；潛伏期是鋒電位與其前導脈沖的時間距離，可以反映刺激誘發的興奮的傳導速度[13-14]；鎖相性表示鋒電位與刺激脈沖之間是否存在一定的相位關系，可以反映刺激對于鋒電位發放的調制作用的強弱[10, 15]。
光柵圖常被用于描述神經元動作電位發放的時間關系，具有較好的直觀性[16]。本文以大鼠海馬 CA1 區軸突高頻刺激期間下游神經元鋒電位發放的描述為例，將光柵圖用于呈現高頻刺激期間鋒電位發放的動態變化，實現上述發放率、潛伏期和鎖相性等指標的圖示化，并分析不同的光柵圖分辨率對于各個指標圖示效果的影響。該圖示化方法為研究各種神經元在電刺激期間的動態響應提供了一種新工具，對于深入揭示 DBS 的機制具有重要意義。
1 方法
1.1 二維光柵圖的設計
一維光柵圖常被用于描述神經元發放的鋒電位在單個時間坐標軸上的位置。為了同時顯示鋒電位在周期性的脈沖刺激間期（inter-pulse-interval，IPI）的發放位置，本文增加一個 IPI 時間坐標軸，從而構成具有兩個時間坐標軸的二維光柵圖。并且，兩個坐標的分辨率可調，光柵點的大小隨著此分辨率的改變而變化。光柵點較大時可以代表多個鋒電位，其鋒電位個數用灰度或顏色來表示。這種二維光柵圖利用 MATLAB 程序制作，其中使用的關鍵作圖函數是“imagesc （）”。光柵圖的細節見下文結果部分的論述。
1.2 大鼠海馬區 HFS 期間神經元鋒電位信號的獲取
本文使用的神經元鋒電位信號取自 Sprague-Dawley 麻醉大鼠的急性實驗。大鼠購自中國浙江省醫學科學院實驗動物中心，其使用遵循浙江大學實驗動物管理的相關規則。動物手術、電極植入、電信號采集和電刺激實施等方法與已報道的相似[17-18]，此處不再復述。簡而言之，將 16 通道微陣列記錄電極植入大鼠海馬 CA1 區，將同芯雙極刺激電極植入到記錄位點上游的輸入通路 Schaffer 側支，并施加 HFS 用于激活下游神經元（圖 1a 左上）。HFS 為脈寬 0.1 ms 的雙相電流型脈沖波，電流強度為 0.3 mA，脈沖頻率為 100 Hz，持續時間為 2 min。
圖1
利用常規二維光柵圖顯示 HFS 期間神經元發放的動態變化
a. 電極位置示意圖和持續 2 min 的 100 Hz HFS 期間的 MUA 信號；b. 為（a）信號中神經元鋒電位的常規二維光柵圖（下）、發放率曲線（上）和 PSTH 曲線（右）
Figure1. A regular two-dimension (2D) raster plot illustrating the dynamics of neuronal firing during HFSa. schematic diagrams of the electrode locations and an example of a MUA signal during 2 min 100 Hz HFS; b. 2D raster plot (below) of the spike sequence in (a) with the curve of firing rate (above) and the curve of PSTH (right)
在 HFS 期間及前后記錄海馬 CA1 區的電信號，原始記錄信號的頻帶為 0.3～5 000 Hz，采樣率為 20 kHz（采樣周期為 0.05 ms）。鋒電位信號的檢測和分類方法詳見已有的報道[17-18]。簡述如下：首先，應用線性插值法去除原始寬頻帶信號中的刺激偽跡；然后，進行高通濾波（截止頻率為 500 Hz），獲得多單元鋒電位信號（multiple unit activity，MUA）；再應用閾值法檢測相鄰 4 個通道 MUA 信號中包含的鋒電位，并提取鋒電位的幅值等特征值進行聚類分析，獲得各個不同神經元的單元鋒電位信號，并將鋒電位的負峰時間點作為動作電位的發放時刻，用于制作二維光柵圖。
2 結果
2.1 利用二維光柵圖描述神經元鋒電位發放隨時間的變化
在海馬 CA1 區 Schaffer 側支施加 100 Hz 的 HFS 時，在刺激的初期會誘發下游神經元群體產生同步的動作電位發放，即群峰電位（population spike，PS），之后 PS 消失，而 MUA 持續存在（圖 1a 右上）。此現象與已有的報道一致[18]。
