腫瘤血清標志物的核酸適配體是利用指數富集的系統進化技術（SELEX），從體外篩選獲得的一種能與腫瘤血清標志物高特異性、高親和性結合的寡核苷酸分子。利用核酸適配體的優勢，探尋對腫瘤更具診斷價值的新的腫瘤標志物。目前在肝癌、胃癌等腫瘤的研究中已經取得了一定成果。本文綜述了當前核酸適配體及其在腫瘤血清標志物篩選中的相關研究，討論了腫瘤血清標志物的核酸適配體在腫瘤診斷中的價值以及目前的研究所存在的問題。期望通過本文的綜合描述，有助于人們更好地了解腫瘤血清標志物核酸適配體的篩選，并為新的腫瘤血清標志物的發現提供幫助。
引用本文： 馬淑玲, 曾家豫. 核酸適配體在腫瘤血清標志物篩選中的應用研究. 生物醫學工程學雜志, 2018, 35(2): 320-323. doi: 10.7507/1001-5515.201710026 復制
引言
惡性腫瘤是影響人類生命健康的主要原因之一。隨著人類生存環境的不斷惡化以及不良生活習慣等影響，惡性腫瘤的發病率呈逐年上升的趨勢[1-2]。早期診斷是治療惡性腫瘤的關鍵，但大多數惡性腫瘤在被確診時已經處于中晚期。目前診斷腫瘤的主要方法有觀察臨床體征、影像學檢查和病理學檢查等。臨床上常常聯合多種檢測手段對患者進行診斷。腫瘤血清標志物檢測因其簡捷實用、無創性等優點，在腫瘤的診斷中具有重要的意義，尤其是作為腫瘤普查的手段，體現了良好的臨床應用前景。
理想的腫瘤血清標志物能夠靈敏地進行腫瘤的早期診斷、特異性地定位所患腫瘤的位置、監測疾病的進展情況等。目前，國內外在臨床上用于腫瘤相關的成熟腫瘤血清標志物還比較有限，且均存在特異性差、敏感性低等缺點。更具價值的腫瘤血清標志物的研究，引起了研究人員的廣泛關注。隨著質譜成像等技術的發展，新的腫瘤標志物不斷發現，尤其是功能基因組學包括蛋白質組學的發展，為尋找新的腫瘤標志物的研究提供了新的機遇[3-5]。近年來，很多研究者利用核酸適配體的優勢，并借助蛋白質組學等技術手段，發現了一些新的腫瘤血清標志物，為快速簡捷地診斷腫瘤提供了可能。本文綜述了核酸適配體，以及以此為基礎尋找新的腫瘤血清標志物的研究情況, 借此希望有助于人們更好地了解腫瘤血清標志物核酸適配體的篩選，并為新的腫瘤血清標志物的發現提供幫助。
1 核酸適配體及其特性
核酸適配體是一種能特異性結合靶分子的單鏈寡聚 DNA 或 RNA 分子，通過指數富集的配體系統進化技術 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)，從人工合成的寡核苷酸文庫中篩選得到。寡核苷酸分子是一段由中間 20～110 bp 的隨機序列和兩端固定序列構成的具有多樣性的隨機序列。寡核苷酸分子極易形成口袋、發卡、假節、G-四聚體等多種空間結構，理論上幾乎能通過氫鍵、范德華力、形狀匹配等方式，與蛋白質、核酸、氨基酸、無機物，甚至金屬離子等所有類型的靶分子結合，并且不同的核酸分子與同一靶標結合的力度也不同。因此，寡核苷酸文庫基本包括了與靶分子親和力由弱到強的幾乎所有的寡核苷酸分子，而通過 SELEX 技術篩選，最終可以獲得與靶分子高特異性、高親和力結合的核酸分子，即核酸適配體[6-8]。
核酸適配體也被稱作“化學抗體”，相較于普通抗體，其最大的優點是沒有免疫原性，且靶標范圍廣、分子量小、容易在體外通過化學方式合成并進行修飾和標記[9]。研究顯示，部分 RNA 核酸適配體–靶標復合物的解離常數（即Kd 值，其大小可以用來表征親和力的強弱，Kd 值越小，則親和力越強）可達到皮摩爾級，顯示出了核酸適配體與靶分子優于抗體與抗原更強的親和力[10-11]。同時，核酸適配體具有較高的特異性，能夠嚴格識別靶標分子與非靶標分子之間甚至是一個基團的差別以及不同旋光性的氨基酸[8]。因此，自核酸適配體的概念被提出以來，就受到廣大研究者的關注。
