樹鼩是一種新型的優質實驗動物模型。本研究針對樹鼩感染相關的細胞因子白介素 6（IL-6）、IL-8、IL-10、IL-17A、γ-干擾素（IFN-γ）及管家基因磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）建立熒光定量聚合酶鏈式反應檢測方法。研究證明所建立方法具有良好的特異性。線性范圍高點可達到 1 × 1010 copies，低點則至 10 copies（IL-6、IL-17A）、100 copies（IL-10、GAPDH）和 1 000 copies（IL-8、IFN-γ）不等，在此區間各試劑線性相關系數 R2 均大于 0.99。IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A、IFN-γ 和 GAPDH 最低檢測值分別在 8、8、4、8、128、4 copies。研究表明所建立的檢測方法具有很好的特異性、靈敏度及較廣的線性范圍，適用于多重濃度范圍的樣品檢測，可用于后續樹鼩細胞因子的研究工作。
引用本文： 李瀟, 劉文寬, 邱淑燕, 許多, 周志超, 田新貴, 李熾, 辜淑君, 周榮. 樹鼩感染相關細胞因子熒光定量 PCR 檢測方法的建立. 生物醫學工程學雜志, 2019, 36(3): 407-413. doi: 10.7507/1001-5515.201801036 復制
引言
樹鼩（Tupaia belangeri，tree shrew）是一種形似松鼠的小型哺乳動物，在分類學上屬于哺乳綱、有胎盤類，是一個獨立的目，稱為攀鼩目（Scandentia）。其主要分布在熱帶和亞熱帶，如我國云南、廣西、廣東和海南等地，以及東南亞的印度恒河北部、緬甸、越南、泰國、馬來西亞、印尼和菲律賓等地。樹鼩具有體型小、繁殖快、價格較為低廉以及易馴養和飼育的特點，新陳代謝比犬、鼠等動物更接近于人，解剖結構也更近似于人，許多分子與細胞結構與人類近似[1]，因而是一種重要的新型實驗動物。樹鼩在醫學生物學上的用途很多，受到許多學者的重視。目前利用樹鼩開展的研究已經涉及到形態解剖學、生態學、行為學、人類學、生物化學、遺傳學、心理學、神經生物學、繁殖生物學、胚胎學、寄生蟲學、病毒學、免疫學、病理學以及運動生理、急慢性壓力的影響和應激等社會生物學的研究[2-7]。
樹鼩作為一種新的優質動物模型，其研究還處于早期階段。目前其重要的配套資源如細胞因子等的抗體的商品化仍未做到如小鼠等動物那樣全面，而細胞因子水平是研究機體免疫活動的重要指標，如與感染密切相關的白介素（interleukin，IL）6（IL-6）、IL-8、IL-10、IL-17A、γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）等[8-9]。雖然目前樹鼩還未有成熟的商品化的細胞因子抗體，無法進行基于免疫學技術的細胞因子水平檢測，但得益于樹鼩全基因組數據的獲得[10]，可以通過檢測相關 mRNA 的方法進行細胞因子檢測。
本研究基于 Taqman 探針法熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術，通過對常見的感染相關細胞因子 IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A、IFN-γ 進行序列分析，同時設計樹鼩管家基因磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）mRNA 作為內參，建立高特異性、高靈敏度、快速、操作簡單方便的樹鼩常見感染相關細胞因子的檢測及定量試劑，用于體內細胞因子水平的研究分析。
1 材料與方法
1.1 材料
樹鼩購自昆明醫科大學實驗動物中心（樹鼩生產許可證號：SCXK（滇）K2013-0002）；人喉癌上皮細胞 Hep-2、犬腎細胞 MDCK、E.coli TOP10、E.coli DH5а均由呼吸疾病國家重點實驗室呼吸疾病生物資源庫保存。本研究通過廣東省實驗動物監測所 IACUC 審核（編號：I-IACUC2015002）。
1.2 試劑與儀器
