本文旨在研究微重力環境對 MC3T3-E1 細胞成骨分化的影響，并進一步探討微重力環境下核因子 κB（NF-κB）信號通路對成骨細胞零重力的響應機制。將 MC3T3-E1 細胞分別進行正常培養（CON）和模擬微重力培養（SMG），培養期滿后觀察成骨性相關分子表達變化以及 NF-κB 信號通路變化情況。結果顯示，在微重力條件下，堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）、一型膠原（CoL-Ⅰ）的基因和蛋白水平表達下調；與此同時，NF-κB 信號抑制子 α（IκB-α）下調，p65 表達顯著上調，且二者磷酸化水平升高，細胞培養液中 IL-6 含量增多。研究表明，微重力環境下 NF-κB 信號通路可激活并調控成骨細胞分化。
引用本文： 韓標, 張揚, 李昊, 韋淑萍, 李瑞欣, 張西正. 模擬微重力環境下核因子κB信號通路調節MC3T3-E1細胞成骨分化的實驗研究. 生物醫學工程學雜志, 2019, 36(3): 421-427. doi: 10.7507/1001-5515.201801019 復制
引言
骨骼是支撐和維持人類基本活動的重要器官之一，力學載荷在保持骨量和骨的完整性方面具有重要的作用。研究表明，骨組織對力學環境的改變極為敏感，能對環境的變化做出相應的改變來體現出自身的力學適應性[1-2]。隨著航空航天技術的不斷發展，空間飛行和長期的太空探索亦愈加頻繁，然而來自太空復雜多變的環境諸如真空、極端溫度、太空垃圾、宇宙射線和失重等是制約人類長期太空作業的重要原因[3]；近年來已證實太空飛行會造成機體的骨骼系統、心血管系統、肌肉系統以及免疫系統等不同程度的損害，尤其以骨骼系統損傷為重[4-6]。研究表明，骨骼系統在機體離開微重力環境到達地球表面后仍會繼續產生病理性變化，微觀方面主要表現在骨組織細胞結構和功能的破壞，宏觀方面主要是股骨、脊柱等承重骨的骨質流失、骨脆性增加、骨折罹患率增高等。這些危害對太空作業人員的身體健康構成了嚴重的威脅，并影響太空任務圓滿完成以及航天員返回地球再適應的能力。然而，目前對于失重環境下骨丟失的具體分子機制以及細胞間相互作用機制尚不完全清楚。
核因子 kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）在免疫炎癥反應、細胞增殖、腫瘤的發生過程中起到至關重要的作用[7-8]。到目前為止，該家族共發現了 NF-κB1（p50/p105）、NF-κB2（p52/p100）、Rel A（p65）、Rel B、cRel 共 5 種蛋白；其中，p50 與 p50、p52 與 p52 以及 p65 和 p50 可形成同源二聚體和異源二聚體，而且在該家族中，p65 與 p50 形成的異源二聚體數量最多，通常也用以代指 NF-κB。研究發現在 NF-κB 信號通路中，p65 的高表達會抑制多種成骨性相關基因的表達和細胞礦化[9]；另有研究表明[10-11]，抑制 NF-κB 信號通路活性可預防由雌激素缺乏導致的骨丟失，在發生雌激素缺乏型骨質疏松時，會形成“細胞分泌炎性因子→NF-κB 信號通路活化→促進炎性因子分泌”循環，最終 NF-κB 異常活化，抑制骨的形成。本課題組[12]前期研究表明，NF-κB 信號通路可以經力學刺激激活，Wang 等發現，對 MC3T3-E1 細胞施加 2 000 με 應變，可以激活 NF-κB 通路，促進成骨作用，可能是與 P38MAPK 信號通路共同作用于骨形態發生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）有關。以上研究由于細胞的種類、研究因素等不同，NF-κB 信號通路的激活/抑制對骨組織代謝的影響也不盡相同，甚至出現了相反的結果，但可以肯定的是，力學環境的改變可以導致 NF-κB 信號通路的異常改變。
現有的研究發現 NF-κB 在骨組織形成與吸收過程中發揮著重要的作用，并可以對力學刺激進行響應，但其在失重環境下對骨組織細胞的代謝機制還尚未清楚。目前已知微重力環境下成骨分化會受到抑制，但是，微重力環境下 NF-κB 信號通路的變化是正向還是負向仍需進一步了解。在本研究中，我們主要探討微重力環境下 NF-κB 信號通路對成骨細胞的力學信號響應機制，以深入了解 NF-κB 在微重力環境下對成骨細胞分化的調節作用。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
MC3T3-E1 細胞系由協和醫科大學基礎醫學研究所提供，本實驗室凍存。α-MEM 培養液、優級胎牛血清、0.25% 胰酶+EDTA 購于美國 Gibco 公司。堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。PCR 引物購于生工生物工程（上海）股份有限公司。SYBR Premix Ex TaqTM II、TrizoL 購于日本 Takara 公司。High-capacity cDNA reverse transcription kits 購于美國 Invitrogen 公司。骨鈣素（osteocalcin，OCN）、一型膠原（type Ⅰ collagen，CoL-Ⅰ）、骨形態發生蛋白 2 和 4（BMP-2，BMP-4）、Smad 1、Smad 5 等一抗購于美國 Santa Cruz 公司，二抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司。BCA 蛋白提取試劑盒購于南京凱基生物科技發展有限公司。干擾素 6（interleukin 6，IL-6）Elisa 試劑盒購于武漢默沙克生物科技有限公司。Cytodex 3 微載體購于美國 GE Healthcare 公司。旋轉培養系統（rotary cell culture systems，RCCS）購于美國 Cell Tech 公司。
1.2 微重力環境建立
