在腫瘤細胞的黏附、遷移和增殖中，分化抗原 44（CD44）與埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白（ERM）的 FERM 結構域結合并招募脾酪氨酸激酶（Syk）至關重要。本文首先觀察分析靜態及平衡過程中 CD44/FERM 復合物的構象和接觸面殘基的相互作用，發現該復合物結構穩定，同時 ERM 蛋白上非傳統的免疫受體酪氨酸活化基序（ITAM-like）以及磷酸化位點 Y191 和 Y205 都被包埋在了結構里面，不利于 ERM 蛋白的磷酸化以及對 Syk 的招募，影響后續的信號傳導。接著采用拉伸分子動力學模擬的方法，模擬力學環境中 CD44/FERM 復合物的相互作用，比較分析復合物構象的變化以及溶劑可及表面積，發現力學信號可以調控 ITAM-like 序列以及磷酸化位點 Y205 的暴露。本研究首次在原子層面揭示力如何經由 CD44 胞內域調控下游信號的激活，為深入理解腫瘤細胞的黏附遷移路徑和抗腫瘤藥物的設計提供參考。
引用本文： 李雨峰, 方穎, 吳建華. 利用分子動力學模擬探究力學信號對 CD44/FERM 復合物結構的影響. 生物醫學工程學雜志, 2018, 35(4): 501-508. doi: 10.7507/1001-5515.201801051 復制
引言
分化抗原 44（clusters of differentiation 44，CD44）是一種廣泛分布的細胞膜黏附分子，尤其在腫瘤細胞上呈高表達[1-2]。它的胞外域可以與透明質酸（hyaluronan，HA）結合[3]，而胞內域則可以與埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白（ezrin/radixin/moesin，ERM）發生相互作用[4]，從而建立起腫瘤細胞胞內與胞外基質的聯系，介導腫瘤細胞的生長、代謝以及遷移等過程[5-6]。大量的研究表明，CD44 與 HA 的結合能介導腫瘤細胞在內皮細胞上的初始黏附以及快速滾動，通過結合 ERM 蛋白并誘導 ERM 蛋白的磷酸化[7-9]，啟動下游信號級聯反應[10-12]，進而促進腫瘤細胞的黏附、遷移和增殖[13-14]。同時，該生物學過程受到血流剪應力的調控[15-17]。Suzuki 等[18]發現力能夠誘導 CD44 與 HA 的結合區域迅速轉變為高親和力狀態，從而增強細胞黏附；DeSouza 等[19]則證明在神經膠質瘤細胞中 CD44 與 HA 的結合能夠促進 CD44 與 ERM 蛋白的相互作用。這些研究表明 HA 與力信號協同調控著 CD44 與 ERM 蛋白的相互作用及下游信號應答。
在胞內信號轉導的過程中，脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）信號分子的活化是至關重要的一步，一般通過與磷酸化的免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）的結合而激活[20]，因此 ITAM 序列上磷酸化位點的磷酸化對于 Syk 的激活十分關鍵。近年來，一些非傳統的 ITAM 序列（unconventional immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM-like）也被證明與傳統的 ITAM 序列有著相似的作用，甚至該序列上單個磷酸化位點的磷酸化就足夠實現對 Syk 的招募[21]。ERM 蛋白上就存在著這樣的 ITAM-like 序列，且該序列上有兩個重要的磷酸化位點——Y191 和 Y205[22]。
Mori 等[23]在 2008 年結晶出了 CD44 胞內區近膜端與鼠的根蛋白 FERM（protein 4.1-ezrin-radixin-moesin）結構域的復合物晶體結構，發現根蛋白的 ITAM-like 序列位于 FERM 結構域中。通過對靜態晶體結構的分析，我們發現 ITAM-like 序列周圍的空間位阻比較大，而且磷酸化位點 Y191 和 Y205 更是被包埋在了結構域里面，這會對后續的磷酸化以及 Syk 的招募造成困難。既然血流中的細胞無不受到剪應力的作用，而力又是一種十分關鍵的物理信號，因此我們猜想：CD44 胞外域與 HA 結合以后，血流剪切力所產生的力學信號可以經由 CD44 胞內域誘導 FERM 結構域的構象發生變化，進而促進 FERM 結構域上 ITAM-like 序列以及其上磷酸化位點的暴露，為后續 ERM 蛋白的磷酸化以及 Syk 的招募提供便利。為了驗證上述猜想，本文利用分子動力學模擬的方法，模擬在拉力的作用下 CD44 與 FERM 結構域的相互作用及其構象變化。本研究在原子水平揭示了力學信號在細胞信號傳導中的重要作用，有利于深入了解力-化學信號耦合調控機制。
1 材料與方法
1.1 復合物體系的構建
模擬所用到的復合物 CD44/FERM 初始結構下載自蛋白數據庫（Protein Data Bank, PDB），代碼為 2ZPY，分辨率為 2.1 ?；鼠源根蛋白 FERM 結構域的序列號為 3～297。由于該晶體結構中鼠源根蛋白 FERM 結構域 N 末端（298～313 號殘基）信息缺失，因此采用分子可視化操作軟件（Visual Molecular Dynamics，VMD）[24]，將 PDB 代碼為 2EMT N 端完整的鼠源根蛋白 FERM 結構域與 2ZPY 中的 FERM 結構域對齊，保證兩者盡可能地重疊，然后將 2EMT 中 FERM 結構域的 N 末端序列（298～313 號殘基）替換到 2ZPY 中，得到最終所需要的 CD44 與 FERM 結構域復合物體系（如圖 1b 所示），其中 FERM 結構域的序列為 3～313 號殘基，CD44 胞內區近膜端的序列為 399～407 號殘基。
1.2 分子動力學模擬