M-MLV 逆轉錄酶、Taq DNA 聚合酶與 dNTPs（美國 Promega 公司），優化的 5 × 一步法 RT-PCR 緩沖液 5 × reaction buffer 各成分配制含量為 250 mmol/L Tris-Cl［pH 8.9］、375 mmol/L KCl、20 mmol/L MgCl2 和 50% 甘油，Trizol（美國 Invitrogen 公司），小鼠淋巴細胞分離液（天津灝洋生物制品科技有限公司），E.coli TOP10 感受態細胞、TIANprep DNA gel extraction kit 及 TIANprep Plasmid extraction kit（天根生物公司），pMD-18T（寶生物（大連）工程有限公司），ABI 7500 熒光定量 PCR 儀（美國 ABI 公司），NanoDrop ONE 分光光度計（美國 Thermo Scientific 公司）。
1.3 樹鼩 IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A、IFN-γ 及內參樹鼩 GAPDH 跨內含子引物探針設計
本方法采用 Taqman 探針技術，通過 Genebank 中樹鼩基因組及其 mRNA 的信息，查找的 IL-6（NW_006207386.1、KU519627.1、XM_006169841.2）、IL-8（LC218169.1、KJ126716.1）、IL-10（XM_006159278.1、NW_006160147.1、KC905630.1）、IL-17A（NW_006208319.1、XM_006170444.1）、IFN-γ（XM_006147283.1、NW_006159683.1）及樹鼩內參 GAPDH mRNA（XM_006170849.1）的序列資料，并對比分析樹鼩基因組序列信息，對各目標分子的跨內含子保守區進行引物探針設計，詳細序列見表 1 所示。其中引物由華大基因公司合成，探針由寶生物工程（大連）公司合成。
表1
樹鼩感染相關細胞因子引物及 GAPDH 探針序列
Table1.
Primers and probes of infection-related cytokines and GAPDH of tree shrew
1.4 熒光 PCR 檢測試劑建立及特異性實驗
1.4.1 核酸提取
實驗分別取 2 只樹鼩各 1 mL 抗凝全血，使用小鼠淋巴細胞分離液按照說明書進行淋巴細胞分離，加入 500 μL Trizol 進行 RNA 提取，最終得到 100 μL 提取 RNA，操作按照核酸提取試劑說明書進行。同時分別提取 5 × 105 左右的 MDCK 細胞 2 例、Hep-2 細胞 2 例及 1 mL 過夜培養的 E.coli TOP10、E.coli DH5a 各 1 例作為對照，方法同上。
1.4.2 檢測試劑建立
25 μL 反應體系中含有 5 × 一步法 RT-PCR 緩沖液 5 × reaction buffer 5 μL、dNTPs（10 mmol/L each）1.5 μL、正/反向引物（10 mmol/L each）各 1 μL、各組對應探針（10 mmol/L）0.3 μL、M-MLV 逆轉錄酶（200 U/μL）0.25 μL、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、RNase Free dH2O 10.75 μL、提取的樣品核酸 5 μL。使用 ABI7500 熒光定量 PCR 儀進行反應，條件為：逆轉錄 48℃ 10 min；預變性 94℃ 2 min；循環條件：94℃ 10 s、55℃ 35 s（此步讀取熒光值），40 個循環。實驗中同時設置未加逆轉錄酶 M-MLV 的實驗組，用于驗證檢測方法排除 DNA 干擾的能力。
1.4.3 陽性 PCR 產物 T 載體克隆及測序驗證特異性
擴增后陽性片段使用膠回收試劑盒進行回收。回收產物用于 pMD-18T 連接，并轉化至 E.coli TOP10 感受態細胞中，后涂布于 LB-Amp 固體培養基平板中 37℃ 過夜培養。第二天挑取單克隆菌落接種于 3 mL 的 LB-Amp 液體培養中，37℃ 200 r/min 過夜培養。培養液直接送檢用于測序分析（華大基因公司），并對比結果是否為正確的樹鼩細胞因子序列。
1.5 檢測試劑的擴增線性范圍及標準曲線
使用已經構建的含有樹鼩目標檢測片段的 T 載體克隆質粒作為靈敏度實驗樣品，對檢測試劑的線性范圍進行檢測驗證。
（1）培養含有樹鼩 IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A、IFN-γ 及 GAPDH 各目標片段的 T 載體質粒的細菌，并使用 TIANprep Plasmid extraction kit 提取質粒，步驟依照產品說明書進行。
