本文采用兩親性膽甾醇基 γ-聚谷氨酸納米膠束（γ-PGA-graft-CH NMs）負載紫杉醇（PTX），考察了該膠束體系的載藥性能與體內外特性。研究結果表明，γ-PGA-graft-CH NMs 對 PTX 體現了良好的負載性能，最佳藥載比為 1/10，載藥量達 26.9% ± 0.8%，包封率 88.6% ± 1.7%，對應載藥納米膠束（PTX/NMs）的粒徑為（343.5 ± 7.3）nm；體外釋藥結果顯示，PTX/NMs 能延緩 PTX 的釋放，并具有 pH 敏感的釋藥特性和較低的細胞毒性；藥代動力學研究表明，PTX/NMs 在小鼠體內的消除半衰期（t1/2β）、血藥濃度–時間曲線下面積（AUC）均明顯大于 PTX/聚氧乙烯蓖麻油注射劑（PTX/PCO），并具有較低的清除率（CL）；PTX/NMs 在肝臟和瘤體分布高于 PTX/PCO，且對荷瘤小鼠具有良好的抑瘤效果。本研究針對將 γ-PGA-graft-CH NMs 用于抗腫瘤給藥系統奠定了一定的基礎。
引用本文： 胡凡, 肖港, 王育川, 姚俊, 曹新. 膽甾醇基γ-聚谷氨酸載紫杉醇自組裝納米膠束的制備與性能. 生物醫學工程學雜志, 2018, 35(3): 403-408. doi: 10.7507/1001-5515.201708027 復制
引言
聚氨基酸是目前研究較多的一種重要的功能高分子材料，由于其良好的水溶性和生物相容性，將其作為藥物的緩釋和靶向載體已成為近年研究的熱點之一，包括基于化學法合成的 α-聚谷氨酸（谷氨酸單體經 α-酰胺鍵結合）、聚天冬氨酸、聚鳥氨酸等[1]。但從體內安全性考慮，天然聚氨基酸材料具有更好的組織親和性、非免疫原性和生物可降解性，用于藥物載體更具優勢。作為迄今為止發現的三種天然聚氨基酸之一，γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid, γ-PGA）是一種可由微生物發酵合成的生物高分子材料，其主鏈由 D，L-谷氨酸單體經 γ-酰胺鍵結合形成 Nylon-4 結構，在機體內可被降解、吸收、代謝和排泄，不易產生積蓄和毒副作用[1-3]，其側鏈游離的羧基使之具有優于天然多糖的水溶性和化學改性性能，初步研究已顯示出 γ-PGA 在藥物傳輸領域的應用潛力，特別是采用兩親性嵌段/接枝 γ-PGA 衍生物并以自組裝方式獲得疏水核親水殼結構的載藥納米膠束（nano-micelles, NMs）是目前的研究熱點[4-7]。
本課題組在前期工作中構建了基于兩親性膽甾醇基 γ-PGA 衍生物（cholesterol-bearing γ-PGA, γ-PGA-graft-CH）的自組裝 NMs（γ-PGA-graft-CH NMs）[7]，本研究將以紫杉醇（paclitaxel, PTX）為模式藥物，研究 γ-PGA-graft-CH NMs 對 PTX 的載藥性能和體內外特性，評價其作為抗腫瘤藥物載體的可行性，以期為抗腫瘤給藥系統的研發提供新途徑。
1 材料與方法
1.1 試劑與儀器
γ-PGA，本實驗室自制[3]，分子量為 3.0 × 105 D，分子量分布多分散系數為 1.2；膽甾醇（中國惠興生化試劑有限公司）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽［1-（3-Dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC］（上海共價化學科技有限公司）；PTX（純度 99.5%，西安天豐生物科技有限公司）；PTX/聚氧乙烯蓖麻油注射劑（PTX/polyoxyethylene castor oil, PTX/PCO）（北京益普四環醫藥技術開發有限公司）；甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）（Sigma Co., 美國）；其余試劑均為分析純。緩沖液：0.2 mol/L 醋酸鹽緩沖液（pH 4.0），0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline, PBS）（pH 6.0、pH 7.4），0.2 mol/L 硼酸鹽緩沖液（pH 9.0）；透析袋（截留分子量：1.2 × 104 D）。
透射電子顯微鏡（JEM1010，日本）、粒徑分析儀（Beckman Coulter N4PLUS，美國）、超聲波勻質儀（SCIENTZ-IID，寧波新芝生物科技股份有限公司）、低溫冷凍干燥機（LGJ-10D，北京四環公司）、高效液相色譜儀/色譜柱（Agilent 1200/LiChrosphere C18，美國）、酶標儀（BIO-RAD Model 680，美國）。
1.2 細胞株與實驗動物
人宮頸癌 HeLa 細胞株、人乳腺癌 T-47D 細胞株：由本實驗室凍存、培養；清潔級 8 周 C57BL 小鼠（雌雄各半）、未交配雌性 4～6 周 BABL/c 裸鼠，由南京醫科大學實驗動物中心提供。
1.3 實驗過程與分析方法