將復蘇后的 MC3T3-E1 細胞按 1 × 105密度接種于 25 cm2 細胞培養瓶中，置于 5% CO2、37℃ 的恒溫培養箱中培養，每 2 d 換液，待細胞鋪滿培養瓶底部 80%～90% 進行傳代。
按操作說明書對 Cytodex 3 微載體及旋轉培養系統進行預處理，將細胞按 1 × 105/mL 的密度接種于旋轉培養系統內，而后陸續加入 5 mL 微載體溶液（5 mg/mL）、5 mL 優級胎牛血清，最后加入新鮮培養基（無血清和雙抗）灌滿，用注射器將系統內氣泡排盡，以 20 r/min 轉速勻速培養 3 d；期間若發現有氣泡產生，立即將氣泡趕盡；對照組置于細胞培養瓶中常規培養。
1.3 細胞獲取
對照組（CON）：細胞培養 3 d 后，0.25% 的胰酶室溫消化 2～3 min，加等量培養液終止消化，用移液槍輕輕吹打數次，將所有液體轉入新的離心管中，1 000 r/min 離心 5 min 棄上清，再加入 1 mL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）輕輕吹打，再次離心，收集細胞。
微重力組（SMG）：微重力培養期滿后，將旋轉系統中細胞轉移至 50 mL 離心管中以 1 000 r/min 離心 5 min，PBS 洗滌 2 次，收集微載體于 10 mL 離心管中，加入 3～5 mL 胰酶，反復吹打消化 5～10 min 后，加入 2 倍胰酶體積的培養液終止消化，用 200 目濾網過濾收集液體，而后以 1 000 r/min 離心 5 min，收集細胞。
1.4 掃描電鏡觀察 MC3T3-E1 細胞與微載體貼附生長情況
收集 SMG 組培養期滿的細胞-微載體復合體及空白微載體，1 000 r/min 離心 5 min 棄上清，預冷的 PBS 清洗 3 次，再次離心，去上清，加入適量 2.5% 戊二醛 4℃ 過夜固定，棄上清，PBS 清洗 3 次，1% 鋨酸常溫固定 1 h，PBS 清洗 3 次，按照 30%、50%、75%、95%、100% 體積濃度的乙醇進行梯度脫水，臨界點干燥儀中進行臨界點干燥，最后進行 Pt 表面鍍膜，置于掃描電鏡下觀察。
1.5 堿性磷酸酶活性檢測
在收集的細胞中加入 0.5 mL 的 PBS 緩沖液，保證超聲探頭在液面以下，設置功率 300 W，冰水浴狀態下進行蛋白超聲裂解，每次超聲 5 s，間隔 4 次，每次間隔時間為 30 s，BCA 方法將蛋白定量，按操作表將各試劑加入到 96 孔板，520 nm 處波長酶標儀測定各孔吸光度。
1.6 real-time PCR 檢測成骨相關基因表達水平變化
收集各組細胞，用預冷的 PBS 清洗 3 次后加入 1 mL TrizoL 冰上充分裂解細胞，酚氯仿法提取細胞總 RNA，通過 OD260/280 計算 RNA 的純度與濃度，將 RNA 濃度定量到 1 μg/μL。用 High-capacity cDNA reverse transcription kits 將 RNA 體系在 70℃ 10 min、37℃ 30 min、95℃ 5 min 逆轉錄成 cDNA，以 cDNA 為模板采用實時熒光定量 PCR 分別檢測 ALP、OCN、COL-Ⅰ、BMP-2、BMP-4、Smad 1、Smad 5 的基因表達水平（每個基因設置三次生物學重復）。引物序列見表 1。總反應體系為 25 μL：cDNA（稀釋 20 倍）2.5 μL，Primer-F（10 mmol/L）1 μL，Primer-R（10 mmol/L）1 μL，SYBR? Premix Ex TaqTM II 12.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR 循環反應為：95℃ 預變性 10 min，95℃ 變性 15 s、60℃ 退火 1 min、72℃ 延伸 15 s 共 40 個循環，72℃ 終延伸 5 min。各組結果采用 
法[13]將對照組與 β-actin 標準化后進行比較。
表1
引物序列
Table1.
Sequences of primer used in this study
1.7 Western-blot 檢測成骨相關蛋白表達水平變化
收集各組細胞，BCA 法提取并定量細胞蛋白，取定量后蛋白 30 μg，加入 5 × 上樣緩沖液，沸水中煮 10 min，而后將樣品加入含有配制好的含 10% 分離膠與 5% 濃縮膠的電泳系統內跑膠；切膠并轉膜；轉膜結束后，將聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜放入封閉袋中與 5% 脫脂奶粉室溫下反應 1 h；封閉后的 PVDF 膜分別與兔抗 OCN、COL-Ⅰ、BMP-2、BMP-4、Smad 1、Smad 5 等一抗（1∶500 稀釋）4℃ 孵育過夜；取出 PVDF 膜，PBST 洗滌 5 次，與山羊抗兔的二抗（1∶5 000 稀釋）常溫孵育 1 h，PBST 洗滌 5 次；加入顯影發光液，暗室顯影定影，取出膠片應用 Image J 軟件分析結果。
1.8 Elisa 檢測 IL-6 含量變化
無菌管收集各組細胞培養上清液，2 000 r/min 離心 20 min，收集上清液，按說明書加入各組分，并執行相關步驟，450 nm 處波長測各組分 OD 值。
1.9 統計分析
實驗數據均用均值 ± 標準差表示，采用單因素方差分析，P < 0.05 表示差異具有統計學意義，每組數據來源至少為 3 次獨立實驗結果。
2 結果
2.1 模擬微重力環境下細胞與微載體的貼附結果
MC3T3-E1 細胞與微載體貼附效率較高，一般情況下，旋轉培養 12 h 內可完成較理想的貼附，而后隨著時間增長，微載體表面的細胞會不斷增殖。如圖 1 所示，結果表明在模擬微重力環境下，MC3T3-E1 細胞能較好地貼附在微載體上，且生長狀態良好。
圖1
掃描電鏡下不同倍數細胞貼附微載體結果圖
Figure1.