2 腫瘤血清標志物的核酸適配體篩選及其應用研究
2.1 腫瘤血清標志物的應用
腫瘤標志物 (tumor marker, TM) 是一種存在于腫瘤患者組織、體液和排泄物中，由腫瘤細胞產生，或者由宿主與腫瘤相互刺激產生，能夠用免疫學、生物學及化學等方法進行檢測的物質。利用它可對腫瘤的發生、發展等進行監測[12]。根據腫瘤標志物存在位置的不同對其進行劃分，將存在于血清中的腫瘤標志物，稱作腫瘤血清標志物。目前臨床上已廣泛借助腫瘤標志物檢測技術進行腫瘤的診斷和篩查。如：① 細胞角蛋白 19 片段（cytokeratin 19 fragment, CYFRA21-1）是輔助診斷腺癌和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）等的首要腫瘤血清標志物。41%～48% 的 NSCLC 患者的血清中，CYFRA21-1 的水平表現為升高趨勢 [13-14]。② 癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）與乳腺癌、消化系統腫瘤、甲狀腺癌等多種腫瘤相關，敏感性和陽性率都不高，因此即使血清中的 CEA 濃度升高，也很難判斷是否存在腫瘤[15]。③ 糖類抗原 125（carbohydrate antigen 125, CA125）用于檢測中晚期的卵巢癌時陽性率達到 90% 以上，在早期篩查上卻表現為敏感性和陽性率都很低，只有 15% 左右[12]。
盡管部分腫瘤血清標志物已經作為輔助手段應用于腫瘤的臨床診斷和監測，但大多表現為特異性較差、敏感性較低等特點。即使通過血清檢測顯示某一腫瘤標志物濃度升高或降低，仍然不能確定是否患有腫瘤，即使確定患有腫瘤，也不能很好地確定腫瘤所在的具體位置，需要結合影像學檢查等方式，給腫瘤的診斷造成了困難，增加了患者確診的費用，更有甚者造成過度治療，增加患者負擔[16]，難以體現出血清檢測腫瘤的經濟實用性和簡捷方便的優點。因此，如何獲得高特異性、高親和性的腫瘤標志物，是目前臨床上利用腫瘤血清標志物診斷腫瘤所需解決的一個難題。
2008 年，Berezovski 等[17]提出“核酸適配體可以促進生物標志物的發現”的新概念，并發現了用于區別成熟、非成熟樹突狀細胞的未知生物標志物。其后研究人員們也利用核酸適配體發現了一些新的生物標志物，并驗證了其應用價值，因此提示研究者們可以利用核酸適配體的優勢，以血清為復合靶標，篩選未知腫瘤血清標志物的核酸適配體，進而發現新的腫瘤血清標志物。
2.2 腫瘤血清標志物核酸適配體的篩選
腫瘤血清標志物的核酸適配體，是以腫瘤患者血清為復合靶標（其中包含已知的腫瘤標志物和未知的腫瘤標志物），在體外通過化學方法構建寡核苷酸文庫，利用 SELEX 技術進行“盲篩”，從文庫中篩選出相應的具有高特異性、高親和性的寡核苷酸分子。將篩選獲得的核酸適配體進行蛋白質組學分析等，很有可能發現新的腫瘤血清標志物。
SELEX 技術是應用最為普遍的核酸適配體篩選方法，靶標的不斷拓展、篩選介質的優化以及相關高新技術的問世等，使得 SELEX 技術在傳統流程的基礎上不斷衍生，出現了一系列針對性更強、工作效率更高的 SELEX 技術，如消減 SELEX、實時定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）–SELXE 以及結合高通量測序技術的 SELEX 技術等。這些新型 SELEX 技術的出現，為高效率地篩選核酸適配體提供了可能，有助于進一步發現新的腫瘤標志物。