為模擬正常生理環境，將上述構建的 CD44/FERM 復合物體系溶解于尺寸為 88.1 ? × 91.2 ? × 88.1 ?的 TIP3 水框中，加入 0.154 mol/L 的 NaCl，得到原子總數為 102 653 個的體系。然后利用納米尺度分子動力學軟件（nanoscale molecular dynamics, NAMD）[25]在 CHARMM27[26]力場中分別對體系進行 3 次能量最小化，使得體系的能量降到最低：第一次為固定蛋白質讓水運動，第二次為固定蛋白質主鏈讓側鏈和水運動，第三次為蛋白質和水都能運動。運算過程中采用埃瓦爾德粒子網格算法（particle mesh Ewald algorithm, PME）計算靜電相互作用，范德華力作用截止值設定為 12 ?。接著對能量最小化之后的復合物體系進行了 50 ns 的能量平衡，控制溫度為 310 K，壓力為 1 atm（1 atm= 101 325 Pa），使體系達到穩定平衡。
為了模擬 CD44/FERM 復合物在外力作用下的穩定性以及構象變化，對平衡 50 ns 后的復合物體系進行了 3 次受控分子動力學模擬（steered molecular dynamics，SMD）。具體步驟為：① 取平衡 50 ns 后 CD44/FERM 復合物的最后一幀構象，根據跨膜分子 CD44 的連接順序（HA/CD44/ERM/F-actin）和細胞的受力方式，將 FERM 結構域中與細胞骨架相連的 C 端 S313 殘基上的 Cα 原子設為固定原子；將與 HA 連接的 CD44 的 N 末端 G399 殘基上的 Cα 原子設定為拉伸原子。② 將調整坐標后的復合物溶解于尺寸為 137.6 ? × 88.0 ? × 90.2 ?的 TIP3 水框中，加入 0.154 mol/L 的 NaCl；③ 將所得到的體系再分別進行三次能量最小化和一次 5 ns 的能量平衡；④ 恒速拉伸分子動力學模擬，由于計算資源和尺度效應，同時參考已發表的相關成果[27-28]，設定拉伸步長為 2 fs/步，拉伸速度為 5 ?/ns，拉伸方向為拉伸原子和固定原子的連線方向，拉伸原子和固定原子之間的虛擬彈簧系數為 69.48 pN/nm，拉伸時間為 20 ns。
1.3 數據分析方法
蛋白質結構顯示和數據分析均借助 VMD 軟件。CD44/FERM 復合物的結構穩定性用重原子的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）以及接觸面氫鍵的數目表示。拉伸過程中，ITAM-like 序列以及磷酸化位點是否發生暴露可以利用溶劑可及表面積（solvent-accessible surface area，SASA）來判斷。SASA 值越大表明蛋白質結構越容易暴露在溶劑中，與其他分子發生相互作用的可能性就越大。氫鍵的界定：供體原子與受體原子之間的距離小于 3.5 ?并且供體-氫原子-受體之間的夾角大于 150°。模擬過程中氫鍵生存率（H）為該氫鍵累計形成時間（t）與模擬時間（T）之比，即：
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2 結果與分析
2.1 復合物的靜態構象
FERM 結構域主要由三個亞域（subdomain）組成：A 亞域、B 亞域和 C 亞域，其中 ITAM-like 序列（氨基酸殘基編號為 191～208）作為紐帶將 B 亞域和 C 亞域連接起來（如圖 1a 所示）。CD44 與 FERM 結構域的 C 亞域發生相互作用，并與 C 亞域上的 β5C 片層形成了一個平行的相互作用面，該接觸面的相互作用主要通過氫鍵介導（如圖 1b 所示）。可以發現，靜態結構中 ITAM-like 序列（紅色，Tube 模型）呈蜷縮狀態，磷酸化位點 Y191（紫色，Licorice 模型）以及 Y205（深藍，Licorice 模型）則被包埋在了結構域內（如圖 1a 所示）。這將會阻礙對 Syk 的招募，從而影響胞內的信號傳導。因此，外力的作用很可能對復合物構象的改變發揮著重要作用。
圖1
FERM 結構域和 CD44/FERM 復合物晶體結構
a. FERM 結構域的晶體結構；b. CD44/FERM 復合物結合面上的關鍵殘基，關鍵氫鍵以紅色虛線表示
Figure1. Crystal structure of FERM domain and CD44/FERM complexa. the crystal structure of FERM domain; b. the key residues on the interface of CD44/FERM complex, and key hydrogen bonds were represented in red dotted lines
2.2 平衡過程中復合物 CD44/FERM 的穩定性
對構建的 CD44/FERM 復合物體系先經過 3 次能量最小化，再進行 50 ns 的平衡，觀察平衡過程中復合物體系的波動情況以及結合面殘基之間的相互作用。通過分析 CD44/FERM 復合物中重原子的 RMSD 值（如圖 2a 所示），可以看出在 10 ns 后該復合物系統已基本趨于平穩，僅在一個很小的幅度上下波動。
圖2
平衡過程中 CD44/FERM 復合物的 RMSD 以及接合面處的氫鍵數目
a. 重原子的 RMSD 值；b. 接觸面處的氫鍵數目
Figure2. RMSD and hydrogen bond number of CD44/FERM complex during the equilibriuma. RMSD of heavy atoms; b. hydrogen bond number on the interface
對 CD44/FERM 復合物靜態晶體結構的分析表明接觸面上的氫鍵是維持復合物結構穩定的關鍵，那么在平衡過程中這些分子之間的相互作用又發生了怎樣的變化？為此，我們跟蹤了整個平衡過程中接觸面殘基的相互作用，計算分析氫鍵形成的數目以及各氫鍵的生存率。由圖 2b 可以看出，在平衡的過程中復合物接觸面形成的氫鍵數目保持在 9 個左右。
表 1 列出了平衡過程中氫鍵生存率排名前 10 位的氫鍵，其中 CD44 上的 LEU403、LYS401、ASN406、ILE405 均被證實為維持復合物結構穩定的重要殘基[23]，而 GLY407 殘基作為 CD44 結構上的柔性 loop 對接在 FERM 結構域的疏水性凹槽中，也對復合物結構的穩定性起到了重要作用。以上數據表明在動態平衡的過程中 CD44/FEMR 復合物不僅保留了在靜態結構中觀察到的重要氫鍵（如圖 1b 所示），并且這些氫鍵在平衡的過程中也十分穩定。
表1
平衡過程中氫鍵生存率排名前十位的氫鍵
Table1.