The image of cell-microcarriers with scanning electron microscope in different magnification
2.2 模擬微重力對 MC3T3-E1 細胞成骨相關性基因和蛋白的表達水平影響
ALP、OCN、CoL-Ⅰ是反映成骨活性的主要標志性基因，為了驗證微重力環境下這些成骨相關性基因和蛋白是否表達下調，我們檢測了這些基因的表達。結果表明微重力培養成骨細胞 3 d 后，ALP、OCN 和 COL-Ⅰ基因的 mRNA 水平顯著下調（見圖 2a），ALP 活性檢測及 western blot 結果顯示蛋白水平的表達與 mRNA 改變相一致（見圖 2b、2c）。
圖2
模擬微重力環境對成骨細胞成骨相關蛋白和基因的影響
a. qRT-PCR 檢測 ALP、OCN、CoL-Ⅰ mRNA 水平；b. Elisa 檢測 MC3T3-E1 成骨細胞 ALP 活性；c. western blot 檢測 OCN、CoL-Ⅰ蛋白表達水平。* 與 CON 組比較，
a. the expression of ALP, OCN and CoL-Ⅰ mRNA were investigated using qRT-PCR; b. the MC3T3-E1 cell ALP activity was measured using Elisa kits; c. the expression of OCN and CoL-Ⅰ protein were detected by western blot. *
2.3 模擬微重力環境下對 BMP/Smad 通路的調控
在前期的研究發現[12]，生理性動態力學載荷（2 000 με）能激活 NF-κB 信號通路，調節 BMPs，進而通過經典的 Smad 通路促進成骨分化。在本研究中，為了觀察 BMPs 是否也對模擬微重力有相應的力學響應機制，我們檢測了細胞在模擬微重力培養 3 d 后 BMP-2、BMP-4 的表達，如圖 3 所示。與對照組相比，SMG 組 BMP-2 基因表達水平和蛋白表達水平無顯著變化，BMP-4 的基因表達水平下調（見圖 3a），但是蛋白表達水平無明顯變化（見圖 3b），說明 BMP-4 僅在轉錄水平發生了改變。為了明確 BMP-2、BMP-4 對微重力環境的力學響應，并確認 BMP-2、BMP-4 是否通過 Smads 蛋白對成骨分化進行調節，我們檢測了 Smad 1、Smad 5 基因和蛋白表達水平的變化，結果顯示 Smad 1、Smad 5 無論在基因表達水平還是蛋白表達水平與對照組相比均無顯著差異（見圖 3）。因此，在模擬微重力條件下，成骨細胞的分化并不是通過 BMPs 來調控的。
圖3
模擬微重力環境對 BMP/Smad 信號通路的影響
a. qRT-PCR 檢測 BMP-2、BMP-4、Smad 1、Smad 5 mRNA 水平；b. western blot 檢測 BMP-2、BMP-4、Smad 1、Smad 5 蛋白表達水平。* 與 CON 組比較，
a. the expression of BMP-2, BMP-4, Smad 1 and Smad 5 mRNA were investigated using qRT-PCR; b. the expression of BMP-2, BMP-4, Smad 1 and Smad 5 protein were detected by western blot. *
2.4 NF-κB 信號通路對模擬微重力的響應
為了觀察微重力環境下成骨細胞的分化是否與 NF-κB 信號通路相關，我們檢測了微重力培養后的成骨細胞與 NF-κB 信號通路相關的信號分子變化，如 NF-κB 抑制蛋白（inhibitory nuclear factor-kappa B，IκB）α（IκB-α）及 p65 的蛋白總量變化及其磷酸化水平，來確定 NF-κB 信號通路是否激活或抑制。課題組前期實驗表明 NF-κB 信號通路在給予力學刺激后，在 30 min 時被激活，并在 60 min 時達到最高峰[12，14-15]。因此本次實驗在微重力培養成骨細胞 60 min 時檢測了 IκB-α 及 p65 的磷酸化水平。結果如圖 4 所示，微重力條件下，IκB-α 蛋白表達水平降低，磷酸化水平升高；p65 總蛋白表達顯著上調，磷酸化水平亦顯著升高。上述結果表明，微重力條件下 NF-κB 信號通路活性增強。
圖4
western blot 檢測模擬微重力對 NF-κB 信號分子 IκB-α、p65 蛋白及其磷酸化的影響
* 0 min 與 60 min 比較，
the expression of IκB-α, p65, p-IκB-α, p-p65 protein were detected by western blot. * 0 min
2.5 模擬微重力條件下細胞炎性因子 IL-6 的表達情況
為了深入了解 NF-κB 信號通路活性增強的原因，我們檢測了細胞分泌炎性因子的情況，結果如圖 5 所示，細胞在模擬微重力條件下培養 3 d 后，MC3T3-E1 細胞分泌的炎性因子 IL-6 顯著增多。
圖5
模擬微重力對 MC3T3-E1 細胞分泌 IL-6 的影響（* 與 CON 組比較，P < 0.05）
Figure5.