（2）提取的質粒使用 NanoDrop ONE 分光光度計測量核酸濃度。根據其各自分子量和濃度計算得出 IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A、IFN-γ 及 GAPDH 的 T 載體質粒的最終分子濃度分別為 5.85 × 1010、6.76 × 1010、7.02 × 1010、6.46 × 1010、7.29 × 1010、5.34 × 1010 copies/μL。
（3）質粒 10 倍梯度稀釋，使 5 μL 上機檢測的模板中分別含有 1 × 1010、1 × 109、1 × 108、1 × 107、1 × 106、0.2 × 105、1 × 104、1 × 103、1 × 102、1 × 101、1 × 100 copies 的質粒。擴增檢測，驗證所建立試劑的線性范圍及標準曲線方程。
1.6 檢測試劑的最低檢測量
為驗證所建立的試劑的最低核酸檢測量，使用低濃度的含目標片段的 T 載體質粒，逐步 2 倍稀釋后進行擴增檢測，使 5 μL 上機檢測的模板中分別含有 1 × 210、1 × 29、1 × 28、1 × 27、1 × 26、1 × 25、1 × 24、1 × 23、1 × 22、1 × 21、1 × 20 copies 的質粒。擴增檢測，驗證所建立試劑的最低檢測量。
2 實驗結果
2.1 樹鼩常見感染相關細胞因子熒光 PCR 檢測方法建立及特異性
使用樹鼩血液淋巴細胞、犬來源的 MDCK 細胞、人來源的 Hep-2 細胞及 E.coli 進行試劑特異性檢測。結果表明該套細胞因子檢測體系具有良好的特異性，未在非樹鼩來源的樣品中檢測出陽性（見表 2）。實驗同時設置不加逆轉錄酶 M-MLV 實驗，驗證跨內含子引物探針設計對排除 DNA 干擾的能力。結果未加逆轉錄酶的樣品檢測中都為陰性（見表 2）。進一步對熒光 PCR 檢測陽性的樣品進行 T 載體克隆后測序表明都為目標片段，結果如圖 1 所示。
表2
樹鼩常見感染相關細胞因子及 GAPDH 熒光定量 PCR 特異性檢測
Table2.
Specificity testing of real-time PCR for infection-related cytokines and GAPDH of tree shrew
圖1
測序分析樹鼩細胞因子及 GAPDH 熒光定量 PCR 擴增片段
Figure1.
Sequence analysis of the positive products of real-time PCR for cytokines and GAPDH of tree shrew
2.2 檢測方法的擴增線性范圍及標準曲線
使用 5 μL 稀釋好的含有 1～1 × 1010 copies 的樹鼩目標檢測片段的 T 載體克隆質粒作為靈敏度實驗樣品，驗證所建立試劑的線性范圍。結果顯示 IL-6 在 1 × 1010～10 copies、IL-8 在 1 × 1010～1 × 103 copies、IL-10 在 1 × 1010～100 copies、IL-17A 在 1 × 1010～10 copies、IFN-γ 在 1 × 1010～1 × 103 copies 及 GAPDH 在 1 × 1010～100 copies 模板下均具有很好的線性。在此區間建立標準曲線，各試劑線性相關系數 R2 均大于 0.99（見圖 2、表 3）。
圖2
樹鼩細胞因子及其內參 GAPDH 熒光定量 PCR 擴增圖譜及標準曲線
Figure2.
Amplification and standard curves of real-time PCR for cytokines and GAPDH of tree shrew
表3
樹鼩細胞因子及 GAPDH 熒光定量 PCR 擴增線性范圍 及標準曲線
Table3.
Amplification linear ranges and standard curves of real- time PCR for cytokines and GAPDH of tree shrew
2.3 檢測試劑的最低檢測量
為驗證建立的試劑的最低核酸檢測量，使用低濃度的含目標片段的 T 載體質粒，逐步稀釋后進行擴增檢測。結果表明試劑最低可檢測到：IL-6 為 8 copies，IL-8 為 8 copies，IL-10 為 4 copies，IL-17A 為 8 copies，IFN-γ 為 128 copies，GAPDH 為 4 copies。其擴增曲線在此濃度下仍可清晰判斷陰陽性（見圖 3）。
圖3
樹鼩細胞因子及 GAPDH 熒光定量 PCR 最低檢測模板擴增曲線
Figure3.