1.3.1 γ-PGA-graft-CH NMs 的制備
γ-PGA-graft-CH 的合成與 γ-PGA-graft-CH NMs 的制備參見文獻[7]。
1.3.2 γ-PGA-graft-CH NMs 對 PTX 的負載與表征
在超聲條件下向空白 γ-PGA-graft-CH NMs 溶液（5 mg/mL）中緩慢滴加 PTX-甲醇溶液，50 r/min 下避光震蕩 12 h，轉移至透析袋內，去離子水中透析以除去甲醇（12 h 更換去離子水 1 次），24 h 后將透析袋內的膠束溶液 3 000 r/min 離心 10 min，除去未包埋的 PTX，上清液即為負載 PTX 的 γ-PGA-graft-CH NMs（PTX/NMs）分散懸液；取樣后銅網打撈膠束，多余的液體用濾紙迅速吸去，置空氣中自然干燥，再將載網正面貼附于 2% 磷鎢酸溶液（pH 6.8），避光染色 5 min，吸取多余染料，室溫干燥，采用透射電子顯微鏡觀察其形態；粒徑分析儀測定膠束粒徑及粒徑分布多分散系數（polydispersity index, PDI）；采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography, HPLC）測定 PTX/NMs 懸液中 PTX 的含量，色譜條件：流動相為乙腈-水（體積比：45∶55），檢測波長 227 nm，柱溫 35℃，流速 1 mL/min，進樣 20 μL；包封率（entrapment efficiency, EE）和載藥量（loading content, LC）的計算公式如下：包封率 =（載藥膠束中 PTX 量/投藥 PTX 量）× 100%；載藥量 =（載藥膠束中 PTX 量/載藥膠束總量）× 100%。
1.3.3 體外實驗
體外釋藥：取 1.3.2 小節中制備的 PTX/NMs 懸液 2 mL 置于透析袋中，密封后分別放入裝有 50 mL 不同 pH 緩沖介質（pH 4.0、pH 7.4、pH 9.0）的錐形瓶中，37 ℃以及 50 r/min 條件下振蕩孵育，定時取 0.5 mL 透析介質，檢測 PTX 的含量，方法同載藥量測定一致，每個樣本重復測定 3 次。其釋藥率 =（PTX 釋放量/PTX 總量）× 100%。另取 PTX/NMs 溶液 2 mL 置于 pH 4.0、pH 6.0、pH 7.4、pH 9.0 緩沖介質中，振蕩孵育 30 min，粒徑分析儀測定膠束粒徑及其表面 Zeta 電位，并以 Zeta 電位表征 pH 對 PTX/NMs 粒徑以及體外釋藥性能的影響。
細胞毒性評定：采用 MTT 法檢測 PTX/NMs 的細胞毒性：將對數生長期的 HeLa 細胞接種到 96 孔板中（每孔接種 1 × 104個細胞），37 ℃培養，細胞貼壁 24 h 后加藥；實驗分設空白對照組（空白培養基）、陰性對照組（γ-PGA-graft-CH NMs）、陽性對照組（PTX/PCO）與實驗組（PTX/NMs），根據 PTX 劑量，陽性對照組與實驗組分別按 5、10、20、50、100 μg/mL PTX 濃度投加 PTX/PCO 或 PTX/NMs（對應陰性對照組的 γ-PGA-graft-CH NMs 濃度范圍 10～300 μg/mL），每濃度 6 孔；培養 24 h 后更換新鮮培養液，培養 72 h 后每孔加入 5 mg/mL MTT 20 μL 培養 4～6 h，吸盡培養液，每孔再加入二甲亞砜 150 μL，震蕩 30 s，放置 15 min 后，用酶標儀測定 570 nm 處的吸光度（absorbance）（以符號 A 表示），計算細胞相對增殖百分率（relative growth rate, RGR）= A實驗組/A空白對照組 × 100%，按美國藥典（United States pharmacopoeia）（2006）所述標準評定細胞毒性級別[8]。
1.3.4 體內實驗
體內釋藥：將 C57BL 小鼠隨機分為 2 組，尾靜脈注射給藥（PTX 劑量為 1.0 mg/100 g）：一組采用 PTX/PCO 注射劑，命名為：PTX/PCO 注射組；另一組注射 PTX/NMs 懸液，命名為：PTX/NMs 注射組。給藥后分別于 0.05、0.25、0.5、1、2、4、8 h 眼眶取血于肝素化的抗凝管（每取血點取鼠 6 只），5 000 r/min 離心 10 min，取上清血漿 4℃保存，HPLC 法測定 PTX 濃度。藥代動力學數據采用藥代動力學分析軟件 3P97（中國藥理學會數學藥理專業委員會，中國）進行擬合與計算。
