本文利用自由基共聚法合成了一種多重響應性交聯聚合物載藥膠束，對其化學結構、納米級形貌進行了表征，并測定其載藥率。實驗結果表明，交聯聚合物載藥膠束為尺寸約 100 nm 的球形顆粒；其在還原劑谷胱甘肽（GSH）作用下可發生降解并溶脹；交聯聚合物載藥膠束的低臨界溶液溫度（LCST）為 39.4℃，當環境溫度高于 LCST 時，該膠束結構發生明顯收縮。本研究分析了該交聯聚合物載藥膠束在模擬腫瘤微環境下的載藥釋放情況，即當該交聯聚合物載藥膠束處于酸性（pH 5.0）、還原性（GSH 10 mmol/L）和高溫（42.0℃）條件下時，受條件刺激可促進其中藥物釋放，其累積釋放率可達 91.78%，而該交聯聚合物載藥膠束在無刺激條件下累積釋放率僅為 1.12%。細胞毒性實驗進一步表明，本文合成的交聯聚合物載藥膠束表現出了較強的細胞攝取能力，具有良好的生物相容性和較好的體外抗腫瘤活性。基于以上研究結果，本實驗中制備的交聯聚合物載藥膠束具有多重響應性釋藥功能，有望成為一種具備高效可控釋藥功能的理想載體材料。
引用本文： 屈婧, 陳康隆, 王秋月, 林娟, 周慶翰. 還原、溫度和 pH 三重響應性交聯聚合物載藥膠束的制備及其釋藥性能研究. 生物醫學工程學雜志, 2018, 35(1): 70-80. doi: 10.7507/1001-5515.201708038 復制
引言
近年來，聚合物膠束由于其獨特的雙親性結構受到了研究者們廣泛的關注[1]。聚合物膠束可包載疏水性藥物，在提高疏水性藥物的溶解度以及生物利用度的同時，其納米級的尺度可利用腫瘤組織的高通透性和滯留效應（enhanced permeation retention effect，EPR）增強藥物對腫瘤組織血管壁的滲透[2-3]。而經過化學交聯的聚合物膠束因具有穩定化學結構，可以防止膠束在體內循環中由于稀釋以及化學環境變化等原因導致的分解，同時交聯結構內部大量的空腔還可提高膠束載藥量，有利于提高其對腫瘤的治療效果[4-6]。
為了使藥物在腫瘤組織達到高效釋放的目的，交聯聚合物載藥膠束應具有對腫瘤細胞內微環境的響應性。研究發現，腫瘤細胞與正常細胞內微環境條件明顯不同，如腫瘤細胞中內涵體和溶酶體 pH 為 4～6，正常細胞 pH 為 7.4[7-12]；同時，腫瘤細胞中谷胱甘肽（glutathione，GSH）濃度（2～10 mmol/L）比正常組織細胞（1.2 mmol/L）高數倍，因而腫瘤細胞微環境具有較高的還原響應性[13-15]；另外，腫瘤細胞內較高的糖酵解速率也使其處于高溫環境（40～42℃）[16]。因此，構建一種結構穩定，同時能夠響應細胞內多重刺激的“智能”藥物載體體系是目前交聯聚合物載藥膠束的研究熱點[17]。Lin 等[18]制備了一種以聚羧基甜菜堿甲基丙烯酸酯為親水段，聚 ε-己內酯為疏水段的可降解聚合物膠束，在 10 mmol/L 二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）以及 pH 5.0 條件的雙重刺激下，藥物實現了高效靶向釋放。Gao 等[19]利用聚多肽合成了一種具有還原響應性以及溫度敏感性的雙響應性聚合物膠束，其臨界聚集膠束濃度遠小于未交聯聚合物膠束的臨界聚集膠束濃度，同時包裹阿霉素（doxorubicin，DOX）后能夠有效殺傷人宮頸癌細胞系 HeLa 細胞。雖然研究者對刺激響應性交聯聚合物膠束進行了廣泛的研究，但同時具有還原響應性、溫度敏感性以及 pH 敏感性的多重響應性交聯聚合物載藥膠束卻報道較少。
基于以上原因，并參考前述文獻所描述的腫瘤細胞內微環境的特征條件，本文利用乙烯基聚谷氨酸芐酯［poly（γ-benzyl-L-glutamate），PBLG］及 N-異丙基丙烯酰胺（N-isopropyl acrylamide，NIPAM）為共聚組分，偶氮二異丁氰（2,2-azobisisobutyronitrile，AIBN）為引發劑，N，N-雙（丙稀酰）胱胺（N，N-bisacrylamide，BACy）為交聯劑，利用自由基共聚法制備交聯聚合物；再通過腙鍵接載 DOX 制備了一種具有還原響應性、溫度敏感性以及 pH 敏感性的多重響應性交聯聚合物載藥膠束，以期提高聚合物膠束的體內循環穩定性，同時實現其在腫瘤細胞微環境中的高效可控釋藥，為藥物傳遞體系的構建與研究提供一種新的選擇。
1 實驗部分
1.1 試劑
NIPAM：純度 98%，購自薩恩化學技術（上海）有限公司；谷氨酸芐酯；分析純，購自四川同晟氨基酸有限公司；丙烯胺：純度 99%，購自成都貝斯特試劑有限公司；AIBN：純度 99%，購自天津市科密歐化學試劑有限公司；聯肼：純度 80%，購自天津市致遠化學試劑有限公司；DOX：純度 98%，購自北京華奉聯博化學材料有限公司。其余溶劑和試劑均為分析純，購自成都市科隆化學品有限公司。
1.2 實驗過程
整體合成路線如圖 1 所示。首先用丙烯胺與谷氨酸芐酯環內酸酐（γ-Benzyl-L-glutamate N-carboxyanhydride，Glu-NCA）反應制得乙烯基 PBLG；用胱胺鹽酸鹽與丙烯酰氯反應制得 BACy。然后，利用乙烯基 PBLG 及 NIPAM 為共聚組分，AIBN 為引發劑，BACy 為交聯劑，并利用自由基共聚法制備交聯聚合物；通過腙鍵接載 DOX 制備多重響應性交聯聚合物載藥膠束。
圖1
載藥膠束的合成路線以及藥物釋放過程
Figure1.