圖 1a 下方的 3 個小段信號的放大圖分別為 HFS 前（橙色）、HFS 前期（藍色）和 HFS 后期（紅色）的同一個神經元的鋒電位信號。其中，一維光柵圖顯示了該神經元鋒電位的發放序列。將這種光柵序列按照 HFS 的 IPI 依次排列而構成二維光柵圖，就可以顯示鋒電位在 100 Hz 的 HFS 每個 IPI（10 ms）中分布的變化（見圖 1b）。每個光柵點表示一個鋒電位。由圖中可見，HFS 前的基線記錄期間，鋒電位在虛擬的 IPI 中均勻分布（橙色箭頭所示）。而在 HFS 開始后，鋒電位卻集中在 IPI 的 6～8 ms 區間（藍色箭頭所示），平均潛伏期約為 7 ms。這表明 HFS 期間，鋒電位與刺激脈沖之間存在明顯的相位關系。而且，隨著 HFS 的持續，鋒電位的發放呈現逐漸遷移的動態過程，在 HFS 后期，鋒電位發放的潛伏期逐漸后移至約 9 ms 處，且集中趨勢逐漸減弱，部分鋒電位發放遷移至下一刺激脈沖之后（如圖 1a 右下的放大圖中，鋒電位的潛伏期可為 11.3 ms，大于 10 ms 的 IPI 長度），在二維光柵圖中表現為向右下角遷移（紅色箭頭所示）。將 IPI 均勻分為 50 個區間，區間寬度設為 0.2 ms，統計各區間內光柵點的總個數，得到圖 1b 右側的刺激后時間直方圖（peri-stimulus-time histogram，PSTH），其波峰分布進一步反映了鋒電位的相位關系。將刺激持續時間均勻分為 130 個區間（區間寬度設為 1 s），統計各區間內光柵點的總個數，得到圖 1b 上方的發放率曲線。可見，HFS 后期神經元的發放率較平穩，刺激的 40～120 s 期間，平均發放率為 66.6 個/s，明顯高于刺激前的基礎發放率（平均值為 38.2 個/s）。
雖然這種常規二維光柵圖能夠反映鋒電位與刺激脈沖之間的關系，但是，用于描述數分鐘 HFS 期間的鋒電位發放時，由于 IPI 的數量太多（對于 100 Hz 刺激每分鐘有 6 000 個 IPI），圖中數以萬計的光柵太細小，不利于觀察。特別是較稀疏的鋒電位發放難以考察（如圖 1b 紅色箭頭所示）。為了解決此問題，本文將光柵圖的橫坐標“刺激持續時間”的分辨率從單個 IPI 的 10 ms 增至 1 s，同時將縱坐標“IPI 時間”的分辨率由 0.05 ms 的采樣間隔增至 0.1 ms，從而增大每個光柵點的面積，并采用灰度或者彩色兩種方法來體現各光柵點所包含時間范圍內的鋒電位數量。這種改進的二維光柵圖可以突顯鋒電位發放率較高的時間區域。
2.2 利用改進光柵圖描述 HFS 期間的鋒電位動態變化
以時長為 2 min 的 HFS 數據（圖 2a）為例，雖然常規二維光柵圖（圖 2b）能夠在一定程度上展現 HFS 期間鋒電位的鎖相性和潛伏期等特性，但光柵點過于細小。相比之下，改進光柵圖（圖 2c 所示的灰度圖和圖 2d 所示的彩色圖）累計 1 s 的 IPI 數據用于作圖，使得 2 min 的 100 Hz 刺激期間光柵列數從常規圖的 12 000 列下降至 120 列，大大增加了各列光柵點的寬度；同時，IPI 的分辨率降低也增加了光柵點的高度。這樣，通過調節兩個坐標的分辨率，改進的光柵圖增大了光柵點的面積，使得光柵圖所包含的信息更豐富且更清晰。
圖2
利用改進光柵圖顯示 HFS 期間鋒電位發放的動態變化
a. 持續 2 min 的 100 Hz 高頻刺激期間的鋒電位信號；b. 常規二維光柵圖；c. 改進的二維灰度光柵圖；d. 改進的二維彩色光柵圖
Figure2. Newly designed raster plot illustrating the dynamics of neuronal firing during HFSa. MUA signal during a 2-min 100 Hz HFS; b. regular raster plot; c. newly designed raster plots with gray-scale; d. newly designed raster plots with color-scale
與常規二維光柵圖（圖 2b）相比較，灰度光柵圖（圖 2c）和彩色光柵圖（圖 2d）都能夠較為明顯地呈現圖中右下角稀疏的鋒電位（空心箭頭所示）；而且，也能夠反映鋒電位的密集程度（實心箭頭所示），HFS 前和 HFS 結束后自發的稀疏鋒電位也變得清晰可見。圖中的灰度或彩色表示鋒電位的個數。
此外，改進光柵圖的分辨率降低并不會損失鋒電位發放的動態信息。圖 2c 和圖 2d 都直觀地呈現了 HFS 期間的鋒電位發放與刺激之間的明顯鎖相關系，潛伏期從初始的 7～8 ms 逐步增加并穩定于 8～10 ms 之間，且有部分稀疏的鋒電位發放遷移至光柵圖的右下角。這些動態趨勢都與常規光柵圖（圖 2b）的顯示結果一致，且緊隨 HFS 結束后的鋒電位發放靜息期等其他信息的顯示也更清晰。
2.3 調節光柵圖的分辨率可以改善圖示效果