Amplification curves of real-time PCR for detection of minimum templates of cytokines and GAPDH of tree shrew
3 討論
樹鼩是一種在多個方面比犬、鼠等更接近人的優質小型動物模型，其本身的諸多優點使其受到廣泛的關注，也已經被用于醫學生物學多個方向的研究，取得了較好的效果。但總體上，樹鼩作為實驗動物的研究仍處于早期階段，其品系開發及對應的商品化的產品仍不完善，這在一定程度上也限制了樹鼩在研究中的應用。2013 年 Fan 等[10]報道了樹鼩的全基因組結果，為基于核酸檢測的研究方法的建立奠定了重要基礎，對其發展具有重大的推動作用。
本研究中針對樹鼩感染相關的常見細胞因子 IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A、IFN-γ 及管家基因 GAPDH 的保守區序列特點，基于 Taqman real-time PCR 技術方法設計了跨內含子的引物、探針，并用于檢測試劑中。該方法通過驗證，具有很好的特異性和靈敏度。設計管家基因 GAPDH 作為內參，可直接對采樣的效果進行質控；同時，樣品采集后處理、核酸提取等過程是否合格，也可以通過檢測樣品中的管家基因進行質控。因此，通過 GAPDH 的引入對采樣效果及核酸提取進行有效質控，可有效減少試劑的假陰性結果。
本研究通過使用樹鼩淋巴細胞和其他非樹鼩來源的真核、原核樣品核酸驗證檢測試劑的特異性，結果未見非特異擴增產生（見表 2）。對陽性擴增產物的測序分析也確認為樹鼩細胞因子的目標序列（見圖 1），進一步驗證了試劑的特異性。同時實驗證明跨內含子引物、探針設計有效地避免了基因組污染的問題，無需對模板進行 DNA 酶切消化，減少了對 RNA 的損傷，提高了試劑的應用效果和實驗的精確性。
在對各組試劑靈敏度的檢測中發現，各組試劑的線性范圍高點可達到 1 × 1010 copies，低點在 IL-6 和 IL-17A 為 10 copies，在 IL-10 和 GAPDH 為 100 copies，在 IL-8 和 IFN-γ 為 1 000 copies（見表 3）。在此區間內擴增圖譜呈現標準 S 型和很好的梯度（見圖 2）。該區間內建立的標準曲線的線性相關系數 R2 均大于 0.99，同時斜率相近，標準曲線基本平行。在最低濃度檢測中，IL-6 在 8 copies、IL-8 在 8 copies、IL-10 在 4 copies、IL-17A 在 8 copies、IFN-γ 在 128 copies、GAPDH 在 4 copies 模板量下仍能準確判斷陰陽性。這些結果都說明所建立的檢測試劑具有很好的靈敏度及較廣的線性范圍，適用于多重濃度范圍的樣品檢測。
綜合上面的實驗表明，本研究所研發的樹鼩感染相關細胞因子及其內參 GAPDH real-time PCR 檢測試劑具有特異性高、靈敏度高、線性范圍廣、易操作等特點，可以用于樹鼩感染相關細胞因子檢測，具有良好的應用前景。
致謝：此研究得到廣州呼吸健康研究院馬婧的協助，在此表示衷心感謝。
引言
樹鼩（Tupaia belangeri，tree shrew）是一種形似松鼠的小型哺乳動物，在分類學上屬于哺乳綱、有胎盤類，是一個獨立的目，稱為攀鼩目（Scandentia）。其主要分布在熱帶和亞熱帶，如我國云南、廣西、廣東和海南等地，以及東南亞的印度恒河北部、緬甸、越南、泰國、馬來西亞、印尼和菲律賓等地。樹鼩具有體型小、繁殖快、價格較為低廉以及易馴養和飼育的特點，新陳代謝比犬、鼠等動物更接近于人，解剖結構也更近似于人，許多分子與細胞結構與人類近似[1]，因而是一種重要的新型實驗動物。樹鼩在醫學生物學上的用途很多，受到許多學者的重視。目前利用樹鼩開展的研究已經涉及到形態解剖學、生態學、行為學、人類學、生物化學、遺傳學、心理學、神經生物學、繁殖生物學、胚胎學、寄生蟲學、病毒學、免疫學、病理學以及運動生理、急慢性壓力的影響和應激等社會生物學的研究[2-7]。
樹鼩作為一種新的優質動物模型，其研究還處于早期階段。目前其重要的配套資源如細胞因子等的抗體的商品化仍未做到如小鼠等動物那樣全面，而細胞因子水平是研究機體免疫活動的重要指標，如與感染密切相關的白介素（interleukin，IL）6（IL-6）、IL-8、IL-10、IL-17A、γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）等[8-9]。雖然目前樹鼩還未有成熟的商品化的細胞因子抗體，無法進行基于免疫學技術的細胞因子水平檢測，但得益于樹鼩全基因組數據的獲得[10]，可以通過檢測相關 mRNA 的方法進行細胞因子檢測。