The top ten hydrogen bonds and their survival ratios during the equilibrium
2.3 恒速拉伸過程中復合物的解離
為研究外力作用下 CD44/FERM 復合物構象的變化，對平衡后的復合物進行了三次恒速拉伸分子動力學模擬，分析拉伸過程中拉力、復合物接觸面的氫鍵數目以及復合物的構象變化。由圖 3 可以看出三次獨立的拉伸模擬實驗中，拉力隨拉伸時間的變化以及氫鍵數目隨拉伸時間的變化均表現出相似的趨勢：拉伸前 11 ns，拉力隨著時間呈現總體上升的趨勢，但接觸面的氫鍵數目卻相對保持穩定；當拉伸至 12～15 ns 之間，拉力突然下降，氫鍵也隨之迅速斷裂，直至為 0，復合物發生解離。三次 SMD 的解離時間集中在 11～15 ns，解離力在 250 pN 左右。
圖3
三次拉伸過程中拉力和氫鍵數目的變化情況
Figure3.
The changes of force and hydrogen bond number in three SMDs
通過分析 CD44/FERM 復合物在拉伸過程中的構象變化（如圖 4 所示），可以看出在拉伸的初始階段復合物的構象比較穩定。但在 6.4 ns 左右，隨著拉力的不斷上升，FERM 結構域 C 末端 α 螺旋開始發生解折疊；在 9 ns 左右，α 螺旋已經完全解折疊，拉力繼續上升；隨后，在 13 ns 左右，復合物分子之間的鍵合不敵外力，CD44 與 FERM 結構域完全解離。
圖4
拉伸過程中 FERM 結構域的構象變化
Figure4.
Conformational changes of FERM domain during SMD process
2.4 拉伸過程中磷酸化位點的暴露
在拉力的作用下，CD44/FERM 復合物解離之前發生的解折疊過程表明了該復合物結合的穩定性，同時也提示解折疊的過程可能有利于 ITAM-like 序列以及磷酸化位點的暴露。通過對解折疊構象演變的分析（如圖 4 所示），發現在拉伸之前 ITAM-like 序列（紅色，Tube 模型）像是一條“繩子”蜷縮在結構域內并連接著 B 亞域和 C 亞域。隨著解折疊的進行，B、C 亞域逐漸分離，ITAM-like 序列逐漸被拉出并暴露在溶劑中。為了檢驗力學信號是否能夠介導 FERM 結構域上磷酸化位點 Y191（紫色，Licorice 模型）和 Y205（深藍，Licorice 模型）的暴露，提取了復合物在拉伸過程中的局部空間構象，圖 5 展示了 0、6.4、9、13 ns 時的構象。可以發現在拉力的作用下，C 亞域結構逐漸松散，開始被包埋在復合物結構里面的 Y205 逐漸發生了暴露，而在整個過程中 Y191 始終都被包埋在結構中沒有發生暴露。
圖5
拉伸過程中磷酸化位點 Y205 的暴露
Figure5.
Exposure of phosphorylation site Y205 during SMD process
2.5 SASA 值的分析
為了定量表征拉伸過程中 ITAM-like 序列、Y191 和 Y205 的暴露程度，本文以半徑為 1.4 ?的水分子作為探針，分別對平衡過程以及拉伸過程中它們的 SASA 值進行跟蹤和計算分析。在平衡過程中，ITAM-like 序列、Y191 和 Y205 的 SASA 值的時間歷程如圖 6 所示，其數學平均值分別為 652.44、5.21、36.22 ?2，且總體上 SASA 值變化幅度不大，說明在沒有外力作用時它們周圍確實存在著較大的空間位阻。而從它們各自三次恒速拉伸過程中 SASA 值的時間歷程可以看出：ITAM-like 序列和 Y205 的 SASA 值都有明顯的增大，而且波動幅度提高，其中 ITAM-like 序列能從最初的 600 ?2增大到 900 ?2，Y205 能從最初的 20 ?2增大到 100 ?2。但 Y191 的 SASA 值變化幅度不大，且始終保持在 30 ?2以下。
圖6
平衡以及三次 SMD 過程中 ITAM-like 序列以及 Y191 和 Y205 SASA 值的時間歷程
Figure6.