組織分布：取對數生長期的 T-47D 細胞，配成 2 × 106 個/mL 單細胞懸液，雌性 BABL/c 裸鼠腋下接種（0.2 mL/只）3 天后制備荷瘤裸鼠動物模型，然后將荷瘤裸鼠隨機分兩組，分別尾靜脈注射 PTX/PCO 注射劑與 PTX/NMs 懸液（PTX 劑量 1.0 mg/100 g），給藥后 0.5、1、2 h 處死小鼠分離肝、脾、肺、腎、瘤組織（每組每批取 5 只小鼠），合并同組同批的組織樣品，按重量比 1∶3 加入勻漿液（體積比：生理鹽水∶乙腈 = 1∶1）后勻漿；取 0.2 mL 組織勻漿，加入 2 mL 甲基叔丁基醚，渦旋振蕩混勻，14 000 r/min 離心 10 min 后取上清液，40℃氮氣流吹干，加入 200 μL 流動相復溶，渦旋振蕩后 14 000 r/min 離心，取上清液，按 1.3.2 小節所述色譜條件測定 PTX 含量。
裸鼠抑瘤實驗：另取荷瘤裸鼠隨機分為 4 組（每組 5 只）：空白對照組注射滅菌生理鹽水，陰性對照組注射 γ-PGA-graft-CH NMs 懸液，陽性對照組（注射 PTX/PCO 注射劑）和實驗組（注射 PTX/NMs 懸液）的 PTX 給藥劑量均為 1.0 mg/100 g，2 天給藥 1 次，共給藥 10 次；處死裸鼠后分離瘤體稱量，計算各組均重（以符號
表示），測量瘤塊長（短）徑并計算腫瘤體積（以符號 V 表示，V = 0.5 × 長徑 × 短徑2）與均值（
），計算腫瘤重量抑制率［以符號 Iw 表示，Iw =（
空白對照組 –
實驗組）/
空白對照組 × 100%］，以及體積抑瘤率［以符號 Iv 表示，Iv =（
空白對照組 –
實驗組）/
空白對照組 × 100%］。
2 結果與討論
2.1 γ-PGA-graft-CH NMs 的合成及 PTX 的載藥量
γ-PGA 經 EDC 活化，側鏈游離羧基接枝膽甾醇分子的 3—OH 活性基團，制備得到 γ-PGA-graft-CH 產物，如圖 1 所示。前期研究表明 γ-PGA-graft-CH 具有兩親性和自組裝膠束的能力，γ-PGA-graft-CH 的取代度約為 20%時（對應每摩爾單位 γ-PGA 單體的膽甾醇用量和 EDC 用量分別為 1.2 mol 和 0.7 mol），采用超聲探頭法可制得形態規則、粒徑均一且分散穩定的 NMs[7]。本文將進一步研究該 γ-PGA-graft-CH NMs 用于抗腫瘤藥物給藥系統的功效。
圖1
γ-PGA-graft-CH 分子結構
Figure1.
Molecule structure of γ-PGA-graft-CH
投藥量對 γ-PGA-graft-CH NMs 負載 PTX 性能的影響如表 1 所示。隨 PTX 投藥量的增加載體膠束的載藥量逐漸增加（12.6% ± 0.7%～30.7% ± 1.3%），膠束粒徑也隨之增大［（286.5 ± 4.8）～（398.5 ± 19.6）nm］；PTX 與載體膠束的藥載比小于 1/10，包封率處于較高水平（91.9% ± 1.1%～88.6% ± 1.7%）；藥載比大于 1/10 時，載藥量雖略有提高，但包封率出現明顯下降，說明 γ-PGA-graft-CH NMs 對 PTX 的負載已達到飽和。從載藥量和包封率綜合考慮，1/10 為最佳藥載比，該條件下制備的 PTX/NMs 透射電鏡觀察結果如圖 2 所示，膠束形態規則，界面清晰，核、殼區域的襯度差異明顯（另核區可見藥物析出現象），粒徑在 250～350 nm 左右，大小較為均一。粒度分析結果顯示，PTX/NMs 的平均粒徑在（343.5 ± 7.3）nm，與電鏡測定結果相近，其粒徑分布多分散系數為 0.212 ± 0.018。
表1
投藥量對 PTX/NMs 載藥量的影響
Table1.
Effect of PTX dosage on drug-loading of PTX/NMs
圖2
PTX/NMs 透射電鏡結果
Figure2.
Transmission electron microscope image of PTX/NMs
2.2 體外實驗
2.2.1 PTX/NMs 的體外釋藥與表征
采用動態透析法考察 PTX/NMs 的體外釋藥特征，pH 值不同的釋藥介質中 PTX/NMs 的釋藥曲線如圖 3 所示。實驗結果表明，PTX/NMs 在 pH 7.4 的 PBS 中釋藥穩定，速率較慢，12 h 的釋藥率僅為 29.0%，84 h 的釋藥率為 51.2%，考慮到突釋效應主要是由于鑲嵌或吸附于膠束表面或近表面的藥物在短時間內快速釋放有關，以上結果表明 PTX 是完全包載于 γ-PGA-graft-CH NMs 核內的，故無突釋現象出現。在 pH 4.0 與 pH 9.0 的緩沖介質中，釋藥速率明顯增加，這主要是由于 γ-PGA-graft-CH 分子的親水區域含有大量游離的羧基，在偏酸性介質中，膠束表面 Zeta 電位較低，γ-PGA-graft-CH 的親水端所帶電荷趨于中性，粒徑較小，但由于 γ-PGA-graft-CH 親水端側鏈呈質子化趨勢，分子內和分子間氫鍵加強，二級結構以 α-螺旋為主[1-2]，其分子柔性較差，自組裝膠束性能以及藥物負載能力減弱；而在偏堿性介質中，膠束表面 Zeta 電位較高，親水端因游離的羧基電離為－COO–而帶負電荷，同種電荷相斥使得膠束內部結構充分吸水溶脹，對包封藥物的通透性增加，如圖 3 所示。
圖3
PTX/NMs 的體外表征
Figure3.