Effect of microgravity on IL-6 content in MC3T3-E1 cell culture media (* P < 0.05 vs. CON)
3 討論
在地球表面，重力對維持骨的結構和功能具有重要的作用，重力缺失會導致骨組織大量流失，影響骨細胞的增殖、分化與凋亡，進而影響骨代謝與骨重建過程。Frost[16]的“應力-穩態理論”指出，骨組織在生長發育過程中，其形狀、質量、結構、功能均受其所處的力學環境影響，并發生適應性改變。大量研究證明[17-23]，微重力環境下骨組織會嚴重流失，重力缺失所致宇航員骨質流失的量每月可高達 2%，相當于絕經期婦女由雌激素缺乏導致骨流失一年的量；失重還會使機體骨密度降低，骨質變稀薄，發生骨質疏松的概率增大；微重力條件下間充質干細胞向成骨分化、成骨細胞周期轉化、成骨分化及活性均受到抑制，且破骨細胞功能顯著增強。
成骨細胞由間充質干細胞分化而來，主要存在于骨組織（松質骨與皮質骨）表面，是骨組織感受力學刺激后作出響應的重要效應器之一。在本研究中，MC3T3-E1 細胞是小鼠源成骨貼壁細胞，不能直接在旋轉培養系統的細胞培養器中旋轉培養，需要附著于特定的微載體上才能懸浮生長。本研究選用的 Cytodex 3 是一種針對旋轉培養細胞貼壁用微載體，其表面在交聯葡聚糖基架上化學偶聯了一層變性膠原，可以使 MC3T3-E1 較好地貼壁生長（見圖 1）；當 RCCS 旋轉速度達到勻速 20 r/min 時，由于細胞在一個不斷變化的重力場中來不及對重力做出響應，因此可以很好地模擬失重環境。
ALP、OCN、CoL-Ⅰ是成骨細胞分化的主要標志物，在本研究中，模擬微重力培養成骨細胞 3 d 后，相比對照組，它們的表達明顯下調，說明微重力條件下成骨細胞的分化受到抑制。BMPs 是轉化生長因子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族的一員，該信號通路非常復雜，有多種蛋白分子參與信號傳遞過程[24]，其中 BMP-2、BMP-4 在骨形成與分化中發揮著重要的作用。細胞內 BMPs 信號的傳遞主要通過 Smad 蛋白完成，Smad 1 和 Smad 5 是傳遞 BMP-2 和 BMP-4 信號的重要信號分子，活化的 Smad 1 和 Smad 5 蛋白在 Smad 4 的協同作用下進入細胞核調節成骨細胞分化相關基因的表達[25]。模擬微重力條件下培養后，BMP-4 僅在轉錄水平發生了改變，蛋白表達水平并沒有發生改變，而 BMP-2 不論在基因水平還是蛋白水平與對照組均無顯著差異，同時，Smad 1 和 Smad 5 的基因與蛋白的表達水平在實驗前后亦未發生顯著改變，說明微重力條件下成骨分化的調控與 BMPs 并沒有密切的關系。
NF-κB 信號通路主要包括三類：NF-κB、IκB 和 IκB 激酶（IκB kinase，IKK）。一般情況下，NF-κB 與抑制因子以三聚體的狀態存在于細胞漿中，并不發揮生物學功能，當有諸如力學載荷、炎癥反應、氧化毒物等外界因素刺激時，會使抑制因子從三聚體中游離出來，激活 NF-κB 的活性，進行相關的調控作用。有研究表明，持續激活 NF-κB 會導致多種疾病的發生，如骨關節炎、骨質疏松、骨肌肉營養不良等。Chang 等[9]研究發現當 p65 高表達時，會抑制 Runx 2、ALP、CoL-Ⅰ等成骨關鍵因子的表達。在切除卵巢的大鼠骨質疏松模型中，能觀察到 NF-κB 活化異常，本研究發現，模擬微重力條件下培養細胞后，p-IκB-α、p-p65 磷酸化水平異常增高，說明 NF-κB 活性增強。課題組前期的研究表明[12，14]，生理性動態力學載荷（2 000 με）刺激小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞可激活 NF-κB 信號通路，并促進成骨分化；但是，本研究結果顯示，模擬微重力條件下 NF-κB 信號通路同樣被激活，卻抑制成骨分化。在查閱相關文獻后發現，Cazzaniga 等[26]在模擬微重力條件下，收集培養 72 h 后的微血管內皮細胞的培養液（含內皮細胞分泌較高的 IL-6），繼續培養人成骨細胞，結果發現成骨細胞活性減弱。在本研究結果中，模擬微重力條件下，存在炎性因子 IL-6 分泌增加的現象，可能與前述中“細胞分泌炎性因子→NF-κB 信號通路活化→促進炎性因子分泌”的正反饋有關，導致 NF-κB 信號通路的持續激活，進而抑制成骨分化，這與上述研究結果相一致；而力學載荷刺激 NF-κB 信號通路激活促進成骨分化的原因是 NF-κB 信號通路與 p38MAPK 信號通路存在“cross-talk”，共同調控 BMPs，進而促進成骨分化。在本研究中，模擬微重力條件下，BMPs 表達水平無顯著變化，因此可以推測出生理性力學載荷與模擬微重力條件下通過激活 NF-κB 信號通路對成骨分化的調控，屬于不同的機制，后者可能是由于持續的炎性刺激導致 NF-κB 信號異常活化，從而抑制成骨分化。
綜上所述，本研究提示在微重力條件下成骨細胞炎性因子 IL-6 增多，p65 蛋白表達及磷酸化水平升高，導致 NF-κB 通路異常活化，進而抑制成骨細胞的分化，這預示著 NF-κB 通路或許可以作為預防或臨床治療失重性骨質疏松/廢用性骨質疏松潛在的靶標。
引言