Time courses of SASAs of ITAM-like motif, Y191 and Y205 in the equilibrium and three SMDs
隨后，對其在無外力作用下的平衡過程和有外力作用下的拉伸過程的 SASA 值進行了統計學分析（u 檢驗，檢驗水準為 0.01），用平均值和標準誤表示（如圖 7 所示）。ITAM-like 序列在平衡過程以及拉伸過程中的 SASA 值分別為（652.44 ± 2.11）?2和（709.18 ± 2.10）?2，增大了約 9%，兩者之間差異有統計學意義（P < 0.01）。Y205 的 SASA 值分別為（36.22 ± 0.25）? 2和（49.04 ± 0.31）?2，增大了約 35%，兩者之間差異有統計學意義（P < 0.01）。Y191 的 SASA 值分別為（5.21 ± 0.07）? 2和（8.26 ± 0.12）?2，兩者之間差異雖然有統計學意義（P < 0.01），但由于空間位阻的影響，SASA 值一直較小且變化幅度不大。
上述結果表明，力學信號在腫瘤細胞的增殖、黏附以及遷移過程中發揮了重要作用。在血流環境下，HA 與 CD44 相互作用產生的力學信號可以通過 CD44 介導 FERM 結構域中 ITAM-like 序列以及磷酸化位點 Y205 的暴露，有利于 ERM 蛋白上關鍵位點的磷酸化及其與 Syk 的結合，進而激活下游信號通路，實現胞內信號的轉導，調控腫瘤細胞的新陳代謝過程。
圖7
平衡過程和拉伸過程中 ITAM-like 序列、Y191 和 Y205 的 SASA 值統計分析（** P < 0.01）
Figure7.
SASA statistical analysis of ITAM-like motif, Y191 and Y205 in the equilibrium and SMD (** P < 0.01)
3 討論和展望
CD44 胞外域能與 HA 結合，胞內域則能夠與 ERM 蛋白的 FERM 結構域結合，是連接胞外基質與細胞骨架的紐帶[2]，同時還是一種力敏感蛋白，力可上調其與 HA 的親和力[18]。而 ERM 蛋白則是力-化學信號的接受者，同時由于 ERM 蛋白通過其 C 末端的肌動蛋白結合區域連接著細胞骨架，繼而將力傳遞給細胞骨架蛋白。ERM 蛋白上的 ITAM-like 序列以及磷酸化位點 Y191 和 Y205 的磷酸化對于招募 Syk 分子、激活 Src 家族激酶、引發細胞鈣響應進而促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲是至關重要的。然而，CD44/FERM 復合物晶體結構表明 FERM 結構域中的 ITAM-like 序列以及磷酸化位點 Y191 和 Y205 都被包埋在了結構里面（如圖 1a 所示），阻礙了 ERM 蛋白的磷酸化以及對 Syk 的招募。因此，我們推斷外力可能導致 ERM 蛋白構象變化，進而暴露 ITAM-like 序列以及上面的磷酸化位點。
我們采用分子動力學模擬方法，比較無外力作用的平衡過程及恒速拉伸過程中復合物接觸面分子的相互作用、構象變化以及 ITAM-like 序列和磷酸化位點 Y191、Y205 的暴露程度，探索力-化學信號偶聯調控 ERM 蛋白磷酸化的過程和分子結構基礎。模擬結果顯示 CD44/FERM 復合物在整個平衡過程中都很穩定（如圖 2 所示），靜態結構中觀察到的接觸面上的重要氫鍵也保持著較高的生存率（如表 1 所示），同時在整個過程中，ITAM-like 序列以及磷酸化位點始終被包埋在結構內，沒有發生暴露。然而，在恒速拉伸動力學模擬過程，復合物結構不再穩定，FERM 結構域的 α 螺旋先發生解折疊，隨后 CD44/FERM 復合物發生解離（如圖 4 所示）。在解折疊的過程中，通過對復合物構象（如圖 5 所示）的觀察，發現 ITAM-like 序列和磷酸化位點 Y205 都發生了明顯的暴露，并進一步被 ITAM-like 序列和磷酸化位點 Y205 的 SASA 值的定量統計學檢驗所證實（如圖 7 所示），說明外力能夠有效地使 ITAM-like 序列和磷酸化位點 Y205 發生暴露，以便于后續的磷酸化以及對 Syk 的招募。
由于計算資源的限制，與單分子的原子力顯微鏡及光鑷實驗比較，一般模擬計算的拉伸速度要高 3～4 個數量級，而拉力則高 1～2 個數量級[29-30]，分子動力學模擬方法的優點在于能再現實驗無法觀察到的分子構象的動態變化，因此成為一個越來越重要的研究工具。P 選擇素糖蛋白受體 1（P-selectin glycoprotein ligand 1, PSGL-1）具有類似 CD44 的結構，結合配體后胞質區可與 FERM 結構鍵合，在白細胞的捕獲和黏附中發揮關鍵作用[20]。我們實驗室前期曾模擬血流剪應力作用下 PSGL-1/FERM 的相互作用[27]，得到的拉伸斷裂力在 250～300 pN，解離時間在 20～25 ns，均高于 CD44/FERM 的 250 pN 和 11～15 ns，另外其 ITAM-like 序列及其磷酸化位點 Y205 的暴露程度也高于 CD44/FERM。因此我們推斷 CD44 承受并傳遞外力給骨架蛋白的能力、活化 Syk 信號分子的能力可能不如 PSGL-1，但外力可能有助于 CD44 近膜端的酶切，從而脫離細胞膜進入細胞核去調控基因的復制與轉錄，最終上調 CD44 的表達。
本研究在原子水平揭示了力學信號在 HA、CD44、ERM 以及 F-actin 之間信號傳導的重要作用，進一步證實了 PSGL-1/FERM 分子體系中的發現：外力有利于 FERM 結構域中 ITAM-like 序列上磷酸化位點的暴露，有助于下游 Syk 的磷酸化募集。同時也給研究者以啟發：力敏感蛋白可能具有共性，除接受并傳遞力學信號外，還能引起自身及下游信號分子的構象變化，從而加速啟動下游信號級聯反應。