Characterization of PTX/NMs in vitro
PTX/NMs 這種對 pH 敏感的釋藥特性也存在于其他 pH 敏感的凝膠體系中[4-6]，由于人體內各組織的環境 pH 值各有差別，特別是腫瘤組織的微環境 pH 一般低于正常組織，因而這一特性對設計靶向腫瘤組織或特定器官的給藥系統具有重要應用價值。
2.2.2 細胞毒性評定
以 HeLa 細胞為實驗細胞株，采用 MTT 法評定 PTX/NMs 的細胞毒性，如圖 4 所示。陰性對照組采用各劑量載藥膠束對應的 γ-PGA-graft-CH NMs 濃度給藥，測試結果顯示細胞增殖未受到抑制，所得結果均與空白對照組無明顯差異，可排除 γ-PGA-graft-CH NMs 自身的影響，故圖 4 中未予展示。陽性對照組與實驗組隨給藥劑量的增加細胞增殖均受到抑制，其 RGR 值均呈下降趨勢；給藥劑量較低時（5 μg/mL），陽性對照組與實驗組的 RGR 值無明顯的差異，細胞毒性均為 0 級；給藥劑量為 10 μg/mL 時，實驗組的 RGR 值高于陽性對照組，但細胞毒性評級同為 1 級；給藥劑量增至 20～100 μg/mL，實驗組的細胞毒性均低于相應劑量的陽性對照組。說明實驗組由于有 γ-PGA-graft-CH NMs 的外層保護，與陽性對照組的 PTX/PCO 劑型相比明顯減輕了包埋的 PTX 的細胞毒性。
圖4
PTX/NMs 體外細胞毒性評定
Figure4.
Cytotoxicity of PTX/NMs in vitro
2.3 體內實驗
2.3.1 體內釋藥與藥代動力學研究
給藥后小鼠體內血藥濃度—時間的關系曲線如圖 5 所示。給藥后 0～2 h，PTX/PCO 注射組與 PTX/NMs 注射組的血藥濃度均明顯降低，但 PTX/NMs 注射組下降較慢，4 h 后血藥濃度仍維持在一定水平，這一結果提示 PTX/NMs 在小鼠體內消除較慢。兩組血藥濃度–時間數據采用 3P97 軟件進行房室模型擬合，均符合兩室模型，但藥代動力學特征存在明顯差異，如表 2 所示。PTX/NMs 的分布速率常數（α）、消除速率常數（β）、外周室到中央室轉運速率常數（K21)、中央室消除速率常數（K10）、中央室到外周室轉運速率常數（K12）和藥物清除率（clearance, CL）均低于 PTX/PCO，但 PTX/NMs 具有較大的血藥濃度–時間曲線下面積（area under concentration-time curve, AUC）、表觀分布容積［V（c）］以及較長的慢速分布相半衰期（t1/2α）和消除半衰期（t1/2β），表明 PTX/NMs 可使血漿中的藥物濃度維持更長時間，有利于改善 PTX 的生物利用度以及治療指數。
圖5
PTX/NMs 和 PTX/PCO 給藥后的血藥濃度–時間曲線
Figure5.
Concentration–time curves of PTX/NMs and PTX/PCO
表2
PTX 在小鼠體內的藥代動力學參數（n = 6）
Table2.
Pharmacokinetic parameters of PTX in mice（n = 6）
2.3.2 組織分布
本文采用人乳腺癌 T-47D 細胞作為抑瘤實驗的細胞株，裸鼠接種荷瘤后，給藥期間均正常存活。給藥后 1 h，PTX/NMs 與 PTX/PCO 在各組織的分布均呈下降趨勢。如圖 6 所示為給藥 1 h 時，兩種制劑在小鼠各組織的分布比較，PTX/NMs 在肝臟和瘤體的分布明顯高于 PTX/PCO 注射劑，而在其他組織中兩者分布差異不明顯，顯示了 PTX/NMs 對肝和腫瘤組織的靶向趨勢，這可能是由于 PTX/NMs 在小鼠血漿內較長的 t1/2β 和較低的 CL（如 2.3.1 小節所述）使得被動靶向到達肝臟和腫瘤組織的機會增加。
圖6
PTX/NMs 和 PTX/PCO 在小鼠體內各組織的分布
Figure6.
Drug distribution of PTX/NMs and PTX/PCO in mice tissues
2.3.3 裸鼠抑瘤實驗
裸鼠抑瘤實驗結果如表 3 所示，空白對照組和陰性對照組瘤體增長最快，重量和體積相近，與細胞毒性的結果相符；相同 PTX 劑量的 PTX/PCO 注射劑和 PTX/NMs 對腫瘤均有明顯的抑制作用，給藥后陽性對照組與實驗組的瘤體重量和體積均明顯低于空白對照組與陰性對照組，總體抑瘤效果相當。這是因為 PTX/NMs 的細胞毒性雖然較低，但其獨特的釋藥特性、體內長循環的藥代動力學特性以及較高的瘤體分布使其抑瘤效果與 PTX/PCO 相當。可見 PTX 經 γ-PGA-graft-CH NMs 包埋后，其給藥達到了緩釋、低毒和有效的目的。
表3
PTX/NMs 和 PTX/PCO 用于裸鼠抑瘤實驗的效果比較
Table3.