陳文學[18]利用消減 SELEX 技術，以肝癌混合血清為復合靶標，采用反映敏感性和特異性連續變量的指標——受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve, ROC）分析，篩選出肝癌血清標志物核酸適配體 9-25（aptamer-hepatic carcinoma serum, AP-HCS-9-25）、肝癌血清標志物核酸適配體 9-41（aptamer-hepatic carcinoma serum, AP-HCS-9-41），其敏感性和特異性都在 80% 以上。但該分析所針對的標本數少，尚不能作為臨床的參考數據，篩選的適配體對肝癌診斷的最終價值，還有待進一步驗證分析。張洪麗[19]利用逐級加大樣本量并聯合熒光法來評定篩選的胃癌血清標志物核酸適配體，發現胃癌血清標志物核酸適配體-15-16（aptamer-gastric cancer serum, AP-GCS-15-16）的受試者工作特征曲線下面積（area under the receiver operating characteristic, AUROC）達到了 0.880。而 AUROC 作為一種評價診斷準確性的指標，越接近 1，說明診斷效果越好。研究結果說明，這種方法具有良好的診斷價值。葸玉琴等[20]利用實時定量 PCR 技術并結合高通量測序技術，篩選出 20 條胃癌血清標志物核酸適配體，鑒定結果顯示 5、7、16、17、18 號適配體能夠與胃癌血清高特異性結合而與正常血清不結合，初步證明對胃癌的臨床診斷具有一定的研究意義。
核酸適配體的篩選一般都在體外進行，Mi 等[21]將 RNA 文庫直接注入患腫瘤的小鼠體內，在小鼠血清中篩選出一組與腫瘤蛋白特異性結合的適配子，進一步證實，其中適配體 14、16 號的靶標是一種在大腸癌中過度表達的 RNA 解螺旋酶 P68。這個發現，為核酸適配體的篩選提供了新的思路。
2.3 核酸適配體在腫瘤血清標志物篩選中的研究應用
近年來，研究人員利用 SELEX 技術，篩選到多種特異性識別腫瘤標志物的核酸適配體，為腫瘤的診斷奠定了理論基礎。方念[22]的研究中篩選到甲胎蛋白異質體（alpha-fetoprotein fraction, AFP-L3）的適配體，并以肝癌患者的血清作為試驗對象，顯示出了核酸適配體在臨床研究中的優勢。萬波[23]以癌胚抗原單克隆抗體 (anti-carcino-embryonic antigen, anti-CEA) 為靶標，篩選到 4 條特異性核酸適配體，為肺癌血清標志物核酸適配體的篩選提供了依據。Gold 等[24]首先以人血清中 813 種蛋白質為靶標篩選核酸適配體，獲得的適配體再以慢性腎臟疾病（chronic kidney disease, CKD）血清為復合靶標進一步篩選，最終得到 2 種已知的 CKD 標志物和 58 種未知 CKD 標志物。Ostroff 等[25]利用上述與 813 種蛋白質結合的適配子，建立了血清蛋白組學分析技術，共發現 12 種 NSCLC 血清腫瘤標志物，敏感度和特異度都在 80% 以上，高于以往用于診斷 NSCLC 的標志物。下一步經過臨床驗證后，很有可能作為臨床診斷 NSCLC 的腫瘤標志物。
綜上所述，通過核酸適配體檢測腫瘤血清標志物的研究雖然取得了一定的進展，但核酸適配體的篩選仍然是整個研究的瓶頸，需要研究人員進一步探索和完善。
3 總結和展望