引言
分化抗原 44（clusters of differentiation 44，CD44）是一種廣泛分布的細胞膜黏附分子，尤其在腫瘤細胞上呈高表達[1-2]。它的胞外域可以與透明質酸（hyaluronan，HA）結合[3]，而胞內域則可以與埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白（ezrin/radixin/moesin，ERM）發生相互作用[4]，從而建立起腫瘤細胞胞內與胞外基質的聯系，介導腫瘤細胞的生長、代謝以及遷移等過程[5-6]。大量的研究表明，CD44 與 HA 的結合能介導腫瘤細胞在內皮細胞上的初始黏附以及快速滾動，通過結合 ERM 蛋白并誘導 ERM 蛋白的磷酸化[7-9]，啟動下游信號級聯反應[10-12]，進而促進腫瘤細胞的黏附、遷移和增殖[13-14]。同時，該生物學過程受到血流剪應力的調控[15-17]。Suzuki 等[18]發現力能夠誘導 CD44 與 HA 的結合區域迅速轉變為高親和力狀態，從而增強細胞黏附；DeSouza 等[19]則證明在神經膠質瘤細胞中 CD44 與 HA 的結合能夠促進 CD44 與 ERM 蛋白的相互作用。這些研究表明 HA 與力信號協同調控著 CD44 與 ERM 蛋白的相互作用及下游信號應答。
在胞內信號轉導的過程中，脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）信號分子的活化是至關重要的一步，一般通過與磷酸化的免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）的結合而激活[20]，因此 ITAM 序列上磷酸化位點的磷酸化對于 Syk 的激活十分關鍵。近年來，一些非傳統的 ITAM 序列（unconventional immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM-like）也被證明與傳統的 ITAM 序列有著相似的作用，甚至該序列上單個磷酸化位點的磷酸化就足夠實現對 Syk 的招募[21]。ERM 蛋白上就存在著這樣的 ITAM-like 序列，且該序列上有兩個重要的磷酸化位點——Y191 和 Y205[22]。
Mori 等[23]在 2008 年結晶出了 CD44 胞內區近膜端與鼠的根蛋白 FERM（protein 4.1-ezrin-radixin-moesin）結構域的復合物晶體結構，發現根蛋白的 ITAM-like 序列位于 FERM 結構域中。通過對靜態晶體結構的分析，我們發現 ITAM-like 序列周圍的空間位阻比較大，而且磷酸化位點 Y191 和 Y205 更是被包埋在了結構域里面，這會對后續的磷酸化以及 Syk 的招募造成困難。既然血流中的細胞無不受到剪應力的作用，而力又是一種十分關鍵的物理信號，因此我們猜想：CD44 胞外域與 HA 結合以后，血流剪切力所產生的力學信號可以經由 CD44 胞內域誘導 FERM 結構域的構象發生變化，進而促進 FERM 結構域上 ITAM-like 序列以及其上磷酸化位點的暴露，為后續 ERM 蛋白的磷酸化以及 Syk 的招募提供便利。為了驗證上述猜想，本文利用分子動力學模擬的方法，模擬在拉力的作用下 CD44 與 FERM 結構域的相互作用及其構象變化。本研究在原子水平揭示了力學信號在細胞信號傳導中的重要作用，有利于深入了解力-化學信號耦合調控機制。
1 材料與方法
1.1 復合物體系的構建
模擬所用到的復合物 CD44/FERM 初始結構下載自蛋白數據庫（Protein Data Bank, PDB），代碼為 2ZPY，分辨率為 2.1 ?；鼠源根蛋白 FERM 結構域的序列號為 3～297。由于該晶體結構中鼠源根蛋白 FERM 結構域 N 末端（298～313 號殘基）信息缺失，因此采用分子可視化操作軟件（Visual Molecular Dynamics，VMD）[24]，將 PDB 代碼為 2EMT N 端完整的鼠源根蛋白 FERM 結構域與 2ZPY 中的 FERM 結構域對齊，保證兩者盡可能地重疊，然后將 2EMT 中 FERM 結構域的 N 末端序列（298～313 號殘基）替換到 2ZPY 中，得到最終所需要的 CD44 與 FERM 結構域復合物體系（如圖 1b 所示），其中 FERM 結構域的序列為 3～313 號殘基，CD44 胞內區近膜端的序列為 399～407 號殘基。
1.2 分子動力學模擬
為模擬正常生理環境，將上述構建的 CD44/FERM 復合物體系溶解于尺寸為 88.1 ? × 91.2 ? × 88.1 ?的 TIP3 水框中，加入 0.154 mol/L 的 NaCl，得到原子總數為 102 653 個的體系。然后利用納米尺度分子動力學軟件（nanoscale molecular dynamics, NAMD）[25]在 CHARMM27[26]力場中分別對體系進行 3 次能量最小化，使得體系的能量降到最低：第一次為固定蛋白質讓水運動，第二次為固定蛋白質主鏈讓側鏈和水運動，第三次為蛋白質和水都能運動。運算過程中采用埃瓦爾德粒子網格算法（particle mesh Ewald algorithm, PME）計算靜電相互作用，范德華力作用截止值設定為 12 ?。接著對能量最小化之后的復合物體系進行了 50 ns 的能量平衡，控制溫度為 310 K，壓力為 1 atm（1 atm= 101 325 Pa），使體系達到穩定平衡。