Synthesis route and DOX release process of the drug-conjugated cross-linked micelles
1.2.1 Glu-NCA 的制備
以乙酸乙酯為溶劑，在三口燒瓶中加入谷氨酸芐酯 7.12 g，在氮氣保護下，攪拌回流 0.5 h，反應溫度為 85℃，加入三光氣，繼續攪拌 2 h，待溶液澄清。利用正己烷作為溶劑進行純化，干燥后即得產品。
1.2.2 乙烯基 PBLG 的制備
將丙烯胺 5 μL，Glu-NCA 0.70 g 和 4 mL 二甲基甲酰胺（dimethyl formamide，DMF）同時轉移至聚合管中，通入氮氣保護。冷凍-解凍循環 3 次后，室溫下反應 24 h。反應結束后，將產品用冰乙醚沉淀、過濾、干燥后即得產品。
1.2.3 BACy 的制備
將胱胺鹽酸鹽 2.30 g，溶于 18 mL 水中；同時取 1.8 mL 丙烯酰氯，溶于 3.0 mL 二氯甲烷中，冰浴降溫。用恒壓漏斗同時滴加配置好的 NaOH 溶液和丙烯酰氯溶液，冰浴下反應 3 h。利用二氯甲烷對產品進行萃取，利用無水 MgSO4 干燥、過濾、旋蒸、重結晶后即得產品。
1.2.4 交聯聚合物的制備
將 NIPAM 0.61 g，乙烯基 PBLG 0.20 g，BACy 0.04 g，AIBN 0.04 g 加入三口燒瓶中，以甲苯作為溶劑，在 85℃ 氮氣保護下反應 12 h。反應后將產品再用冰乙醚和四氫呋喃混合液進行沉淀、過濾、干燥后即得產品。
1.2.5 空白膠束的制備
稱取交聯聚合物 10 mg，溶于 2 mL 的四氫呋喃中，放在磁力攪拌器上攪拌 1 h。將溶液逐滴滴加到 5 mL 的蒸餾水中形成空白膠束。用透析袋（MWCO12000，MYM 生物科技有限公司）透析 3 d，凍干。
1.2.6 交聯聚合物載藥膠束的制備
將上述交聯聚合物溶解于 DMF 中，加入過量的 DOX，避光；室溫下，氮氣保護，加入聯肼在甲苯溶液中反應 24 h。用透析袋（MWCO12000，MYM 生物科技有限公司）透析 3 d，凍干，所得紅色粉末即為產品。
1.3 測試與表征
1.3.1 核磁共振分析
本文采用核磁共振儀（1H-nuclear magnetic resonance，1H-NMR）（Inova-400，美國瓦里安技術有限公司）進行測試，選擇氘代三氯甲烷（CDCl3）為樣品氘代試劑。
1.3.2 傅里葉變換紅外光譜分析
采用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）儀（IR2000，美國熱電公司）進行測試；利用 KBr 鹽片涂膜法進行測定，掃描范圍為 400～4 000 cm–1，分辨率為 4 cm–1。
1.3.3 紫外光譜分析
紫外吸收光譜（ultraviolet spectrum，UV）分析采用紫外可見光分光光度計（TU1950，上海美譜達儀器有限公司）測試。藥物釋放紫外吸收波長選擇 480 nm。
1.3.4 納米粒度分析
采用納米粒度（dynamic light scattereing，DLS）儀（Zetasizer Nano-zs 90，英國馬爾文儀器有限公司）進行測試。實驗室溫度為 25℃，溶劑水的折射率 n = 1.332，入射光波長 λ = 632.8 nm，樣品測試持續時間為 300 s。
1.3.5 吸光度分析
利用紫外可見光分光光度計（TU1950，上海美譜達儀器有限公司）測量吸光度，吸收波長為 600 nm，通過測定不同吸光度值計算交聯聚合物溶液的相對吸光度。
1.3.6 透射電鏡觀察
利用透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）（Hitachi-600 型，日立有限公司）進行測試，將產品滴于銅網的碳膜上，室溫干燥后進行觀察。
1.3.7 低臨界溶液溫度的測定
取 1.6 mg 空白膠束溶于 2 mL 去離子水中，配置為 0.8 mg/mL 的空白膠束水溶液，并將溶液從 20℃ 升高至 50℃，每升高 2℃ 恒溫 10 min 后，即用紫外可見分光光度計于 500 nm 波長處測溶液透光率，當透光率變化 50% 時的溫度即為空白膠束的低臨界溶液溫度（low critical solution temperature，LCST）。隨后，本文又測定了空白膠束分別在 25℃ 和 55℃ 溫度下的粒徑大小以及空白膠束分別在溫度由 25℃ 升高至 45℃ 和由 45℃ 降低至 25℃ 等不同變化趨勢下的粒徑大小變化情況，以求全面了解膠束粒徑隨溫度變化的情況。
1.4 藥物釋放
配置 1.0 mg/mL 交聯聚合物載藥膠束溶液，分別在以下條件下進行實驗：① 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS），pH = 7.4，37℃；② GSH，10 mmol/L，PBS（pH = 7.4），37℃；③ 醋酸鹽緩沖液（acetate buffer solution，ABS），pH = 5.0，37℃；④ GSH，10 mmol/L，ABS（pH = 5.0），37℃；⑤ GSH，10 mmol/L，ABS（pH = 5.0），42℃。在不同時間間隔分別取出 1.5 mL 用于溶液吸光度測定，進而計算 DOX 累積釋放率。依據公式（1）如下所示：
載藥效率（%）= 載藥量/投入藥量 (1)
本文根據 DOX 標準曲線以及式（1）可計算交聯聚合物的載藥效率。
1.5 細胞毒性實驗
在羅斯威爾·帕克紀念研究所 1640 （Roswell Park memorial institute-1640，RPMI-1640）培養基中培養 HeLa 細胞 24 h，然后配置濃度分別為 1 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL 以及 80 μg/mL 的樣品溶液，各取 200 μL 作用于已處理過的 HeLa 細胞，24 h 后，加入 100 μL 新鮮培養基和 10 μL 細胞計數試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）試劑，用酶標儀在 450 nm 處檢測光密度（optical density，OD）值。以同樣方法處理人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC），用于檢測空白膠束對正常細胞的細胞毒性。
1.6 共聚焦顯微鏡成像
首先用處理好的 PBS 清洗細胞，然后用 4% 的多聚甲醛使細胞固定住，室溫靜置 30 min。在避光條件下進行 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色，室溫靜置。然后將細胞與樣品一同培養，一定時間后，棄掉培養液，利用激光共聚焦顯微鏡（AE31，麥克奧迪實業集團有限公司）進行觀察拍照。
2 結果與討論
2.1 交聯聚合物以及相關分子的結構分析
利用胱胺鹽酸鹽與丙烯酰氯反應制得 BACy；用丙烯胺與 Glu-NCA 反應制得乙烯基 PBLG；最后，利用乙烯基 PBLG 及 NIPAM 為共聚組分，AIBN 為引發劑，BACy 為交聯劑利用自由基共聚法制備交聯聚合物。用1H-NMR 對 BACy、乙烯基 PBLG、交聯聚合物以及交聯聚合物載藥膠束的結構進行了表征。如圖 2 中 BACy 的 1H-NMR 所示，δ = 6.5～6.7 對應于仲胺鍵上的氫，δ = 6.2～6.4 對應于乙烯基上的氫，δ = 3.6～3.8 為二硫鍵旁 α-碳原子上的氫，δ = 2.7～2.9 為二硫鍵旁 β-碳原子上的氫。1H-NMR 結果顯示，BACy 的合成是成功的。如圖 2 中乙烯基 PBLG 的 1H-NMR 所示，δ = 7.8～8.0 對應于主鏈上仲胺鍵上的氫，δ = 7.1～7.3 對應于 PBLG 中苯環上的氫，δ = 5.0～5.1 對應于芐基上的氫，δ = 4.5～4.7 為主鏈次甲基上的氫，δ = 2.8～2.9 對應于引發劑殘基上亞甲基的氫，δ = 2.3～2.7 對應于支鏈上 β-亞甲基上的氫，δ = 2.0～2.1 對應于支鏈上 α-亞甲基上的氫。1H-NMR 結果顯示，乙烯基 PBLG 的合成是成功的。如圖 2 中交聯聚合物的 1H-NMR 所示，δ = 7.8～8.0 對應于乙烯基 PBLG 主鏈上仲胺鍵上的氫，δ = 7.1～7.3 對應于乙烯基 PBLG 中苯環上的氫，δ = 5.0～5.1 對應于芐基上的氫，δ = 4.5～4.7 為主鏈次甲基上的氫，δ = 2.3～2.7 對應于乙烯基 PBLG 支鏈上 β-亞甲基上的氫，δ = 2.0～2.1 對應于乙烯基 PBLG 支鏈上 α-亞甲基上的氫，δ = 1.0～1.3 為 NIPAM 鏈段上甲基的氫，1H-NMR 結果顯示，已成功制備交聯聚合物。最后，通過腙鍵接載 DOX 制備交聯聚合物載藥膠束。交聯聚合物載藥膠束的 1H-NMR 結果如圖 2 所示。δ = 7.8～8.1 對應于聚合物主鏈上仲胺鍵上的氫，δ = 7.1～7.3 對應于 DOX 中苯環上的氫，δ = 5.5～5.6 對應于 DOX 中的羥基上的氫，δ = 4.9～5.1 對應于 DOX 中叔碳上的氫，δ = 4.2～4.3 對應于乙烯基 PBLG 中叔碳上的氫，δ = 4.0～4.2 對應于 NIPAM 中支鏈次甲基上的氫，δ = 2.3～2.7 對應于乙烯基 PBLG 支鏈上 β-亞甲基上的氫，δ = 2.0～2.1 對應于乙烯基 PBLG 支鏈上 α-亞甲基上的氫，δ = 1.1～1.4 為 NIPAM 支鏈甲基上的氫，δ = 0.8～1.0 對應于 DOX 中甲基上的氫，1H-NMR 結果顯示，交聯聚合物載藥膠束的制備是成功的。
圖2
BACy、乙烯基 PBLG、交聯聚合物以及交聯聚合物載藥膠束的 1H-NMR 圖及化學結構式
Figure2.