核酸適配體的篩選，為發現高特異性的腫瘤血清標志物提供了可能，盡管研究人員不斷改善核酸適配體篩選的技術手段，優化篩選的條件等，但適配體篩選仍然是整個研究的難點。例如：① 核酸適配體的篩選條件受到多種因素的影響，目前篩選得到的適配體是在特定的實驗室環境中篩選得到，一旦環境發生變化，篩選的條件等可能也有較大的變化，因而增加了技術共享和規模化研究的困難；② 所收集的腫瘤血清很難區分早、中、晚期，因此篩選獲得的核酸適配體是否能作為早期診斷的依據，仍然需要進一步去驗證；③ 由于腫瘤的種類眾多，而目前涉及到的相關核酸適配體的篩選很少，今后可將諸如乳腺癌、淋巴癌等也作為研究的對象等。即使目前核酸適配體的篩選有難度，但其表現出的價值和應用前景，可以讓人相信通過核酸適配體的篩選，有望發現新的腫瘤血清標志物，為腫瘤的診斷提供新的依據。
引言
惡性腫瘤是影響人類生命健康的主要原因之一。隨著人類生存環境的不斷惡化以及不良生活習慣等影響，惡性腫瘤的發病率呈逐年上升的趨勢[1-2]。早期診斷是治療惡性腫瘤的關鍵，但大多數惡性腫瘤在被確診時已經處于中晚期。目前診斷腫瘤的主要方法有觀察臨床體征、影像學檢查和病理學檢查等。臨床上常常聯合多種檢測手段對患者進行診斷。腫瘤血清標志物檢測因其簡捷實用、無創性等優點，在腫瘤的診斷中具有重要的意義，尤其是作為腫瘤普查的手段，體現了良好的臨床應用前景。
理想的腫瘤血清標志物能夠靈敏地進行腫瘤的早期診斷、特異性地定位所患腫瘤的位置、監測疾病的進展情況等。目前，國內外在臨床上用于腫瘤相關的成熟腫瘤血清標志物還比較有限，且均存在特異性差、敏感性低等缺點。更具價值的腫瘤血清標志物的研究，引起了研究人員的廣泛關注。隨著質譜成像等技術的發展，新的腫瘤標志物不斷發現，尤其是功能基因組學包括蛋白質組學的發展，為尋找新的腫瘤標志物的研究提供了新的機遇[3-5]。近年來，很多研究者利用核酸適配體的優勢，并借助蛋白質組學等技術手段，發現了一些新的腫瘤血清標志物，為快速簡捷地診斷腫瘤提供了可能。本文綜述了核酸適配體，以及以此為基礎尋找新的腫瘤血清標志物的研究情況, 借此希望有助于人們更好地了解腫瘤血清標志物核酸適配體的篩選，并為新的腫瘤血清標志物的發現提供幫助。
1 核酸適配體及其特性
核酸適配體是一種能特異性結合靶分子的單鏈寡聚 DNA 或 RNA 分子，通過指數富集的配體系統進化技術 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)，從人工合成的寡核苷酸文庫中篩選得到。寡核苷酸分子是一段由中間 20～110 bp 的隨機序列和兩端固定序列構成的具有多樣性的隨機序列。寡核苷酸分子極易形成口袋、發卡、假節、G-四聚體等多種空間結構，理論上幾乎能通過氫鍵、范德華力、形狀匹配等方式，與蛋白質、核酸、氨基酸、無機物，甚至金屬離子等所有類型的靶分子結合，并且不同的核酸分子與同一靶標結合的力度也不同。因此，寡核苷酸文庫基本包括了與靶分子親和力由弱到強的幾乎所有的寡核苷酸分子，而通過 SELEX 技術篩選，最終可以獲得與靶分子高特異性、高親和力結合的核酸分子，即核酸適配體[6-8]。
核酸適配體也被稱作“化學抗體”，相較于普通抗體，其最大的優點是沒有免疫原性，且靶標范圍廣、分子量小、容易在體外通過化學方式合成并進行修飾和標記[9]。研究顯示，部分 RNA 核酸適配體–靶標復合物的解離常數（即Kd 值，其大小可以用來表征親和力的強弱，Kd 值越小，則親和力越強）可達到皮摩爾級，顯示出了核酸適配體與靶分子優于抗體與抗原更強的親和力[10-11]。同時，核酸適配體具有較高的特異性，能夠嚴格識別靶標分子與非靶標分子之間甚至是一個基團的差別以及不同旋光性的氨基酸[8]。因此，自核酸適配體的概念被提出以來，就受到廣大研究者的關注。
2 腫瘤血清標志物的核酸適配體篩選及其應用研究
2.1 腫瘤血清標志物的應用