為了模擬 CD44/FERM 復合物在外力作用下的穩定性以及構象變化，對平衡 50 ns 后的復合物體系進行了 3 次受控分子動力學模擬（steered molecular dynamics，SMD）。具體步驟為：① 取平衡 50 ns 后 CD44/FERM 復合物的最后一幀構象，根據跨膜分子 CD44 的連接順序（HA/CD44/ERM/F-actin）和細胞的受力方式，將 FERM 結構域中與細胞骨架相連的 C 端 S313 殘基上的 Cα 原子設為固定原子；將與 HA 連接的 CD44 的 N 末端 G399 殘基上的 Cα 原子設定為拉伸原子。② 將調整坐標后的復合物溶解于尺寸為 137.6 ? × 88.0 ? × 90.2 ?的 TIP3 水框中，加入 0.154 mol/L 的 NaCl；③ 將所得到的體系再分別進行三次能量最小化和一次 5 ns 的能量平衡；④ 恒速拉伸分子動力學模擬，由于計算資源和尺度效應，同時參考已發表的相關成果[27-28]，設定拉伸步長為 2 fs/步，拉伸速度為 5 ?/ns，拉伸方向為拉伸原子和固定原子的連線方向，拉伸原子和固定原子之間的虛擬彈簧系數為 69.48 pN/nm，拉伸時間為 20 ns。
1.3 數據分析方法
蛋白質結構顯示和數據分析均借助 VMD 軟件。CD44/FERM 復合物的結構穩定性用重原子的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）以及接觸面氫鍵的數目表示。拉伸過程中，ITAM-like 序列以及磷酸化位點是否發生暴露可以利用溶劑可及表面積（solvent-accessible surface area，SASA）來判斷。SASA 值越大表明蛋白質結構越容易暴露在溶劑中，與其他分子發生相互作用的可能性就越大。氫鍵的界定：供體原子與受體原子之間的距離小于 3.5 ?并且供體-氫原子-受體之間的夾角大于 150°。模擬過程中氫鍵生存率（H）為該氫鍵累計形成時間（t）與模擬時間（T）之比，即：
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2 結果與分析
2.1 復合物的靜態構象
FERM 結構域主要由三個亞域（subdomain）組成：A 亞域、B 亞域和 C 亞域，其中 ITAM-like 序列（氨基酸殘基編號為 191～208）作為紐帶將 B 亞域和 C 亞域連接起來（如圖 1a 所示）。CD44 與 FERM 結構域的 C 亞域發生相互作用，并與 C 亞域上的 β5C 片層形成了一個平行的相互作用面，該接觸面的相互作用主要通過氫鍵介導（如圖 1b 所示）。可以發現，靜態結構中 ITAM-like 序列（紅色，Tube 模型）呈蜷縮狀態，磷酸化位點 Y191（紫色，Licorice 模型）以及 Y205（深藍，Licorice 模型）則被包埋在了結構域內（如圖 1a 所示）。這將會阻礙對 Syk 的招募，從而影響胞內的信號傳導。因此，外力的作用很可能對復合物構象的改變發揮著重要作用。
圖1
FERM 結構域和 CD44/FERM 復合物晶體結構
a. FERM 結構域的晶體結構；b. CD44/FERM 復合物結合面上的關鍵殘基，關鍵氫鍵以紅色虛線表示
Figure1. Crystal structure of FERM domain and CD44/FERM complexa. the crystal structure of FERM domain; b. the key residues on the interface of CD44/FERM complex, and key hydrogen bonds were represented in red dotted lines
2.2 平衡過程中復合物 CD44/FERM 的穩定性
對構建的 CD44/FERM 復合物體系先經過 3 次能量最小化，再進行 50 ns 的平衡，觀察平衡過程中復合物體系的波動情況以及結合面殘基之間的相互作用。通過分析 CD44/FERM 復合物中重原子的 RMSD 值（如圖 2a 所示），可以看出在 10 ns 后該復合物系統已基本趨于平穩，僅在一個很小的幅度上下波動。
圖2
平衡過程中 CD44/FERM 復合物的 RMSD 以及接合面處的氫鍵數目
a. 重原子的 RMSD 值；b. 接觸面處的氫鍵數目
Figure2. RMSD and hydrogen bond number of CD44/FERM complex during the equilibriuma. RMSD of heavy atoms; b. hydrogen bond number on the interface
對 CD44/FERM 復合物靜態晶體結構的分析表明接觸面上的氫鍵是維持復合物結構穩定的關鍵，那么在平衡過程中這些分子之間的相互作用又發生了怎樣的變化？為此，我們跟蹤了整個平衡過程中接觸面殘基的相互作用，計算分析氫鍵形成的數目以及各氫鍵的生存率。由圖 2b 可以看出，在平衡的過程中復合物接觸面形成的氫鍵數目保持在 9 個左右。
表 1 列出了平衡過程中氫鍵生存率排名前 10 位的氫鍵，其中 CD44 上的 LEU403、LYS401、ASN406、ILE405 均被證實為維持復合物結構穩定的重要殘基[23]，而 GLY407 殘基作為 CD44 結構上的柔性 loop 對接在 FERM 結構域的疏水性凹槽中，也對復合物結構的穩定性起到了重要作用。以上數據表明在動態平衡的過程中 CD44/FEMR 復合物不僅保留了在靜態結構中觀察到的重要氫鍵（如圖 1b 所示），并且這些氫鍵在平衡的過程中也十分穩定。
表1
平衡過程中氫鍵生存率排名前十位的氫鍵
Table1.