1H-NMR spectra and the chemical structure of BACy, vinyl radical PBLG, cross-linked polymer and DOX-conjugated cross-linked micelle
為進一步驗證 BACy，乙烯基 PBLG 以及交聯聚合物的化學結構，本實驗利用 FTIR 對以上化合物進行了表征。如圖 3 所示為 BACy、乙烯基 PBLG 以及交聯聚合物的 FTIR 圖，其中，BACy 的曲線處 3 266 cm–1為氮氫鍵的伸縮振動吸收峰，1 560.13 cm–1為碳氧雙鍵的伸縮振動吸收峰，1 049.71 cm–1為碳氮鍵的伸縮振動吸收峰，698.10 cm–1為碳硫鍵的伸縮振動吸收峰。結果顯示，BACy 的制備是成功的。乙烯基 PBLG 的 FTIR 圖顯示，3 200～3 500 cm–1為氮氫鍵的伸縮振動吸收峰，3 080 cm–1為苯環上碳氫鍵的伸縮振動吸收峰，1 700 cm–1為碳氧雙鍵的伸縮振動吸收峰，1 050～1 210 cm–1為醚鍵的特征吸收峰。結果顯示，乙烯基 PBLG 的制備是成功的。由 NIPAM 和乙烯基 PBLG 的交聯聚合物的 FTIR 譜圖可知，3 200～3 500 cm–1為氮氫鍵的伸縮振動吸收峰，3 080 cm–1為苯環上碳氫鍵的伸縮振動吸收峰，1 700 cm–1為碳氧雙鍵的伸縮振動吸收峰，1 397 cm–1為亞甲基的骨架振動吸收峰，1 050～1 210 cm–1為醚鍵的特征吸收，698.10 cm–1為碳硫鍵的伸縮振動吸收峰。結果顯示，交聯聚合物合成成功。
圖3
BACy，乙烯基 PBLG 和交聯聚合物的 FTIR 圖
Figure3.
FTIR spectra of BACy, vinyl radical PBLG and cross-linked polymer
2.2 空白膠束的還原響應性
平均尺寸為 10～200 nm 的球形或近似球形的納米形態能夠提高載體材料對血管管壁的通透性和 EPR 效應，有利于藥物傳遞。因此，本文對空白膠束的形貌及尺寸大小進行了表征。如圖 4 所示，從空白膠束的 DLS 結果中可以看出，在 PBS（pH 7.4）未加入 GSH 的條件下，膠束的粒徑為 100 nm 左右。空白膠束的 TEM 照片顯示，空白膠束呈球形結構，且分散穩定性良好，其平均粒徑為 70 nm 左右。TEM 測出的粒徑數值小于 DLS 檢測實驗測出的粒徑，是由于 TEM 實驗過程中，膠束滴于銅網上，在干燥條件下進行實驗，而空白膠束干燥過程中發生收縮，從而導致其粒徑減小。
圖4
空白膠束的形貌表征
Figure4.
The morphological characterization of blank micelles
為驗證空白膠束的還原響應性，本文利用 DLS 實驗對空白膠束在 GSH（10 mmol/L）條件下的粒徑變化進行了測試，如圖 5 所示。在 PBS（pH 7.4）未加入 GSH 的條件下，空白膠束的粒徑在 24 h 內沒有發生明顯的變化，說明空白膠束在 PBS 條件下粒徑形態能夠保持穩定。當加入 10 mmol/L GSH 后，空白膠束的粒徑隨著時間增加而不斷增加；而 4 h 后，空白膠束粒徑隨時間的增加而減小。出現上述現象的原因是由于在 0～4 h 內，空白膠束中的二硫鍵與 GSH 發生還原反應，使得二硫鍵斷裂，空白膠束發生溶脹使得其粒徑逐漸增大；4 h 后，空白膠束中斷裂的聚合物分子鏈逐步脫落，造成其粒徑反而減小。為進一步驗證空白膠束的還原響應性，本實驗中對空白膠束的相對吸光度進行了測試。如圖 5 的相對吸光度變化譜圖所示，在沒有加入 GSH 的條件下，空白膠束的相對吸光度沒有發生明顯變化。加入 10 mmol/L GSH 后，相對吸光度明顯下降。結果表明，空白膠束在 GSH 作用下發生降解；同時證明，所制備空白膠束中的二硫鍵結構對還原劑 GSH 的濃度變化有較好的響應性。
圖5
加入 GSH 的空白膠束 DLS 及相對吸光度變化譜圖
Figure5.