腫瘤標志物 (tumor marker, TM) 是一種存在于腫瘤患者組織、體液和排泄物中，由腫瘤細胞產生，或者由宿主與腫瘤相互刺激產生，能夠用免疫學、生物學及化學等方法進行檢測的物質。利用它可對腫瘤的發生、發展等進行監測[12]。根據腫瘤標志物存在位置的不同對其進行劃分，將存在于血清中的腫瘤標志物，稱作腫瘤血清標志物。目前臨床上已廣泛借助腫瘤標志物檢測技術進行腫瘤的診斷和篩查。如：① 細胞角蛋白 19 片段（cytokeratin 19 fragment, CYFRA21-1）是輔助診斷腺癌和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）等的首要腫瘤血清標志物。41%～48% 的 NSCLC 患者的血清中，CYFRA21-1 的水平表現為升高趨勢 [13-14]。② 癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）與乳腺癌、消化系統腫瘤、甲狀腺癌等多種腫瘤相關，敏感性和陽性率都不高，因此即使血清中的 CEA 濃度升高，也很難判斷是否存在腫瘤[15]。③ 糖類抗原 125（carbohydrate antigen 125, CA125）用于檢測中晚期的卵巢癌時陽性率達到 90% 以上，在早期篩查上卻表現為敏感性和陽性率都很低，只有 15% 左右[12]。
盡管部分腫瘤血清標志物已經作為輔助手段應用于腫瘤的臨床診斷和監測，但大多表現為特異性較差、敏感性較低等特點。即使通過血清檢測顯示某一腫瘤標志物濃度升高或降低，仍然不能確定是否患有腫瘤，即使確定患有腫瘤，也不能很好地確定腫瘤所在的具體位置，需要結合影像學檢查等方式，給腫瘤的診斷造成了困難，增加了患者確診的費用，更有甚者造成過度治療，增加患者負擔[16]，難以體現出血清檢測腫瘤的經濟實用性和簡捷方便的優點。因此，如何獲得高特異性、高親和性的腫瘤標志物，是目前臨床上利用腫瘤血清標志物診斷腫瘤所需解決的一個難題。
2008 年，Berezovski 等[17]提出“核酸適配體可以促進生物標志物的發現”的新概念，并發現了用于區別成熟、非成熟樹突狀細胞的未知生物標志物。其后研究人員們也利用核酸適配體發現了一些新的生物標志物，并驗證了其應用價值，因此提示研究者們可以利用核酸適配體的優勢，以血清為復合靶標，篩選未知腫瘤血清標志物的核酸適配體，進而發現新的腫瘤血清標志物。
2.2 腫瘤血清標志物核酸適配體的篩選
腫瘤血清標志物的核酸適配體，是以腫瘤患者血清為復合靶標（其中包含已知的腫瘤標志物和未知的腫瘤標志物），在體外通過化學方法構建寡核苷酸文庫，利用 SELEX 技術進行“盲篩”，從文庫中篩選出相應的具有高特異性、高親和性的寡核苷酸分子。將篩選獲得的核酸適配體進行蛋白質組學分析等，很有可能發現新的腫瘤血清標志物。
SELEX 技術是應用最為普遍的核酸適配體篩選方法，靶標的不斷拓展、篩選介質的優化以及相關高新技術的問世等，使得 SELEX 技術在傳統流程的基礎上不斷衍生，出現了一系列針對性更強、工作效率更高的 SELEX 技術，如消減 SELEX、實時定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）–SELXE 以及結合高通量測序技術的 SELEX 技術等。這些新型 SELEX 技術的出現，為高效率地篩選核酸適配體提供了可能，有助于進一步發現新的腫瘤標志物。陳文學[18]利用消減 SELEX 技術，以肝癌混合血清為復合靶標，采用反映敏感性和特異性連續變量的指標——受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve, ROC）分析，篩選出肝癌血清標志物核酸適配體 9-25（aptamer-hepatic carcinoma serum, AP-HCS-9-25）、肝癌血清標志物核酸適配體 9-41（aptamer-hepatic carcinoma serum, AP-HCS-9-41），其敏感性和特異性都在 80% 以上。