The top ten hydrogen bonds and their survival ratios during the equilibrium
2.3 恒速拉伸過程中復合物的解離
為研究外力作用下 CD44/FERM 復合物構象的變化，對平衡后的復合物進行了三次恒速拉伸分子動力學模擬，分析拉伸過程中拉力、復合物接觸面的氫鍵數目以及復合物的構象變化。由圖 3 可以看出三次獨立的拉伸模擬實驗中，拉力隨拉伸時間的變化以及氫鍵數目隨拉伸時間的變化均表現出相似的趨勢：拉伸前 11 ns，拉力隨著時間呈現總體上升的趨勢，但接觸面的氫鍵數目卻相對保持穩定；當拉伸至 12～15 ns 之間，拉力突然下降，氫鍵也隨之迅速斷裂，直至為 0，復合物發生解離。三次 SMD 的解離時間集中在 11～15 ns，解離力在 250 pN 左右。
圖3
三次拉伸過程中拉力和氫鍵數目的變化情況
Figure3.
The changes of force and hydrogen bond number in three SMDs
通過分析 CD44/FERM 復合物在拉伸過程中的構象變化（如圖 4 所示），可以看出在拉伸的初始階段復合物的構象比較穩定。但在 6.4 ns 左右，隨著拉力的不斷上升，FERM 結構域 C 末端 α 螺旋開始發生解折疊；在 9 ns 左右，α 螺旋已經完全解折疊，拉力繼續上升；隨后，在 13 ns 左右，復合物分子之間的鍵合不敵外力，CD44 與 FERM 結構域完全解離。
圖4
拉伸過程中 FERM 結構域的構象變化
Figure4.
Conformational changes of FERM domain during SMD process
2.4 拉伸過程中磷酸化位點的暴露
在拉力的作用下，CD44/FERM 復合物解離之前發生的解折疊過程表明了該復合物結合的穩定性，同時也提示解折疊的過程可能有利于 ITAM-like 序列以及磷酸化位點的暴露。通過對解折疊構象演變的分析（如圖 4 所示），發現在拉伸之前 ITAM-like 序列（紅色，Tube 模型）像是一條“繩子”蜷縮在結構域內并連接著 B 亞域和 C 亞域。隨著解折疊的進行，B、C 亞域逐漸分離，ITAM-like 序列逐漸被拉出并暴露在溶劑中。為了檢驗力學信號是否能夠介導 FERM 結構域上磷酸化位點 Y191（紫色，Licorice 模型）和 Y205（深藍，Licorice 模型）的暴露，提取了復合物在拉伸過程中的局部空間構象，圖 5 展示了 0、6.4、9、13 ns 時的構象。可以發現在拉力的作用下，C 亞域結構逐漸松散，開始被包埋在復合物結構里面的 Y205 逐漸發生了暴露，而在整個過程中 Y191 始終都被包埋在結構中沒有發生暴露。
圖5
拉伸過程中磷酸化位點 Y205 的暴露
Figure5.
Exposure of phosphorylation site Y205 during SMD process
2.5 SASA 值的分析
為了定量表征拉伸過程中 ITAM-like 序列、Y191 和 Y205 的暴露程度，本文以半徑為 1.4 ?的水分子作為探針，分別對平衡過程以及拉伸過程中它們的 SASA 值進行跟蹤和計算分析。在平衡過程中，ITAM-like 序列、Y191 和 Y205 的 SASA 值的時間歷程如圖 6 所示，其數學平均值分別為 652.44、5.21、36.22 ?2，且總體上 SASA 值變化幅度不大，說明在沒有外力作用時它們周圍確實存在著較大的空間位阻。而從它們各自三次恒速拉伸過程中 SASA 值的時間歷程可以看出：ITAM-like 序列和 Y205 的 SASA 值都有明顯的增大，而且波動幅度提高，其中 ITAM-like 序列能從最初的 600 ?2增大到 900 ?2，Y205 能從最初的 20 ?2增大到 100 ?2。但 Y191 的 SASA 值變化幅度不大，且始終保持在 30 ?2以下。
圖6
平衡以及三次 SMD 過程中 ITAM-like 序列以及 Y191 和 Y205 SASA 值的時間歷程
Figure6.