The size and the relative absorbance change of blank micelles in response to GSH
2.3 空白膠束的溫度敏感性行為實驗
溫度敏感性聚合物的溶解度在 LCST 附近發生變化，當溫度低于 LCST 時，聚合物中氮原子與水分子間的氫鍵結合使聚合物膠束可溶于水；而當溫度高于 LCST 后，氫鍵被破壞，聚合物中疏水相互作用增強從而導致聚合物膠束崩解，并從水中析出。為測試所制備空白膠束的 LCST，本實驗利用紫外可見分光光度計于 500 nm 波長處測量溶液透光率。實驗測得空白膠束的 LCST 為 39.4℃，如圖 6 中空白膠束隨溫度變化的透過率變化圖所示。同時，從溶解度照片中可以看出，當溫度低于 LCST 時，空白膠束可溶于水，形成透明溶液；而當溫度高于 LCST 后，氫鍵被破壞，并從水中析出，溶液出現渾濁。實驗測得的空白膠束有較高的 LCST，其原因是空白膠束核殼結構中有氨基酸組分存在，其酰胺鍵結構增強了空白膠束與水分子間的氫鍵作用，這也更有利于空白膠束在人體正常溫度下的循環穩定性和藥物的傳遞。由空白膠束在不同溫度下的粒徑圖可知，溫度為 25℃ 時，空白膠束的粒徑大小為 220 nm，溫度為 55℃ 時，空白膠束的粒徑大小為 164 nm，結果說明空白膠束可在高溫條件下發生收縮，證明了其具備溫度敏感性。從圖 6 中空白膠束隨溫度變化的粒徑變化圖可知，當將溫度從 25℃ 升高至 45℃ 時，空白膠束的粒徑從 220 nm 下降至 168 nm，同時，當將溫度由 45℃ 冷卻至 25℃ 時，空白膠束的粒徑從 170 nm 增大至 221 nm，表明了空白膠束隨溫度變化的可逆性，顯示了其作為載藥材料的可控性。
圖6
空白膠束的溫度敏感性行為
Figure6.
Thermosensitive behavior of blank micelles
2.4 交聯聚合物載藥膠束對藥物的控制釋放
為進一步研究交聯聚合物載藥膠束的釋藥性能，本文對其可控釋藥的多重響應性條件進行了探索。首先，利用紫外可見分光光度計在 480 nm 處測定交聯聚合物載藥膠束的吸光度，計算得到交聯聚合物的載藥效率為 44.74%，表明交聯聚合物對藥物有較高的載藥效率。本文設定了① 37℃，PBS（pH = 7.4）；② 37℃，PBS（pH = 7.4），GSH 10 mmol/L；③ 37℃，ABS（pH = 5.0）；④ 37℃，ABS（pH = 5.0），GSH 10 mmol/L；⑤ 42℃，ABS（pH = 5.0），GSH 10 mmol/L 共 5 種不同的微環境條件，并測試了在 5 種條件下交聯聚合物載藥膠束的藥物釋放性能。如圖 7 所示，游離 DOX 在 5 h 內快速釋放，其累積釋放率達 95.04%。當交聯聚合物載藥膠束在① 條件下，24 h 的累積釋放率僅為 1.12%；在 ② 條件下，其 24 h 累積釋放率為 43.78%；在 ③ 條件下，其 24 h 累積釋放率為 68.65%；在 ④ 條件下，其釋放率為 86%；在 ⑤ 條件下，其 24 h 累積釋放率達到最高，為 91.78%。實驗數據表明：① 交聯聚合物載藥膠束在無刺激條件下僅存在微量的藥物釋放，表明其具有優異的藥物穩定性；② GSH 條件下藥物釋放效率較大，表明其具有良好的還原響應性；③ 酸性條件下較中性條件藥物釋放效率增大，是由于交聯聚合物載藥膠束中腙鍵在酸性條件下斷裂，表明其具有良好的 pH 敏感性；④ 高溫條件下（42℃）藥物釋放效率較大，表明交聯聚合物載藥膠束具有溫度敏感性。綜上所述，由于腫瘤細胞內涵體的弱酸性微環境（pH 5.0），同時細胞內 GSH 濃度較高，溫度也較正常細胞偏高，故本文所制備交聯聚合物載藥膠束有望在腫瘤細胞內快速高效釋藥；而在人體正常 pH 條件下微量釋藥，從而有效減小藥物毒副作用，提高藥物的傳遞效率。
圖7
交聯聚合物載藥膠束的藥物釋放表征
Figure7.
DOX release profiles of DOX conjugated cross-linked micelle
2.5 交聯聚合物載藥膠束的細胞毒性研究
為了進一步研究交聯聚合物載藥膠束在細胞中的攝入和分布情況，本文對其進行了共聚焦顯微鏡實驗。如圖 8 所示為 HeLa 細胞分別在游離 DOX 和交聯聚合物載藥膠束溶液中培養 2 h 和 24 h 的激光共聚焦圖像。從圖中可以看出，與樣品培養 2 h 后游離 DOX 在 HeLa 細胞內僅出現了較弱的 DOX 熒光信號；而交聯聚合物載藥膠束在 HeLa 細胞內出現了較強的 DOX 熒光信號。這是由于交聯聚合物載藥膠束在腫瘤細胞微環境條件下能夠快速釋放藥物，而游離 DOX 是通過擴散機制進入細胞，因擴散速度較慢從而導致 DOX 的細胞攝入量較低。交聯聚合物載藥膠束與 HeLa 細胞培養 24 h 后，從游離 DOX 與從膠束中進入 HeLa 細胞內的 DOX 熒光信號相似，表明兩者具有相似的 DOX 細胞攝入量。實驗結果表明，交聯聚合物載藥膠束進入細胞后能快速釋放出 DOX，并且能夠進入細胞核，進而有效殺傷腫瘤細胞。
圖8
HeLa 細胞激光共聚焦顯微圖像
Figure8.
The laser confocal micrograph of HeLa cells
在前述研究基礎上，本文課題組采用 CCK8 法對 HUVEC 細胞以及 HeLa 細胞進行了細胞毒性實驗，如圖 9 所示。由 HUVEC 細胞活性實驗可知，在空白膠束樣品中細胞存活率較高，表明空白膠束有較好的生物相容性；通過對交聯聚合物載藥膠束對 HeLa 細胞的抑制率隨濃度的變化曲線進行擬合計算可得，DOX 的半抑制率濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為 19.6 μg/mL；交聯聚合物載藥膠束的 IC50 為 33.2 μg/mL，其腫瘤細胞抑制率略低于 DOX。結果表明，隨著交聯聚合物載藥膠束中 DOX 濃度的增強，交聯聚合物載藥膠束在腫瘤細胞微環境條件刺激下釋放藥物分子進而殺死癌細胞，因此其具備良好的抗腫瘤活性。HeLa 細胞活性實驗的結果顯示，細胞存活率隨著空白膠束濃度增高而降低，空白膠束對 HeLa 細胞表現出了低毒性。這是由于 HeLa 細胞內 GSH 的濃度為 2～10 mmol/L，在此還原條件下空白膠束內二硫鍵斷裂，降解產生 PBLG 分子鏈，因而對 HeLa 細胞造成一定的細胞毒性；然而，在 HUVEC 細胞內 GSH 的濃度較低，僅有 1.2 mmol/L，空白膠束內二硫鍵幾乎未發生斷裂，整體保持膠束原有結構，不會對 HUVEC 細胞造成明顯細胞毒性，因此表現出較好的生物相容性。以上結果再次證實了本課題組最初期望將該交聯聚合物載藥膠束具有作為載藥材料潛力的猜想。
圖9
HUVEC 細胞和 HeLa 細胞存活率表征
Figure9.