Comparison of tumor-inhibiting effects of PTX/NMs and PTX/PCO in T–47D-inoculated nude mice
3 結論
本文研究的具有核殼結構的 γ-PGA-graft-CH NMs 對 PTX 顯示了良好的負載性能，通過實驗分析，PTX 與載體膠束的最佳藥載比定為 1/10，制備的膠束粒徑為（343.5 ± 7.3）nm，粒徑分布較窄；體外實驗結果表明 PTX/NMs 具有 pH 敏感的釋藥特性；小鼠體內釋藥與組織分布實驗結果顯示 PTX/NMs 與 PTX/PCO 在小鼠體內表現為不同的藥代動力學行為，PTX/NMs 表現出明顯的長循環效果，且在瘤體中的分布水平高于 PTX/PCO 注射劑；裸鼠抑瘤實驗表明，PTX/NMs 具有良好的抑瘤性能，抑瘤效果與 PTX/PCO 相當，但比 PTX/PCO 具有較低的細胞毒性。綜上所述，γ-PGA-graft-CH NMs 在抗腫瘤給藥領域顯示了良好的應用潛力。
引言
聚氨基酸是目前研究較多的一種重要的功能高分子材料，由于其良好的水溶性和生物相容性，將其作為藥物的緩釋和靶向載體已成為近年研究的熱點之一，包括基于化學法合成的 α-聚谷氨酸（谷氨酸單體經 α-酰胺鍵結合）、聚天冬氨酸、聚鳥氨酸等[1]。但從體內安全性考慮，天然聚氨基酸材料具有更好的組織親和性、非免疫原性和生物可降解性，用于藥物載體更具優勢。作為迄今為止發現的三種天然聚氨基酸之一，γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid, γ-PGA）是一種可由微生物發酵合成的生物高分子材料，其主鏈由 D，L-谷氨酸單體經 γ-酰胺鍵結合形成 Nylon-4 結構，在機體內可被降解、吸收、代謝和排泄，不易產生積蓄和毒副作用[1-3]，其側鏈游離的羧基使之具有優于天然多糖的水溶性和化學改性性能，初步研究已顯示出 γ-PGA 在藥物傳輸領域的應用潛力，特別是采用兩親性嵌段/接枝 γ-PGA 衍生物并以自組裝方式獲得疏水核親水殼結構的載藥納米膠束（nano-micelles, NMs）是目前的研究熱點[4-7]。
本課題組在前期工作中構建了基于兩親性膽甾醇基 γ-PGA 衍生物（cholesterol-bearing γ-PGA, γ-PGA-graft-CH）的自組裝 NMs（γ-PGA-graft-CH NMs）[7]，本研究將以紫杉醇（paclitaxel, PTX）為模式藥物，研究 γ-PGA-graft-CH NMs 對 PTX 的載藥性能和體內外特性，評價其作為抗腫瘤藥物載體的可行性，以期為抗腫瘤給藥系統的研發提供新途徑。
1 材料與方法
1.1 試劑與儀器
γ-PGA，本實驗室自制[3]，分子量為 3.0 × 105 D，分子量分布多分散系數為 1.2；膽甾醇（中國惠興生化試劑有限公司）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽［1-（3-Dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC］（上海共價化學科技有限公司）；PTX（純度 99.5%，西安天豐生物科技有限公司）；PTX/聚氧乙烯蓖麻油注射劑（PTX/polyoxyethylene castor oil, PTX/PCO）（北京益普四環醫藥技術開發有限公司）；甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）（Sigma Co., 美國）；其余試劑均為分析純。緩沖液：0.2 mol/L 醋酸鹽緩沖液（pH 4.0），0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline, PBS）（pH 6.0、pH 7.4），0.2 mol/L 硼酸鹽緩沖液（pH 9.0）；透析袋（截留分子量：1.2 × 104 D）。
透射電子顯微鏡（JEM1010，日本）、粒徑分析儀（Beckman Coulter N4PLUS，美國）、超聲波勻質儀（SCIENTZ-IID，寧波新芝生物科技股份有限公司）、低溫冷凍干燥機（LGJ-10D，北京四環公司）、高效液相色譜儀/色譜柱（Agilent 1200/LiChrosphere C18，美國）、酶標儀（BIO-RAD Model 680，美國）。
1.2 細胞株與實驗動物
人宮頸癌 HeLa 細胞株、人乳腺癌 T-47D 細胞株：由本實驗室凍存、培養；清潔級 8 周 C57BL 小鼠（雌雄各半）、未交配雌性 4～6 周 BABL/c 裸鼠，由南京醫科大學實驗動物中心提供。
1.3 實驗過程與分析方法
1.3.1 γ-PGA-graft-CH NMs 的制備
γ-PGA-graft-CH 的合成與 γ-PGA-graft-CH NMs 的制備參見文獻[7]。
1.3.2 γ-PGA-graft-CH NMs 對 PTX 的負載與表征
在超聲條件下向空白 γ-PGA-graft-CH NMs 溶液（5 mg/mL）中緩慢滴加 PTX-甲醇溶液，50 r/min 下避光震蕩 12 h，轉移至透析袋內，去離子水中透析以除去甲醇（12 h 更換去離子水 1 次），24 h 后將透析袋內的膠束溶液 3 000 r/min 離心 10 min，除去未包埋的 PTX，上清液即為負載 PTX 的 γ-PGA-graft-CH NMs（PTX/NMs）分散懸液；取樣后銅網打撈膠束，多余的液體用濾紙迅速吸去，置空氣中自然干燥，再將載網正面貼附于 2% 磷鎢酸溶液（pH 6.8），避光染色 5 min，吸取多余染料，室溫干燥，采用透射電子顯微鏡觀察其形態；粒徑分析儀測定膠束粒徑及粒徑分布多分散系數（polydispersity index, PDI）；采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography, HPLC）測定 PTX/NMs 懸液中 PTX 的含量，色譜條件：流動相為乙腈-水（體積比：45∶55），檢測波長 227 nm，柱溫 35℃，流速 1 mL/min，進樣 20 μL；包封率（entrapment efficiency, EE）和載藥量（loading content, LC）的計算公式如下：包封率 =（載藥膠束中 PTX 量/投藥 PTX 量）× 100%；載藥量 =（載藥膠束中 PTX 量/載藥膠束總量）× 100%。