骨骼是支撐和維持人類基本活動的重要器官之一，力學載荷在保持骨量和骨的完整性方面具有重要的作用。研究表明，骨組織對力學環境的改變極為敏感，能對環境的變化做出相應的改變來體現出自身的力學適應性[1-2]。隨著航空航天技術的不斷發展，空間飛行和長期的太空探索亦愈加頻繁，然而來自太空復雜多變的環境諸如真空、極端溫度、太空垃圾、宇宙射線和失重等是制約人類長期太空作業的重要原因[3]；近年來已證實太空飛行會造成機體的骨骼系統、心血管系統、肌肉系統以及免疫系統等不同程度的損害，尤其以骨骼系統損傷為重[4-6]。研究表明，骨骼系統在機體離開微重力環境到達地球表面后仍會繼續產生病理性變化，微觀方面主要表現在骨組織細胞結構和功能的破壞，宏觀方面主要是股骨、脊柱等承重骨的骨質流失、骨脆性增加、骨折罹患率增高等。這些危害對太空作業人員的身體健康構成了嚴重的威脅，并影響太空任務圓滿完成以及航天員返回地球再適應的能力。然而，目前對于失重環境下骨丟失的具體分子機制以及細胞間相互作用機制尚不完全清楚。
核因子 kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）在免疫炎癥反應、細胞增殖、腫瘤的發生過程中起到至關重要的作用[7-8]。到目前為止，該家族共發現了 NF-κB1（p50/p105）、NF-κB2（p52/p100）、Rel A（p65）、Rel B、cRel 共 5 種蛋白；其中，p50 與 p50、p52 與 p52 以及 p65 和 p50 可形成同源二聚體和異源二聚體，而且在該家族中，p65 與 p50 形成的異源二聚體數量最多，通常也用以代指 NF-κB。研究發現在 NF-κB 信號通路中，p65 的高表達會抑制多種成骨性相關基因的表達和細胞礦化[9]；另有研究表明[10-11]，抑制 NF-κB 信號通路活性可預防由雌激素缺乏導致的骨丟失，在發生雌激素缺乏型骨質疏松時，會形成“細胞分泌炎性因子→NF-κB 信號通路活化→促進炎性因子分泌”循環，最終 NF-κB 異常活化，抑制骨的形成。本課題組[12]前期研究表明，NF-κB 信號通路可以經力學刺激激活，Wang 等發現，對 MC3T3-E1 細胞施加 2 000 με 應變，可以激活 NF-κB 通路，促進成骨作用，可能是與 P38MAPK 信號通路共同作用于骨形態發生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）有關。以上研究由于細胞的種類、研究因素等不同，NF-κB 信號通路的激活/抑制對骨組織代謝的影響也不盡相同，甚至出現了相反的結果，但可以肯定的是，力學環境的改變可以導致 NF-κB 信號通路的異常改變。
現有的研究發現 NF-κB 在骨組織形成與吸收過程中發揮著重要的作用，并可以對力學刺激進行響應，但其在失重環境下對骨組織細胞的代謝機制還尚未清楚。目前已知微重力環境下成骨分化會受到抑制，但是，微重力環境下 NF-κB 信號通路的變化是正向還是負向仍需進一步了解。在本研究中，我們主要探討微重力環境下 NF-κB 信號通路對成骨細胞的力學信號響應機制，以深入了解 NF-κB 在微重力環境下對成骨細胞分化的調節作用。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
MC3T3-E1 細胞系由協和醫科大學基礎醫學研究所提供，本實驗室凍存。α-MEM 培養液、優級胎牛血清、0.25% 胰酶+EDTA 購于美國 Gibco 公司。堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。PCR 引物購于生工生物工程（上海）股份有限公司。SYBR Premix Ex TaqTM II、TrizoL 購于日本 Takara 公司。High-capacity cDNA reverse transcription kits 購于美國 Invitrogen 公司。骨鈣素（osteocalcin，OCN）、一型膠原（type Ⅰ collagen，CoL-Ⅰ）、骨形態發生蛋白 2 和 4（BMP-2，BMP-4）、Smad 1、Smad 5 等一抗購于美國 Santa Cruz 公司，二抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司。BCA 蛋白提取試劑盒購于南京凱基生物科技發展有限公司。干擾素 6（interleukin 6，IL-6）Elisa 試劑盒購于武漢默沙克生物科技有限公司。Cytodex 3 微載體購于美國 GE Healthcare 公司。旋轉培養系統（rotary cell culture systems，RCCS）購于美國 Cell Tech 公司。
1.2 微重力環境建立
將復蘇后的 MC3T3-E1 細胞按 1 × 105密度接種于 25 cm2 細胞培養瓶中，置于 5% CO2、37℃ 的恒溫培養箱中培養，每 2 d 換液，待細胞鋪滿培養瓶底部 80%～90% 進行傳代。
按操作說明書對 Cytodex 3 微載體及旋轉培養系統進行預處理，將細胞按 1 × 105/mL 的密度接種于旋轉培養系統內，而后陸續加入 5 mL 微載體溶液（5 mg/mL）、5 mL 優級胎牛血清，最后加入新鮮培養基（無血清和雙抗）灌滿，用注射器將系統內氣泡排盡，以 20 r/min 轉速勻速培養 3 d；期間若發現有氣泡產生，立即將氣泡趕盡；對照組置于細胞培養瓶中常規培養。