Survival assay of HUVEC cells and HeLa cells
3 結論
本文利用自由基共聚法合成了交聯聚合物，再通過腙鍵接載 DOX 制備具有還原響應性、溫度敏感性以及 pH 敏感性的三重響應性交聯聚合物載藥膠束。實驗結果顯示，此交聯聚合物載藥膠束在 GSH 10 mmol/L 條件下發生二硫鍵斷裂，交聯聚合物載藥膠束發生降解；其 LCST 為 39.4℃，在腫瘤細胞溫度下發生收縮；在 pH 5.0 的弱酸性條件下腙鍵斷裂釋放藥物。細胞毒性實驗表明，該交聯聚合物載藥膠束具備較好的生物相容性和抗腫瘤活性趨勢。綜上所述，本文所制備的三重響應性交聯聚合物載藥膠束有望成為一種具備高效可控釋藥功能的理想載體材料。
引言
近年來，聚合物膠束由于其獨特的雙親性結構受到了研究者們廣泛的關注[1]。聚合物膠束可包載疏水性藥物，在提高疏水性藥物的溶解度以及生物利用度的同時，其納米級的尺度可利用腫瘤組織的高通透性和滯留效應（enhanced permeation retention effect，EPR）增強藥物對腫瘤組織血管壁的滲透[2-3]。而經過化學交聯的聚合物膠束因具有穩定化學結構，可以防止膠束在體內循環中由于稀釋以及化學環境變化等原因導致的分解，同時交聯結構內部大量的空腔還可提高膠束載藥量，有利于提高其對腫瘤的治療效果[4-6]。
為了使藥物在腫瘤組織達到高效釋放的目的，交聯聚合物載藥膠束應具有對腫瘤細胞內微環境的響應性。研究發現，腫瘤細胞與正常細胞內微環境條件明顯不同，如腫瘤細胞中內涵體和溶酶體 pH 為 4～6，正常細胞 pH 為 7.4[7-12]；同時，腫瘤細胞中谷胱甘肽（glutathione，GSH）濃度（2～10 mmol/L）比正常組織細胞（1.2 mmol/L）高數倍，因而腫瘤細胞微環境具有較高的還原響應性[13-15]；另外，腫瘤細胞內較高的糖酵解速率也使其處于高溫環境（40～42℃）[16]。因此，構建一種結構穩定，同時能夠響應細胞內多重刺激的“智能”藥物載體體系是目前交聯聚合物載藥膠束的研究熱點[17]。Lin 等[18]制備了一種以聚羧基甜菜堿甲基丙烯酸酯為親水段，聚 ε-己內酯為疏水段的可降解聚合物膠束，在 10 mmol/L 二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）以及 pH 5.0 條件的雙重刺激下，藥物實現了高效靶向釋放。Gao 等[19]利用聚多肽合成了一種具有還原響應性以及溫度敏感性的雙響應性聚合物膠束，其臨界聚集膠束濃度遠小于未交聯聚合物膠束的臨界聚集膠束濃度，同時包裹阿霉素（doxorubicin，DOX）后能夠有效殺傷人宮頸癌細胞系 HeLa 細胞。雖然研究者對刺激響應性交聯聚合物膠束進行了廣泛的研究，但同時具有還原響應性、溫度敏感性以及 pH 敏感性的多重響應性交聯聚合物載藥膠束卻報道較少。
基于以上原因，并參考前述文獻所描述的腫瘤細胞內微環境的特征條件，本文利用乙烯基聚谷氨酸芐酯［poly（γ-benzyl-L-glutamate），PBLG］及 N-異丙基丙烯酰胺（N-isopropyl acrylamide，NIPAM）為共聚組分，偶氮二異丁氰（2,2-azobisisobutyronitrile，AIBN）為引發劑，N，N-雙（丙稀酰）胱胺（N，N-bisacrylamide，BACy）為交聯劑，利用自由基共聚法制備交聯聚合物；再通過腙鍵接載 DOX 制備了一種具有還原響應性、溫度敏感性以及 pH 敏感性的多重響應性交聯聚合物載藥膠束，以期提高聚合物膠束的體內循環穩定性，同時實現其在腫瘤細胞微環境中的高效可控釋藥，為藥物傳遞體系的構建與研究提供一種新的選擇。
1 實驗部分
1.1 試劑
NIPAM：純度 98%，購自薩恩化學技術（上海）有限公司；谷氨酸芐酯；分析純，購自四川同晟氨基酸有限公司；丙烯胺：純度 99%，購自成都貝斯特試劑有限公司；AIBN：純度 99%，購自天津市科密歐化學試劑有限公司；聯肼：純度 80%，購自天津市致遠化學試劑有限公司；DOX：純度 98%，購自北京華奉聯博化學材料有限公司。其余溶劑和試劑均為分析純，購自成都市科隆化學品有限公司。
1.2 實驗過程
整體合成路線如圖 1 所示。首先用丙烯胺與谷氨酸芐酯環內酸酐（γ-Benzyl-L-glutamate N-carboxyanhydride，Glu-NCA）反應制得乙烯基 PBLG；用胱胺鹽酸鹽與丙烯酰氯反應制得 BACy。然后，利用乙烯基 PBLG 及 NIPAM 為共聚組分，AIBN 為引發劑，BACy 為交聯劑，并利用自由基共聚法制備交聯聚合物；通過腙鍵接載 DOX 制備多重響應性交聯聚合物載藥膠束。
圖1
載藥膠束的合成路線以及藥物釋放過程
Figure1.