本研究基于 Taqman 探針法熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術，通過對常見的感染相關細胞因子 IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A、IFN-γ 進行序列分析，同時設計樹鼩管家基因磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）mRNA 作為內參，建立高特異性、高靈敏度、快速、操作簡單方便的樹鼩常見感染相關細胞因子的檢測及定量試劑，用于體內細胞因子水平的研究分析。
1 材料與方法
1.1 材料
樹鼩購自昆明醫科大學實驗動物中心（樹鼩生產許可證號：SCXK（滇）K2013-0002）；人喉癌上皮細胞 Hep-2、犬腎細胞 MDCK、E.coli TOP10、E.coli DH5а均由呼吸疾病國家重點實驗室呼吸疾病生物資源庫保存。本研究通過廣東省實驗動物監測所 IACUC 審核（編號：I-IACUC2015002）。
1.2 試劑與儀器
M-MLV 逆轉錄酶、Taq DNA 聚合酶與 dNTPs（美國 Promega 公司），優化的 5 × 一步法 RT-PCR 緩沖液 5 × reaction buffer 各成分配制含量為 250 mmol/L Tris-Cl［pH 8.9］、375 mmol/L KCl、20 mmol/L MgCl2 和 50% 甘油，Trizol（美國 Invitrogen 公司），小鼠淋巴細胞分離液（天津灝洋生物制品科技有限公司），E.coli TOP10 感受態細胞、TIANprep DNA gel extraction kit 及 TIANprep Plasmid extraction kit（天根生物公司），pMD-18T（寶生物（大連）工程有限公司），ABI 7500 熒光定量 PCR 儀（美國 ABI 公司），NanoDrop ONE 分光光度計（美國 Thermo Scientific 公司）。
1.3 樹鼩 IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A、IFN-γ 及內參樹鼩 GAPDH 跨內含子引物探針設計
本方法采用 Taqman 探針技術，通過 Genebank 中樹鼩基因組及其 mRNA 的信息，查找的 IL-6（NW_006207386.1、KU519627.1、XM_006169841.2）、IL-8（LC218169.1、KJ126716.1）、IL-10（XM_006159278.1、NW_006160147.1、KC905630.1）、IL-17A（NW_006208319.1、XM_006170444.1）、IFN-γ（XM_006147283.1、NW_006159683.1）及樹鼩內參 GAPDH mRNA（XM_006170849.1）的序列資料，并對比分析樹鼩基因組序列信息，對各目標分子的跨內含子保守區進行引物探針設計，詳細序列見表 1 所示。其中引物由華大基因公司合成，探針由寶生物工程（大連）公司合成。
表1
樹鼩感染相關細胞因子引物及 GAPDH 探針序列
Table1.
Primers and probes of infection-related cytokines and GAPDH of tree shrew
1.4 熒光 PCR 檢測試劑建立及特異性實驗
1.4.1 核酸提取
實驗分別取 2 只樹鼩各 1 mL 抗凝全血，使用小鼠淋巴細胞分離液按照說明書進行淋巴細胞分離，加入 500 μL Trizol 進行 RNA 提取，最終得到 100 μL 提取 RNA，操作按照核酸提取試劑說明書進行。同時分別提取 5 × 105 左右的 MDCK 細胞 2 例、Hep-2 細胞 2 例及 1 mL 過夜培養的 E.coli TOP10、E.coli DH5a 各 1 例作為對照，方法同上。
1.4.2 檢測試劑建立
25 μL 反應體系中含有 5 × 一步法 RT-PCR 緩沖液 5 × reaction buffer 5 μL、dNTPs（10 mmol/L each）1.5 μL、正/反向引物（10 mmol/L each）各 1 μL、各組對應探針（10 mmol/L）0.3 μL、M-MLV 逆轉錄酶（200 U/μL）0.25 μL、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、RNase Free dH2O 10.75 μL、提取的樣品核酸 5 μL。使用 ABI7500 熒光定量 PCR 儀進行反應，條件為：逆轉錄 48℃ 10 min；預變性 94℃ 2 min；循環條件：94℃ 10 s、55℃ 35 s（此步讀取熒光值），40 個循環。實驗中同時設置未加逆轉錄酶 M-MLV 的實驗組，用于驗證檢測方法排除 DNA 干擾的能力。