Time courses of SASAs of ITAM-like motif, Y191 and Y205 in the equilibrium and three SMDs
隨后，對其在無外力作用下的平衡過程和有外力作用下的拉伸過程的 SASA 值進行了統計學分析（u 檢驗，檢驗水準為 0.01），用平均值和標準誤表示（如圖 7 所示）。ITAM-like 序列在平衡過程以及拉伸過程中的 SASA 值分別為（652.44 ± 2.11）?2和（709.18 ± 2.10）?2，增大了約 9%，兩者之間差異有統計學意義（P < 0.01）。Y205 的 SASA 值分別為（36.22 ± 0.25）? 2和（49.04 ± 0.31）?2，增大了約 35%，兩者之間差異有統計學意義（P < 0.01）。Y191 的 SASA 值分別為（5.21 ± 0.07）? 2和（8.26 ± 0.12）?2，兩者之間差異雖然有統計學意義（P < 0.01），但由于空間位阻的影響，SASA 值一直較小且變化幅度不大。
上述結果表明，力學信號在腫瘤細胞的增殖、黏附以及遷移過程中發揮了重要作用。在血流環境下，HA 與 CD44 相互作用產生的力學信號可以通過 CD44 介導 FERM 結構域中 ITAM-like 序列以及磷酸化位點 Y205 的暴露，有利于 ERM 蛋白上關鍵位點的磷酸化及其與 Syk 的結合，進而激活下游信號通路，實現胞內信號的轉導，調控腫瘤細胞的新陳代謝過程。
圖7
平衡過程和拉伸過程中 ITAM-like 序列、Y191 和 Y205 的 SASA 值統計分析（** P < 0.01）
Figure7.
SASA statistical analysis of ITAM-like motif, Y191 and Y205 in the equilibrium and SMD (** P < 0.01)
3 討論和展望
CD44 胞外域能與 HA 結合，胞內域則能夠與 ERM 蛋白的 FERM 結構域結合，是連接胞外基質與細胞骨架的紐帶[2]，同時還是一種力敏感蛋白，力可上調其與 HA 的親和力[18]。而 ERM 蛋白則是力-化學信號的接受者，同時由于 ERM 蛋白通過其 C 末端的肌動蛋白結合區域連接著細胞骨架，繼而將力傳遞給細胞骨架蛋白。ERM 蛋白上的 ITAM-like 序列以及磷酸化位點 Y191 和 Y205 的磷酸化對于招募 Syk 分子、激活 Src 家族激酶、引發細胞鈣響應進而促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲是至關重要的。然而，CD44/FERM 復合物晶體結構表明 FERM 結構域中的 ITAM-like 序列以及磷酸化位點 Y191 和 Y205 都被包埋在了結構里面（如圖 1a 所示），阻礙了 ERM 蛋白的磷酸化以及對 Syk 的招募。因此，我們推斷外力可能導致 ERM 蛋白構象變化，進而暴露 ITAM-like 序列以及上面的磷酸化位點。
我們采用分子動力學模擬方法，比較無外力作用的平衡過程及恒速拉伸過程中復合物接觸面分子的相互作用、構象變化以及 ITAM-like 序列和磷酸化位點 Y191、Y205 的暴露程度，探索力-化學信號偶聯調控 ERM 蛋白磷酸化的過程和分子結構基礎。模擬結果顯示 CD44/FERM 復合物在整個平衡過程中都很穩定（如圖 2 所示），靜態結構中觀察到的接觸面上的重要氫鍵也保持著較高的生存率（如表 1 所示），同時在整個過程中，ITAM-like 序列以及磷酸化位點始終被包埋在結構內，沒有發生暴露。然而，在恒速拉伸動力學模擬過程，復合物結構不再穩定，FERM 結構域的 α 螺旋先發生解折疊，隨后 CD44/FERM 復合物發生解離（如圖 4 所示）。在解折疊的過程中，通過對復合物構象（如圖 5 所示）的觀察，發現 ITAM-like 序列和磷酸化位點 Y205 都發生了明顯的暴露，并進一步被 ITAM-like 序列和磷酸化位點 Y205 的 SASA 值的定量統計學檢驗所證實（如圖 7 所示），說明外力能夠有效地使 ITAM-like 序列和磷酸化位點 Y205 發生暴露，以便于后續的磷酸化以及對 Syk 的招募。
由于計算資源的限制，與單分子的原子力顯微鏡及光鑷實驗比較，一般模擬計算的拉伸速度要高 3～4 個數量級，而拉力則高 1～2 個數量級[29-30]，分子動力學模擬方法的優點在于能再現實驗無法觀察到的分子構象的動態變化，因此成為一個越來越重要的研究工具。P 選擇素糖蛋白受體 1（P-selectin glycoprotein ligand 1, PSGL-1）具有類似 CD44 的結構，結合配體后胞質區可與 FERM 結構鍵合，在白細胞的捕獲和黏附中發揮關鍵作用[20]。我們實驗室前期曾模擬血流剪應力作用下 PSGL-1/FERM 的相互作用[27]，得到的拉伸斷裂力在 250～300 pN，解離時間在 20～25 ns，均高于 CD44/FERM 的 250 pN 和 11～15 ns，另外其 ITAM-like 序列及其磷酸化位點 Y205 的暴露程度也高于 CD44/FERM。因此我們推斷 CD44 承受并傳遞外力給骨架蛋白的能力、活化 Syk 信號分子的能力可能不如 PSGL-1，但外力可能有助于 CD44 近膜端的酶切，從而脫離細胞膜進入細胞核去調控基因的復制與轉錄，最終上調 CD44 的表達。
本研究在原子水平揭示了力學信號在 HA、CD44、ERM 以及 F-actin 之間信號傳導的重要作用，進一步證實了 PSGL-1/FERM 分子體系中的發現：外力有利于 FERM 結構域中 ITAM-like 序列上磷酸化位點的暴露，有助于下游 Syk 的磷酸化募集。同時也給研究者以啟發：力敏感蛋白可能具有共性，除接受并傳遞力學信號外，還能引起自身及下游信號分子的構象變化，從而加速啟動下游信號級聯反應。