1.3.3 體外實驗
體外釋藥：取 1.3.2 小節中制備的 PTX/NMs 懸液 2 mL 置于透析袋中，密封后分別放入裝有 50 mL 不同 pH 緩沖介質（pH 4.0、pH 7.4、pH 9.0）的錐形瓶中，37 ℃以及 50 r/min 條件下振蕩孵育，定時取 0.5 mL 透析介質，檢測 PTX 的含量，方法同載藥量測定一致，每個樣本重復測定 3 次。其釋藥率 =（PTX 釋放量/PTX 總量）× 100%。另取 PTX/NMs 溶液 2 mL 置于 pH 4.0、pH 6.0、pH 7.4、pH 9.0 緩沖介質中，振蕩孵育 30 min，粒徑分析儀測定膠束粒徑及其表面 Zeta 電位，并以 Zeta 電位表征 pH 對 PTX/NMs 粒徑以及體外釋藥性能的影響。
細胞毒性評定：采用 MTT 法檢測 PTX/NMs 的細胞毒性：將對數生長期的 HeLa 細胞接種到 96 孔板中（每孔接種 1 × 104個細胞），37 ℃培養，細胞貼壁 24 h 后加藥；實驗分設空白對照組（空白培養基）、陰性對照組（γ-PGA-graft-CH NMs）、陽性對照組（PTX/PCO）與實驗組（PTX/NMs），根據 PTX 劑量，陽性對照組與實驗組分別按 5、10、20、50、100 μg/mL PTX 濃度投加 PTX/PCO 或 PTX/NMs（對應陰性對照組的 γ-PGA-graft-CH NMs 濃度范圍 10～300 μg/mL），每濃度 6 孔；培養 24 h 后更換新鮮培養液，培養 72 h 后每孔加入 5 mg/mL MTT 20 μL 培養 4～6 h，吸盡培養液，每孔再加入二甲亞砜 150 μL，震蕩 30 s，放置 15 min 后，用酶標儀測定 570 nm 處的吸光度（absorbance）（以符號 A 表示），計算細胞相對增殖百分率（relative growth rate, RGR）= A實驗組/A空白對照組 × 100%，按美國藥典（United States pharmacopoeia）（2006）所述標準評定細胞毒性級別[8]。
1.3.4 體內實驗
體內釋藥：將 C57BL 小鼠隨機分為 2 組，尾靜脈注射給藥（PTX 劑量為 1.0 mg/100 g）：一組采用 PTX/PCO 注射劑，命名為：PTX/PCO 注射組；另一組注射 PTX/NMs 懸液，命名為：PTX/NMs 注射組。給藥后分別于 0.05、0.25、0.5、1、2、4、8 h 眼眶取血于肝素化的抗凝管（每取血點取鼠 6 只），5 000 r/min 離心 10 min，取上清血漿 4℃保存，HPLC 法測定 PTX 濃度。藥代動力學數據采用藥代動力學分析軟件 3P97（中國藥理學會數學藥理專業委員會，中國）進行擬合與計算。
組織分布：取對數生長期的 T-47D 細胞，配成 2 × 106 個/mL 單細胞懸液，雌性 BABL/c 裸鼠腋下接種（0.2 mL/只）3 天后制備荷瘤裸鼠動物模型，然后將荷瘤裸鼠隨機分兩組，分別尾靜脈注射 PTX/PCO 注射劑與 PTX/NMs 懸液（PTX 劑量 1.0 mg/100 g），給藥后 0.5、1、2 h 處死小鼠分離肝、脾、肺、腎、瘤組織（每組每批取 5 只小鼠），合并同組同批的組織樣品，按重量比 1∶3 加入勻漿液（體積比：生理鹽水∶乙腈 = 1∶1）后勻漿；取 0.2 mL 組織勻漿，加入 2 mL 甲基叔丁基醚，渦旋振蕩混勻，14 000 r/min 離心 10 min 后取上清液，40℃氮氣流吹干，加入 200 μL 流動相復溶，渦旋振蕩后 14 000 r/min 離心，取上清液，按 1.3.2 小節所述色譜條件測定 PTX 含量。
裸鼠抑瘤實驗：另取荷瘤裸鼠隨機分為 4 組（每組 5 只）：空白對照組注射滅菌生理鹽水，陰性對照組注射 γ-PGA-graft-CH NMs 懸液，陽性對照組（注射 PTX/PCO 注射劑）和實驗組（注射 PTX/NMs 懸液）的 PTX 給藥劑量均為 1.0 mg/100 g，2 天給藥 1 次，共給藥 10 次；處死裸鼠后分離瘤體稱量，計算各組均重（以符號
表示），測量瘤塊長（短）徑并計算腫瘤體積（以符號 V 表示，V = 0.5 × 長徑 × 短徑2）與均值（
），計算腫瘤重量抑制率［以符號 Iw 表示，Iw =（
空白對照組 –
實驗組）/
空白對照組 × 100%］，以及體積抑瘤率［以符號 Iv 表示，Iv =（
空白對照組 –
實驗組）/
空白對照組 × 100%］。
2 結果與討論
2.1 γ-PGA-graft-CH NMs 的合成及 PTX 的載藥量
γ-PGA 經 EDC 活化，側鏈游離羧基接枝膽甾醇分子的 3—OH 活性基團，制備得到 γ-PGA-graft-CH 產物，如圖 1 所示。前期研究表明 γ-PGA-graft-CH 具有兩親性和自組裝膠束的能力，γ-PGA-graft-CH 的取代度約為 20%時（對應每摩爾單位 γ-PGA 單體的膽甾醇用量和 EDC 用量分別為 1.2 mol 和 0.7 mol），采用超聲探頭法可制得形態規則、粒徑均一且分散穩定的 NMs[7]。本文將進一步研究該 γ-PGA-graft-CH NMs 用于抗腫瘤藥物給藥系統的功效。
圖1
γ-PGA-graft-CH 分子結構
Figure1.