1.3 細胞獲取
對照組（CON）：細胞培養 3 d 后，0.25% 的胰酶室溫消化 2～3 min，加等量培養液終止消化，用移液槍輕輕吹打數次，將所有液體轉入新的離心管中，1 000 r/min 離心 5 min 棄上清，再加入 1 mL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）輕輕吹打，再次離心，收集細胞。
微重力組（SMG）：微重力培養期滿后，將旋轉系統中細胞轉移至 50 mL 離心管中以 1 000 r/min 離心 5 min，PBS 洗滌 2 次，收集微載體于 10 mL 離心管中，加入 3～5 mL 胰酶，反復吹打消化 5～10 min 后，加入 2 倍胰酶體積的培養液終止消化，用 200 目濾網過濾收集液體，而后以 1 000 r/min 離心 5 min，收集細胞。
1.4 掃描電鏡觀察 MC3T3-E1 細胞與微載體貼附生長情況
收集 SMG 組培養期滿的細胞-微載體復合體及空白微載體，1 000 r/min 離心 5 min 棄上清，預冷的 PBS 清洗 3 次，再次離心，去上清，加入適量 2.5% 戊二醛 4℃ 過夜固定，棄上清，PBS 清洗 3 次，1% 鋨酸常溫固定 1 h，PBS 清洗 3 次，按照 30%、50%、75%、95%、100% 體積濃度的乙醇進行梯度脫水，臨界點干燥儀中進行臨界點干燥，最后進行 Pt 表面鍍膜，置于掃描電鏡下觀察。
1.5 堿性磷酸酶活性檢測
在收集的細胞中加入 0.5 mL 的 PBS 緩沖液，保證超聲探頭在液面以下，設置功率 300 W，冰水浴狀態下進行蛋白超聲裂解，每次超聲 5 s，間隔 4 次，每次間隔時間為 30 s，BCA 方法將蛋白定量，按操作表將各試劑加入到 96 孔板，520 nm 處波長酶標儀測定各孔吸光度。
1.6 real-time PCR 檢測成骨相關基因表達水平變化
收集各組細胞，用預冷的 PBS 清洗 3 次后加入 1 mL TrizoL 冰上充分裂解細胞，酚氯仿法提取細胞總 RNA，通過 OD260/280 計算 RNA 的純度與濃度，將 RNA 濃度定量到 1 μg/μL。用 High-capacity cDNA reverse transcription kits 將 RNA 體系在 70℃ 10 min、37℃ 30 min、95℃ 5 min 逆轉錄成 cDNA，以 cDNA 為模板采用實時熒光定量 PCR 分別檢測 ALP、OCN、COL-Ⅰ、BMP-2、BMP-4、Smad 1、Smad 5 的基因表達水平（每個基因設置三次生物學重復）。引物序列見表 1。總反應體系為 25 μL：cDNA（稀釋 20 倍）2.5 μL，Primer-F（10 mmol/L）1 μL，Primer-R（10 mmol/L）1 μL，SYBR? Premix Ex TaqTM II 12.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR 循環反應為：95℃ 預變性 10 min，95℃ 變性 15 s、60℃ 退火 1 min、72℃ 延伸 15 s 共 40 個循環，72℃ 終延伸 5 min。各組結果采用 法[13]將對照組與 β-actin 標準化后進行比較。
表1
引物序列
Table1.
Sequences of primer used in this study
1.7 Western-blot 檢測成骨相關蛋白表達水平變化
收集各組細胞，BCA 法提取并定量細胞蛋白，取定量后蛋白 30 μg，加入 5 × 上樣緩沖液，沸水中煮 10 min，而后將樣品加入含有配制好的含 10% 分離膠與 5% 濃縮膠的電泳系統內跑膠；切膠并轉膜；轉膜結束后，將聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜放入封閉袋中與 5% 脫脂奶粉室溫下反應 1 h；封閉后的 PVDF 膜分別與兔抗 OCN、COL-Ⅰ、BMP-2、BMP-4、Smad 1、Smad 5 等一抗（1∶500 稀釋）4℃ 孵育過夜；取出 PVDF 膜，PBST 洗滌 5 次，與山羊抗兔的二抗（1∶5 000 稀釋）常溫孵育 1 h，PBST 洗滌 5 次；加入顯影發光液，暗室顯影定影，取出膠片應用 Image J 軟件分析結果。
1.8 Elisa 檢測 IL-6 含量變化
無菌管收集各組細胞培養上清液，2 000 r/min 離心 20 min，收集上清液，按說明書加入各組分，并執行相關步驟，450 nm 處波長測各組分 OD 值。
1.9 統計分析
實驗數據均用均值 ± 標準差表示，采用單因素方差分析，P < 0.05 表示差異具有統計學意義，每組數據來源至少為 3 次獨立實驗結果。
2 結果
2.1 模擬微重力環境下細胞與微載體的貼附結果
MC3T3-E1 細胞與微載體貼附效率較高，一般情況下，旋轉培養 12 h 內可完成較理想的貼附，而后隨著時間增長，微載體表面的細胞會不斷增殖。如圖 1 所示，結果表明在模擬微重力環境下，MC3T3-E1 細胞能較好地貼附在微載體上，且生長狀態良好。
圖1
掃描電鏡下不同倍數細胞貼附微載體結果圖
Figure1.