Synthesis route and DOX release process of the drug-conjugated cross-linked micelles
1.2.1 Glu-NCA 的制備
以乙酸乙酯為溶劑，在三口燒瓶中加入谷氨酸芐酯 7.12 g，在氮氣保護下，攪拌回流 0.5 h，反應溫度為 85℃，加入三光氣，繼續攪拌 2 h，待溶液澄清。利用正己烷作為溶劑進行純化，干燥后即得產品。
1.2.2 乙烯基 PBLG 的制備
將丙烯胺 5 μL，Glu-NCA 0.70 g 和 4 mL 二甲基甲酰胺（dimethyl formamide，DMF）同時轉移至聚合管中，通入氮氣保護。冷凍-解凍循環 3 次后，室溫下反應 24 h。反應結束后，將產品用冰乙醚沉淀、過濾、干燥后即得產品。
1.2.3 BACy 的制備
將胱胺鹽酸鹽 2.30 g，溶于 18 mL 水中；同時取 1.8 mL 丙烯酰氯，溶于 3.0 mL 二氯甲烷中，冰浴降溫。用恒壓漏斗同時滴加配置好的 NaOH 溶液和丙烯酰氯溶液，冰浴下反應 3 h。利用二氯甲烷對產品進行萃取，利用無水 MgSO4 干燥、過濾、旋蒸、重結晶后即得產品。
1.2.4 交聯聚合物的制備
將 NIPAM 0.61 g，乙烯基 PBLG 0.20 g，BACy 0.04 g，AIBN 0.04 g 加入三口燒瓶中，以甲苯作為溶劑，在 85℃ 氮氣保護下反應 12 h。反應后將產品再用冰乙醚和四氫呋喃混合液進行沉淀、過濾、干燥后即得產品。
1.2.5 空白膠束的制備
稱取交聯聚合物 10 mg，溶于 2 mL 的四氫呋喃中，放在磁力攪拌器上攪拌 1 h。將溶液逐滴滴加到 5 mL 的蒸餾水中形成空白膠束。用透析袋（MWCO12000，MYM 生物科技有限公司）透析 3 d，凍干。
1.2.6 交聯聚合物載藥膠束的制備
將上述交聯聚合物溶解于 DMF 中，加入過量的 DOX，避光；室溫下，氮氣保護，加入聯肼在甲苯溶液中反應 24 h。用透析袋（MWCO12000，MYM 生物科技有限公司）透析 3 d，凍干，所得紅色粉末即為產品。
1.3 測試與表征
1.3.1 核磁共振分析
本文采用核磁共振儀（1H-nuclear magnetic resonance，1H-NMR）（Inova-400，美國瓦里安技術有限公司）進行測試，選擇氘代三氯甲烷（CDCl3）為樣品氘代試劑。
1.3.2 傅里葉變換紅外光譜分析
采用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）儀（IR2000，美國熱電公司）進行測試；利用 KBr 鹽片涂膜法進行測定，掃描范圍為 400～4 000 cm–1，分辨率為 4 cm–1。
1.3.3 紫外光譜分析
紫外吸收光譜（ultraviolet spectrum，UV）分析采用紫外可見光分光光度計（TU1950，上海美譜達儀器有限公司）測試。藥物釋放紫外吸收波長選擇 480 nm。
1.3.4 納米粒度分析
采用納米粒度（dynamic light scattereing，DLS）儀（Zetasizer Nano-zs 90，英國馬爾文儀器有限公司）進行測試。實驗室溫度為 25℃，溶劑水的折射率 n = 1.332，入射光波長 λ = 632.8 nm，樣品測試持續時間為 300 s。
1.3.5 吸光度分析
利用紫外可見光分光光度計（TU1950，上海美譜達儀器有限公司）測量吸光度，吸收波長為 600 nm，通過測定不同吸光度值計算交聯聚合物溶液的相對吸光度。
1.3.6 透射電鏡觀察
利用透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）（Hitachi-600 型，日立有限公司）進行測試，將產品滴于銅網的碳膜上，室溫干燥后進行觀察。
1.3.7 低臨界溶液溫度的測定
取 1.6 mg 空白膠束溶于 2 mL 去離子水中，配置為 0.8 mg/mL 的空白膠束水溶液，并將溶液從 20℃ 升高至 50℃，每升高 2℃ 恒溫 10 min 后，即用紫外可見分光光度計于 500 nm 波長處測溶液透光率，當透光率變化 50% 時的溫度即為空白膠束的低臨界溶液溫度（low critical solution temperature，LCST）。隨后，本文又測定了空白膠束分別在 25℃ 和 55℃ 溫度下的粒徑大小以及空白膠束分別在溫度由 25℃ 升高至 45℃ 和由 45℃ 降低至 25℃ 等不同變化趨勢下的粒徑大小變化情況，以求全面了解膠束粒徑隨溫度變化的情況。
1.4 藥物釋放
配置 1.0 mg/mL 交聯聚合物載藥膠束溶液，分別在以下條件下進行實驗：① 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS），pH = 7.4，37℃；② GSH，10 mmol/L，PBS（pH = 7.4），37℃；③ 醋酸鹽緩沖液（acetate buffer solution，ABS），pH = 5.0，37℃；④ GSH，10 mmol/L，ABS（pH = 5.0），37℃；⑤ GSH，10 mmol/L，ABS（pH = 5.0），42℃。在不同時間間隔分別取出 1.5 mL 用于溶液吸光度測定，進而計算 DOX 累積釋放率。依據公式（1）如下所示：
載藥效率（%）= 載藥量/投入藥量 (1)
本文根據 DOX 標準曲線以及式（1）可計算交聯聚合物的載藥效率。
1.5 細胞毒性實驗
在羅斯威爾·帕克紀念研究所 1640 （Roswell Park memorial institute-1640，RPMI-1640）培養基中培養 HeLa 細胞 24 h，然后配置濃度分別為 1 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL 以及 80 μg/mL 的樣品溶液，各取 200 μL 作用于已處理過的 HeLa 細胞，24 h 后，加入 100 μL 新鮮培養基和 10 μL 細胞計數試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）試劑，用酶標儀在 450 nm 處檢測光密度（optical density，OD）值。以同樣方法處理人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC），用于檢測空白膠束對正常細胞的細胞毒性。
1.6 共聚焦顯微鏡成像
首先用處理好的 PBS 清洗細胞，然后用 4% 的多聚甲醛使細胞固定住，室溫靜置 30 min。在避光條件下進行 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色，室溫靜置。然后將細胞與樣品一同培養，一定時間后，棄掉培養液，利用激光共聚焦顯微鏡（AE31，麥克奧迪實業集團有限公司）進行觀察拍照。
2 結果與討論
2.1 交聯聚合物以及相關分子的結構分析
利用胱胺鹽酸鹽與丙烯酰氯反應制得 BACy；用丙烯胺與 Glu-NCA 反應制得乙烯基 PBLG；最后，利用乙烯基 PBLG 及 NIPAM 為共聚組分，AIBN 為引發劑，BACy 為交聯劑利用自由基共聚法制備交聯聚合物。用1H-NMR 對 BACy、乙烯基 PBLG、交聯聚合物以及交聯聚合物載藥膠束的結構進行了表征。如圖 2 中 BACy 的 1H-NMR 所示，δ = 6.5～6.7 對應于仲胺鍵上的氫，δ = 6.2～6.4 對應于乙烯基上的氫，δ = 3.6～3.8 為二硫鍵旁 α-碳原子上的氫，δ = 2.7～2.9 為二硫鍵旁 β-碳原子上的氫。1H-NMR 結果顯示，BACy 的合成是成功的。如圖 2 中乙烯基 PBLG 的 1H-NMR 所示，δ = 7.8～8.0 對應于主鏈上仲胺鍵上的氫，δ = 7.1～7.3 對應于 PBLG 中苯環上的氫，δ = 5.0～5.1 對應于芐基上的氫，δ = 4.5～4.7 為主鏈次甲基上的氫，δ = 2.8～2.9 對應于引發劑殘基上亞甲基的氫，δ = 2.3～2.7 對應于支鏈上 β-亞甲基上的氫，δ = 2.0～2.1 對應于支鏈上 α-亞甲基上的氫。1H-NMR 結果顯示，乙烯基 PBLG 的合成是成功的。如圖 2 中交聯聚合物的 1H-NMR 所示，δ = 7.8～8.0 對應于乙烯基 PBLG 主鏈上仲胺鍵上的氫，δ = 7.1～7.3 對應于乙烯基 PBLG 中苯環上的氫，δ = 5.0～5.1 對應于芐基上的氫，δ = 4.5～4.7 為主鏈次甲基上的氫，δ = 2.3～2.7 對應于乙烯基 PBLG 支鏈上 β-亞甲基上的氫，δ = 2.0～2.1 對應于乙烯基 PBLG 支鏈上 α-亞甲基上的氫，δ = 1.0～1.3 為 NIPAM 鏈段上甲基的氫，1H-NMR 結果顯示，已成功制備交聯聚合物。最后，通過腙鍵接載 DOX 制備交聯聚合物載藥膠束。交聯聚合物載藥膠束的 1H-NMR 結果如圖 2 所示。δ = 7.8～8.1 對應于聚合物主鏈上仲胺鍵上的氫，δ = 7.1～7.3 對應于 DOX 中苯環上的氫，δ = 5.5～5.6 對應于 DOX 中的羥基上的氫，δ = 4.9～5.1 對應于 DOX 中叔碳上的氫，δ = 4.2～4.3 對應于乙烯基 PBLG 中叔碳上的氫，δ = 4.0～4.2 對應于 NIPAM 中支鏈次甲基上的氫，δ = 2.3～2.7 對應于乙烯基 PBLG 支鏈上 β-亞甲基上的氫，δ = 2.0～2.1 對應于乙烯基 PBLG 支鏈上 α-亞甲基上的氫，δ = 1.1～1.4 為 NIPAM 支鏈甲基上的氫，δ = 0.8～1.0 對應于 DOX 中甲基上的氫，1H-NMR 結果顯示，交聯聚合物載藥膠束的制備是成功的。
圖2
BACy、乙烯基 PBLG、交聯聚合物以及交聯聚合物載藥膠束的 1H-NMR 圖及化學結構式
Figure2.