Molecule structure of γ-PGA-graft-CH
投藥量對 γ-PGA-graft-CH NMs 負載 PTX 性能的影響如表 1 所示。隨 PTX 投藥量的增加載體膠束的載藥量逐漸增加（12.6% ± 0.7%～30.7% ± 1.3%），膠束粒徑也隨之增大［（286.5 ± 4.8）～（398.5 ± 19.6）nm］；PTX 與載體膠束的藥載比小于 1/10，包封率處于較高水平（91.9% ± 1.1%～88.6% ± 1.7%）；藥載比大于 1/10 時，載藥量雖略有提高，但包封率出現明顯下降，說明 γ-PGA-graft-CH NMs 對 PTX 的負載已達到飽和。從載藥量和包封率綜合考慮，1/10 為最佳藥載比，該條件下制備的 PTX/NMs 透射電鏡觀察結果如圖 2 所示，膠束形態規則，界面清晰，核、殼區域的襯度差異明顯（另核區可見藥物析出現象），粒徑在 250～350 nm 左右，大小較為均一。粒度分析結果顯示，PTX/NMs 的平均粒徑在（343.5 ± 7.3）nm，與電鏡測定結果相近，其粒徑分布多分散系數為 0.212 ± 0.018。
表1
投藥量對 PTX/NMs 載藥量的影響
Table1.
Effect of PTX dosage on drug-loading of PTX/NMs
圖2
PTX/NMs 透射電鏡結果
Figure2.
Transmission electron microscope image of PTX/NMs
2.2 體外實驗
2.2.1 PTX/NMs 的體外釋藥與表征
采用動態透析法考察 PTX/NMs 的體外釋藥特征，pH 值不同的釋藥介質中 PTX/NMs 的釋藥曲線如圖 3 所示。實驗結果表明，PTX/NMs 在 pH 7.4 的 PBS 中釋藥穩定，速率較慢，12 h 的釋藥率僅為 29.0%，84 h 的釋藥率為 51.2%，考慮到突釋效應主要是由于鑲嵌或吸附于膠束表面或近表面的藥物在短時間內快速釋放有關，以上結果表明 PTX 是完全包載于 γ-PGA-graft-CH NMs 核內的，故無突釋現象出現。在 pH 4.0 與 pH 9.0 的緩沖介質中，釋藥速率明顯增加，這主要是由于 γ-PGA-graft-CH 分子的親水區域含有大量游離的羧基，在偏酸性介質中，膠束表面 Zeta 電位較低，γ-PGA-graft-CH 的親水端所帶電荷趨于中性，粒徑較小，但由于 γ-PGA-graft-CH 親水端側鏈呈質子化趨勢，分子內和分子間氫鍵加強，二級結構以 α-螺旋為主[1-2]，其分子柔性較差，自組裝膠束性能以及藥物負載能力減弱；而在偏堿性介質中，膠束表面 Zeta 電位較高，親水端因游離的羧基電離為－COO–而帶負電荷，同種電荷相斥使得膠束內部結構充分吸水溶脹，對包封藥物的通透性增加，如圖 3 所示。
圖3
PTX/NMs 的體外表征
Figure3.
Characterization of PTX/NMs in vitro
PTX/NMs 這種對 pH 敏感的釋藥特性也存在于其他 pH 敏感的凝膠體系中[4-6]，由于人體內各組織的環境 pH 值各有差別，特別是腫瘤組織的微環境 pH 一般低于正常組織，因而這一特性對設計靶向腫瘤組織或特定器官的給藥系統具有重要應用價值。
2.2.2 細胞毒性評定
以 HeLa 細胞為實驗細胞株，采用 MTT 法評定 PTX/NMs 的細胞毒性，如圖 4 所示。陰性對照組采用各劑量載藥膠束對應的 γ-PGA-graft-CH NMs 濃度給藥，測試結果顯示細胞增殖未受到抑制，所得結果均與空白對照組無明顯差異，可排除 γ-PGA-graft-CH NMs 自身的影響，故圖 4 中未予展示。陽性對照組與實驗組隨給藥劑量的增加細胞增殖均受到抑制，其 RGR 值均呈下降趨勢；給藥劑量較低時（5 μg/mL），陽性對照組與實驗組的 RGR 值無明顯的差異，細胞毒性均為 0 級；給藥劑量為 10 μg/mL 時，實驗組的 RGR 值高于陽性對照組，但細胞毒性評級同為 1 級；給藥劑量增至 20～100 μg/mL，實驗組的細胞毒性均低于相應劑量的陽性對照組。說明實驗組由于有 γ-PGA-graft-CH NMs 的外層保護，與陽性對照組的 PTX/PCO 劑型相比明顯減輕了包埋的 PTX 的細胞毒性。
圖4
PTX/NMs 體外細胞毒性評定
Figure4.