1.4.3 陽性 PCR 產物 T 載體克隆及測序驗證特異性
擴增后陽性片段使用膠回收試劑盒進行回收。回收產物用于 pMD-18T 連接，并轉化至 E.coli TOP10 感受態細胞中，后涂布于 LB-Amp 固體培養基平板中 37℃ 過夜培養。第二天挑取單克隆菌落接種于 3 mL 的 LB-Amp 液體培養中，37℃ 200 r/min 過夜培養。培養液直接送檢用于測序分析（華大基因公司），并對比結果是否為正確的樹鼩細胞因子序列。
1.5 檢測試劑的擴增線性范圍及標準曲線
使用已經構建的含有樹鼩目標檢測片段的 T 載體克隆質粒作為靈敏度實驗樣品，對檢測試劑的線性范圍進行檢測驗證。
（1）培養含有樹鼩 IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A、IFN-γ 及 GAPDH 各目標片段的 T 載體質粒的細菌，并使用 TIANprep Plasmid extraction kit 提取質粒，步驟依照產品說明書進行。
（2）提取的質粒使用 NanoDrop ONE 分光光度計測量核酸濃度。根據其各自分子量和濃度計算得出 IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A、IFN-γ 及 GAPDH 的 T 載體質粒的最終分子濃度分別為 5.85 × 1010、6.76 × 1010、7.02 × 1010、6.46 × 1010、7.29 × 1010、5.34 × 1010 copies/μL。
（3）質粒 10 倍梯度稀釋，使 5 μL 上機檢測的模板中分別含有 1 × 1010、1 × 109、1 × 108、1 × 107、1 × 106、0.2 × 105、1 × 104、1 × 103、1 × 102、1 × 101、1 × 100 copies 的質粒。擴增檢測，驗證所建立試劑的線性范圍及標準曲線方程。
1.6 檢測試劑的最低檢測量
為驗證所建立的試劑的最低核酸檢測量，使用低濃度的含目標片段的 T 載體質粒，逐步 2 倍稀釋后進行擴增檢測，使 5 μL 上機檢測的模板中分別含有 1 × 210、1 × 29、1 × 28、1 × 27、1 × 26、1 × 25、1 × 24、1 × 23、1 × 22、1 × 21、1 × 20 copies 的質粒。擴增檢測，驗證所建立試劑的最低檢測量。
2 實驗結果
2.1 樹鼩常見感染相關細胞因子熒光 PCR 檢測方法建立及特異性
使用樹鼩血液淋巴細胞、犬來源的 MDCK 細胞、人來源的 Hep-2 細胞及 E.coli 進行試劑特異性檢測。結果表明該套細胞因子檢測體系具有良好的特異性，未在非樹鼩來源的樣品中檢測出陽性（見表 2）。實驗同時設置不加逆轉錄酶 M-MLV 實驗，驗證跨內含子引物探針設計對排除 DNA 干擾的能力。結果未加逆轉錄酶的樣品檢測中都為陰性（見表 2）。進一步對熒光 PCR 檢測陽性的樣品進行 T 載體克隆后測序表明都為目標片段，結果如圖 1 所示。
表2
樹鼩常見感染相關細胞因子及 GAPDH 熒光定量 PCR 特異性檢測
Table2.
Specificity testing of real-time PCR for infection-related cytokines and GAPDH of tree shrew
圖1
測序分析樹鼩細胞因子及 GAPDH 熒光定量 PCR 擴增片段
Figure1.
Sequence analysis of the positive products of real-time PCR for cytokines and GAPDH of tree shrew
2.2 檢測方法的擴增線性范圍及標準曲線
使用 5 μL 稀釋好的含有 1～1 × 1010 copies 的樹鼩目標檢測片段的 T 載體克隆質粒作為靈敏度實驗樣品，驗證所建立試劑的線性范圍。結果顯示 IL-6 在 1 × 1010～10 copies、IL-8 在 1 × 1010～1 × 103 copies、IL-10 在 1 × 1010～100 copies、IL-17A 在 1 × 1010～10 copies、IFN-γ 在 1 × 1010～1 × 103 copies 及 GAPDH 在 1 × 1010～100 copies 模板下均具有很好的線性。在此區間建立標準曲線，各試劑線性相關系數 R2 均大于 0.99（見圖 2、表 3）。
圖2
樹鼩細胞因子及其內參 GAPDH 熒光定量 PCR 擴增圖譜及標準曲線
Figure2.