1H-NMR spectra and the chemical structure of BACy, vinyl radical PBLG, cross-linked polymer and DOX-conjugated cross-linked micelle
為進一步驗證 BACy，乙烯基 PBLG 以及交聯聚合物的化學結構，本實驗利用 FTIR 對以上化合物進行了表征。如圖 3 所示為 BACy、乙烯基 PBLG 以及交聯聚合物的 FTIR 圖，其中，BACy 的曲線處 3 266 cm–1為氮氫鍵的伸縮振動吸收峰，1 560.13 cm–1為碳氧雙鍵的伸縮振動吸收峰，1 049.71 cm–1為碳氮鍵的伸縮振動吸收峰，698.10 cm–1為碳硫鍵的伸縮振動吸收峰。結果顯示，BACy 的制備是成功的。乙烯基 PBLG 的 FTIR 圖顯示，3 200～3 500 cm–1為氮氫鍵的伸縮振動吸收峰，3 080 cm–1為苯環上碳氫鍵的伸縮振動吸收峰，1 700 cm–1為碳氧雙鍵的伸縮振動吸收峰，1 050～1 210 cm–1為醚鍵的特征吸收峰。結果顯示，乙烯基 PBLG 的制備是成功的。由 NIPAM 和乙烯基 PBLG 的交聯聚合物的 FTIR 譜圖可知，3 200～3 500 cm–1為氮氫鍵的伸縮振動吸收峰，3 080 cm–1為苯環上碳氫鍵的伸縮振動吸收峰，1 700 cm–1為碳氧雙鍵的伸縮振動吸收峰，1 397 cm–1為亞甲基的骨架振動吸收峰，1 050～1 210 cm–1為醚鍵的特征吸收，698.10 cm–1為碳硫鍵的伸縮振動吸收峰。結果顯示，交聯聚合物合成成功。
圖3
BACy，乙烯基 PBLG 和交聯聚合物的 FTIR 圖
Figure3.
FTIR spectra of BACy, vinyl radical PBLG and cross-linked polymer
2.2 空白膠束的還原響應性
平均尺寸為 10～200 nm 的球形或近似球形的納米形態能夠提高載體材料對血管管壁的通透性和 EPR 效應，有利于藥物傳遞。因此，本文對空白膠束的形貌及尺寸大小進行了表征。如圖 4 所示，從空白膠束的 DLS 結果中可以看出，在 PBS（pH 7.4）未加入 GSH 的條件下，膠束的粒徑為 100 nm 左右。空白膠束的 TEM 照片顯示，空白膠束呈球形結構，且分散穩定性良好，其平均粒徑為 70 nm 左右。TEM 測出的粒徑數值小于 DLS 檢測實驗測出的粒徑，是由于 TEM 實驗過程中，膠束滴于銅網上，在干燥條件下進行實驗，而空白膠束干燥過程中發生收縮，從而導致其粒徑減小。
圖4
空白膠束的形貌表征
Figure4.
The morphological characterization of blank micelles
為驗證空白膠束的還原響應性，本文利用 DLS 實驗對空白膠束在 GSH（10 mmol/L）條件下的粒徑變化進行了測試，如圖 5 所示。在 PBS（pH 7.4）未加入 GSH 的條件下，空白膠束的粒徑在 24 h 內沒有發生明顯的變化，說明空白膠束在 PBS 條件下粒徑形態能夠保持穩定。當加入 10 mmol/L GSH 后，空白膠束的粒徑隨著時間增加而不斷增加；而 4 h 后，空白膠束粒徑隨時間的增加而減小。出現上述現象的原因是由于在 0～4 h 內，空白膠束中的二硫鍵與 GSH 發生還原反應，使得二硫鍵斷裂，空白膠束發生溶脹使得其粒徑逐漸增大；4 h 后，空白膠束中斷裂的聚合物分子鏈逐步脫落，造成其粒徑反而減小。為進一步驗證空白膠束的還原響應性，本實驗中對空白膠束的相對吸光度進行了測試。如圖 5 的相對吸光度變化譜圖所示，在沒有加入 GSH 的條件下，空白膠束的相對吸光度沒有發生明顯變化。加入 10 mmol/L GSH 后，相對吸光度明顯下降。結果表明，空白膠束在 GSH 作用下發生降解；同時證明，所制備空白膠束中的二硫鍵結構對還原劑 GSH 的濃度變化有較好的響應性。
圖5
加入 GSH 的空白膠束 DLS 及相對吸光度變化譜圖
Figure5.
The size and the relative absorbance change of blank micelles in response to GSH
2.3 空白膠束的溫度敏感性行為實驗
溫度敏感性聚合物的溶解度在 LCST 附近發生變化，當溫度低于 LCST 時，聚合物中氮原子與水分子間的氫鍵結合使聚合物膠束可溶于水；而當溫度高于 LCST 后，氫鍵被破壞，聚合物中疏水相互作用增強從而導致聚合物膠束崩解，并從水中析出。為測試所制備空白膠束的 LCST，本實驗利用紫外可見分光光度計于 500 nm 波長處測量溶液透光率。實驗測得空白膠束的 LCST 為 39.4℃，如圖 6 中空白膠束隨溫度變化的透過率變化圖所示。同時，從溶解度照片中可以看出，當溫度低于 LCST 時，空白膠束可溶于水，形成透明溶液；而當溫度高于 LCST 后，氫鍵被破壞，并從水中析出，溶液出現渾濁。實驗測得的空白膠束有較高的 LCST，其原因是空白膠束核殼結構中有氨基酸組分存在，其酰胺鍵結構增強了空白膠束與水分子間的氫鍵作用，這也更有利于空白膠束在人體正常溫度下的循環穩定性和藥物的傳遞。由空白膠束在不同溫度下的粒徑圖可知，溫度為 25℃ 時，空白膠束的粒徑大小為 220 nm，溫度為 55℃ 時，空白膠束的粒徑大小為 164 nm，結果說明空白膠束可在高溫條件下發生收縮，證明了其具備溫度敏感性。從圖 6 中空白膠束隨溫度變化的粒徑變化圖可知，當將溫度從 25℃ 升高至 45℃ 時，空白膠束的粒徑從 220 nm 下降至 168 nm，同時，當將溫度由 45℃ 冷卻至 25℃ 時，空白膠束的粒徑從 170 nm 增大至 221 nm，表明了空白膠束隨溫度變化的可逆性，顯示了其作為載藥材料的可控性。
圖6
空白膠束的溫度敏感性行為
Figure6.