但該分析所針對的標本數少，尚不能作為臨床的參考數據，篩選的適配體對肝癌診斷的最終價值，還有待進一步驗證分析。張洪麗[19]利用逐級加大樣本量并聯合熒光法來評定篩選的胃癌血清標志物核酸適配體，發現胃癌血清標志物核酸適配體-15-16（aptamer-gastric cancer serum, AP-GCS-15-16）的受試者工作特征曲線下面積（area under the receiver operating characteristic, AUROC）達到了 0.880。而 AUROC 作為一種評價診斷準確性的指標，越接近 1，說明診斷效果越好。研究結果說明，這種方法具有良好的診斷價值。葸玉琴等[20]利用實時定量 PCR 技術并結合高通量測序技術，篩選出 20 條胃癌血清標志物核酸適配體，鑒定結果顯示 5、7、16、17、18 號適配體能夠與胃癌血清高特異性結合而與正常血清不結合，初步證明對胃癌的臨床診斷具有一定的研究意義。
核酸適配體的篩選一般都在體外進行，Mi 等[21]將 RNA 文庫直接注入患腫瘤的小鼠體內，在小鼠血清中篩選出一組與腫瘤蛋白特異性結合的適配子，進一步證實，其中適配體 14、16 號的靶標是一種在大腸癌中過度表達的 RNA 解螺旋酶 P68。這個發現，為核酸適配體的篩選提供了新的思路。
2.3 核酸適配體在腫瘤血清標志物篩選中的研究應用
近年來，研究人員利用 SELEX 技術，篩選到多種特異性識別腫瘤標志物的核酸適配體，為腫瘤的診斷奠定了理論基礎。方念[22]的研究中篩選到甲胎蛋白異質體（alpha-fetoprotein fraction, AFP-L3）的適配體，并以肝癌患者的血清作為試驗對象，顯示出了核酸適配體在臨床研究中的優勢。萬波[23]以癌胚抗原單克隆抗體 (anti-carcino-embryonic antigen, anti-CEA) 為靶標，篩選到 4 條特異性核酸適配體，為肺癌血清標志物核酸適配體的篩選提供了依據。Gold 等[24]首先以人血清中 813 種蛋白質為靶標篩選核酸適配體，獲得的適配體再以慢性腎臟疾病（chronic kidney disease, CKD）血清為復合靶標進一步篩選，最終得到 2 種已知的 CKD 標志物和 58 種未知 CKD 標志物。Ostroff 等[25]利用上述與 813 種蛋白質結合的適配子，建立了血清蛋白組學分析技術，共發現 12 種 NSCLC 血清腫瘤標志物，敏感度和特異度都在 80% 以上，高于以往用于診斷 NSCLC 的標志物。下一步經過臨床驗證后，很有可能作為臨床診斷 NSCLC 的腫瘤標志物。
綜上所述，通過核酸適配體檢測腫瘤血清標志物的研究雖然取得了一定的進展，但核酸適配體的篩選仍然是整個研究的瓶頸，需要研究人員進一步探索和完善。
3 總結和展望
核酸適配體的篩選，為發現高特異性的腫瘤血清標志物提供了可能，盡管研究人員不斷改善核酸適配體篩選的技術手段，優化篩選的條件等，但適配體篩選仍然是整個研究的難點。例如：① 核酸適配體的篩選條件受到多種因素的影響，目前篩選得到的適配體是在特定的實驗室環境中篩選得到，一旦環境發生變化，篩選的條件等可能也有較大的變化，因而增加了技術共享和規模化研究的困難；② 所收集的腫瘤血清很難區分早、中、晚期，因此篩選獲得的核酸適配體是否能作為早期診斷的依據，仍然需要進一步去驗證；③ 由于腫瘤的種類眾多，而目前涉及到的相關核酸適配體的篩選很少，今后可將諸如乳腺癌、淋巴癌等也作為研究的對象等。即使目前核酸適配體的篩選有難度，但其表現出的價值和應用前景，可以讓人相信通過核酸適配體的篩選，有望發現新的腫瘤血清標志物，為腫瘤的診斷提供新的依據。