The image of cell-microcarriers with scanning electron microscope in different magnification
2.2 模擬微重力對 MC3T3-E1 細胞成骨相關性基因和蛋白的表達水平影響
ALP、OCN、CoL-Ⅰ是反映成骨活性的主要標志性基因，為了驗證微重力環境下這些成骨相關性基因和蛋白是否表達下調，我們檢測了這些基因的表達。結果表明微重力培養成骨細胞 3 d 后，ALP、OCN 和 COL-Ⅰ基因的 mRNA 水平顯著下調（見圖 2a），ALP 活性檢測及 western blot 結果顯示蛋白水平的表達與 mRNA 改變相一致（見圖 2b、2c）。
圖2
模擬微重力環境對成骨細胞成骨相關蛋白和基因的影響
a. qRT-PCR 檢測 ALP、OCN、CoL-Ⅰ mRNA 水平；b. Elisa 檢測 MC3T3-E1 成骨細胞 ALP 活性；c. western blot 檢測 OCN、CoL-Ⅰ蛋白表達水平。* 與 CON 組比較，
a. the expression of ALP, OCN and CoL-Ⅰ mRNA were investigated using qRT-PCR; b. the MC3T3-E1 cell ALP activity was measured using Elisa kits; c. the expression of OCN and CoL-Ⅰ protein were detected by western blot. *
2.3 模擬微重力環境下對 BMP/Smad 通路的調控
在前期的研究發現[12]，生理性動態力學載荷（2 000 με）能激活 NF-κB 信號通路，調節 BMPs，進而通過經典的 Smad 通路促進成骨分化。在本研究中，為了觀察 BMPs 是否也對模擬微重力有相應的力學響應機制，我們檢測了細胞在模擬微重力培養 3 d 后 BMP-2、BMP-4 的表達，如圖 3 所示。與對照組相比，SMG 組 BMP-2 基因表達水平和蛋白表達水平無顯著變化，BMP-4 的基因表達水平下調（見圖 3a），但是蛋白表達水平無明顯變化（見圖 3b），說明 BMP-4 僅在轉錄水平發生了改變。為了明確 BMP-2、BMP-4 對微重力環境的力學響應，并確認 BMP-2、BMP-4 是否通過 Smads 蛋白對成骨分化進行調節，我們檢測了 Smad 1、Smad 5 基因和蛋白表達水平的變化，結果顯示 Smad 1、Smad 5 無論在基因表達水平還是蛋白表達水平與對照組相比均無顯著差異（見圖 3）。因此，在模擬微重力條件下，成骨細胞的分化并不是通過 BMPs 來調控的。
圖3
模擬微重力環境對 BMP/Smad 信號通路的影響
a. qRT-PCR 檢測 BMP-2、BMP-4、Smad 1、Smad 5 mRNA 水平；b. western blot 檢測 BMP-2、BMP-4、Smad 1、Smad 5 蛋白表達水平。* 與 CON 組比較，
a. the expression of BMP-2, BMP-4, Smad 1 and Smad 5 mRNA were investigated using qRT-PCR; b. the expression of BMP-2, BMP-4, Smad 1 and Smad 5 protein were detected by western blot. *
2.4 NF-κB 信號通路對模擬微重力的響應
為了觀察微重力環境下成骨細胞的分化是否與 NF-κB 信號通路相關，我們檢測了微重力培養后的成骨細胞與 NF-κB 信號通路相關的信號分子變化，如 NF-κB 抑制蛋白（inhibitory nuclear factor-kappa B，IκB）α（IκB-α）及 p65 的蛋白總量變化及其磷酸化水平，來確定 NF-κB 信號通路是否激活或抑制。課題組前期實驗表明 NF-κB 信號通路在給予力學刺激后，在 30 min 時被激活，并在 60 min 時達到最高峰[12，14-15]。因此本次實驗在微重力培養成骨細胞 60 min 時檢測了 IκB-α 及 p65 的磷酸化水平。結果如圖 4 所示，微重力條件下，IκB-α 蛋白表達水平降低，磷酸化水平升高；p65 總蛋白表達顯著上調，磷酸化水平亦顯著升高。上述結果表明，微重力條件下 NF-κB 信號通路活性增強。
圖4
western blot 檢測模擬微重力對 NF-κB 信號分子 IκB-α、p65 蛋白及其磷酸化的影響
* 0 min 與 60 min 比較，
the expression of IκB-α, p65, p-IκB-α, p-p65 protein were detected by western blot. * 0 min
2.5 模擬微重力條件下細胞炎性因子 IL-6 的表達情況
為了深入了解 NF-κB 信號通路活性增強的原因，我們檢測了細胞分泌炎性因子的情況，結果如圖 5 所示，細胞在模擬微重力條件下培養 3 d 后，MC3T3-E1 細胞分泌的炎性因子 IL-6 顯著增多。
圖5
模擬微重力對 MC3T3-E1 細胞分泌 IL-6 的影響（* 與 CON 組比較，P < 0.05）
Figure5.