Thermosensitive behavior of blank micelles
2.4 交聯聚合物載藥膠束對藥物的控制釋放
為進一步研究交聯聚合物載藥膠束的釋藥性能，本文對其可控釋藥的多重響應性條件進行了探索。首先，利用紫外可見分光光度計在 480 nm 處測定交聯聚合物載藥膠束的吸光度，計算得到交聯聚合物的載藥效率為 44.74%，表明交聯聚合物對藥物有較高的載藥效率。本文設定了① 37℃，PBS（pH = 7.4）；② 37℃，PBS（pH = 7.4），GSH 10 mmol/L；③ 37℃，ABS（pH = 5.0）；④ 37℃，ABS（pH = 5.0），GSH 10 mmol/L；⑤ 42℃，ABS（pH = 5.0），GSH 10 mmol/L 共 5 種不同的微環境條件，并測試了在 5 種條件下交聯聚合物載藥膠束的藥物釋放性能。如圖 7 所示，游離 DOX 在 5 h 內快速釋放，其累積釋放率達 95.04%。當交聯聚合物載藥膠束在① 條件下，24 h 的累積釋放率僅為 1.12%；在 ② 條件下，其 24 h 累積釋放率為 43.78%；在 ③ 條件下，其 24 h 累積釋放率為 68.65%；在 ④ 條件下，其釋放率為 86%；在 ⑤ 條件下，其 24 h 累積釋放率達到最高，為 91.78%。實驗數據表明：① 交聯聚合物載藥膠束在無刺激條件下僅存在微量的藥物釋放，表明其具有優異的藥物穩定性；② GSH 條件下藥物釋放效率較大，表明其具有良好的還原響應性；③ 酸性條件下較中性條件藥物釋放效率增大，是由于交聯聚合物載藥膠束中腙鍵在酸性條件下斷裂，表明其具有良好的 pH 敏感性；④ 高溫條件下（42℃）藥物釋放效率較大，表明交聯聚合物載藥膠束具有溫度敏感性。綜上所述，由于腫瘤細胞內涵體的弱酸性微環境（pH 5.0），同時細胞內 GSH 濃度較高，溫度也較正常細胞偏高，故本文所制備交聯聚合物載藥膠束有望在腫瘤細胞內快速高效釋藥；而在人體正常 pH 條件下微量釋藥，從而有效減小藥物毒副作用，提高藥物的傳遞效率。
圖7
交聯聚合物載藥膠束的藥物釋放表征
Figure7.
DOX release profiles of DOX conjugated cross-linked micelle
2.5 交聯聚合物載藥膠束的細胞毒性研究
為了進一步研究交聯聚合物載藥膠束在細胞中的攝入和分布情況，本文對其進行了共聚焦顯微鏡實驗。如圖 8 所示為 HeLa 細胞分別在游離 DOX 和交聯聚合物載藥膠束溶液中培養 2 h 和 24 h 的激光共聚焦圖像。從圖中可以看出，與樣品培養 2 h 后游離 DOX 在 HeLa 細胞內僅出現了較弱的 DOX 熒光信號；而交聯聚合物載藥膠束在 HeLa 細胞內出現了較強的 DOX 熒光信號。這是由于交聯聚合物載藥膠束在腫瘤細胞微環境條件下能夠快速釋放藥物，而游離 DOX 是通過擴散機制進入細胞，因擴散速度較慢從而導致 DOX 的細胞攝入量較低。交聯聚合物載藥膠束與 HeLa 細胞培養 24 h 后，從游離 DOX 與從膠束中進入 HeLa 細胞內的 DOX 熒光信號相似，表明兩者具有相似的 DOX 細胞攝入量。實驗結果表明，交聯聚合物載藥膠束進入細胞后能快速釋放出 DOX，并且能夠進入細胞核，進而有效殺傷腫瘤細胞。
圖8
HeLa 細胞激光共聚焦顯微圖像
Figure8.
The laser confocal micrograph of HeLa cells
在前述研究基礎上，本文課題組采用 CCK8 法對 HUVEC 細胞以及 HeLa 細胞進行了細胞毒性實驗，如圖 9 所示。由 HUVEC 細胞活性實驗可知，在空白膠束樣品中細胞存活率較高，表明空白膠束有較好的生物相容性；通過對交聯聚合物載藥膠束對 HeLa 細胞的抑制率隨濃度的變化曲線進行擬合計算可得，DOX 的半抑制率濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為 19.6 μg/mL；交聯聚合物載藥膠束的 IC50 為 33.2 μg/mL，其腫瘤細胞抑制率略低于 DOX。結果表明，隨著交聯聚合物載藥膠束中 DOX 濃度的增強，交聯聚合物載藥膠束在腫瘤細胞微環境條件刺激下釋放藥物分子進而殺死癌細胞，因此其具備良好的抗腫瘤活性。HeLa 細胞活性實驗的結果顯示，細胞存活率隨著空白膠束濃度增高而降低，空白膠束對 HeLa 細胞表現出了低毒性。這是由于 HeLa 細胞內 GSH 的濃度為 2～10 mmol/L，在此還原條件下空白膠束內二硫鍵斷裂，降解產生 PBLG 分子鏈，因而對 HeLa 細胞造成一定的細胞毒性；然而，在 HUVEC 細胞內 GSH 的濃度較低，僅有 1.2 mmol/L，空白膠束內二硫鍵幾乎未發生斷裂，整體保持膠束原有結構，不會對 HUVEC 細胞造成明顯細胞毒性，因此表現出較好的生物相容性。以上結果再次證實了本課題組最初期望將該交聯聚合物載藥膠束具有作為載藥材料潛力的猜想。
圖9
HUVEC 細胞和 HeLa 細胞存活率表征
Figure9.
Survival assay of HUVEC cells and HeLa cells
3 結論
本文利用自由基共聚法合成了交聯聚合物，再通過腙鍵接載 DOX 制備具有還原響應性、溫度敏感性以及 pH 敏感性的三重響應性交聯聚合物載藥膠束。實驗結果顯示，此交聯聚合物載藥膠束在 GSH 10 mmol/L 條件下發生二硫鍵斷裂，交聯聚合物載藥膠束發生降解；其 LCST 為 39.4℃，在腫瘤細胞溫度下發生收縮；在 pH 5.0 的弱酸性條件下腙鍵斷裂釋放藥物。細胞毒性實驗表明，該交聯聚合物載藥膠束具備較好的生物相容性和抗腫瘤活性趨勢。綜上所述，本文所制備的三重響應性交聯聚合物載藥膠束有望成為一種具備高效可控釋藥功能的理想載體材料。