Amplification and standard curves of real-time PCR for cytokines and GAPDH of tree shrew
表3
樹鼩細胞因子及 GAPDH 熒光定量 PCR 擴增線性范圍 及標準曲線
Table3.
Amplification linear ranges and standard curves of real- time PCR for cytokines and GAPDH of tree shrew
2.3 檢測試劑的最低檢測量
為驗證建立的試劑的最低核酸檢測量，使用低濃度的含目標片段的 T 載體質粒，逐步稀釋后進行擴增檢測。結果表明試劑最低可檢測到：IL-6 為 8 copies，IL-8 為 8 copies，IL-10 為 4 copies，IL-17A 為 8 copies，IFN-γ 為 128 copies，GAPDH 為 4 copies。其擴增曲線在此濃度下仍可清晰判斷陰陽性（見圖 3）。
圖3
樹鼩細胞因子及 GAPDH 熒光定量 PCR 最低檢測模板擴增曲線
Figure3.
Amplification curves of real-time PCR for detection of minimum templates of cytokines and GAPDH of tree shrew
3 討論
樹鼩是一種在多個方面比犬、鼠等更接近人的優質小型動物模型，其本身的諸多優點使其受到廣泛的關注，也已經被用于醫學生物學多個方向的研究，取得了較好的效果。但總體上，樹鼩作為實驗動物的研究仍處于早期階段，其品系開發及對應的商品化的產品仍不完善，這在一定程度上也限制了樹鼩在研究中的應用。2013 年 Fan 等[10]報道了樹鼩的全基因組結果，為基于核酸檢測的研究方法的建立奠定了重要基礎，對其發展具有重大的推動作用。
本研究中針對樹鼩感染相關的常見細胞因子 IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A、IFN-γ 及管家基因 GAPDH 的保守區序列特點，基于 Taqman real-time PCR 技術方法設計了跨內含子的引物、探針，并用于檢測試劑中。該方法通過驗證，具有很好的特異性和靈敏度。設計管家基因 GAPDH 作為內參，可直接對采樣的效果進行質控；同時，樣品采集后處理、核酸提取等過程是否合格，也可以通過檢測樣品中的管家基因進行質控。因此，通過 GAPDH 的引入對采樣效果及核酸提取進行有效質控，可有效減少試劑的假陰性結果。
本研究通過使用樹鼩淋巴細胞和其他非樹鼩來源的真核、原核樣品核酸驗證檢測試劑的特異性，結果未見非特異擴增產生（見表 2）。對陽性擴增產物的測序分析也確認為樹鼩細胞因子的目標序列（見圖 1），進一步驗證了試劑的特異性。同時實驗證明跨內含子引物、探針設計有效地避免了基因組污染的問題，無需對模板進行 DNA 酶切消化，減少了對 RNA 的損傷，提高了試劑的應用效果和實驗的精確性。
在對各組試劑靈敏度的檢測中發現，各組試劑的線性范圍高點可達到 1 × 1010 copies，低點在 IL-6 和 IL-17A 為 10 copies，在 IL-10 和 GAPDH 為 100 copies，在 IL-8 和 IFN-γ 為 1 000 copies（見表 3）。在此區間內擴增圖譜呈現標準 S 型和很好的梯度（見圖 2）。該區間內建立的標準曲線的線性相關系數 R2 均大于 0.99，同時斜率相近，標準曲線基本平行。在最低濃度檢測中，IL-6 在 8 copies、IL-8 在 8 copies、IL-10 在 4 copies、IL-17A 在 8 copies、IFN-γ 在 128 copies、GAPDH 在 4 copies 模板量下仍能準確判斷陰陽性。這些結果都說明所建立的檢測試劑具有很好的靈敏度及較廣的線性范圍，適用于多重濃度范圍的樣品檢測。
綜合上面的實驗表明，本研究所研發的樹鼩感染相關細胞因子及其內參 GAPDH real-time PCR 檢測試劑具有特異性高、靈敏度高、線性范圍廣、易操作等特點，可以用于樹鼩感染相關細胞因子檢測，具有良好的應用前景。
致謝：此研究得到廣州呼吸健康研究院馬婧的協助，在此表示衷心感謝。