Effect of microgravity on IL-6 content in MC3T3-E1 cell culture media (* P < 0.05 vs. CON)
3 討論
在地球表面，重力對維持骨的結構和功能具有重要的作用，重力缺失會導致骨組織大量流失，影響骨細胞的增殖、分化與凋亡，進而影響骨代謝與骨重建過程。Frost[16]的“應力-穩態理論”指出，骨組織在生長發育過程中，其形狀、質量、結構、功能均受其所處的力學環境影響，并發生適應性改變。大量研究證明[17-23]，微重力環境下骨組織會嚴重流失，重力缺失所致宇航員骨質流失的量每月可高達 2%，相當于絕經期婦女由雌激素缺乏導致骨流失一年的量；失重還會使機體骨密度降低，骨質變稀薄，發生骨質疏松的概率增大；微重力條件下間充質干細胞向成骨分化、成骨細胞周期轉化、成骨分化及活性均受到抑制，且破骨細胞功能顯著增強。
成骨細胞由間充質干細胞分化而來，主要存在于骨組織（松質骨與皮質骨）表面，是骨組織感受力學刺激后作出響應的重要效應器之一。在本研究中，MC3T3-E1 細胞是小鼠源成骨貼壁細胞，不能直接在旋轉培養系統的細胞培養器中旋轉培養，需要附著于特定的微載體上才能懸浮生長。本研究選用的 Cytodex 3 是一種針對旋轉培養細胞貼壁用微載體，其表面在交聯葡聚糖基架上化學偶聯了一層變性膠原，可以使 MC3T3-E1 較好地貼壁生長（見圖 1）；當 RCCS 旋轉速度達到勻速 20 r/min 時，由于細胞在一個不斷變化的重力場中來不及對重力做出響應，因此可以很好地模擬失重環境。
ALP、OCN、CoL-Ⅰ是成骨細胞分化的主要標志物，在本研究中，模擬微重力培養成骨細胞 3 d 后，相比對照組，它們的表達明顯下調，說明微重力條件下成骨細胞的分化受到抑制。BMPs 是轉化生長因子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族的一員，該信號通路非常復雜，有多種蛋白分子參與信號傳遞過程[24]，其中 BMP-2、BMP-4 在骨形成與分化中發揮著重要的作用。細胞內 BMPs 信號的傳遞主要通過 Smad 蛋白完成，Smad 1 和 Smad 5 是傳遞 BMP-2 和 BMP-4 信號的重要信號分子，活化的 Smad 1 和 Smad 5 蛋白在 Smad 4 的協同作用下進入細胞核調節成骨細胞分化相關基因的表達[25]。模擬微重力條件下培養后，BMP-4 僅在轉錄水平發生了改變，蛋白表達水平并沒有發生改變，而 BMP-2 不論在基因水平還是蛋白水平與對照組均無顯著差異，同時，Smad 1 和 Smad 5 的基因與蛋白的表達水平在實驗前后亦未發生顯著改變，說明微重力條件下成骨分化的調控與 BMPs 并沒有密切的關系。
NF-κB 信號通路主要包括三類：NF-κB、IκB 和 IκB 激酶（IκB kinase，IKK）。一般情況下，NF-κB 與抑制因子以三聚體的狀態存在于細胞漿中，并不發揮生物學功能，當有諸如力學載荷、炎癥反應、氧化毒物等外界因素刺激時，會使抑制因子從三聚體中游離出來，激活 NF-κB 的活性，進行相關的調控作用。有研究表明，持續激活 NF-κB 會導致多種疾病的發生，如骨關節炎、骨質疏松、骨肌肉營養不良等。Chang 等[9]研究發現當 p65 高表達時，會抑制 Runx 2、ALP、CoL-Ⅰ等成骨關鍵因子的表達。在切除卵巢的大鼠骨質疏松模型中，能觀察到 NF-κB 活化異常，本研究發現，模擬微重力條件下培養細胞后，p-IκB-α、p-p65 磷酸化水平異常增高，說明 NF-κB 活性增強。課題組前期的研究表明[12，14]，生理性動態力學載荷（2 000 με）刺激小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞可激活 NF-κB 信號通路，并促進成骨分化；但是，本研究結果顯示，模擬微重力條件下 NF-κB 信號通路同樣被激活，卻抑制成骨分化。在查閱相關文獻后發現，Cazzaniga 等[26]在模擬微重力條件下，收集培養 72 h 后的微血管內皮細胞的培養液（含內皮細胞分泌較高的 IL-6），繼續培養人成骨細胞，結果發現成骨細胞活性減弱。在本研究結果中，模擬微重力條件下，存在炎性因子 IL-6 分泌增加的現象，可能與前述中“細胞分泌炎性因子→NF-κB 信號通路活化→促進炎性因子分泌”的正反饋有關，導致 NF-κB 信號通路的持續激活，進而抑制成骨分化，這與上述研究結果相一致；而力學載荷刺激 NF-κB 信號通路激活促進成骨分化的原因是 NF-κB 信號通路與 p38MAPK 信號通路存在“cross-talk”，共同調控 BMPs，進而促進成骨分化。在本研究中，模擬微重力條件下，BMPs 表達水平無顯著變化，因此可以推測出生理性力學載荷與模擬微重力條件下通過激活 NF-κB 信號通路對成骨分化的調控，屬于不同的機制，后者可能是由于持續的炎性刺激導致 NF-κB 信號異常活化，從而抑制成骨分化。
綜上所述，本研究提示在微重力條件下成骨細胞炎性因子 IL-6 增多，p65 蛋白表達及磷酸化水平升高，導致 NF-κB 通路異常活化，進而抑制成骨細胞的分化，這預示著 NF-κB 通路或許可以作為預防或臨床治療失重性骨質疏松/廢用性骨質疏松潛在的靶標。