Cytotoxicity of PTX/NMs in vitro
2.3 體內實驗
2.3.1 體內釋藥與藥代動力學研究
給藥后小鼠體內血藥濃度—時間的關系曲線如圖 5 所示。給藥后 0～2 h，PTX/PCO 注射組與 PTX/NMs 注射組的血藥濃度均明顯降低，但 PTX/NMs 注射組下降較慢，4 h 后血藥濃度仍維持在一定水平，這一結果提示 PTX/NMs 在小鼠體內消除較慢。兩組血藥濃度–時間數據采用 3P97 軟件進行房室模型擬合，均符合兩室模型，但藥代動力學特征存在明顯差異，如表 2 所示。PTX/NMs 的分布速率常數（α）、消除速率常數（β）、外周室到中央室轉運速率常數（K21)、中央室消除速率常數（K10）、中央室到外周室轉運速率常數（K12）和藥物清除率（clearance, CL）均低于 PTX/PCO，但 PTX/NMs 具有較大的血藥濃度–時間曲線下面積（area under concentration-time curve, AUC）、表觀分布容積［V（c）］以及較長的慢速分布相半衰期（t1/2α）和消除半衰期（t1/2β），表明 PTX/NMs 可使血漿中的藥物濃度維持更長時間，有利于改善 PTX 的生物利用度以及治療指數。
圖5
PTX/NMs 和 PTX/PCO 給藥后的血藥濃度–時間曲線
Figure5.
Concentration–time curves of PTX/NMs and PTX/PCO
表2
PTX 在小鼠體內的藥代動力學參數（n = 6）
Table2.
Pharmacokinetic parameters of PTX in mice（n = 6）
2.3.2 組織分布
本文采用人乳腺癌 T-47D 細胞作為抑瘤實驗的細胞株，裸鼠接種荷瘤后，給藥期間均正常存活。給藥后 1 h，PTX/NMs 與 PTX/PCO 在各組織的分布均呈下降趨勢。如圖 6 所示為給藥 1 h 時，兩種制劑在小鼠各組織的分布比較，PTX/NMs 在肝臟和瘤體的分布明顯高于 PTX/PCO 注射劑，而在其他組織中兩者分布差異不明顯，顯示了 PTX/NMs 對肝和腫瘤組織的靶向趨勢，這可能是由于 PTX/NMs 在小鼠血漿內較長的 t1/2β 和較低的 CL（如 2.3.1 小節所述）使得被動靶向到達肝臟和腫瘤組織的機會增加。
圖6
PTX/NMs 和 PTX/PCO 在小鼠體內各組織的分布
Figure6.
Drug distribution of PTX/NMs and PTX/PCO in mice tissues
2.3.3 裸鼠抑瘤實驗
裸鼠抑瘤實驗結果如表 3 所示，空白對照組和陰性對照組瘤體增長最快，重量和體積相近，與細胞毒性的結果相符；相同 PTX 劑量的 PTX/PCO 注射劑和 PTX/NMs 對腫瘤均有明顯的抑制作用，給藥后陽性對照組與實驗組的瘤體重量和體積均明顯低于空白對照組與陰性對照組，總體抑瘤效果相當。這是因為 PTX/NMs 的細胞毒性雖然較低，但其獨特的釋藥特性、體內長循環的藥代動力學特性以及較高的瘤體分布使其抑瘤效果與 PTX/PCO 相當。可見 PTX 經 γ-PGA-graft-CH NMs 包埋后，其給藥達到了緩釋、低毒和有效的目的。
表3
PTX/NMs 和 PTX/PCO 用于裸鼠抑瘤實驗的效果比較
Table3.
Comparison of tumor-inhibiting effects of PTX/NMs and PTX/PCO in T–47D-inoculated nude mice
3 結論
本文研究的具有核殼結構的 γ-PGA-graft-CH NMs 對 PTX 顯示了良好的負載性能，通過實驗分析，PTX 與載體膠束的最佳藥載比定為 1/10，制備的膠束粒徑為（343.5 ± 7.3）nm，粒徑分布較窄；體外實驗結果表明 PTX/NMs 具有 pH 敏感的釋藥特性；小鼠體內釋藥與組織分布實驗結果顯示 PTX/NMs 與 PTX/PCO 在小鼠體內表現為不同的藥代動力學行為，PTX/NMs 表現出明顯的長循環效果，且在瘤體中的分布水平高于 PTX/PCO 注射劑；裸鼠抑瘤實驗表明，PTX/NMs 具有良好的抑瘤性能，抑瘤效果與 PTX/PCO 相當，但比 PTX/PCO 具有較低的細胞毒性。綜上所述，γ-PGA-graft-CH NMs 在抗腫瘤給藥領域顯示了良好的應用潛力。