已有的研究表明，HFS 期間多數神經元的發放率都遠小于刺激頻率[18]。當神經元的發放率較低時，光柵圖的顯示效果較差。此時可以通過調節兩坐標軸分辨率來改善顯示效果。如圖 3 所示為 2 min、100 Hz 的 HFS 下記錄到的發放率較低（5.3 個/s）的神經元鋒電位光柵圖。其中的 9 張子圖的兩個坐標的分辨率各不相同（見圖上方和右側標注）。可見，隨著光柵圖橫、縱坐標的分辨率逐漸降低（兩坐標軸分辨率的取值逐漸增大），鋒電位發放的整體變化趨勢逐漸明朗；但當分辨率過低時，面積過大的光柵點也會導致細節信息的丟失，造成視覺假象，影響判斷。
圖3
調節光柵圖的雙軸分辨率以改善視覺效果
9 個子圖描述同一發放率較低的神經元（5.3 個/s）在 100 Hz HFS 期間的發放。RS 表示刺激持續時間軸的分辨率，RI 表示 IPI 時間軸的分辨率
Figure3. Improving visualization by adjusting the resolutions of coordinate axes of raster plotsThe nine insets are raster plots for identical firing of a neuron with a low firing rate (5.3 spikes/s) during 100 Hz HFS. RS is the resolution of stimulation time. RI is the resolution of IPI time
例如，當 IPI 時間分辨率（縱軸）取采樣周期（0.05 ms）、刺激持續時間的分辨率（橫軸）取為 100 倍 IPI（1 s）時（見圖 3a），各光柵點過于細小。而在圖 3i 中，兩坐標軸的分辨率均降低至圖 3a 的五分之一（IPI 分辨率取 0.25 ms，刺激持續時間分辨率取 5 s），各光柵點的面積明顯增大，圖像清晰且可以判定發放較集中的區域（紅棕色部分），但過大的光柵點容易被誤解為多個鋒電位的密集發放，造成發放率高且集中的假象。而分辨率適中的圖 3e 則表現出良好的圖示化效果，可以正確反映發放率并呈現鋒電位發放的動態變化。
由此可見，調節并選擇合適的分辨率可以獲得更好的光柵圖顯示效果。
3 討論
本文設計了一種具有疊加特性且分辨率可調的改進二維光柵圖，用于描述周期性刺激期間神經元動作電位發放的鎖相性和潛伏期等指標隨時間的動態變化。應用此光柵圖顯示海馬神經元對于軸突 HFS 的響應，清晰地顯示了神經元鋒電位鎖相性逐漸減弱以及潛伏期逐漸延長的過程。這種光柵圖具有如下優點：
（1）能夠同時顯示多種信息。以神經元對于 HFS 的響應為例，改進的光柵圖可顯示如下信息：鋒電位與刺激脈沖之間的鎖相性、潛伏期及其動態變化；鋒電位在刺激周期內發放的概率分布（表現為光柵點的密集程度和顏色/灰度的深淺）。此外，將刺激前與結束后的自發發放按照虛擬脈沖周期一起作圖（見圖 2），還可以更明確地顯示刺激的作用，以及緊隨刺激結束后鋒電位發放的抑制期和恢復過程[10, 18]。結合鋒電位發放率的變化曲線和 PSTH（見圖 1b），則可以更全面地呈現 HFS 引起的鋒電位發放的動態變化，并對鋒電位發放率和潛伏期等動態信息進行定量分析。這些信息對于研究刺激對于神經元的作用機制至關重要[10-11]。
（2）具有較廣的應用范圍。這種改進的光柵圖不僅適用于周期性的電刺激，如頻率固定的脈沖刺激或者正弦波刺激等；也可用于描述其他周期性的外界刺激（如視覺閃光、體感刺激等）對于神經元活動的作用的研究[19-20]。而且，通過調節光柵圖的分辨率，可以適應鋒電位的不同發放率。在描述發放率較低（< 10 個/s）的神經元活動時，也可以正確、清晰地呈現其整體變化趨勢（見圖 3）。
（3）方法簡單易用。本文使用 MATLAB 函數繪制光柵圖，可以采用位圖和矢量圖兩種方式，其中位圖方式能夠極大地減少制圖、編輯和輸出時的計算機處理時間，分辨率的降低也節省了數據的存儲空間[16]。
此外，這種光柵圖的使用需要注意選擇合適的光柵分辨率。分辨率過高，則光柵點難以觀察；分辨率過低，會導致細節信息的丟失，容易造成視覺假象。分辨率的選擇與鋒電位發放率、IPI 時長、刺激持續時長、圖像尺寸大小等多種因素相關，需要人工輔助判斷和調節參數得到合適的方案。光柵圖的色條對比度也可以人工設定。不過，本文以鋒電位的最大累計數為基準，采用自適應的色調對比度，無需人工調節，也可以根據不同發放率獲得清晰的圖像。
總之，本文所設計的二維光柵圖具有制作簡便、參數可調、適用范圍廣等優點，可直觀反映刺激過程中神經元鋒電位發放的動態變化。為研究 DBS 以及其他各種外加刺激對神經系統的作用機制提供了一種有效的數據分析方法。此外，本文利用改進光柵圖顯示的大鼠海馬軸突刺激期間神經元鋒電位發放時刻的動態變化特性，反映了刺激引起的作用，有待于進一步的深入研究，可以揭示有關軸突傳導阻滯、突觸傳遞失敗等 DBS 的重要機制[10, 15, 18]。
